KR20100037145A - 크로마토그래피 방법 - Google Patents

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KR20100037145A
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Abstract

본 발명은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 재생 방법을 포함한다.

Description

크로마토그래피 방법{CHROMATOGRAPHIC METHODS}
본 발명은 폴리펩티드, 특히 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)-결합된(PEGylated) 에리쓰로포이에틴(erythropoietin)의 정제에 유용한 크로마토그래피 분리 방법에 관한 것이다.
단백질은 오늘날 의학 포트폴리오에서 중요한 역할을 수행한다. 모든 치료 단백질이 인간에서 사용되기 위해서는 명확한 기준을 충족시켜야 한다. 인간에 사용되는 생물약제의 안전성을 보장하기 위해, 특히 제조 과정 동안 축적되는 부산물이 제거되어야 한다. 규제 요건을 충족시키기 위해, 제조 과정 이후에 하나 이상의 정제 단계가 수행되어야 한다. 특히, 순도, 처리량 및 수율은 적절한 정제 방법을 결정하는 데 있어서 중요한 역할을 수행한다.
다양한 단백질 정제 방법, 예컨대, 미생물 단백질을 사용하는 친화성 크로마토그래피(예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피), 이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, 양이온 교환(설포프로필 또는 카복시메틸 수지), 음이온 교환(아미노 에틸 수지) 및 혼합 모드 이온 교환), 티오친화성 흡착(예를 들어, 베타-머캡토에탄올 및 다른 SH 리간드를 사용하는 흡착), 소수성 상호작용 또는 방향족 흡착 크로마토그래피(예를 들어, 페닐-세파로스, 아자-아레노친화성 수지 또는 m-아미노페닐보론산을 사용하는 크로마토그래피), 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피(예를 들어, Ni(II)-친화성 및 Cu(II)-친화성 물질을 사용하는 크로마토그래피), 크기 배제 크로마토그래피 및 전기영동 방법(예컨대, 겔 전기영동, 모세관 전기영동)이 잘 공지되어 있고 널리 이용되고 있다(Vijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102).
예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 인터루킨-6(유럽 특허 제0 442 724호), PEG와 에리쓰로포이에틴(국제특허출원 공개 제WO 01/02017호), 엔도스타틴 및 면역글로불린을 포함하는 키메라 분자(미국 특허출원 공개 제2005/008649호), 분비된 항체 기재 융합 단백질(미국 특허출원 공개 제2002/147311호), 알부민을 포함하는 융합 폴리펩티드(미국 특허출원 공개 제2005/0100991호; 인간 혈청 알부민의 경우 미국 특허 제5,876,969호), PEG-결합된 폴리펩티드(미국 특허출원 공개 제2005/0114037호) 및 인터페론 융합체에 대해 접합이 보고되어 있다.
문헌(Necina, R., et al., Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698)에는 높은 전하 밀도를 나타내는 이온 교환 배지를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 인간 단일클론 항체를 직접 포획하는 방법이 기재되어 있다. 국제특허출원 공개 제WO 89/05157호에는 세포 배양 배지를 직접 양이온 교환 처리하여 면역글로불린 생성물을 정제하는 방법이 기재되어 있다. 문헌(Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988), 79-88)에는 마우스 복수(ascite)로부터 단일클론 IgG 항체를 1-단계 분리하는 방법이 기재되어 있다. 폴리펩티드를 이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 방법은 국제특허출원 공개 제WO 2004/024866호에 기재되어 있는데, 상기 방법에서 구배 세척을 이용하여 1종 이상의 오염물질로부터 원하는 폴리펩티드를 분리한다. 유럽 특허 제0 530 447호에는 3개의 크로마토그래피 단계를 병용하여 IgG 단일클론 항체를 정제하는 방법이 기재되어 있다. 문헌(Yu, G., et al., in Process Biotechnol. 42 (2007) 971-977)에는 단일 PEG-결합된 인터루킨-1 수용체 길항제의 용이한 정제가 기재되어 있다. 문헌(Wang, H., et al., Peptides 26 (2005) 1213-1218)에는 이. 콜라이(E. coli)에서 발현된 hTFF3을 2-단계 양이온 교환 크로마토그래피로 정제하는 방법이 기재되어 있다. 문헌(Yun, Q., et al., J. Biotechnol. 118 (2005) 67-74)에는 PEG-결합된 rhG-CSF를 2개의 연속적 이온-교환 크로마토그래피 단계로 정제하는 방법이 기재되어 있다.
본 발명의 한 측면은 원하는 화합물을 용출한 후 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 재생시키는 방법으로서, 하기 단계를 기재된 순서대로 포함하는 방법이다:
- 500 mM 이상의 농도로 염화나트륨을 포함하는 완충된 수용액을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 흡착된 폴리펩티드를 용출시키는 단계;
- 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱(flushing)하는 단계;
- 0.5 M의 수산화나트륨 용액을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
- 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하는 단계;
- 0.5 M의 인산이수소나트륨 및 1 M의 인산을 포함하는 용액을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
- 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하는 단계;
- 0.5 M의 수산화나트륨 용액을 4시간 이상 동안 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계; 및
- 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하여 재생시키는 단계.
[도 1]
재생 과정의 주기 수 유효화 동안 제1 크로마토그래피의 관통 유동(through flowing) 완충제 풀(pool) 중의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 순도.
[도 2]
재생 과정의 주기 수 유효화 동안 제1 크로마토그래피의 관통 유동 완충제 풀 중의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 수율.
본 발명은 원하는 화합물을 용출한 후 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 재생시키는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제1 측면으로서 포함한다:
- 염화나트륨을 포함하는 완충된 수용액을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 잔류 결합된 폴리펩티드를 제거하는 단계;
- 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하는 단계;
- 수산화나트륨 용액을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
- 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하는 단계;
- 인산이수소나트륨 및 인산을 포함하는 용액을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
- 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하는 단계;
- 0.5 M의 수산화나트륨 용액을 4시간 이상 동안 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계; 및
- 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하여 재생시키는 단계.
본원에서 사용된 용어 "정제수"는 미국 약전에 따른 주사용수를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이온 교환 물질"은 이온 교환 크로마토그래피에서 고정상(stationary phase)으로서 사용되는 공유결합된 하전된 치환기를 보유하는 부동 고분자량 매트릭스를 의미한다. 전체 전하가 중성인 경우, 비-공유결합된 반대 이온이 결합되어 있다. "이온 교환 물질"은 그의 비-공유결합된 반대 이온을 주변 용액의 유사하게 하전된 이온으로 교환하는 능력을 갖는다. "이온 교환 수지"는 그의 교환가능한 반대 이온의 전하에 따라 양이온 교환 수지 또는 음이온 교환 수지로서 지칭된다. "이온 교환 수지"는 하전된 기(치환기)의 성질에 따라 예를 들어, 양이온 교환 수지의 경우, 설폰산 수지(S), 설포프로필 수지(SP) 또는 카복시메틸 수지(CM)로서 지칭된다. "이온 교환 수지"는 하전된 기/치환기의 화학적 성질, 즉 공유결합된 하전된 치환기의 강도에 따라 강이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지로 더 분류될 수 있다. 예를 들어, 강 양이온 교환 수지는 하전된 치환기로서 설폰산 기, 바람직하게는 설포프로필 기를 갖고, 약 양이온 교환 수지는 하전된 치환기로서 카복실산 기, 바람직하게는 카복시메틸 기를 갖고, 약음이온 교환 수지는 하전된 치환기로서 다이에틸아미노에틸 기를 갖는다. 한 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 설포프로필 양이온 교환 수지를 함유한다. 즉, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 설포프로필 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이다.
