JP2019034963A - 陽イオン交換基を用いた新規抗体精製法(Novel Antibody Purification method using Cation Exchanger) - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 抗体または抗体由来物質に対するアフィニティリガンドを有する担体1と陽イオン交換基を有する担体2を用いて連結または混合カラムとし、一体として抗体または抗体由来物質の吸着および溶出を行うことを特徴とする抗体または抗体由来物質の精製方法。
[2] 前記抗体または抗体由来物質に対するアフィニティリガンドを有する担体1と陽イオン交換基を有する担体2を用いた抗体または抗体由来物質の精製方法であり、
前記担体1を充填したカラムの下流側に前記担体2を充填したカラムを直結した一体型カラムまたは前記担体1と担体2の両方の混合物が充填された混合型カラムに、抗体または抗体由来物質含有液を通液して抗体または抗体由来物質をカラムに負荷し、
ついで溶出液を通液することで負荷した抗体または抗体由来物質を溶出させることを特徴とする抗体または抗体由来物質の精製方法。
[3] 前記抗体または抗体由来物質の溶出を酸性pHでかつイオン強度のグラジエントで行う[1]または[2]に記載の精製方法。
[4] 前記抗体または抗体由来物質の溶出を酸性pHでかつイオン強度のステップワイズで行う[1]または[2]に記載の精製方法。
[5] 前記一体型カラムまたは混合型カラムを平衡化溶液で平衡化し、前記抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷し、この負荷後溶出開始前に平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液よりも低いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液する[2]〜[4]のいずれかに記載の精製方法。
[6] 前記一体型カラムまたは混合型カラムを平衡化溶液で平衡化し、前記抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷し、この負荷後溶出開始前に平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液と同じまたはより高いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液し、次いで平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液よりも低いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液する[2]〜[4]のいずれかに記載の精製方法。
[7] 前記アフィニティリガンドを有する担体1がプロテインA、プロテインG、プロテインLまたはそれらの類縁物質をリガンドとする担体である[1]〜[6]のいずれかに記載の精製方法。
[8] 前記アフィニティリガンドを有する担体1がプロテインAまたはそれらの類縁物質をリガンドとする担体である[1]〜[7]のいずれかに記載の精製方法。
[9] 前記抗体または抗体由来物質が、免疫グロブリンG、免疫グロブリンG誘導体、または、Fc含有分子である[1]〜[8]のいずれかに記載の精製方法。
[10] 前記抗体または抗体由来物質が、Fab、scFv、diabody、または抗原結合部位含有分子である[1]〜[9]のいずれかに記載の精製方法。
[11] 前記陽イオン交換基を有する担体2が、カルボキシル基をリガンドとする担体である[1]〜[10]のいずれかに記載の精製方法。
[12] 前記カルボキシル基が酸性アミノ酸に由来する[11]に記載の精製方法。
[13] 前記抗体または抗体由来物質の溶出pHが5.0未満である[1]〜[12]のいずれかに記載の精製方法。
[14] 前記担体1のIgGに対する滞留時間6分での10%DBCが1mg/mL以上100mg/mL以下である[1]〜[13]のいずれかに記載の精製方法。
[15] 前記担体2のイオン交換容量が0.001mmol/mL以上0.5mmol/mL以下である[1]〜[14]のいずれかに記載の精製方法。
[16] 前記担体1の体積平均粒径が1μm以上1000μm以下であり、前記担体2の体積平均粒径が1μm以上1000μm以下である[1]〜[15]のいずれかに記載の精製方法。
[17] pKaが4.0以上であるカルボキシル基含有リガンドを有する陽イオン交換基を有する担体2に抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷した後、pH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する[1]〜[16]のいずれかに記載の精製方法。
