TWI395619B - 層析方法 - Google Patents

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TWI395619B TW097126981A TW97126981A TWI395619B TW I395619 B TWI395619 B TW I395619B TW 097126981 A TW097126981 A TW 097126981A TW 97126981 A TW97126981 A TW 97126981A TW I395619 B TWI395619 B TW I395619B
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Description

層析方法
本發明係屬於可用於純化多肽、尤其聚乙二醇化多肽之層析分離方法領域。
蛋白質在當今醫學業務中具有重要作用。對於人類應用，各種醫藥蛋白質必須符合不同標準。為保證用於人類之生物藥劑之安全性，在生產過程期間積累之副產物尤其必須去除。為滿足質量管理規格標準，在製造過程後必須實施一或多個純化步驟。在適宜純化方法之確定中，純度、產量及產率尤其具有重要作用。
不同方法已得到良好發展且廣泛用於蛋白質純化，例如使用微生物蛋白質之親和層析法(例如蛋白質A或蛋白質G親和層析法)、離子交換層析法(例如陽離子交換(磺丙基羧基甲基樹脂)、陰離子交換(胺基乙基樹脂)及混合模式離子交換)、嗜硫菌吸附(例如使用鈣－巰基乙醇及其他SH配體)、疏水作用層析或芳香族吸附層析(例如使用苯基－瓊脂糖、氮雜－親芳烴(arenophilic)樹脂、或間－胺基苯基硼酸)、金屬螯合親和層析法(例如使用Ni(II)－及Cu(II)－親和性物質)、尺寸排除層析法、及電泳方法(例如凝膠電泳、毛細管電泳)(Vijayalakshmi，M.A.Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93－102)。
據報導以下物質之間發生接合：例如聚乙二醇(PEG)與介白素－6之間(歐洲專利第0 442 724號)、PEG與紅血球生 成素之間(WO 01/02017)、包含內皮他丁(Endostatin)之嵌合分子與免疫球蛋白之間(美國專利第2005/008649號)、基於融合蛋白之分泌抗體之間(美國專利第2002/147311號)、包含白蛋白之融合多肽之間(美國專利第2005/0100991號；人血清白蛋白，美國專利第5,876,969號)、聚乙二醇化多肽之間(美國專利第2005/0114037號)、及干擾素融合蛋白之間。
Necina,R.等人(Biotechnol.Bioeng.60(1998)689－698)報導藉由表現高電荷密度之離子交換介質直接自細胞培養物上清液捕獲人單株抗體。在WO 89/05157中報導藉由對細胞培養基直接實施陽離子交換處理來純化產物免疫球蛋白之方法。來自小鼠腹水之單株IgG抗體之一步式純化由Danielsson,A.等人闡述於J.Immun.Meth.115(1988),79－88中。藉由離子交換層析純化多肽之方法報導於WO 2004/024866中，其中使用梯度洗滌來分離目標多肽與一或多種污染物。在歐洲專利第0 530 447號中報導藉由三個層析步驟之組合來純化IgG單株抗體之方法。單－聚乙二醇化介白素－1受體拮抗劑之便捷純化由Yu,G.等人報導於Process Biotechnol.42(2007)971－977中。Wang等人(Wang,H.等人，Peptides 26(2005)1213－1218)報導藉由二步式陽離子交換層析純化大腸桿菌(E.coli)中所表現之hTFF3。Yun等人(Yun,Q.等人，J.Biotechnol.118(2005)67－74)報導藉由兩個連續離子交換層析步驟純化聚乙二醇化rhG－CSF。
本發明一態樣係在洗脫目標化合物後使陽離子交換層析管柱再生之方法，其包含以下順序之下列步驟：－用以至少500 mM之濃度包含氯化鈉之緩衝水溶液自管柱洗脫所吸附多肽，－用淨化水沖洗管柱，－將0.5 M氫氧化鈉溶液施加至管柱中，－用淨化水沖洗管柱，－將包含0.5 M磷酸二氫鈉及1 M磷酸之溶液施加至管柱中，－用淨化水沖洗管柱，－在至少4小時內將0.5 M氫氧化鈉溶液施加至管柱中，且－藉由用淨化水沖洗管柱來使陽離子交換管柱再生。
本發明第一態樣包含在洗脫目標化合物後使陽離子交換層析管柱再生之方法，其包含以下步驟：－用包含氯化鈉之緩衝水溶液自陽離子交換管柱去除殘留經結合多肽，－用淨化水沖洗管柱，－將氫氧化鈉溶液施加至管柱中，－用淨化水沖洗管柱，－將包含磷酸二氫鈉及磷酸之溶液施加至管柱中，－用淨化水沖洗管柱，－在至少4小時內將0.5 M氫氧化鈉溶液施加至管柱中，且 －藉由用淨化水沖洗管柱來使陽離子交換管柱再生。
本申請案所用術語「淨化水」表示美國藥典(US Pharmacopeia)中之注射用水。