다양한 종류의 이온 교환 물질, 즉 고정상이 다양한 상표명 하에 다수의 회사로부터 시판되고 있고, 그 예로는 바이오라드 레이보레이토리스(BioRad Laboratories)로부터 시판되는 양이온 교환 물질 바이오-렉스(Bio-Rex)(등록상표)(예를 들어, 타입 70), 셀렉스(Chelex)(등록상표)(예를 들어, 타입 100), 마크로-프렙(Macro-Prep)(등록상표)(예를 들어, 타입 CM, 하이 S 및 25S) 및 AG(등록상표)(예를 들어, 타입 50W, MP); 시퍼겐(Ciphergen)으로부터 시판되는 WCX 2; 다우 케미칼 컴파니로부터 시판되는 도웩스(Dowex)(등록상표) MAC-3; 팔 코포레이션(Pall Corporation)으로부터 시판되는 머스탕(Mustang) C 및 머스탕 S; 와트만 피아이씨(Whatman pic)로부터 시판되는 셀룰로스 CM(예를 들어, 타입 23 및 52), 하이퍼-D 및 파티스피어(partisphere); 도소 바이오사이언스 게엠베하(Tosoh Bioscience GmbH)로부터 시판되는 앰버라이트(Amberlite)(등록상표) IRC(예를 들어, 타입 76, 747 및 748), 앰버라이트(등록상표) GT 73, 도요펄(등록상표)(예를 들어, 타입 SP, CM 및 650 M); 바이오크롬 랩스(BioChrom Labs)로부터 시판되는 CM 1500 및 CM 3000; 지이 헬쓰케어로부터 시판되는 SP-세파로스(상표명) 및 CM-세파로스(상표명); 퍼셉티브 바이오시스템스(PerSeptive Biosystems)로부터 시판되는 포로스(Poros) 수지; 쇼코 어메리카 인코포레이티드(Shoko America Inc.)로부터 시판되는 아사히팍(Asahipak) ES(예를 들어, 타입 502C), CXpak P, IEC CM(예를 들어, 타입 825, 2825, 5025 및 LG), IEC SP(예를 들어, 타입 420N 및 825), IEC QA(예를 들어, 타입 LG 및 825); 및 에이크롬 테크놀로지스 인코포레이티드(Eichrom Technologies Inc.)로부터 시판되는 50W 양이온 교환 수지가 있다. 한 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 강 양이온 교환 물질, 예컨대, 마크로-프렙(등록상표) 하이 S 또는 25S, 마크로캡(MacroCap) SP, 도요펄(등록상표) SP 650 M, 소스 S, SP 세파로스 또는 폴리캣(POLYCAT) A이다. 예시적 음이온 교환 물질은 다우 케미칼 컴파니로부터 시판되는 도웩스(등록상표) 1; 바이오라드 레이보레이토리스로부터 시판되는 AG(등록상표)(예를 들어, 타입 1, 2 및 4), 바이오-렉스(등록상표) 5, DEAE 바이오-겔 1 및 마크로-프렙(등록상표) DEAE; 에이크롬 테크놀로지스 인코포레이티드로부터 시판되는 음이온 교환 수지 타입 1; 지이 헬쓰케어로부터 시판되는 소스 Q, ANX 세파로스 4, DEAE 세파로스(예를 들어, 타입 CL-6B 및 FF), Q 세파로스, 캡토 Q 및 캡토 S; 퍼킨엘머로부터 시판되는 AX-300; 소코 어메리카 인코포레이티드로부터 시판되는 아사히팍 ES-502C, AXpak WA(예를 들어, 타입 624 및 G) 및 IEC DEAE; 도소 바이오사이언스 게엠베하로부터 시판되는 앰버라이트(등록상표) IRA-96, 도요펄(등록상표) DEAE 및 TSKgel DEAE; 및 팔 코포레이션으로부터 시판되는 머스탕 Q이다.
본원에서 사용된 용어 "플러싱"은 2 이상의 컬럼 부피의 특정 용액을 사용하여 컬럼을 세척하는 것을 의미한다.
용어 "동일한 종류의 양이온 교환 물질"은 동일한 양이온 교환 물질을 사용하여 수행하는 2개의 연속적 이온 교환 크로마토그래피 단계를 표현한다. 이것은 연속적 양이온 교환 크로마토그래피 단계가 양이온 교환 물질의 제1 부분을 제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 사용하고 상기 양이온 교환 물질의 제2 부분을 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 사용함으로써, 또는 제1 양이온 교환 크로마토그래피 및 제2 양이온 교환 크로마토그래피에서 동일한 양이온 교환 물질을 사용함으로써 수행함을 의미한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "단계 용출" 및 "단계 용출 방법"은 예를 들어, 용출시키는 물질의 농도, 즉 소정의 물질로부터의 결합된 화합물의 해리가 한번에, 즉 한 값/수준으로부터 다음 값/수준으로 직접적으로 증가하거나 감소하는 방법을 의미한다. 이 "단계 용출"에서, 1종 이상의 조건, 예를 들어, pH, 이온 강도, 염 농도 및/또는 크로마토그래피의 유동이 제1 값, 예를 들어, 출발 값으로부터 제2 값, 예를 들어, 최종 값으로 한번에 변한다. 즉, 상기 조건은 직선형 변화와 대조적으로 점진적, 즉 단계적으로 변한다. "단계 용출 방법"에서, 이온 강도가 각각 증가한 후 새로운 분획이 모인다. 이 분획은 이온 강도가 상응하게 증가함에 따라 이온 교환 물질로부터 회수된 화합물을 함유한다. 이온 강도가 각각 증가한 후, 용출 방법에서 조건은 다음 단계까지 유지된다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "연속 용출" 및 "연속 용출 방법"은 예를 들어, 용출시키는 물질의 농도, 즉 크로마토그래피 물질로부터의 결합된/흡착된 화합물의 해리가 연속적으로 증가하거나 감소함, 즉 상기 농도가 2% 이하, 바람직하게는 1% 이하의 변화율로 순차적으로 변하는 방법을 의미한다. 이 "연속 용출"에서, 1종 이상의 조건, 예를 들어, pH, 이온 강도, 염 농도 및/또는 크로마토그래피의 유동이 직선형적으로, 기하급수적으로 또는 점근적으로 변할 수 있다. 바람직하게는, 변화는 직선형 변화이다.