[18] 前記カルボキシル基含有リガンドを有する陽イオン交換基を有する担体2のIgGに対する滞留時間6分での10%DBCが1mg/mL以上200mg/mL以下である[1]〜[17]のいずれかに記載の精製方法。
[19] 前記陽イオン交換基を有する担体2を充填したカラムの前にアフィニティリガンドを有する担体1を充填したカラムを連結して一体型カラムを作製し、中性pH条件で抗体または抗体由来物質含有溶液を前記一体型カラムに負荷した後に、pH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する[2]〜[18]のいずれかに記載の精製方法。
[20] 前記一体型カラムを構成する担体1と担体2の割合が、体積基準で、1/20以上20/1以下である[2]〜[19]のいずれかに記載の精製方法。
[21] 前記陽イオン交換基を有する担体2をアフィニティリガンドを有する担体1と共に混合状態で有する混合型カラムを作製し、中性pH条件で抗体又は抗体由来物質含有溶液を負荷してpH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する[2]〜[18]のいずれかに記載の精製方法。
[22] 前記混合型カラムを構成する担体1と担体2の割合が、体積基準で、1/20以上20/1以下である[2]〜[18]、[21]のいずれかに記載の精製方法。
[23] 吸着条件下における担体1のIgGに対する滞留時間6分での10%DBCに対する、担体2のIgGに対する滞留時間6分での10%DBCが、1/10倍以上10倍以下である[1]〜[22]のいずれかに記載の精製方法。
[24] [1]〜[23]のいずれかに記載の精製方法で精製された抗体または抗体由来物質。
[1] pKaが4.0以上であるカルボキシル基含有リガンドを有する陽イオン交換基を有する担体2に抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷した後、pH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する陽イオン交換基を有する担体の使用方法。
[2] 前記カルボキシル基含有リガンドが酸性アミノ酸に由来する[1]に記載の使用方法。
[3] 前記カルボキシル基含有リガンドを有する陽イオン交換基を有する担体2のIgGに対する滞留時間6分での10%DBCが1mg/mL以上200mg/mL以下である[1]または[2]に記載の使用方法。
[4] 前記陽イオン交換基を有する担体2のイオン交換容量が0.001mmol/mL以上0.5mmol/mL以下である[1]〜[3]のいずれかに記載の使用方法。
[5] 前記陽イオン交換基を有する担体2の体積平均粒径が1μm以上1000μm以下である[1]〜[4]のいずれかに記載の使用方法。
[6] 前記陽イオン交換基を有する担体2を充填したカラムの前にアフィニティリガンドを有する担体1を充填したカラムを連結して一体型カラムを作製し、中性pH条件で抗体または抗体由来物質含有溶液を前記一体型カラムに負荷した後に、pH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する[1]〜[5]のいずれかに記載の使用方法。
[7] 前記陽イオン交換基を有する担体2をアフィニティリガンドを有する担体1と共に混合状態で有する混合型カラムを作製し、中性pH条件で抗体又は抗体由来物質含有溶液を負荷してpH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する[1]〜[5]のいずれかに記載の使用方法。
[8] 前記一体型カラムまたは混合型カラムを平衡化溶液で平衡化し、前記抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷し、この負荷後溶出開始前に平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液よりも低イオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液する[6]または[7]に記載の使用方法。
[9] 前記一体型カラムまたは混合型カラムを平衡化溶液で平衡化し、前記抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷し、この負荷後溶出開始前に平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液と同じまたはより高いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液し、次いで平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液よりも低イオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液する[6]または[7]に記載の使用方法。
[10] 前記抗体または抗体由来物質が免疫グロブリンG、免疫グロブリンG誘導体、Fc含有分子、またはFab、scFv、diabodyもしくは抗原結合部位含有分子である[1]〜[9]のいずれかに記載の使用方法。