本申請案中所用術語「離子交換材料」表示在離子交換層析中用作固定相之載有共價鍵結荷電取代基之固定高分子量基質。為達成總電荷中性，非共價鍵結異荷離子與其結合。「離子交換材料」能使其非共價鍵結異荷離子與周圍溶液中帶相同電荷之離子交換。端視其可交換異荷離子之電荷，可將「離子交換樹脂」稱作陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂。端視荷電基團(取代基)之性質，(例如)在陽離子交換樹脂情況下可將「離子交換樹脂」稱作磺酸樹脂(S)、或磺丙基樹脂(SP)、或羧甲基樹脂(CM)。端視荷電基團/取代基之化學性質，「離子交換樹脂」可另外歸類為強或弱離子交換樹脂，此取決於共價鍵結荷電取代基之強度。舉例而言，強陽離子交換樹脂具有磺酸基(磺丙基較佳)作為荷電取代基，弱陽離子交換樹脂具有羧基(羧甲基較佳)作為荷電取代基，且弱陰離子交換樹脂具有二乙胺基乙基作為荷電取代基。在一實施例中，陽離子交換層析管柱含有磺丙基陽離子交換樹脂，即其係磺丙基陽離子交換層析管柱。
不同類型之離子交換材料，即固定相，可以不同名稱自多個公司獲得，例如陽離子交換材料Bio－Rex(例如類型70)、Chelex(例如類型100)、Macro－Prep(例如類型CM、High S、25 S)、AG(例如類型50W、MP)皆可自 BioRad實驗室獲得、WCX 2可自Ciphergen獲得、DowexMAC－3可自Dow chemical公司獲得、Mustang C及Mustang S可自Pall公司獲得、Cellulose CM(例如類型23、52)、超－D、partisphere可自Whatman plc.獲得、AmberliteIRC(例如類型76、747、748)、AmberliteGT 73、Toyopearl(例如類型SP、CM、650M)皆可自Tosoh Bioscience GmbH獲得、CM 1500及CM 3000可自BioChrom實驗室獲得、SP－SepharoseTM 、CM－SepharoseTM 可自GE Healthcare獲得、Poros樹脂可自PerSeptive Biosystems獲得、Asahipak ES(例如類型502C)、CXpak P、IEC CM(例如類型825、2825、5025、LG)、IEC SP(例如類型420N、825)、IEC QA(例如類型LG、825)可自Shoko America公司獲得、50W陽離子交換樹脂可自Eichrom Technologies公司獲得。在一實施例中陽離子交換材料係強陽離子交換材料，例如Macro－PrepHigh S或25S、或MacroCap SP、或ToyopearlSP 650M、或Source S、或SP Sepharose、或POLYCAT A。實例性陰離子交換材料係可自Dow chemical公司獲得之Dowex1、皆可自BioRad實驗室獲得之AG(例如類型1、2、4)、Bio－Rex5、DEAE Bio－Gel 1、Macro－PrepDEAE、可自Eichrom Technologies公司獲得之陰離子交換樹脂類型1、皆可自GE Healthcare獲得之Source Q、ANX Sepharose 4、DEAE Sepharose(例如類型CL－6B、FF)、Q Sepharose、Capto Q、Capto S、可自PerkinElmer獲得之AX－300、皆可自Shoko America公司獲 得之Asahipak ES－502C、AXpak WA(例如類型624、G)、IEC DEAE、皆可自Tosoh Bioscience GmbH獲得之AmberliteIRA－96、ToyopearlDEAE、TSK凝膠DEAE、可自Pall公司獲得之Mustang Q。
本申請案中所用術語「沖洗」表示用兩個或更多個柱體積之指定溶液洗滌管柱。
術語「相同類型之陽離子交換材料」表示所實施兩個連續離子交換層析步驟中採用相同陽離子交換材料。此意指連續陽離子交換層析步驟之實施係在第一陽離子交換層析步驟中使用陽離子交換材料之第一部分，且在第二陽離子交換層析中使用相同陽離子交換材料之第二部分，或在兩個陽離子交換層析步驟中使用相同陽離子交換材料。
術語「步驟洗脫」及「步驟洗脫法」在此申請案中可互換使用，其表示其中(例如)可導致洗脫(即自材料溶解出經結合化合物)之物質濃度立刻升高或降低(即自一數值/濃度直接變為下一數值/濃度)之方法。在此「步驟洗脫」中，一或多種條件(例如pH、離子強度、鹽濃度、及/或層析流量)皆自第一(例如起始)數值立刻變為第二(例如最終)數值，即條件發生與線性改變相反之遞增式改變(即逐步改變)。在「步驟洗脫法」中於每次離子強度增加後收集新流份。此流份含有伴隨相應離子強度增強自離子交換材料回收之化合物。在每次增強後皆使條件維持至洗脫法中之下一步驟。
在此申請案中術語「連續洗脫」及「連續洗脫法」可互 換使用，其表示其中(例如)可導致洗脫(即自材料溶解出經結合化合物)之物質濃度以連續方式升高或降低(即濃度係藉由一系列小步驟來改變，每個小步驟之改變不大於導致洗脫之物質濃度之2%，較佳1%)之方法。在此「連續洗脫」中一或多種條件(例如pH、離子強度、鹽濃度、及/或層析流量)可以線性方式或指數方式或漸近方式來改變。改變較佳係線性。
