RU2015141849A - Способ очистки фактора свертывания крови viii - Google Patents

Claims (31)

1. Композиция вещества, содержащая очищенный рекомбинантный FVIII, полученный способом очистки или обогащения фактора свертывания крови FVIII с использованием хроматографии, включающим следующие стадии:

- обеспечение фракции, содержащей FVIII, в водном растворе с высокой ионной силой;

- приведение фракции, содержащей FVIII, в контакт с катионной многомодальной смолой;

- промывание катионной многомодальной смолы, на которую абсорбирован FVIII, водным промывочным буфером;

- элюирование содержащих FVIII фракций водным элюирующим буфером, содержащим по крайней мере одну аминокислоту, которая положительно заряжена при рН от 6 до 8; и

где последовательность очистки дополнительно включает следующие стадии:

i. катионообменная смола;

ii. анионная мембрана;

iii. стадия инактивации с использованием химических реагентов для вирусов с липидной оболочкой;

iv. аффинная смола на основе белкового лиганда, содержащего фрагмент антитела, экспрессированного в дрожжах;

v. стадия удаления патогенов путем фильтрации с использованием фильтра со средним размером пор 20 нм;

vi. анионобменная смола;

vii. смола для эксклюзионной хроматографии,

отличающаяся тем, что чистота после последней стадии

очистки составляет более 4000 IU/мг, и, что содержание ДНК составляет менее 1000 пг/1000 IU FVIII.

2. Композиция вещества по п. 1, где анионная мембрана представляет собой Sartobind Q, в частности, для уменьшения содержания ДНК.

3. Композиция вещества по п. 1, где катионная многомодальная смола представляет собой Capto MMC.

4. Композиция вещества по п. 1, где катионообменная смола представляет собой SP Sepharose FF.

5. Композиция вещества по п. 1, где стадия инактивации с использованием химических реагентов для вирусов с липидной оболочкой представляет собой инактивирующую обработку типа “растворитель/детергент” с использованием три-н-бутилфосфата и Triton X-100.

6. Композиция вещества по п. 1, где аффинная смола на основе белкового лиганда представляет собой VIIISelect, где лиганд VIIIselect состоит из фрагмента антитела, экспрессированного в дрожжах.

7. Композиция вещества по п. 1, где стадия удаления патогенов путем фильтрации осуществляется с использованием фильтра со средним размером пор приблизительно 20 нм, в частности, Planova 20N.

8. Композиция вещества по п. 1, где анионообменная смола представляет собой Q Sepharose FF.

9. Композиция вещества по п. 1, где смола для эксклюзионной хроматографии представляет собой Superdex 200pg.

10. Композиция вещества по п. 1, отличающаяся тем, что

рекомбинантный FVIII получен из производной эмбриональных клеток почек человека 293.

11. Композиция вещества по п. 1, отличающаяся тем, что рекомбинантный FVIII представляет собой FVIII с удаленным B-доменом.

12. Композиция вещества по п. 1, отличающаяся тем, что водный раствор, содержащий FVIII, представляет собой раствор с большой концентрацией соли, соответствующей проводимости от приблизительно 25 до приблизительно 200 мС/см при 25°С.

13. Композиция вещества по п. 1, отличающаяся тем, что аминокислота, которая положительно заряжена при рН от 6 до 8, выбрана из группы аминокислот, содержащей такие аминокислоты как лизин, аргинин, гистидин и их комбинаций, в частности, в концентрациях менее 0,4М, в частности, менее 0,5М.

14. Композиция вещества по п. 1, где элюирующий буфер дополнительно содержит по меньшей мере одну гидроксильную группу, которая содержит органические соединения, такие как спирт, по меньшей мере одну аминогруппу, содержащую органическое соединение, такое как аминокислота, по меньшей мере один источник ионов Ca²⁺, по меньшей мере одно соединение для регулирования ионной силы буфера, такое как неорганические соли, по меньшей мере один неионогенный детергент и по меньшей мере одно буферное вещество для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 6 до приблизительно 8, в частности, для поддержания приблизительно нейтрального значения рН.

15. Композиция вещества по п. 1, отличающаяся тем, что последовательность очистки дополнительно включает стадии удаления/инактивации патогенов, включающие стадии хроматографии, которые основаны на различных физиологических свойствах, направленных на удаляемый патоген.

16. Композиция вещества по п. 1, отличающаяся тем, что чистота после последней стадии очистки составляет более 9000 IU/мг и, предпочтительно, более 10000 IU/мг белка, а содержание ДНК составляет менее 100 пг/1000 IU FVIII, предпочтительно менее 10 пг/1000 IU FVIII.