[11] 前記抗体または抗体由来物質の溶出を酸性pHでかつイオン強度のグラジエントで行う[1]〜[10]のいずれかに記載の使用方法。
[12] 前記抗体または抗体由来物質の溶出を酸性pHでかつイオン強度のステップワイズで行う[1]〜[10]のいずれかに記載の使用方法。
[13] [1]〜[12]のいずれかに記載の使用方法で精製された抗体または抗体由来物質。
例えば、本発明(第一態様)の精製方法は、前記抗体等に対するアフィニティリガンドを有する担体1と陽イオン交換基を有する担体2を用いた抗体等の精製方法であり、前記担体1を充填したカラムの下流側に前記担体2を充填したカラムを直結した一体型カラムまたは前記担体1と担体2の両方の混合物が充填された混合型カラムに、抗体等含有液を通液して抗体等をカラムに負荷し、ついで溶出液を通液することで負荷した抗体等を溶出させることを特徴とするものである。なお、本発明(第一態様)において、アフィニティリガンドを有する担体1は、好ましくは陽イオン交換基を含まず、陽イオン交換基を有する担体2は、好ましくはアフィニティリガンドを含まない。
本発明(第一態様、第二態様)における、「アフィニティリガンドを有する担体」(以下、アフィニティリガンドを有する担体1、アフィニティ担体またはアフィニティ担体1と称する場合がある)とは、抗原と抗体の結合に代表される、特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から標的(目的)の分子を選択的に捕集(結合)する物質がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものを示す。
第一態様、第二態様において、前記アフィニティリガンドは、標的分子結合ドメイン(単量体ペプチドまたは蛋白質、単ドメイン)を有していれば特に制限されないが、2個以上のドメインが連結された多量体ペプチドまたは蛋白質(複ドメイン)が好ましく、2〜10個がより好ましく、2〜8個、更に2〜6個のドメインが連結された多量体蛋白質であることが好ましい。これらの多量体蛋白質は、単一の標的分子結合ドメインの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであっても良いし、標的分子が同一であれば、複数種類の標的分子結合ドメインの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
斯かる10%DBCは、例えば以下の式により求めることができる。
DBC10%=(V10%−Vd)C0/Vc(式中、V10%は、IgGが10%漏出した時の溶液体積、Vdは配管内体積(例えば、インジェクションからカラム入り口までの配管内体積およびカラム出口から検出器までの配管内体積を含む)、C0は負荷液の抗体濃度(mg/mL)、Vcはカラム体積)。DBC10%を測定する場合、所定の流速、すなわち、所定の滞留時間(例えば1分〜10分、好適には3〜6分)で行うことが好適である。
本発明(第一態様、第二態様)における、「陽イオン交換基を有する担体」(以下、陽イオン交換基を有する担体2、陽イオン交換担体または陽イオン交換担体2と称する場合がある)は、アフィニティリガンドから標的分子である抗体等が溶出(脱離)する条件下で陽イオン交換基として機能し標的分子を捕捉できると共に、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のカウンターイオンにより、該標的分子の単量体(モノマー)、凝集体の順序でイオン強度依存的に溶出(脱離)出来る陽イオン交換基が水不溶性担体上に固定化されているものであれば良い。アフィニティリガンドからの標的分子の溶出pHである酸性pH域において、80%以上の回収率で標的分子を回収するため、陽イオン交換基として、弱酸性基であるカルボキシル基をリガンドとする陽イオン交換基(カルボキシル基含有リガンド)の利用が好ましい。また、前記カルボキシル基含有リガンドは、酸性アミノ酸に由来することが可能で、より好ましくはグルタミン酸に由来するものである。通常、アフィニティ担体からの溶出にはpH4.0以下の酸性pHが用いられることから、当該pHで高い回収率を得るには、本発明(第一態様、第二態様)の陽イオン交換リガンドであるカルボキシル基含有リガンドのpKaは4.0以上である。前記カルボキシル基含有リガンドのpKaは、好ましくは4.05以上6.5以下、より好ましくは4.10以上6.45以下である。pKaが低いと、抗体収率が低下する虞がある。
第一態様において、その好ましい態様では、陽イオン交換基が、カルボキシル基、スルホン基等であることが推奨される。中でも、カルボキシル基が好ましく、pKaが4.0以上のカルボキシル基がより好ましい。また、前記カルボキシル基は、酸性アミノ酸に由来することが可能で、より好ましくはグルタミン酸に由来するものである。さらに、アフィニティリガンドからの標的分子の溶出pH域において、局所的な酸性環境の形成を避けることが好ましく、弱酸性基であることが好ましい。たとえば、プロテインAをアフィニティリガンドとする担体を用いる場合は、陽イオン交換基としてカルボキシル基をリガンドとする陽イオン交換基の利用が好ましい。