用於此申請案中之術語「施加至」及其語法上等效之表述表示純化方法之部分步驟，其中使含有(例如)欲純化目標物質之溶液與固定相接觸。此表示a)將溶液添加至固定相已經定位之層析裝置中，或b)將固定相添加至溶液中。在a)情況下，含有(例如)欲純化目標物質之溶液流經固定相，使得固定相與溶液中物質之間可發生交互作用。端視諸如pH、電導率、鹽濃度、溫度、及/或流速等條件，溶液中之某些物質與固定相結合且由此自溶液中移除。其他物質保留於溶液中或自固定相解吸附。可在流出物中發現溶液中之物質。「流出物」表示流經層析裝置後所獲得之溶液，其可為含有目標物質之所施加溶液，或用於沖洗管柱或導致與固定相結合之一或多種物質洗脫之緩衝液。在一實施例中，層析器件係管柱或卡匣。在純化步驟後可藉由熟習此項技術者熟知之方法自溶液回收目標物質，例如沈澱、鹽析、超濾、滲濾、凍乾、親和層析、或減少溶劑體積以獲得呈基本均勻形式之目標物質。在b)情況下，(例如)以固體形式將固定相添加至含有(例如)欲純化目標物質 之溶液中，此使得固定相與溶液中之物質之間可發生交互作用。在交互作用後(例如)藉由過濾移除固定相，其中(例如)目標物質與固定相結合並藉此自溶液移除，或未與固定相結合並保留於溶液中。
用於此申請案中之術語「在適宜結合條件下」及其語法上等效之表述表示目標物質(例如聚乙二醇化紅血球生成素)在與固定相(例如離子交換材料)接觸時與固定相結合。此不必表示目標物質之100%與固定相結合，但基本上目標物質之100%與固定相結合，即目標物質之至少50%與固定相結合，目標物質較佳至少75%與固定相結合，目標物質較佳至少85%與固定相結合，或目標物質更佳95%以上與固定相結合。
此申請案中所用術語「經緩衝」表示其中因添加或釋放酸性或鹼性物質所引起之pH變化可由緩衝物質來平衡之溶液。可使用導致此一效應之任一緩衝物質。在一實施例中，使用醫藥上可接受之緩衝物質，例如磷酸或其鹽、乙酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、嗎啉、2－(N－嗎啉基)乙烷磺酸或其鹽、組胺酸或其鹽、甘胺酸或其鹽、或三(羥甲基)胺基甲烷(TRIS)或其鹽。在較佳實施例中，可使用磷酸或其鹽、或乙酸或其鹽、或檸檬酸或其鹽、或組胺酸或其鹽。經緩衝溶液視需要可包含其他鹽，例如氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉、或檸檬酸鉀。
一般層析方法及其應用係為熟習此項技術者已知。參見(例如)Chromatography，第5版，部分A：Fundamentals and Techniques,Heftmann(編輯)，Elsevier Science Publishing公司1992，Chromatography，第5版，51 A 1992；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences,Deyl,Z.(編輯)，Elsevier Science BV,Amsterdam,The Netherlands,(1998)；Chromatography Today,Poole,C.F.及Poole,S.K.，Elsevier Science Publishing公司，New York,(1991)；Scopes,Protein Purification：Principles and Practice(1982)；Sambrook,J.等人(編輯)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；或Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel,F.M.等人(編輯)，John Wiley & Sons公司，New York。
紅血球生成素之聚乙二醇化通常產生不同化合物之混合物，例如多－聚乙二醇化紅血球生成素、單－聚乙二醇化紅血球生成素、非－聚乙二醇化紅血球生成素、活化PEG酯之水解產物、以及紅血球生成素自身之水解產物。為獲得呈基本均勻形式之單－聚乙二醇化紅血球生成素，必須分離該等物質且必須純化目標化合物。
因此，本發明第二態樣提供獲得呈基本上均勻形式之單－聚乙二醇化紅血球生成素之方法，該方法包含以下步驟：a)使用分子量為20 kDa至40 kDa之活化聚乙二醇化試劑來聚乙二醇化紅血球生成素， b)用兩個連續陽離子交換層析步驟來純化在步驟a)中獲得之聚乙二醇化紅血球生成素，其中第一及第二陽離子交換層析步驟採用相同類型之陽離子交換材料，c)自第二陽離子交換層析管柱回收呈基本均勻形式之單－聚乙二醇化紅血球生成素，d)藉由本發明方法使陽離子交換層析管柱再生。
此方法尤其可用於純化經聚乙二醇化之糖基化重組多肽，即其係由哺乳動物細胞產生，較佳係由CHO細胞、HEK293細胞、BHK細胞、Per.C6細胞、或HeLa細胞產生，且之後以化學方法經聚乙二醇化。在一實施例中，陽離子交換層析管柱之再生包含以下步驟：－用包含氯化鈉之緩衝水溶液自陽離子交換管柱去除經結合多肽，－用淨化水沖洗管柱，較佳經至少兩個柱體積沖洗，－將氫氧化鈉溶液施加至管柱中，較佳施加至少兩個柱體積，－用淨化水沖洗管柱，較佳經至少兩個柱體積沖洗，－將包含磷酸二氫鈉及磷酸之溶液施加至管柱中，較佳施加至少三個柱體積，－用淨化水沖洗管柱，較佳經至少兩個柱體積沖洗，－在至少4小時、較佳4小時內將0.5 M氫氧化鈉溶液施加至管柱中，且－藉由用淨化水沖洗管柱使陽離子交換管柱再生，較佳經至少兩個柱體積沖洗。