본원에서 사용된 용어 "에 인가하는" 및 이와 문법적으로 동등한 용어는 예를 들어, 정제할 원하는 물질을 함유하는 용액이 고정상과 접촉하는 정제 방법의 부분적 단계를 의미한다. 이것은 a) 용액을 고정상이 위치하는 크로마토그래피 장치에 첨가하거나, b) 고정상을 용액에 첨가하는 것을 의미한다. a)의 경우, 예를 들어, 정제할 원하는 물질을 함유하는 용액은 고정상을 관통하여 상기 용액에서 상기 고정상과 상기 물질이 상호작용할 수 있게 한다. 조건, 예를 들어, pH, 전도성, 염 농도, 온도 및/또는 유속에 따라, 용액의 일부 물질은 고정상에 결합되어 용액으로부터 제거된다. 다른 물질은 용액에 잔존하거나 고정상으로부터 탈착된다. 용액에 잔존하는 물질은 관통 유동 용액에서 발견될 수 있다. "관통 유동 용액"은 크로마토그래피 장치의 관통 후 수득된 용액을 의미하며, 상기 용액은 원하는 물질을 함유하는 인가된 용액이거나, 또는 컬럼을 플러싱하는 데 사용되거나 고정상에 결합된 1종 이상의 물질을 용출시키는 데 사용된 완충제일 수 있다. 한 실시양태에서, 크로마토그래피 장치는 컬럼 또는 카세트이다. 원하는 물질은 정제 단계 후 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 침전, 염석, 한외여과, 정용여과, 동결건조, 친화성 크로마토그래피, 또는 실질적으로 균질한 형태로 원하는 물질을 수득하기 위한 용매 부피 감축에 의해 용액으로부터 회수될 수 있다. b)의 경우, 고정상은 예를 들어, 정제할 원하는 물질을 함유하는 용액에, 예를 들어, 고체로서 첨가되어 용액에서 상기 고정상과 상기 물질이 상호작용할 수 있게 한다. 상기 상호작용 후, 고정상은 예를 들어, 여과에 의해 제거되고, 이에 따라, 예를 들어, 원하는 물질은 고정상에 결합된 상태로 용액으로부터 고정상과 함께 제거되거나, 고정상과 결합되지 않은 상태로 용액 중에 잔존한다.
본원에서 사용된 용어 "결합에 적합한 조건 하에서" 및 이와 문법적으로 동등한 용어는 원하는 물질, 예를 들어, PEG-결합된 에리쓰로포이에틴이 고정상, 예를 들어, 이온 교환 물질과 접촉하였을 때 상기 고정상에 결합하는 조건을 의미한다. 이것은 반드시 100%의 원하는 물질이 결합됨을 의미하는 것은 아니지만, 본질적으로 100%의 원하는 물질이 결합됨, 즉 50% 이상의 원하는 물질, 75% 이상의 원하는 물질, 85% 이상의 원하는 물질, 보다 바람직하게는 95%보다 높은 수준의 원하는 물질이 고정상에 결합됨을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "완충된"은 산성 또는 염기성 물질의 첨가 또는 방출로 인한 용액의 pH 변화가 완충제 물질에 의해 수평 상태가 됨을 의미한다. 이러한 효과를 초래하는 임의의 완충제 물질이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 완충제 물질, 예컨대, 인산 또는 이의 염, 아세트산 또는 이의 염, 시트르산 또는 이의 염, 모르폴린, 2-(N-모르폴리노)에탄설폰산 또는 이의 염, 히스티딘 또는 이의 염, 글리신 또는 이의 염, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 또는 이의 염이 사용된다. 바람직한 실시양태에서, 인산 또는 이의 염, 아세트산 또는 이의 염, 시트르산 또는 이의 염, 또는 히스티딘 또는 이의 염이 사용된다. 선택적으로, 완충된 용액은 추가 염, 예컨대, 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨을 포함할 수 있다.
일반적인 크로마토그래피 방법 및 이의 용도는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann (ed), Elsevier Science Publishing Company, Chromatography 5th ed 51A, 1992); 문헌(Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)); 문헌(Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991)); 문헌(Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)); 문헌(Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989); 또는 문헌(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds), John Wiley & Sons, Inc., New York)을 참조한다.
에리쓰로포이에틴의 PEG-결합은 통상적으로 다양한 화합물의 혼합물, 예를 들어, 다중 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, PEG-비결합된 에리쓰로포이에틴, 활성화된 PEG 에스터의 가수분해 생성물 및 에리쓰로포이에틴 자체의 가수분해 생성물로 이루어진 혼합물을 발생시킨다. 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 실질적으로 균질한 형태로 수득하기 위해, 상기 물질들은 분리되어야 하고, 원하는 화합물은 정제되어야 한다.
따라서, 본 발명의 제2 측면은 하기 단계 a) 내지 c)를 포함하는, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 실질적으로 균질한 형태로 수득하는 방법을 제공한다:
a) 분자량이 20 내지 40 kDa인 활성화된 PEG-결합제를 사용하여 에리쓰로포이에틴에 PEG를 결합시키는 단계;
b) 동일한 종류의 양이온 교환 물질을 사용하는 제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계 및 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 연속적으로 수행하여 상기 단계 a)에서 수득된 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 정제하는 단계;
c) 상기 제2 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 실질적으로 균질한 형태로 회수하는 단계; 및
d) 본 발명에 따른 방법으로 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 재생시키는 단계.
이 방법은 글리코실화되고 PEG-결합된 재조합 폴리펩티드, 즉 포유동물 세포, 바람직하게는 CHO 세포, HEK293 세포, BHK 세포, Per.C6(등록상표) 세포 또는 HeLa 세포에 의해 생성된 후 화학적으로 PEG-결합된 재조합 폴리펩티드의 정제에 있어서 특히 유용하다. 한 실시양태에서, 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 재생은 하기 단계를 포함한다:
- 염화나트륨을 포함하는 완충된 수용액을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 결합된 폴리펩티드를 제거하는 단계;
- 바람직하게는 2 이상의 컬럼 부피의 정제수로 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 플러싱하는 단계;
- 바람직하게는 2 이상의 컬럼 부피의 수산화나트륨 용액을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
- 바람직하게는 2 이상의 컬럼 부피의 정제수로 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 플러싱하는 단계;
- 바람직하게는 3 이상의 컬럼 부피의, 인산이수소나트륨 및 인산을 포함하는 용액을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
- 바람직하게는 2 이상의 컬럼 부피의 정제수로 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 플러싱하는 단계;
- 0.5 M 수산화나트륨 용액을 4시간 이상, 바람직하게는 4시간 동안 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계; 및
- 바람직하게는 2 이상의 컬럼 부피의 정제수로 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 플러싱하여 재생시키는 단계.