従来では、陽イオン交換基を有する担体を単独で使用する際、陽イオン交換基pKa<溶出pHの条件で行われていたところ、陽イオン交換基を有する担体とアフィニティ担体を併用する為の好適な条件を本発明で見出したものである。前記関係を満足する限り、溶出時に標的タンパク質(抗体等)の電荷がプラス側に大きく帯電するのに対して、陽イオン交換基のリガンドがマイナスからプラス側への転化が比較的抑えられる為、プラスの電荷をさらに帯びた凝集抗体等を回収することができ、抗体モノマーが精製されやすくなると考えられる。
DBC10%=(V10%−Vd)C0/Vc(式中、V10%は、IgGが10%漏出した時の溶液体積、Vdは配管内体積(例えば、インジェクションからカラム入り口までの配管内体積およびカラム出口から検出器までの配管内体積を含む)、C0は負荷液の抗体濃度(mg/mL)、Vcはカラム体積)。DBC10%を測定する場合、所定の流速、すなわち、所定の滞留時間(例えば1分〜10分、好適には3〜6分)、所定pH(例えば3〜5、特に4)で行うことが好適である。
本発明(第一態様、第二態様)に用いることのできる「水不溶性担体」は、水に不溶な基材であって、抗体アフィニティリガンドと陽イオン交換基を固定化できれば特に制限されないが、例えば、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるGCL2000、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したSephacryl S−1000、アクリレート系の担体であるTOYOPEARL、アガロース系の架橋担体であるSepharose CL4B、Rapid Run Agarose Beads、および、セルロース系の架橋担体であるCellufineなどを例示することができる。
また、これらの水不溶性担体は、抗体アフィニティリガンド導入の前にリガンドが担体に共有結合できるように活性化されるが、市販の活性化担体を用いても良いし、自ら活性化を行っても良い。
リンカーを利用する固定化技術としては、担体とリガンドの距離を確保し、立体障害を排除して高性能化を図る方法の他、リンカーまたはスペーサーの中に官能基(例えば、帯電アミン)を付与、形成させる方法等が挙げられる。抗体アフィニティリガンドの固定化時にリンカーまたはスペーサー部分にリガンドを効果的に集積し、固定化収率の向上による分離性能の向上が検討されてきている。たとえば、リンカーアームの一部としてNHS活性化されたカルボン酸で誘導体化されたアガロース担体への蛋白質性リガンドの固定化技術が挙げられる(米国特許第5,260,373号、特開2010−133733、特開2010−133734)。
また、リンカーやスペーサーとは別に担体に会合性基を利用し、抗体アフィニティリガンドを担体に集積した後に、会合性基と抗体アフィニティリガンドの間に共有結合を形成させずに、水不溶性担体上に抗体アフィニティリガンドを個別に固定化する方法も提案されている(特開2011−256176)。
抗体医薬品の精製プラットホームプロセスに利用される第一クロマトグラフィーと第二クロマトグラフィーの代表例として、例えばプロテインAクロマトグラフィーと陽イオンクロマトグラフィーの組み合わせが用いられる。
吸着工程において、所定濃度の抗体または抗体由来物質含有溶液を担体に吸着させるが、抗体または抗体由来物質含有溶液の溶媒として、例えばPBS(約10mM リン酸、約150mM NaCl等)を使用してもよい。また、吸着工程の前に、平衡化工程を行ってもよいが、平衡化溶液の溶媒として、例えばPBS(約10mM リン酸、約150mM NaCl等)を使用してもよい。
(1)前記一体型カラムまたは混合型カラムを平衡化溶液で平衡化し、前記抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷し、この負荷後溶出開始前に平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液よりも低いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液(第2の洗浄液)を通液することが好ましく、(2)前記一体型カラムまたは混合型カラムを平衡化溶液で平衡化し、前記抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷し、この負荷後溶出開始前に平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液と同じまたはより高いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液(第1の洗浄液)を通液し、次いで平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液よりも低いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液(第2の洗浄液)を通液することも好ましい。