在方法之第一步驟中使紅血球生成素聚乙二醇化。用於聚乙二醇化反應中之聚(乙二醇)(PEG)聚合物分子之分子量為約20 kDa至40 kDa(用於本文中之「分子量」應理解為PEG之平均分子量，因為所獲得呈聚合化合物形式之PEG不具有確定分子量而事實上具有分子量分佈；術語「約」意指在該等PEG製劑中，某些分子之分子量可大於或稍低於所述分子量，即術語「約」係指其中95% PEG分子之分子量在所述分子量之＋/－ 10%範圍內之分子量分佈。舉例而言，30 kDa之分子量表示自27 kDa至33 kDa。)
術語「紅血球生成素」係指具有序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2之蛋白質，或其實質上同源之蛋白質或多肽，其生物學特性與刺激紅血球產生及刺激骨髓中定型紅系祖細胞之分裂與分化相關。重組紅血球生成素可藉由重組DNA技術或藉由內源基因活化經由在真核細胞(例如CHO細胞、或BHK細胞、或HeLa細胞)中表現來製備，即紅血球生成素糖蛋白係藉由內源基因活化來表現，參見(例如)美國專利第5,733,761號、美國專利第5,641,670號、美國專利第5,733,746號、WO 93/09222、WO 94/12650、WO 95/31560、WO 90/11354、WO 91/06667、及WO 91/09955。在一實施例中，本發明紅血球生成素係基於人EPO之序列。在較佳實施例中，人紅血球生成素具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中所列之胺基酸序列，人紅血球生成素更佳具有SEQ ID NO：1中所列之胺基酸序列。術語「紅血球生成素」亦表示SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2蛋 白質之變體，其中一或多個胺基酸殘基經改變、刪除、或插入，且其具有與未經修飾蛋白質相同之生物學活性，例如歐洲專利第1 064 951號或美國專利第6,583,272號所報導。變體可具有人紅血球生成素之胺基酸序列，其具有1至6個額外糖基化位點。聚乙二醇化紅血球生成素之具體活性可藉由業內已知之各種分析方法來測定。本發明經純化聚乙二醇化紅血球生成素之生物學活性使得藉由注射將該蛋白質投與人類患者可導致與個體之未經注射或對照組相比，骨髓細胞中網織紅血球及紅血球之產量增加。根據本發明獲得並純化之聚乙二醇化紅血球生成素之生物學活性可藉由Pharmeuropa Spec.Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97－2(1997)31－48中之方法來測試。
本發明之「PEG」或「PEG基團」意指含有聚(乙二醇)作為主要部分之殘基。此一PEG可另外含有結合反應必須之化學基團，其係得自分子之化學合成，或其為分子各部分間達成最佳距離之間隔體。該等其他化學基團並不用於計算PEG聚合物分子之分子量。此外，此一PEG可由連接至一起之一或多個PEG側鏈組成。具有一個以上PEG鏈之PEG稱為多臂或具分支PEG。具分支PEG可藉由(例如)將聚氧化乙烯添加至各種多元醇(包括甘油、異戊四醇、及山梨醇)中來製備。具分支PEG闡述於(例如)歐洲專利第0 473 084號、美國專利第5,932,462號中。在一實施例中使用直鏈PEG分子作為分子量為20－35 kDa之PEG，且在另一實施例中使用具分支PEG作為分子量超過35 kDa(尤其為40 kDa)之PEG聚合物。尤佳使用二臂PEG作為PEG 40 kDa。
術語「聚乙二醇化」意指聚(乙二醇)殘基共價鍵結於多肽之N末端及/或內部離胺酸殘基上。蛋白質之聚乙二醇化在業內廣泛為人所知，且由(例如)Veronese,F.M.綜述於Biomaterials 22(2001)405－417中。可使用不同官能團及具有不同分子量之聚(乙二醇)、直鏈及具支鏈PEG以及不同連接基團來連接PEG(亦參見Francis,G.E.等人，Int.J.Hematol.68(1998)1－18；Delgado,C.等人，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Systems 9(1992)249－304)。如(例如)WO 00/44785中所述，紅血球生成素之聚乙二醇化可在水性溶液中用聚乙二醇化試劑來實施，在一實施例中係使用分子量介於5 kDa與40 kDa之間之經NHS活化之直鏈或具支鏈PEG分子來實施。根據Lu,Y.等人，Reactive Polymers 22(1994)221－229，聚乙二醇化亦可在固相中實施。無獨有偶，N末端聚乙二醇化多肽亦可根據WO 94/01451來製造。
該等方法產生在離胺酸殘基之一或多個ε－胺基處及/或在N末端胺基處聚乙二醇化之紅血球生成素。在N末端胺基酸處之選擇性聚乙二醇化可根據Felix,A.M.等人，ACS Symp.Ser.680(Poly(ethylene glycol))(1997)218－238來實施。選擇性N末端聚乙二醇化可在固相合成期間藉由偶合Nα －聚乙二醇化胺基酸衍生物與肽鏈之N－1末端胺基酸來達成。側鏈聚乙二醇化可在固相合成期間藉由偶合Nε －聚乙二醇化離胺酸衍生物與生長鏈來實施。組合N末端及側鏈 聚乙二醇化可如上文所述在固相合成期間實施，或藉由固相合成經由將活化PEG試劑施加至胺基去保護之肽來實施。