상기 방법의 제1 단계에서, 에리쓰로포이에틴에 PEG가 결합된다. PEG-결합 반응에서 사용되는 PEG 중합체 분자의 분자량은 약 20 내지 40 kDa이다(여기서, "분자량"은 중합체 화합물인 PEG가 정해진 분자량을 갖는 화합물로서 수득되는 것이 아니라 사실상 분자량 분포를 갖기 때문에 PEG의 평균 분자량을 의미하는 것으로서 이해되어야 하고, 용어 "약"은 상기 PEG 제제 중의 일부 분자들의 분자량이 기재된 분자량보다 더 크거나 작을 것임을 의미하고, 즉 용어 "약"은 95%의 PEG 분자의 분자량이 표시된 분자량의 +/- 10% 내에 있는 분자량 분포를 가짐을 의미한다. 예를 들어, 30 kDa의 분자량은 27 내지 33 kDa의 분자량 범위를 의미한다).
용어 "에리쓰로포이에틴"은 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 단백질, 또는 상기 단백질과 실질적으로 유사한 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하고, 에리쓰로포이에틴의 생물학적 성질은 골수에서 적혈구의 생성 자극 및 적혈구 전구세포의 분열 및 분화 자극과 관련된다. 재조합 에리쓰로포이에틴은 재조합 DNA 기술 또는 내재(endogenous) 유전자 활성화를 이용하여 진핵 세포, 예를 들어, CHO 세포, BHK 세포 또는 HeLa 세포에서 발현시킴으로써 제조할 수 있다. 즉, 에리쓰로포이에틴 당단백질은 내재 유전자 활성화에 의해 발현된다(예를 들어, 미국 특허 제5,733,761호, 제5,641,670호 및 제5,733,746호, 및 국제특허출원 공개 제WO 93/09222호, 제WO 94/12650호, 제WO 95/31560호, 제WO 90/11354호, 제WO 91/06667호 및 제WO 91/09955호 참조). 한 실시양태에서, 본 발명에 따른 에리쓰로포이에틴은 인간 EPO의 서열을 기초로 한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 인간 에리쓰로포이에틴은 서열번호 1 또는 2에 표시된 아미노산 서열, 더 바람직하게는 서열번호 1에 표시된 아미노산 서열을 갖는다. 용어 "에리쓰로포이에틴"은 1개 이상의 아미노산 잔기가 변경되거나, 결실되거나 또는 삽입되어 있지만 비-변이된 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는, 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 단백질의 변이체, 예컨대, 유럽 특허 제1 064 951호 또는 미국 특허 제6,583,272호에 기재된 변이체도 포함한다. 변이체는 글리코실화를 위한 1 내지 6개의 추가 부위를 갖는 인간 에리쓰로포이에틴의 아미노산 서열을 가질 수 있다. PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 특이적 활성은 당업계에 공지되어 있는 다양한 분석법에 의해 확인될 수 있다. 본 발명의 정제된 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 생물학적 활성은 상기 에리쓰로포이에틴을 인간 환자에게 주사 투여하였을 때 골수 세포에 의한 망상적혈구 및 적혈구의 생성을 비-주사 투여된 또는 대조군 개체에 비해 증가시키는 것이다. 본 발명에 따라 수득되고 정제된 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 생물학적 활성은 문헌(Pharmeuropa Spec. Issue Biologicals BRP Erythropoietin Bio 97-2 (1997) 31-48)에 따른 방법에 의해 시험될 수 있다.
본 발명에 따른 "PEG" 또는 "PEG 기"는 PEG를 필수적 부분으로서 함유하는 잔기를 의미한다. 이러한 PEG는 분자의 화학적 합성으로부터 비롯된, 결합 반응에 필요한 화학적 기, 또는 분자의 부분 사이의 최적 거리를 위한 스페이서로 작용하는 화학적 기를 추가로 함유할 수 있다. 이 추가 화학적 기는 PEG 중합체 분자의 분자량의 산출에 사용되지 않는다. 또한, 이러한 PEG는 서로 연결되어 있는 1개 이상의 PEG 측쇄로 구성될 수 있다. 1개보다 많은 PEG 쇄를 갖는 PEG는 다중암(multiarmed)을 가진 PEG 또는 분지쇄 PEG로 지칭된다. 분지쇄 PEG는 예를 들어, 폴리에틸렌 옥사이드를 다양한 폴리올(글리세롤, 펜타에리쓰리올 및 소르비톨)에 첨가함으로써 제조할 수 있다. 분지쇄 PEG는 예를 들어, 유럽 특허 제0 473 084호 및 미국 특허 제5,932,462호에 기재되어 있다. 한 실시양태에서 분자량이 20 내지 35 kDa인 직쇄 PEG 분자를 PEG로서 사용하고, 또 다른 실시양태에서 분자량이 35 kDa, 특히 40 kDa보다 분지쇄 PEG를 큰 PEG로서 사용한다. 2개의 암(arm)을 가진 40 kDa의 PEG가 PEG로서 특히 바람직하다.
용어 "PEG-결합"은 폴리펩티드의 N-말단에 있는 폴리(에틸렌 글리콜) 잔기 및/또는 내부 라이신 잔기의 공유결합을 의미한다. 단백질의 PEG-결합은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Veronese, F.M., Biomaterials 22 (2001) 405-417)에 논의되어 있다. PEG는 분자량이 상이한 다양한 작용기 및 폴리에틸렌 글리콜, 직쇄 PEG 및 분지쇄 PEG뿐만 아니라 다양한 연결기를 사용하여 연결시킬 수 있다(문헌(Francis, G.E., et al., Int. J. Hematol. 68 (1998) 1-18; Delgado, C, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Systems 9 (1992) 249-304)도 참조한다). 에리쓰로포이에틴의 PEG-결합은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 00/44785호에 기재된 PEG-결합제를 사용하여, 한 실시양태에서는 분자량이 5 내지 40 kDa인 NHS-활성화된 직쇄 또는 분지쇄 PEG 분자를 사용하여 수용액 중에서 수행할 수 있다. PEG-결합은 문헌(Lu, Y., et al., Reactive Polymers 22 (1994) 221-229)에 따라 고체상에서 수행할 수도 있다. 무작위적으로는 아니지만, N-말단에서 PEG-결합된 폴리펩티드도 국제특허출원 공개 제WO 94/01451호에 따라 제조할 수 있다.
이러한 방법은 에리쓰로포이에틴이 라이신 잔기의 1개 이상의 ε-아미노 기 및/또는 N-말단 아미노 기에서 PEG가 결합되게 한다. N-말단 아미노산에서의 선택적 PEG-결합은 문헌(Felix, A.M., et al., ACS Symp. Ser. 680 (Poly( ethylene glycol)) (1997) 218-238)에 따라 수행될 수 있다. 선택적 N-말단 PEG-결합은 Nα-PEG-결합된 아미노산 유도체를 펩티드 쇄의 N-1 말단 아미노산에 커플링시킴으로써 고체상 합성 과정 동안에 달성할 수 있다. 측쇄 PEG-결합은 Nε-PEG-결합된 라이신 유도체를 성장하는 쇄에 커플링시킴으로써 고체상 합성 과정 동안에 달성될 수 있다. 조합된 N-말단 및 측쇄 PEG-결합은 전술한 바와 같은 고체상 합성에서 용이하게 수행할 수 있거나, 활성화된 PEG 시약을 아미노 탈보호된 펩티드에 첨가함으로써 고체상 합성으로 용이하게 수행할 수 있다.