上記(1)および(2)の方法は、通常のプロテインAクロマトグラフィーで使用される洗浄方法を、一体型カラムまたは混合型カラムにも適用するものであり、プロテインA担体に非特異的に吸着した不純物を洗い流すことができ、陽イオン交換担体に吸着した不純物をも洗い流すことができる。また、上記(1)は、例えば精製純度の高い抗体に対して行われることが好適であり、上記(2)は、例えば培養上清に対して行われることが好適である。上記(1)および(2)で使用される第2の洗浄液は、例えば10mM Tris/HCl pH7等の溶液であり、上記(2)で使用される第1の洗浄液は、例えば10mM Tris 1M NaCl pH7、10mM Tris pH7等の溶液である。なお、上記(1)および(2)の前に、平衡化溶液と同じイオン強度およびpHの溶液(例えば、PBS)で前洗浄してもよい。
第一態様、第二態様において、例えば、抗体等の溶出を酸性pHでかつイオン強度のグラジエントで行ってもよく、抗体等の溶出を酸性pHでかつイオン強度のステップワイズで行ってもよい。なお、洗浄工程のイオン強度と酸性溶出pHの組み合わせでも凝集体等がカラムに残留し溶出画分に混入しない場合は、イオン強度調節工程を省略することが出来る。
カルボキシル基導入担体の調製(調製例1)
4%アガロースビーズとして冷水に置換したLow density Glyoxal 4 Rapid Run(ABT社)を湿潤体積として4mLを反応容器にとり、冷やした1Mグルタミン酸(pH6)で5回洗浄し、回収後にスラリーの液量を7mLとした。クロマトチャンバー内で2時間転倒攪拌した後に、1Mのジメチルアミンボラン水溶液を0.5mL追加投入し、クロマトチャンバー内で1時間30分攪拌した。更に、一晩室温で転倒攪拌した。遠心して担体を沈降させた後に液面が6mLになるように上清を除去した中に、20mgの水素化ホウ素ナトリウムを直接加え、室温で更に2時間転倒攪拌した。水、0.1Mクエン酸、0.1M水酸化ナトリウム、および0.5MのNaClを添加したPBSで十分に洗浄し、グルタミン酸のアミノ基を介し還元的アミノ化法でアルデヒド基にカルボキシル基を導入したアガロース担体を得た。本陽イオン交換担体をGlyoxal−COOHとした。
カルボキシル基導入陽イオン交換担体として、CM−Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア;陽イオン交換担体A)、TOYOPEARL CM−650M(東ソー;陽イオン交換担体B)、FRACTOGEL COO(M)(メルク;陽イオン交換担体C)、Glyoxal−COOH(調製例1;陽イオン交換担体D)を1M KCl(pH2)で置換し、0.1M NaOHで滴定してpKaとイオン交換容量を求めた。結果を表1に示した。
カルボキシル基導入陽イオン交換担体として、CM−Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア)、TOYOPEARL CM−650M(東ソー)、Fractogel COO(M)(メルク)、Glyoxal−COOH(調製例1)をOmnifit社製のカラム(ID 0.66cm x Height 7cm)に充填し、0.5mg/mLに調製したヒトポリクローナル抗体(ガンマグロブリン・ニチヤク:日本製薬)を負荷液として、以下のクロマトグラフィー条件にて結合容量を測定した。負荷液のpHを3.7、4.2、または、4.7として、それぞれの結合容量を10%漏出の動的結合容量(10%DBC)として測定した。
カラム:ID 0.66cm x Height 7cm、2.4mL容(Omnifit社製)
流速:0.4mL/分(滞留時間:6分)
ポリクローナル抗体(IgG):ガンマグロブリン・ニチヤク(日本製薬)
負荷液:0.5mg−IgG/mL(5mMクエン酸:pH3.7、4.2、または、4.7)
平衡化液:5mMクエン酸(pH3.7、4.2、または、4.7)
溶出液:50mMクエン酸、0.5M塩化ナトリウム(pH3.7)
CIP液:0.1M水酸化ナトリウム、1M塩化ナトリウム
中和・再平衡化液:5mMクエン酸(pH3.7、4.2、または、4.7)
各クロマトグラフィー溶出液をゲルろ過に供し、凝集体とモノマーを分画し、そのエリア値の比較からモノマー含量を求めた。以下にゲルろ過条件を示した。
カラム:Superdex200 10/300 GL(ID 1cm x Height 30cm)(GEヘルスケア)
流速:0.5mL/分
検出波長:214nm
負荷液:100μL/Injection(吸光度値が1を超えない範囲に希釈)
溶離液:PBS(pH7.4)
陽イオン交換担体を用いたpH5緩衝液中での抗体の分離