適宜PEG衍生物係經活化PEG分子，其平均分子量在一實施例中為約5至約40 kDa，在較佳實施例中為約20至約40 kDa，且在更佳實施例中為約30 kDa至約35 kDa。PEG衍生物可為直鏈或具支鏈PEG。適用於製備PEG－蛋白質及PEG－肽偶合物之衆多種PEG衍生物可自Shearwater Polymers(Huntsville,AL,U.S.A.；www.nektar.com)獲得。
活化PEG衍生物係為業內所知且闡述於(例如)關於PEG－乙烯基碸之Morpurgo,M.等人，J.Bioconjug.Chem.7(1996)363－368中。直鏈及具支鏈鏈PEG物質適用於製備聚乙二醇化片段。反應性PEG試劑之實例係碘－乙醯基－甲氧基－PEG、或甲氧基PEG－乙烯基碸(在一實施例中m係約450至約900之整數且R係具有一至六個碳原子之直鏈或具支鏈低碳烷基，例如甲基、乙基、異丙基等，其中甲基較佳)：
該等碘－活化物質之應用係為業內已知且由(例如)Hermanson,G.T.闡述於Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996)，第147－148頁中。
在一實施例中，PEG物質係活化PEG酯，例如N－羥基琥珀醯亞胺基丙酸酯、或N－羥基琥珀醯亞胺基丁酸酯、或諸如PEG－NHS等N－羥基琥珀醯亞胺(Monfardini,C.等人，Bioconjugate Chem.6(1995)62－69)。在一實施例中，PEG係由N－羥基琥珀醯亞胺酯活化 其中使用烷氧基－PEG－N－羥基琥珀醯亞胺，例如甲氧基PEG－N－羥基琥珀醯亞胺(MW 30000；Shearwater Polymers公司)，其中R及m係如上文所定義。在一實施例中，PEG物質係甲氧基聚(乙二醇)－丁酸之N－羥基琥珀醯亞胺基酯。術語「烷氧基」係指烷基醚基團，其中術語「烷基」意指最多含有四個碳原子之直鏈或具支鏈烷基，例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基及諸如此類，甲氧基較佳。
此申請案中所用術語「基本均勻形式」表示所獲得、所含有、或所用聚乙二醇化紅血球生成素係彼等具有界定數量所連接PEG基團者。在一實施例中，聚乙二醇化紅血球生成素係單－聚乙二醇化紅血球生成素。製劑可含有未反應(即缺少PEG基團)之紅血球生成素、多－聚乙二醇化紅血 球生成素、以及在聚乙二醇化反應期間所生成多肽之片段。術語「基本均勻形式」表示單－聚乙二醇化紅血球生成素之製劑含有至少50%(w/w)之單－聚乙二醇化紅血球生成素、至少75%之單－聚乙二醇化紅血球生成素、至少90%之單－聚乙二醇化紅血球生成素、或95%以上之單－聚乙二醇化紅血球生成素。百分比值係基於獲得單－聚乙二醇化紅血球生成素之陽離子交換層析之相應層析圖的面積－%。
本發明報告純化單－聚乙二醇化紅血球生成素以獲得單－聚乙二醇化紅血球生成素之基本均勻形式之方法。人們驚訝地發現，皆使用相同類型陽離子交換材料之兩個連續陽離子交換層析步驟之組合可提供單－聚乙二醇化紅血球生成素之基本均勻形式。因此本發明提供純化單－聚乙二醇化紅血球生成素之方法，其包含以下步驟：提供包含單－、多－、及非－聚乙二醇化紅血球生成素之溶液，實施兩個連續陽離子交換層析步驟、在第二陽離子交換層析步驟中回收經純化單－聚乙二醇化紅血球生成素，其中在兩個陽離子交換層析步驟中使用相同類型之陽離子交換材料，及藉由本發明第一態樣中之方法使陽離子交換層析管柱再生。
在第二陽離子交換層析步驟中經純化單－聚乙二醇化紅血球生成素之回收係藉由自第二陽離子交換層析材料洗脫單－聚乙二醇化紅血球生成素來達成。在本發明方法之一實施例中，所用洗脫方法中之兩個陽離子交換層析步驟各不相同。在此實施例中，第一陽離子交換層析步驟係根據 步驟洗脫法來實施，即所用緩衝液之離子強度係自一離子強度值逐步(即立刻)增加至下一離子強度值。在一實施例中，步驟洗脫法係根據三步洗脫法來實施。在第一步驟中，主要自陽離子交換層析管柱洗脫出多－聚乙二醇化紅血球生成素。離子強度之第二次增強主要洗脫出單－聚乙二醇化紅血球生成素，以對應尺寸排除層析圖之面積計(面積－%)，其純度大於60%。離子強度之第三次增強主要自管柱洗脫出殘留非－聚乙二醇化紅血球生成素。
在一實施例中，第二陽離子交換層析步驟係根據連續洗脫法來實施，即緩衝液之離子強度係以連續方式來增強。合併含有單－聚乙二醇化紅血球生成素之經洗脫流份以獲得呈基本均勻形式之單－聚乙二醇化紅血球生成素，在一實施例中以對應層析圖之面積計，其含有小於0.5%之低分子量形式。在一實施例中，緩衝液之濃度為10 mM至250 mM，較佳為50 mM至150 mM，更佳為約100 mM。
因此，在本發明方法中，兩個連續陽離子交換層析步驟係指以下步驟：a)在適用於使該單－聚乙二醇化紅血球生成素與第一陽離子交換層析管柱中所含陽離子交換材料結合之條件下，將包含單－、多－、及非－聚乙二醇化紅血球生成素之混合物之緩衝水溶液施加至該第一管柱中，b)藉由步驟洗脫法經由逐步增加流經緩衝液之離子強度自第一陽離子交換層析管柱回收單－聚乙二醇化紅血球生成素，其中與步驟a)中所施加之混合物相比，該 單－聚乙二醇化紅血球生成素之相對含量增加，c)在適用於使所回收單－聚乙二醇化紅血球生成素與第二陽離子交換層析管柱中所含陽離子交換材料結合之條件下，將來自步驟b)之該紅血球生成素施加至該第二管柱中，其中該第二管柱中所含陽離子交換材料與第一管柱中之陽離子交換材料係同一類型，d)藉由連續洗脫方法經由連續增加該流經緩衝液之離子強度自該第二陽離子交換層析管柱回收呈基本均勻形式之該經純化單－聚乙二醇化紅血球生成素。