적절한 PEG 유도체는 한 실시양태에서 평균 분자량이 약 5 내지 약 40 kDa, 바람직한 실시양태에서 평균 분자량이 약 20 내지 약 40 kDa, 더 바람직한 실시양태에서 평균 분자량이 약 30 내지 약 35 kDa인 활성화된 PEG 분자이다. PEG 유도체는 직쇄 또는 분지쇄 PEG이다. PEG-단백질 및 PEG-펩티드 접합체의 제조에서 사용하기에 적합한 매우 다양한 PEG 유도체가 쉐어워터 폴리머스(Shearwater Polymers)(미국 알라바마주 헌츠빌 소재; www.nektar.com)로부터 입수될 수 있다.
활성화된 PEG 유도체는 당업계에 공지되어 있고 예를 들어, PEG-비닐 설폰이 문헌(Morpurgo, M., et al., J. Bioconjug. Chem. 7 (1996) 363-368)에 기재되어 있다. 직쇄 및 분지쇄 PEG 종이 PEG-결합된 단편의 제조에 적합하다. 반응성 PEG 시약의 예는 하기 화학식 1의 요오도-아세틸-메톡시-PEG 또는 화학식 2의 메톡시-PEG-비닐설폰이다:
Figure pct00001
Figure pct00002
상기 식에서,
m은 한 실시양태에서 약 450 내지 약 900의 정수이고,
R은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 저급 알킬, 예컨대, 메틸, 에틸, 이소프로필 등이고, 메틸이 바람직하다.
상기 요오도-활성화된 물질의 사용은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌(Hermanson, G. T., in Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) p. 147-148)에 기재되어 있다.
한 실시양태에서, PEG 종은 활성화된 PEG 에스터, 예를 들어, N-하이드록시석신이미딜 프로피오네이트, N-하이드록시석신이미딜 부타노에이트, 또는 N-하이드록시석신이미드, 예컨대, PEG-NHS이다(Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6 (1995) 62-69). 한 실시양태에서, PEG는 알콕시-PEG-N-하이드록시석신이미드, 예컨대, 메톡시-PEG-N-하이드록시석신이미드(MW 30,000; 쉐어워터 폴리머스 인코포레이티드)를 사용하여 하기 화학식 3 또는 4의 N-하이드록시석신이미드 에스터로 활성화시킨다:
Figure pct00003
Figure pct00004
상기 식에서,
R 및 m은 상기 정의된 바와 같다. 한 실시양태에서, PEG 종은 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜)-부티르산의 N-하이드록시석신이미딜 에스터이다. 용어 "알콕시"는 용어 "알킬"이 최대 4개의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 알킬 기를 의미하는 알킬 에테르 기, 예컨대, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시 등, 바람직하게는 메톡시를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로 균질한 형태"는 수득되거나, 함유되거나 사용되는 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴이 정해진 수의 PEG 기가 결합되어 있는 에리쓰로포이에틴임을 의미한다. 한 실시양태에서, PEG-결합된 에리쓰로포이에틴은 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴이다. 제제는 미반응된(즉, PEG 기 결여) 에리쓰로포이에틴, 다중 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴뿐만 아니라 PEG-결합 반응 동안에 발생된 폴리펩티드의 단편도 함유할 수 있다. 용어 "실질적으로 균질한 형태"는 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴 제제가 50%(중량/중량) 이상의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, 75% 이상의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, 90% 이상의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, 또는 95%보다 많은 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 함유함을 의미한다. % 값은 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴이 수득되는 양이온 교환 크로마토그래피 정제에 상응하는 크로마토그램의 면적%를 기초로 한 값이다.
본 발명은 실질적으로 균질한 형태의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 수득하기 위해 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 정제하는 방법을 제공한다. 놀랍게도, 동일한 종류의 양이온 교환 물질을 사용하는 2개의 연속적 양이온 교환 크로마토그래피 단계의 조합이 실질적으로 균질한 형태의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 제공함을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, 다중 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴 및 PEG-비결합된 에리쓰로포이에틴을 포함하는 용액을 제공하는 단계; 동일한 종류의 양이온 교환 물질을 사용하는 제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계 및 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 연속적으로 수행하는 단계; 정제된 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 회수하는 단계; 및 본 발명의 제1 측면에 따른 방법으로 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 재생시키는 단계를 포함하는, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 정제 방법을 제공한다.
제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 정제된 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 회수는 제2 양이온 교환 크로마토그래피 물질로부터 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 용출함으로써 달성한다. 본 발명에 따른 방법의 한 실시양태에서, 제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계와 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 이용된 용출 방법에서 구별된다. 한 실시양태에서, 제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 단계 용출 방법으로서 수행되고, 즉 사용되는 완충제의 이온 강도는 단계적으로 증가하고, 즉 한 이온 강도 값으로부터 다음 이온 강도 값으로 한번에 증가한다. 한 실시양태에서, 단계 용출 방법은 3-단계 용출 방법으로서 수행된다. 제1 단계에서, 주로 다중 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴이 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출된다. 이온 강도의 제2 증가는 기본적으로 상응하는 크기-배제 크로마토그램의 면적(면적%)을 기준으로 60%보다 높은 순도로 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 용출한다. 이온 강도의 제3 증가는 주로 잔존하는 PEG-비결합된 에리쓰로포이에틴을 컬럼으로부터 용출한다.
제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 한 실시양태에서 연속 용출 방법으로서 수행되고, 즉 완충제의 이온 강도는 연속적으로 증가한다. 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 함유하는 용출된 분획은 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 실질적으로 균질한 형태(한 실시양태에서 상응하는 크로마토그램의 면적을 기준으로 0.5% 미만의 저분자량 형태를 함유함)로 수득하기 위해 조합된다. 완충제는 한 실시양태에서 10 내지 250 mM, 바람직하게는 50 내지 150 mM, 더 바람직하게는 약 100 mM의 농도로 존재한다.
따라서, 본 발명에 따른 방법에서 2개의 연속적 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 하기 단계 a) 내지 d)를 포함한다:
a) 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴이 제1 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 함유된 양이온 교환 물질에 결합하기에 적합한 조건 하에서, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, 다중 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴 및 PEG-비결합된 에리쓰로포이에틴의 혼합물을 포함하는 완충된 수용액을 상기 제1 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
b) 관통 유동 완충제의 이온 강도가 단계적으로 증가하는 단계 용출 방법을 이용하여 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 제1 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 회수하는 단계로서, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 상대적 함량이 단계 a)의 인가된 혼합물에 비해 증가한, 단계;
c) 상기 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴이 제2 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 함유된 양이온 교환 물질에 결합하기에 적합한 조건 하에서, 회수된 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 상기 제2 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계로서, 상기 제2 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 함유된 양이온 교환 물질이 상기 제1 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 함유된 양이온 교환 물질과 동일한 종류의 양이온 교환 물질인, 단계; 및
d) 관통 유동 완충제의 이온 강도가 연속적으로 증가하는 연속 용출 방법을 이용하여 상기 제2 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 정제된 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 실질적으로 균질한 형태로 회수하는 단계.