陽イオン交換担体として、CM−Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア)、TOYOPEARL CM−650M(東ソー)、Fractogel COO(M)(メルク)、Glyoxal−COOH(調製例1)をOmnifit社製のカラム(ID 0.66cm x Height 7cm)に充填し、0.5mg/mLに調製したヒトポリクローナル抗体(ガンマグロブリン・ニチヤク:日本製薬)を負荷液として、以下のクロマトグラフィー条件にて分離を行った。溶出フラクションには、最終濃度として50−100mMのアルギニンを添加し、pH5〜6としてゲルろ過クロマトグラフィーにてモノマー含量の測定を行った。また、そのエリア値分析から各分画のモノマーおよび凝集体量を求めた。
カラム:ID 0.66cm x Height 7cm、2.4mL容(Omnifit社製)
流速:0.4mL/分(滞留時間:6分)、ただし、CIP以降は、0.8mL/分
ポリクローナル抗体(IgG):ガンマグロブリン・ニチヤク(日本製薬)
負荷液:0.5mg−IgG/mL(10mMクエン酸、pH5)
平衡化(5カラム体積):10mMクエン酸、pH5
負荷(30mg)
洗浄(5カラム体積):10mMクエン酸、pH5
溶出グラジエント(40カラム体積):A→Bリニアグラジエント
A液:10mMクエン酸、pH5
B液:250mMクエン酸、pH5
再生(4カラム体積):50mMクエン酸、250mM 塩化ナトリウム、pH5
CIP(4カラム体積):0.1M水酸化ナトリウム、1M塩化ナトリウム
中和・再平衡化(4カラム体積):10mMクエン酸、pH5
フラクション:1カラム体積
プロテインA担体を用いた抗体の分離
プロテインA担体として、MabSelect SuRe(GEヘルスケア)をOmnifit社製のカラム(ID 0.66cm x Height 7cm)に充填し、2.5mg/mLに調製したヒトポリクローナル抗体(ガンマグロブリン・ニチヤク:日本製薬)を負荷液として、以下のクロマトグラフィー条件にて分離を行った。溶出液には、最終濃度として50−100mMのアルギニンを添加し、pH5〜6としてゲルろ過クロマトグラフィーにてモノマー含量の測定を行った。また、そのエリア値分析から各分画のモノマーおよび凝集体量を求めた。
カラム:ID 0.66cm x Height 7cm、2.4mL容(Omnifit社製)
流速:0.4mL/分(滞留時間:6分)、ただし、CIP以降は、0.8mL/分
ポリクローナル抗体(IgG):ガンマグロブリン・ニチヤク(日本製薬)
負荷液:2.5mg−IgG/mL(PBS、pH7.4)
平衡化(5カラム体積):PBS、pH7.4
負荷(10mg、30mgまたは40mg)
洗浄(5カラム体積):PBS、pH7.4
洗浄2(4カラム体積):10mM Tris/HCl、pH7
溶出グラジエント(40カラム体積):A→Bリニアグラジエント
A液:1mMクエン酸、pH3.7
B液:250mMクエン酸、pH3.7
再生(4カラム体積):50mMクエン酸、250mM 塩化ナトリウム、pH3.7
CIP(4カラム体積):0.1M水酸化ナトリウム、1M塩化ナトリウム
中和・再平衡化(4カラム体積):PBS、pH7.4
プロテインA担体を充填したカラムとスルホプロピル基をリガンドとする陽イオン交換担体(SP−Sepharose Fast Flow)を充填したカラムとを連結した一体型カラムを用いた抗体の分離
プロテインA担体としてMabSelect SuRe(GEヘルスケア)を、陽イオン交換担体としてSP−Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア)をそれぞれOmnifit社製のカラム(ID 0.66cm x Height 7cm)に充填し、2本のカラムをプロテインA担体を充填したカラム、陽イオン交換担体を充填したカラムの順で連結し、1体のカラムとしてクロマトグラフィー操作を実施した。2.5mg/mLに調製したヒトポリクローナル抗体(ガンマグロブリン・ニチヤク:日本製薬)を負荷液として、以下のクロマトグラフィー条件にて分離を行った。なお、1カラム体積は、1本分の2.4mLとして操作した。溶出液には、最終濃度として50−100mMのアルギニンを添加し、pH5〜6としてゲルろ過クロマトグラフィーにてモノマー含量の測定を行った。また、そのエリア値分析から各分画のモノマーおよび凝集体量を求めた。
カラム:ID 0.66cm x Height 7cm、2.4mL容(Omnifit社製)の連結体
流速:0.4mL/分(滞留時間:6分)、ただし、CIP以降は、0.8mL/分
ポリクローナル抗体(IgG):ガンマグロブリン・ニチヤク(日本製薬)
負荷液:2.5mg−IgG/mL(PBS、pH7.4;10mM リン酸、150mM NaCl等)
平衡化(5カラム体積):PBS、pH7.4
負荷(40mg)
洗浄(5カラム体積):PBS、pH7.4
洗浄2(4カラム体積):10mM Tris/HCl、pH7