多肽之聚乙二醇化通常不提供呈均勻形式之聚乙二醇化產物。此外可以單－聚乙二醇化、多－聚乙二醇化及非－聚乙二醇化產物之混合物形式獲得目標產物。因此方法之步驟a)中所施加聚乙二醇化紅血球生成素之溶液係存於水性緩衝液中之單－、多－、及非－聚乙二醇化紅血球生成素與低分子量形式或片段之混合物。不同物質之相對含量係藉由尺寸排除層析(SE－HPLC)來測定。在尺寸排除層析圖中相關峰之面積總和(即峰下面積)係尺寸排除層析圖之總面積。單個峰之百分比表示為面積－%，即表示為層析圖總面積之相對面積百分比。
一般層析法、其應用及相關術語已為熟習此項技術者所熟知。參見(例如)Chromatography，第5版，部分A：Fundamentals and Techniques,Heftmann(編輯)，Elsevier Science Publishing公司，Chromatography，第5版，51 A(1992)及其它相關文獻。在層析期間，緩衝液流經陽離子 交換層析管柱。根據層析方法步驟之需要來調整此「流經緩衝液」。其將目標物質輸送至(施加)層析材料及自層析材料輸送出(洗脫)目標物質。
在第一陽離子交換層析步驟中，以約1 mg/ml之蛋白質濃度將單－聚乙二醇化、多－聚乙二醇化、及非－聚乙二醇化紅血球生成素施加至存於經約100 mM磷酸鉀緩衝且pH為約3.0之水溶液中之第一陽離子交換層析管柱中。此申請案中所用術語「約」表示給定數值左右10%之範圍，即±10%。在施加之前或之後用相同緩衝溶液洗滌第一管柱。在步驟洗脫法之第一步驟中，使緩衝液變為具有約100 mM磷酸鉀、約90 mM氯化鈉且pH為約3.0之緩衝液。用此緩衝液自陽離子交換層析管柱洗脫出經水解PEG試劑(即對應聚乙二醇化碳酸)、未反應偶合劑、及多－聚乙二醇化紅血球生成素。在三步洗脫法之第二步驟中，使緩衝液變為具有約100 mM磷酸鉀、約250 mM氯化鈉且pH為約3.0之緩衝液。在此步驟中，自第一陽離子交換層析管柱回收單－聚乙二醇化紅血球生成素。用淨化水將此洗脫步驟中所收集流經緩衝液稀釋至約1：5至1：8。在第一陽離子交換層析步驟後，所回收單－聚乙二醇化紅血球生成素中不含游離PEG。
第一陽離子交換層析之第二步驟中所收集之流經緩衝液含有增高相對含量之單－聚乙二醇化紅血球生成素，即與實施第一陽離子交換層析步驟之前相比，以重量或以面積－%計之單－聚乙二醇化紅血球生成素之百分比(在第二步 驟所收集流經緩衝液之尺寸排除層析之層析圖中)升高。在一實施例中，單－聚乙二醇化紅血球生成素之相對含量為至少60面積－%。在較佳實施例中，單－聚乙二醇化紅血球生成素之相對含量為至少80面積－%。
為進行單－聚乙二醇化紅血球生成素之進一步純化，實施第二陽離子交換層析步驟。在第二陽離子交換層析中，將第二洗脫步驟中所收集且經稀釋之流經緩衝液調整至磷酸鉀濃度為約100 mM且pH為約pH 3.0，且將其施加至與第一陽離子交換層析管柱含有相同類型陽離子交換材料之第二陽離子交換層析管柱中。在一實施例中，第二陽離子交換管柱及其中所含陽離子交換材料與第一陽離子交換層析步驟中相同。藉由施加線性梯度自第二陽離子交換層析管柱回收單－聚乙二醇化紅血球生成素，該梯度起始於濃度為約100 mM並具有約50 mM氯化鈉且pH為約3.0之磷酸鉀緩衝液，且終止於濃度為約100 mM並具有約500 mM氯化鈉且pH為約3.0之磷酸鉀緩衝液。在十個管柱體積內，氯化鈉濃度呈線性變化。對流經緩衝液實施分級分離且將每一流份用1 M磷酸氫二鉀稀釋以使pH值提高至約pH 6至8。
在第二陽離子交換層析步驟後獲得呈基本均勻形式之單－聚乙二醇化紅血球生成素，其純度較佳為至少95面積－%。
熟習此項技術者熟知離子交換層析技術。在與陽離子交換材料結合之多肽之回收步驟中，增強流經離子交換管柱之緩衝液/溶液之離子強度(即電導率)。此可藉由提高緩衝液鹽濃度或藉由將其他鹽類(所謂洗脫鹽)添加至緩衝溶液 中來達成。端視洗脫方法，可藉由逐次添加濃縮緩衝液或洗脫鹽溶液來立刻(步驟洗脫法)或以連續方式(連續洗脫法)提高緩衝液/鹽濃度。在一實施例中，洗脫鹽係檸檬酸鈉、氯化鈉、硫酸鈉、磷酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、磷酸鉀、或檸檬酸或磷酸之其他鹽、或該等組份之任一混合物。在較佳實施例中，洗脫鹽係檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、或其混合物。
在當前方法之一實施例中，陽離子交換材料係強陽離子交換材料，在較佳實施例中為ToyopearlSP 650 M，在另一較佳實施例中為磺丙基陽離子交換材料。導致洗脫之鹽濃度在一實施例中為5 mM至500 mM，在較佳實施例中為5 mM至400 mM，且在尤佳實施例中為5 mM至250 mM。在本發明另一實施例中，導致洗脫之鹽同時用作緩衝物質，例如檸檬酸或其鹽或磷酸或其鹽。