폴리펩티드의 PEG-결합은 통상적으로 PEG-결합된 생성물을 균질한 형태로 제공하지 못한다. 뿐만 아니라, PEG-결합된 생성물은 단일 PEG-결합된 생성물, 다중 PEG-결합된 생성물 및 PEG-비결합된 생성물의 혼합물로서 수득된다. 따라서, 본 방법의 단계 a)에서 인가된 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴 용액은 수성 완충제 중의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, 다중 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, PEG-비결합된 에리쓰로포이에틴 및 저분자량 형태 또는 단편의 혼합물이다. 상이한 물질들의 상대적 함량은 SE-HPLC에 의해 측정된다. 크기 배재 크로마토그램에서 상관관계가 있는 피크의 면적, 즉 피크 하의 면적의 합은 크기-배제 크로마토그램의 총 면적이다. 단일 피크의 분율은 면적%, 즉 크로마토그램의 총 면적의 상대적 면적 분율로서 표시된다.
일반적인 크로마토그래피 방법, 이의 용도 및 관련 용어는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌(Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, Chromatography 5th ed., 51A (1992)) 및 다른 관련 교재를 참조한다. 크로마토그래피 동안 완충제는 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 관통하여 유동한다. "관통 유동 완충제"는 크로마토그래피 방법의 단계의 요건에 따라 조절된다. 상기 완충제는 원하는 물질을 크로마토그래피 물질로 수송하고(인가) 크로마토그래피 물질로부터 수송한다(용출).
제1 양이온 교환 크로마토그래피에서, 약 pH 3.0에서 약 100 mM의 인산칼륨으로 완충된 수용액 중의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, 다중 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴 및 PEG-비결합된 에리쓰로포이에틴의 혼합물을 약 1 mg/ml의 단백질 농도로 제1 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가한다. 본원에서 사용된 용어 "약"은 표시된 값으로부터 10% 이내의 범위, 즉 표시된 값 ± 10%를 의미한다. 한 실시양태에서, 제1 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 인가 전 및 후에 동일한 완충제 용액으로 세척된다. 단계 용출 방법에서 제1 단계의 경우, 완충제는 약 100 mM 인산칼륨 및 약 90 mM의 염화나트륨을 함유하고 pH가 약 3.0인 완충제로 교체된다. 이 완충제를 사용하여, 가수분해된 PEG 시약, 즉 상응하는 PEG-결합된 카본산, 미반응된 커플링제 및 다중 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 용출한다. 3-단계 용출 방법에서 제2 단계의 경우, 완충제는 약 100 mM 인산칼륨 및 약 250 mM 염화나트륨을 함유하고 pH가 약 3.0인 완충제로 교체된다. 이 단계에서, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴이 제1 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 회수된다. 이 용출 단계에서 모은 관통 유동 완충제는 정제수를 사용하여 약 1:5 내지 1:8의 비로 희석한다. 제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계 후, 회수된 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴은 자유 PEG를 갖지 않는다.
제1 양이온 교환 크로마토그래피의 제2 단계에서 모은 관통 유동 완충제는 증가한 상대적 함량으로 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 함유한다. 즉, (제2 단계에서 모은 관통 유동 완충제의 크기 배제 크로마토그래피의 크로마토그램에서의) 중량% 또는 면적%를 기준으로 한 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 분율이 제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계 전에 비해 증가한다. 한 실시양태에서, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 상대적 함량은 60 면적% 이상이다. 바람직한 실시양태에서, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 상대적 함량은 80 면적% 이상이다.
단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 더 정제하기 위해, 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 수행한다. 제2 양이온 교환 크로마토그래피의 경우, 제2 용출 단계에서 모아지고 희석된 관통 유동 완충제의 인산칼륨 농도를 약 100 mM로 조절하고 pH를 약 pH 3.0으로 조절하고 제1 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼과 동일한 종류의 양이온 교환 물질을 함유하는 제2 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가한다. 한 실시양태에서, 제2 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼 및 이 컬럼에 함유되는 양이온 교환 물질은 제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계에서 사용된 것과 동일하다. 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴은 약 50 mM의 염화나트륨을 함유하고 pH가 약 3.0인 약 100 mM 농도의 인산칼륨 완충제로 시작되어 약 500 mM의 염화나트륨을 함유하고 pH가 약 3.0인 약 100 mM 농도의 인산칼륨 완충제로 종결되는 직선형 구배를 이용하여 제2 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 회수한다. 염화나트륨 농도의 변화는 10 컬럼 부피에 걸친 직선형 변화이다. 관통 유동 완충제는 분획화되고, 각 분획을 1 M의 인산수소이칼륨으로 희석하여 pH 값을 약 6부터 8까지 증가시킨다.
제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계 후, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴이 실질적으로 균질한 형태로, 한 실시양태에서 95 면적% 이상의 순도로 수득된다.
당업자는 이온 교환 크로마토그래피의 기술을 잘 알고 있다. 양이온 교환 물질에 결합된 폴리펩티드의 회수 단계에서, 이온 교환 컬럼을 관통하는 완충제/용액의 이온 강도, 즉 전도성은 증가한다. 이것은 완충제 염 농도를 증가시켜 달성할 수 있거나, 다른 염, 소위 용출 염을 완충제 용액에 첨가하여 달성할 수 있다. 용출 방법에 따라, 완충제/염 농도는 농축된 완충제 또는 용출 염 용액의 분할 첨가에 의해 한번에(단계 용출 방법)에 증가하거나 연속적으로(연속 용출 방법) 증가한다. 한 실시양태에서, 용출 염은 시트르산나트륨, 염화나트륨, 황산나트륨, 인산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 인산칼륨, 시트르산 또는 인산의 다른 염, 또는 이들의 임의의 혼합물이다. 바람직한 실시양태에서, 용출 염은 시트르산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨 또는 이들의 혼합물이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 양이온 교환 물질은 강 양이온 교환 물질, 바람직한 실시양태에서 도요펄(등록상표) SP 650 M, 또 다른 바람직한 실시양태에서 설포프로필 양이온 교환 물질이다. 용출시키는 염의 농도는 한 실시양태에서 5 내지 500 mM, 바람직하게는 5 내지 400 mM, 특히 바람직한 실시양태에서 5 내지 250 mM이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 용출시키는 염, 예컨대, 시트르산 또는 이의 염 또는 인산 또는 이의 염이 완충제 물질로도 사용된다.
단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴은 당업계에 공지된 방법에 의해 약학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클과 함께 주사하기에 적합한 약학 조성물에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 적절한 약학 조성물은 국제특허출원 공개 제WO 97/09996호, 제WO 97/40850호, 제WO 98/58660호 및 제WO 99/07401호에 기재되어 있다. 본 발명의 생성물을 제제화하기에 바람직한 약학적으로 허용가능한 담체로는 인간 혈청 알부민, 인간 혈장 단백질 등이 있다. 본 발명의 화합물은 등장화제, 예를 들어, 132 mM의 염화나트륨을 함유하는 pH 7의 10 mM 인산나트륨/인산칼륨 완충제 중에서 제제화될 수 있다. 선택적으로, 약학 조성물은 보존제를 함유할 수 있다. 약학 조성물은 다양한 양, 예를 들어, 10 내지 1,000 ㎍/㎖, 예컨대, 50 또는 400 ㎍의 의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 함유할 수 있다.