溶出グラジエント(40カラム体積):A→Bリニアグラジエント
A液:1mMクエン酸、pH3.7
B液:250mMクエン酸、pH3.7
再生(4カラム体積):50mMクエン酸、250mM 塩化ナトリウム、pH3.7
CIP(4カラム体積):0.1M水酸化ナトリウム、1M塩化ナトリウム
中和・再平衡化(4カラム体積):PBS、pH7.4
プロテインA担体を充填したカラムとpKaが4.0未満のカルボキシル基をリガンドとする陽イオン交換担体A(CM−Sepharose Fast Flow)を充填したカラムとを連結した一体型カラムを用いた抗体の分離
プロテインA担体としてMabSelect SuRe(GEヘルスケア)を、陽イオン交換担体AとしてCM−Sepharose Fast Flow(GEヘルスケア)をそれぞれOmnifit社製のカラム(ID 0.66cm x Height 7cm)に充填し、2本のカラムをプロテインA担体を充填したカラム、陽イオン交換担体Aを充填したカラムの順で連結し、1体のカラムとしてクロマトグラフィー操作を実施した。2.5mg/mLに調製したヒトポリクローナル抗体(ガンマグロブリン・ニチヤク:日本製薬)を負荷液として、比較例3のクロマトグラフィー条件にて分離を行った。なお、1カラム体積は、1本分の2.4mLとして操作した。溶出液には、最終濃度として50−100mMのアルギニンを添加し、pH5〜6としてゲルろ過クロマトグラフィーにてモノマー含量の測定を行った。また、そのエリア値分析から各分画のモノマーおよび凝集体量を求めた。
カラム:ID 0.66cm x Height 7cm、2.4mL容(Omnifit社製)の連結体
流速:0.4mL/分(滞留時間:6分)、ただし、CIP以降は、0.8mL/分
ポリクローナル抗体(IgG):ガンマグロブリン・ニチヤク(日本製薬)
負荷液:2.5mg−IgG/mL(PBS、pH7.4;10mM リン酸、150mM NaCl等)
平衡化(5カラム体積):PBS、pH7.4
負荷(40mg)
洗浄(5カラム体積):PBS、pH7.4
洗浄2(4カラム体積):10mM Tris/HCl、pH7
溶出グラジエント(40カラム体積):A→Bリニアグラジエント
A液:1mMクエン酸、pH3.7
B液:250mMクエン酸、pH3.7
再生(4カラム体積):50mMクエン酸、250mM 塩化ナトリウム、pH3.7
CIP(4カラム体積):0.1M水酸化ナトリウム、1M塩化ナトリウム
中和・再平衡化(4カラム体積):PBS、pH7.4
プロテインA担体を充填したカラムとカルボキシル基をリガンドとする陽イオン交換担体B(TOYOPEARL CM−650M)を充填したカラムとを連結した一体型カラムを用いた抗体の分離
プロテインA担体としてMabSelect SuRe(GEヘルスケア)を、陽イオン交換担体BとしてTOYOPEARL CM−650M(東ソー)をそれぞれOmnifit社製のカラム(ID 0.66cm x Height 7cm)に充填し、2本のカラムをプロテインA担体を充填したカラム、陽イオン交換担体Bを充填したカラムの順で連結し、1体のカラムとしてクロマトグラフィー操作を実施した。2.5mg/mLに調製したヒトポリクローナル抗体(ガンマグロブリン・ニチヤク:日本製薬)を負荷液として、比較例3のクロマトグラフィー条件にて分離を行った。なお、1カラム体積は、1本分の2.4mLとして操作した。溶出液には、最終濃度として50−100mMのアルギニンを添加し、pH5〜6としてゲルろ過クロマトグラフィーにてモノマー含量の測定を行った。また、そのエリア値分析から各分画のモノマーおよび凝集体量を求めた。
表2の各連結カラムの評価結果について、再生画分までのモノマー回収率、再生画分までの混合液中のモノマー含量、モノマー回収率80%までの溶出液混合液中のモノマー含量を比較例2と比較して示した。比較例2の再生画分までのCIP画分までに回収できたモノマーは99.9%であり、モノマー含量は93.5%であった。モノマー回収率が80%の時点で比較しても、比較例2のモノマー含量が93.4%であるのに対し、実施例1のモノマー含量は97.1%であり、モノマー含量が向上した。
プロテインA担体を充填したカラムとカルボキシル基をリガンドとする陽イオン交換担体C(Fractogel COO(M))を充填したカラムとを連結した一体型カラムを用いた抗体の分離
プロテインA担体としてMabSelect SuRe(GEヘルスケア)を、陽イオン交換担体CとしてFractogel COO(M)(メルク)をそれぞれOmnifit社製のカラム(ID 0.66cm x Height 7cm)に充填し、2本のカラムをプロテインA担体を充填したカラム、陽イオン交換担体Cを充填したカラムの順で連結し、1体のカラムとしてクロマトグラフィー操作を実施した。2.5mg/mLに調製したヒトポリクローナル抗体(ガンマグロブリン・ニチヤク:日本製薬)を負荷液として、比較例3のクロマトグラフィー条件にて分離を行った。なお、1カラム体積は、1本分の2.4mLとして操作した。溶出液には、最終濃度として50−100mMのアルギニンを添加し、pH5〜6としてゲルろ過クロマトグラフィーにてモノマー含量の測定を行った。また、そのエリア値分析から各分画のモノマーおよび凝集体量を求めた。