單－聚乙二醇化紅血球生成素可用於醫藥組合物中，該組合物適用於以醫藥上可接受之載劑或媒劑藉由業內已知方法來注射。舉例而言，適宜組合物已闡述於WO 97/09996、WO 97/40850、WO 98/58660、及WO 99/07401中。調配本發明產物之醫藥上可接受之較佳載劑係人血清白蛋白、人血漿蛋白等。可將本發明化合物調配於pH為7且含有滲透性調節劑(例如132 mM氯化鈉)之10 mM磷酸鈉/鉀緩衝液中。醫藥組合物視需要可含有防腐劑。醫藥組合物可含有不同量之單－聚乙二醇化紅血球生成素，例如10－1000 μg/ml、例如50 μg或400 μg。
本發明紅血球生成素糖蛋白產物之投與導致人類中紅血球形成。因此，投與單－聚乙二醇化紅血球生成素糖蛋白產物可補充此對於紅血球產生具有重要作用之紅血球生成素蛋白。可以有效濃度調配含有單－聚乙二醇化紅血球生成素糖蛋白產物之醫藥組合物以供藉由各種方式投與經歷血液病症之人類患者，該等血液病症之特徵為紅血球產量低或紅血球生成缺陷，其係單獨存在或作為部分病況或疾病而存在。可藉由注射投與醫藥組合物，例如皮下或靜脈內注射。單－聚乙二醇化紅血球生成素糖蛋白產物之平均量可變。偶合物之確切量主要取決於以下因素：所治療病況之確切類型、所治療患者之情況、以及組合物中之其他成份。舉例而言，可(例如)每周一次以0.01－10 μg/kg體重、較佳0.1－1 μg/kg體重來投與。
人們已驚訝地發現，可使用本發明方法來使陽離子交換層析管柱再生且分離效能未顯著下降。已顯示藉助本發明再生方法，陽離子交換層析管柱可使用至少40個分離循環，在一實施例中可使用至少50個分離循環，在另一實施例中可使用至少60個分離循環，且分離效能(參見圖1)及產率(參見圖2)未顯著降低。本申請案中所用術語「分離循環」表示以下序列：i)平衡管柱，ii)將待分離溶液施加至管柱上，iii)洗滌管柱，iv)自管柱回收所吸附化合物，v)洗滌管柱，vi)使管柱再生。亦已發現，藉助本發明再生方法不僅可避免分離效能降低，亦可防止裝載容量降低(參見圖2)。
本申請案中所用術語「分離效能」表示陽離子交換層析管柱分離溶液中化合物之能力。本申請案中所用術語「未顯著降低」表示在含有相同化合物之溶液之連續層析中，陽離子交換層析管柱提供相同(即變化在＋/－ 5%內，在一實施例中變化在＋/－ 2.5%內)化合物分離。本申請案中所用術語「裝載容量」表示自陽離子交換層析管柱回收之目標化合物之量。
提供以下實例、所列序列及圖以幫助理解本發明，本發明之真實範圍展示於隨附專利申請範圍中。應瞭解，可在不偏離本發明精神之條件下對所列程序實施多種修改。
材料及方法
SE－HPLC
SE－HPLC根據蛋白質之表觀分子量來將其分離。因此，此方法能檢測單－聚乙二醇化紅血球生成素、低分子量形式及片段、多－聚乙二醇化形式及紅血球生成素較大聚集體之存在。HPLC配備有220－nm檢測器及Superose 6 HR管柱(尺寸為10x300 mm，Pharmacia Biotech，Cat－Nr：17－0537－01)或Superose 6 10/300 GL管柱(Pharmacia Biotech,Cat－Nr：17－5172－01)。管柱係在等強度條件及室溫下使用約0.4 ml/min之流速作業。流動相緩衝液係具有300 mM氯化鈉且pH為6.8之50 mM磷酸鈉緩衝液。端視所用HPLC－系統，可以100 μL或500 μL之樣品施加體積來實施方法。用流動相緩衝液將樣品稀釋至蛋白質濃度為約0.5 mg/mL(100 μL裝載)或0.1 mg/mL(500 μL裝載)。蛋白質濃度低於 0.1 mg/mL之樣品可不加稀釋即使用。在220 nm之檢測器波長下檢測經洗脫蛋白質。
RP－HPLC：
純度係藉由RP－HPLC來分析，其自寡聚形式及相關物質分離單－聚乙二醇化紅血球生成素。分析係在Poroshell管柱上使用乙腈/水性TFA梯度來實施。以220 nm處之UV吸收來監測洗脫曲線。單－聚乙二醇化紅血球生成素及相關物質或寡聚形式之百分比係基於所洗脫蛋白質之總峰面積來計算。
實例1
單－聚乙二醇化紅血球生成素之純化
紅血球生成素可根據(例如)WO 01/87329來製造，且根據WO 96/135718中所述來純化。聚乙二醇化紅血球生成素可根據(例如)WO 03/029291來製造。
a)在SP Toyopearl 650 M上之第一層析
第一層析步驟係在填充有SP Toyopearl650M之磺丙基(SP)管柱上實施。管柱係在RT下作業。第一管柱之最大裝載容量限定為1.5 g蛋白質/升管柱體積(CV)。用pH為2.9至3.1之100 mM磷酸鉀緩衝液(SP－A緩衝液)來平衡管柱。裝載步驟後，用一系列含有漸增含量NaCl之磷酸鉀緩衝液洗滌並洗脫管柱。去除流出物中之游離聚乙二醇化碳酸(即經水解PEG試劑)及多－聚乙二醇化形式，且隨後分別用SP－A緩衝液及pH為2.9至3.1且含有90 mM氯化鈉之100 mM磷酸鉀緩衝液(SP－B緩衝液)實施洗滌步驟。藉由施加pH為2.9 至3.1且含有250 mM氯化鈉之100 mM磷酸鉀緩衝液(SP－C緩衝液)來洗脫單－聚乙二醇化紅血球生成素，將其收集於容器中且用淨化水直接以1：5稀釋。所收集該洗脫液稱為「SP洗脫液混合物I」。隨後用pH為2.9至3.1且含有750 mM氯化鈉之100 mM磷酸鉀緩衝液(SP－D緩衝液)洗滌管柱以去除未反應紅血球生成素且使管柱再生。