본 발명의 에리쓰로포이에틴 당단백질 생성물의 투여는 인간에서 적혈구를 형성시킨다. 따라서, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴 당단백질 생성물의 투여는 적혈구의 생성에 있어서 중요한 에리쓰로포이에틴 단백질을 보충한다. 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴 당단백질을 함유하는 약학 조성물은 적혈구 생성이 낮거나 결여되어 있음을 특징으로 하는 혈액 장애를 단독 질환으로서 또는 부분적 증상 또는 질환으로서 앓고 있는 인간 환자에게 다양한 수단에 의해 투여되기에 효과적인 강도로 제제화될 수 있다. 약학 조성물은 주사, 예를 들어, 피하 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴 당단백질 생성물의 평균 양은 달라질 수 있다. 접합체의 정확한 양은 치료될 증상의 정확한 종류, 치료될 환자의 상태 및 조성물 중의 다른 성분과 같은 인자에 따라 결정된다. 예를 들어, 체중 1 kg 당 0.01 내지 10 ㎍, 바람직하게는 0.1 내지 1 ㎍이 예를 들어, 주당 1회 투여될 수 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 분리 효율의 유의한 감소를 초래하지 않으면서 본 발명에 따른 방법으로 재생될 수 있음을 발견하였다. 본 발명에 따른 재생 방법을 이용하는 경우 분리 효율(도 1 참조) 및 수율(도 2 참조)의 유의한 감소를 초래하지 않고 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 40 분리 주기 이상, 한 실시양태에서 50 분리 주기 이상, 추가 실시양태에서 60 분리 주기 이상 사용할 수 있음을 발견하였다. 본원에서 사용된 용어 "분리 주기"는 i) 컬럼의 평형화, ii) 컬럼 상에의 분리될 용액의 인가, iii) 컬럼의 세척, iv) 컬럼으로부터 흡착된 화합물의 회수, v) 컬럼의 세척, 및 vi) 컬럼의 재생으로 구성된 순차적 과정을 의미한다. 또한, 본 발명에 따른 재생 방법을 이용하는 경우 분리 효율의 감소를 피할 수 있을 뿐만 아니라 적재능의 감소도 방지할 수 있음을 발견하였다(도 2 참조).
본원에서 사용된 용어 "분리 효율"은 용액의 화합물을 분리하는 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼의 능력을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "유의한 감소를 초래하지 않고"는 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 동일한 화합물을 함유하는 용액의 연속적 크로마토그래피에서 동일한 화합물 분리, 즉 +/- 5%의 편차, 한 실시양태에서 +/- 2.5%의 편차 내의 화합물 분리를 제공함을 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "적재능"은 양이온 교환 크로마토그래피로부터 회수되는 원하는 화합물의 양을 의미한다.
하기 실시예, 서열목록 및 도면은 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공되는 것이고, 본 발명의 진정한 범위는 첨부된 특허청구범위에 기재되어 있다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 기재된 절차에 대한 변경을 가할 수 있음을 이해할 것이다.
[실시예]
재료 및 방법
SE-HPLC
SE-HPLC는 단백질을 단백질의 겉보기 분자량에 따라 분리한다. 따라서, 이 방법은 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴, 에리쓰로포이에틴의 저분자량 형태 및 단편, 및 에리쓰로포이에틴의 다중 PEG-결합된 형태 및 고차 응집체의 존재를 검출할 수 있다. HPLC에는 220-nm 검출기 및 수퍼로스(Superose) 6 HR 컬럼(차수 10 x 300 nm, 파마샤 바이오텍, 카달로그 번호:　17-0537-01) 또는 수퍼로스 6 10/300 GL 컬럼(파마샤 바이오텍, 카달로그 번호: 17-5172-01)이 장착되어 있다. 컬럼은 실온에서 등용매 조건 하에서 약 0.4 ㎖/분의 유속을 이용하여 작동시킨다. 이동상 완충제는 300 mM 염화나트륨을 함유하는 pH 6.8의 50 mM 인산나트륨 완충제이다. 사용된 HPLC-시스템에 따라, 100 또는 500 ㎕의 샘플 인가 부피를 이용하여 이 방법을 수행할 수 있다. 이동상 완충제를 사용하여 샘플을 단백질 농도 약 0.5 ㎎/㎖(100 ㎕ 적재) 또는 0.1 ㎎/㎖(500 ㎕ 적재)까지 희석한다. 단백질 농도가 0.1 ㎎/㎖인 샘플은 희석되지 않은 상태로 사용될 수 있다. 용출된 단백질은 220 nm의 검출기 파장에서 검출된다.
RP-HPLC
순도는 올리고 형태 및 관련 물질들로부터 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 분리하는 RP-HPLC에 의해 분석된다. 이 분석법은 아세토니트릴/수성 TFA 구배를 사용하여 포로쉘(Poroshell) 컬럼 상에서 수행한다. 용출 프로파일은 220 nm에서 UV 흡광도로서 모니터링된다. 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴 및 관련 물질 또는 올리고 형태의 백분율은 용출된 단백질의 총 피크 면적을 기초로 하여 산출한다.
실시예 1
단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 정제
에리쓰로포이에틴은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 01/87329호에 따라 제조될 수 있고 국제특허출원 공개 제WO 96/135718호 기재된 바와 같이 정제될 수 있다. PEG-결합된 에리쓰로포이에틴은 예를 들어, 국제특허출원 공개 제WO 03/029291호에 따라 제조될 수 있다.
a) SP 도요펄 650 M 상에서의 제1 크로마토그래피
생성물의 제1 크로마토그래피는 SP 도요펄 650 M으로 팩킹된 SP 컬럼 상에서 수행하였다. 상기 컬럼은 실온에서 작동시켰다. 제1 컬럼의 최대 적재량은 컬럼 부피(CV) 1 ℓ 당 1.5 g 단백질로서 정의된다. 컬럼을 pH 2.9 내지 3.1의 100 mM 인산칼륨 완충제로 평형화시켰다. 적재 단계 후, 컬럼을 세척하고 증가하는 양의 NaCl이 함유된 일련의 인산칼륨 완충제로 용출하였다. 자유 PEG-결합된 카본산, 즉 가수분해된 PEG 시약 및 다중 PEG-결합된 형태는 관통 유동 후, SP-A 완충제 및 SP-B 완충제(90 mM 염화나트륨을 함유하는 pH 2.9 내지 3.1의 100 mM 인산칼륨 완충제)를 사용하여 세척하는 단계에서 제거하였다. 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴은 250 mM 염화나트륨을 함유하는 pH 2.9 내지 3.1의 100 mM 인산칼륨 완충제(SP-C 완충제)를 인가하여 용출하고 용기 내에 모으고 정제수를 사용하여 1:5로 직접 희석하였다. 상기 모은 용출물은 "SP 용출물 풀(pool) I"로 명명되었다. 이어서, 750 mM 염화나트륨을 함유하는 pH 2.9 내지 3.1의 100 mM 인산칼륨 완충제(SP-D 완충제)를 사용하여 컬럼을 세척하여 미반응된 에리쓰로포이에틴을 제거하고 컬럼을 재생시켰다.
