RU2010105312A - Хроматографические способы - Google Patents

Abstract

1. Способ регенерации катионообменной хроматографической колонки после элюирования целевых веществ, включающий следующие шаги в представленной последовательности: ! элюирование адсорбированных полипептидов из колонки забуференным водным раствором, содержащим хлорид натрия в концентрации по меньшей мере 500 мМ, ! промывание колонки очищенной водой, ! введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия, ! промывание колонки очищенной водой, ! введение в колонку раствора, содержащего 0,5 М дигидрофосфата натрия и 1 М фосфорной кислоты, ! промывание колонки очищенной водой, ! введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия по меньшей мере на 4 ч и !регенерацию катионобменной колонки посредством промывания колонки очищенной водой. ! 2. Способ получения монопегилированного эритропоэтина, в котором один полиэтиленгликолевый остаток ковалентно связан с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, включающий следующие стадии: ! а) ковалентное связывание полиэтиленгликолевого остатка с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку с помощью активированного реагента для ковалентного связывания полиэтиленгликолевого остатка с молекулярной массой от 20 кДа до 40 кДа с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку, ! б) очистку получаемого на стадии а) эритропоэтина, в котором полиэтиленгликолевый остаток ковалентно связан с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку, с помощью двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, где на первой и второй катионообменных хроматог

Claims (10)

1. Способ регенерации катионообменной хроматографической колонки после элюирования целевых веществ, включающий следующие шаги в представленной последовательности:

элюирование адсорбированных полипептидов из колонки забуференным водным раствором, содержащим хлорид натрия в концентрации по меньшей мере 500 мМ,

промывание колонки очищенной водой,

введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия,

промывание колонки очищенной водой,

введение в колонку раствора, содержащего 0,5 М дигидрофосфата натрия и 1 М фосфорной кислоты,

промывание колонки очищенной водой,

введение в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия по меньшей мере на 4 ч и

регенерацию катионобменной колонки посредством промывания колонки очищенной водой.

2. Способ получения монопегилированного эритропоэтина, в котором один полиэтиленгликолевый остаток ковалентно связан с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку в форме, являющейся в существенной степени гомогенной, включающий следующие стадии:

а) ковалентное связывание полиэтиленгликолевого остатка с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку с помощью активированного реагента для ковалентного связывания полиэтиленгликолевого остатка с молекулярной массой от 20 кДа до 40 кДа с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку,

б) очистку получаемого на стадии а) эритропоэтина, в котором полиэтиленгликолевый остаток ковалентно связан с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку, с помощью двух последовательных катионообменных хроматографических стадий, где на первой и второй катионообменных хроматографических стадиях задействован катионит одного и того же типа,

в) выделение эритропоэтина, в котором один полиэтиленгликолевый остаток ковалентно связан с эритропоэтином по N-концу и/или внутреннему лизиновому остатку, из второй катионообменной хроматографической колонки в форме, являющейся в существенной степени гомогенной,

г) регенерацию катионообменной хроматографической колонки с помощью следующих шагов в представленной последовательности:

1) удаления адсорбированных полипептидов из колонки забуференным водным раствором, содержащим хлорид натрия в концентрации по меньшей мере 500 мМ,

2) промывания колонки очищенной водой,

3) введения в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия,

4) промывания колонки очищенной водой,

5) введения в колонку раствора, содержащего 0,5 М дигидрофосфата натрия и 1 М фосфорной кислоты,

6) промывания колонки очищенной водой,

7) введения в колонку 0,5 М раствора гидроксида натрия не менее чем на 4 часа и

8) регенерации катионобменной колонки посредством промывания колонки очищенной водой.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутая катионообменная хроматографическая колонка является сильной катионообменной хроматографической колонкой.

4. Способ по п.3, отличающийся тем, что упомянутая катионообменная хроматографическая колонка является сульфопропильной катионообменной хроматографической колонкой.

5. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что упомянутый буфер является фосфорной кислотой или ее солями, или уксусной кислотой или ее солями, или лимонной кислотой или ее солями, или гистидином или его солями.

ее солями, или лимонной кислотой или ее солями, или гистидином или его солями.

6. Способ по п.2, отличающийся тем, что упомянутый эритропоэтин является человеческим эритропоэтином, характеризуемым аминокислотной последовательностью, приведенной в перечне последовательностей SEQ ID NO:1 или 2.

7. Способ по п.2 или 6, отличающийся тем, что упомянутый полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой 20-35 кДа и является линейным.

8. Способ по п.2 или 6, отличающийся тем, что упомянутый полиэтиленгликоль характеризуется молекулярной массой 40 кДа и является разветвленным.

9. Способ по п.2 или 6, отличающийся тем, что упомянутую первую катионообменную хроматографическую стадию осуществляют с помощью пошагового элюирования, а вторую катионообменную хроматографическую стадию осуществляют с помощью линейного градиентного элюирования.

10. Способ по пп.1, 2 или 6, отличающийся тем, что упомянутая катионообменная хроматографическая колонка может использоваться по меньшей мере для 40 циклов разделения.