b)在SP Toyopearl 650 M上之第二層析
第二管柱係在RT下作業。在用SP－A緩衝液平衡後，將SP洗脫液混合物I施加至管柱且之後用SP－A緩衝液洗滌管柱。在經pH為2.9至3.1之100 mM磷酸鉀緩衝液緩衝之十個管柱體積內，藉由施加斜率為50至500 mM氯化鈉之線性梯度來洗脫單－聚乙二醇化紅血球生成素。在最多8個單獨流份中分級分離產物峰且用1 M磷酸氫二鉀直接稀釋每個流份以使pH提高至6至8。在單－聚乙二醇化紅血球生成素之洗脫完成後，可增加梯度之斜率，此使得需要立即用pH為2.9至3.1且含有500 mM氯化鈉之100 mM磷酸鉀洗滌管柱。
c)SP Toyopearl 650 M管柱之再生
在一系列七個步驟中使兩個管柱之樹脂再生。用淨化水沖洗管柱，之後用0.5 M氫氧化鈉溶液沖洗。用淨化水置換鹼性溶液，之後實施酸洗滌(0.5 M磷酸二氫鈉、1 M磷酸)。在另一淨化水步驟後，在4小時內用0.5 M氫氧化鈉對管柱實施去熱原化。在苛性再生後，再次用淨化水洗滌管柱。淨化水(PW III)係藉由超濾來製造。PW III之品質 與美國藥典中之注射用水相當。根據Ph.Eur.及USP來實施測試。在根據上文所述第一層析步驟實施控制實驗期間，在各流經緩衝液中未檢測到殘留蛋白質或PEG部分。在60次循環後，樹脂之SDS－PAGE分析顯示在凝膠上不含有殘留蛋白質或PEG部分。基於該等數據，可不考慮殘留蛋白質及PEG部分之批次間遺留，且因此管柱之再生效率極高(亦參見圖1)。據測定，每次層析中所獲得產率未顯示下降(亦參見圖2)。
如圖1及2中所示，在所有循環之第一層析步驟中單－聚乙二醇化紅血球生成素在流經緩衝液中之純度及產率明顯在至少80%純度及至少35%產率範圍內。此外，在管柱之壽命期間未觀察到單－聚乙二醇化紅血球生成素純度之趨勢。
圖1 在再生方法之多次驗證循環期間在第一層析之流經緩衝液混合物中單－聚乙二醇化紅血球生成素之純度。
圖2 在再生方法之多次驗證循環期間在第一層析之流經緩衝液混合物中單－聚乙二醇化紅血球生成素之產率。
<110> 端士商赫孚孟拉羅股份公司<120> 層析方法<130> 24383 FT <140> 097126981 <141> 2008－07－16 <150> EP 07013960.5 <151> 2007－07－17 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> 智人<400> 1 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> 智人<400> 2
(無元件符號說明)

Claims (10)

  1. 一種在洗脫目標化合物後使陽離子交換層析管柱再生之方法，其包含以下順序之下列步驟：－用包含濃度至少500 mM之氯化鈉之緩衝水溶液自該管柱洗脫所吸附多肽，－用淨化水沖洗該管柱，－將0.5 M氫氧化鈉溶液施加至該管柱中，－用淨化水沖洗該管柱，－將包含0.5 M磷酸二氫鈉及1 M磷酸之溶液施加至該管柱中，－用淨化水沖洗該管柱，－在至少4小時內將0.5 M氫氧化鈉溶液施加至該管柱中，及－藉由用淨化水沖洗該陽離子交換層析管柱來使該管柱再生。
  2. 一種獲得呈基本均勻形式之單－聚乙二醇化紅血球生成素之方法，其包含以下步驟：a)使用分子量為20 kDa至40 kDa之活化聚乙二醇化試劑來聚乙二醇化紅血球生成素，b)用兩個連續陽離子交換層析步驟來純化該在步驟a)中獲得之聚乙二醇化紅血球生成素，其中該第一及第二陽離子交換層析步驟採用相同類型之陽離子交換材料，c)自該第二陽離子交換層析管柱回收呈基本均勻形式之 該單－聚乙二醇化紅血球生成素，d)藉由為以下順序之下列步驟使該陽離子交換層析管柱再生：i)用包含氯化鈉之緩衝水溶液自該陽離子交換管柱去除所結合多肽，ii)用淨化水沖洗該管柱，iii)將氫氧化鈉溶液施加至該管柱中，iv)用淨化水沖洗該管柱，v)將包含磷酸二氫鈉及磷酸之溶液施加至該管柱中，vi)用淨化水沖洗該管柱，vii)在至少4小時內將0.5 M氫氧化鈉溶液施加至該管柱中，且viii)藉由用淨化水沖洗該陽離子交換層析管柱來使該管柱再生。
  3. 如請求項1或2之方法，其特徵在於該陽離子交換層析管柱係強陽離子交換層析管柱。
  4. 如請求項3之方法，其特徵在於該陽離子交換層析管柱係磺丙基陽離子交換層析管柱。
  5. 如請求項1或2之方法，其特徵在於該緩衝液係磷酸或其鹽、或乙酸或其鹽、或檸檬酸或其鹽、或組胺酸或其鹽。
  6. 如請求項2之方法，其特徵在於該紅血球生成素係具有SEQ ID NO：1或2之胺基酸序列之人紅血球生成素。
  7. 如請求項2或6之方法，其特徵在於該PEG具有20－35 kDa 之分子量且為直鏈。
  8. 如請求項2或6之方法，其特徵在於該PEG具有40 kDa之分子量且具支鏈。
  9. 如請求項2或6之方法，其特徵在於該第一陽離子交換層析步驟係以步驟洗脫來實施，且該第二陽離子交換層析步驟係以線性洗脫來實施。
  10. 如請求項1或2之方法，其特徵在於該陽離子交換層析管柱可用於至少40次分離循環中。
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