b) SP 도요펄 650 M 상에서의 제2 크로마토그래피
제2 컬럼을 실온에서 작동시켰다. SP-A 완충제를 사용하여 평형화시킨 후, SP 용출물 풀 I을 컬럼에 인가한 후, 컬럼을 SP-A 완충제로 세척하였다. pH 2.9 내지 3.1의 100 mM 인산칼륨 완충제로 완충되고 염화나트륨 농도가 10 컬럼 부피에 걸쳐 50 mM부터 500 mM까지 변하는 직선형 구배를 이용하여 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 용출하였다. 생성물 피크는 최대 8개의 단일 분획으로 분획화시키고, 각 분획을 1 M 인산수소이칼륨으로 직접 희석하여 pH를 6부터 8까지 증가시켰다. 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 용출이 완결된 후, 상기 구배의 기울기를 증가시켜 500 mM 염화나트륨을 함유하는 pH 2.9 내지 3.1의 100 mM 인산칼륨을 사용한 즉석 컬럼 세척을 달성할 수 있다.
c) SP 도요펄 650 M 컬럼의 재생
상기 두 컬럼의 수지는 일련의 7 단계에서 재생시켰다. 컬럼을 정제수에 이어 0.5 M 수산화나트륨 용액으로 플러싱하였다. 알칼리성 용액을 정제수로 교체한 후 산 세척(0.5 M 인산이수소나트륨, 1 M 인산)을 수행하였다. 또 다른 정제수 세척 단계 후, 0.5 M 수산화나트륨을 사용하여 컬럼의 발열원을 4시간 이상 동안 제거하였다. 가성(caustic) 재생 후, 컬럼을 정제수로 다시 세척하였다. 정제수(PW III)는 한외여과를 통해 수득하였다. PW III의 질은 미국 약전에 따른 주사용수의 질과 동등하다. 시험은 유럽 약전 및 미국 약전에 따라 수행하였다. 상기 요약된 제1 크로마토그래피 단계에 따라 대조군 실험을 수행하는 동안 잔류 단백질 또는 PEG 잔기는 관통 유동 완충제 각각에서 전혀 검출될 수 없었다. 60 주기 후 수지를 SDS-PAGE로 분석한 결과, 겔 상에서 잔류 단백질 또는 PEG 잔기가 전혀 보이지 않았다. 이 데이터에 기초할 때, 잔류 단백질 및 PEG 잔기의 회분(batch)-대-회분 전달이 회피될 수 있으므로, 컬럼의 재생은 매우 효율적이다(도 1 참조). 크로마토그래피 단계 각각에서 수득된 수율을 측정한 결과 수율 감소는 전혀 보이지 않았다(도 2 참조).
크로마토그래피 재생을 위한 파라미터의 개요
단계 완충제 용액 컬럼 부피 유속(ℓ/분)
린스 PW III ≥2 1.6-2.1
가성 컬럼 재생 I 0.5 mol/ℓ NaOH ≥2 1.6-2.1
린스 PW III ≥2 1.6-2.1
산 컬럼 재생 1 mol/ℓ 인산 0.5 mol/ℓ 인산이수소나트륨 ≥3 1.6-2.1
린스 PW III ≥2 1.6-2.1
가성 컬럼 재생 II 0.5 mol/ℓ NaOH ≥3 n.a.
린스 PW III ≥2 1.6-2.1
n.a.: 적용될 수 없음
도 1 및 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 모든 주기의 제1 크로마토그래피 단계에 있어서 관통 유동 완충제 풀 중의 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 순도 및 수율은 명확히 80% 이상(순도) 및 35% 이상(수율)의 범위 내에 있다. 뿐만 아니라, 컬럼의 수명 동안 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴의 순도 변화를 전혀 관찰할 수 없다.
SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> CHROMATOGRAPHIC METHODS <130> 24383 FT <150> EP 07013960.5 <151> 2007-07-17 <160> 2 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165

Claims (10)

  1. 원하는 화합물을 용출한 후 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 재생시키는 방법으로서,
    - 500 mM 이상의 농도로 염화나트륨을 포함하는 완충된 수용액을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 흡착된 폴리펩티드를 용출시키는 단계;
    - 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱(flushing)하는 단계;
    - 0.5 M의 수산화나트륨 용액을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
    - 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하는 단계;
    - 0.5 M의 인산이수소나트륨 및 1 M의 인산을 포함하는 용액을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
    - 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하는 단계;
    - 0.5 M의 수산화나트륨 용액을 4시간 이상 동안 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계; 및
    - 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하여 재생시키는 단계
    를 기재된 순서대로 포함하는 방법.
  2. a) 분자량이 20 내지 40 kDa인 활성화된 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG)-결합제를 사용하여 에리쓰로포이에틴에 PEG를 결합시키는 단계;
    b) 동일한 종류의 양이온 교환 물질을 사용하는 제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계 및 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계를 연속적으로 수행하여, 상기 단계 a)에서 수득된 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 정제하는 단계;
    c) 상기 제2 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 실질적으로 균질한 형태로 회수하는 단계; 및
    d) 하기 단계 i) 내지 viii)을 기재된 순서대로 수행하여 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 재생시키는 단계
    를 포함하는, 단일 PEG-결합된 에리쓰로포이에틴을 실질적으로 균질한 형태로 수득하는 방법:
    i) 염화나트륨을 포함하는 완충된 수용액을 사용하여 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼으로부터 잔류 결합된 폴리펩티드를 제거하는 단계;
    ii) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하는 단계;
    iii) 수산화나트륨 용액을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
    iv) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하는 단계;
    v) 인산이수소나트륨 및 인산을 포함하는 용액을 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계;
    vi) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하는 단계;
    vii) 0.5 M의 수산화나트륨 용액을 4시간 이상 동안 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 인가하는 단계; 및
    viii) 상기 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼을 정제수로 플러싱하여 재생시키는 단계.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 강 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 설포프로필 양이온 교환 크로마토그래피 컬럼임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    완충제가 인산 또는 이의 염, 아세트산 또는 이의 염, 시트르산 또는 이의 염, 또는 히스티딘 또는 이의 염임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항에 있어서,
    에리쓰로포이에틴이 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 에리쓰로포이에틴임을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    PEG가, 분자량이 20 내지 35 kDa인 직쇄 PEG임을 특징으로 하는 방법.
  8. 제2항 또는 제6항에 있어서,
    PEG가, 분자량이 40 kDa인 분지쇄 PEG임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제2항 및 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 양이온 교환 크로마토그래피 단계가 단계 용출로서 수행되고, 제2 양이온 교환 크로마토그래피 단계가 직선형 용출로서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    양이온 교환 크로마토그래피 컬럼이 40 분리 주기 이상 동안 사용될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
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