表2の各連結カラムの評価結果について、再生画分までのモノマー回収率、再生画分までの混合液中のモノマー含量、モノマー回収率80%までの溶出液混合液中のモノマー含量を比較例2と比較して示した。比較例2の再生画分までのCIP画分までに回収できたモノマーは99.9%であり、モノマー含量は93.5%であった。モノマー回収率が80%の時点で比較しても、比較例2のモノマー含量が93.4%であるのに対し、実施例2のモノマー含量は99.2%であり、モノマー含量が向上した。
プロテインA担体を充填したカラムとカルボキシル基をリガンドとする陽イオン交換担体D(Glyoxal−COOH)を充填したカラムとを連結したカラムを用いた抗体の分離
プロテインA担体としてMabSelect SuRe(GEヘルスケア)を、陽イオン交換担体DとしてGlyoxal−COOHをそれぞれOmnifit社製のカラム(ID 0.66cm x Height 7cm)に充填し、2本のカラムをプロテインA担体を充填したカラム、陽イオン交換担体Dを充填したカラムの順で連結し、1体のカラムとしてクロマトグラフィー操作を実施した。2.5mg/mLに調製したヒトポリクローナル抗体(ガンマグロブリン・ニチヤク:日本製薬)を負荷液として、比較例3のクロマトグラフィー条件にて分離を行った。なお、1カラム体積は、1本分の2.4mLとして操作した。溶出液には、最終濃度として50−100mMのアルギニンを添加し、pH5〜6としてゲルろ過クロマトグラフィーにてモノマー含量の測定を行った。また、そのエリア値分析から各分画のモノマーおよび凝集体量を求めた。
表2の各連結カラムの評価結果について、再生画分までのモノマー回収率、再生画分までの混合液中のモノマー含量、モノマー回収率80%までの溶出液混合液中のモノマー含量を比較例2と比較して示した。比較例2の再生画分までのCIP画分までに回収できたモノマーは99.9%であり、モノマー含量は93.5%であった。モノマー回収率が80%の時点で比較しても、比較例2のモノマー含量が93.4%であるのに対し、実施例3のモノマー含量は99.1%であり、モノマー含量が向上した。
プロテインA担体とカルボキシル基をリガンドとする陽イオン交換担体D(Glyoxal−COOH)とを1つのカラム内に混合充填した混合型カラムを用いた抗体の分離
プロテインA担体としてMabSelect SuRe(GEヘルスケア)を、陽イオン交換担体DとしてGlyoxal−COOHをそれぞれ4:1(体積比)に混合してOmnifit社製のカラム(ID 0.66cm x Height 7cm)に充填し、2.5mg/mLに調製したヒトポリクローナル抗体(ガンマグロブリン・ニチヤク:日本製薬)を負荷液として、比較例2のクロマトグラフィー条件にて分離を行った。抗体負荷量は、10mgとした。なお、1カラム体積は、1本分の2.4mLとして操作した。溶出液には、最終濃度として50−100mMのアルギニンを添加し、pH5〜6としてゲルろ過クロマトグラフィーにてモノマー含量の測定を行った。また、そのエリア値分析から各分画のモノマーおよび凝集体量を求めた。
表3の各連結カラムの評価結果について、再生画分までのモノマー回収率、再生画分までの混合液中のモノマー含量、モノマー回収率80%までの溶出液混合液中のモノマー含量を比較例2と比較して示した。比較例2の再生画分までのCIP画分までに回収できたモノマーは99.9%であり、モノマー含量は96.5%であった。モノマー回収率が80%の時点で比較しても、比較例2のモノマー含量が97.1%であるのに対し、実施例4のモノマー含量は99.1%であり、モノマー含量が向上した。
すなわち、本発明(第二態様)の使用方法を用いることで、アフィニティ担体から標的分子の溶出を行う酸性溶出pHで陽イオン交換担体からの抗体等の分離を行うこと、または、アフィニティ担体と陽イオン交換担体を連結または混合カラムとし、一体として抗体等の吸着、および溶出を行うことにより、抗体医薬品の製造プロセスの生産性向上と高純度化に寄与できる。
Claims (37)
- 抗体または抗体由来物質に対するアフィニティリガンドを有する担体1と陽イオン交換基を有する担体2を用いて連結または混合カラムとし、一体として抗体または抗体由来物質の吸着および溶出を行うことを特徴とする抗体または抗体由来物質の精製方法。
- 抗体または抗体由来物質に対するアフィニティリガンドを有する担体1と陽イオン交換基を有する担体2を用いた抗体または抗体由来物質の精製方法であり、
前記担体1を充填したカラムの下流側に前記担体2を充填したカラムを直結した一体型カラムまたは前記担体1と担体2の両方の混合物が充填された混合型カラムに、抗体または抗体由来物質含有液を通液して抗体または抗体由来物質をカラムに負荷し、
ついで溶出液を通液することで負荷した抗体または抗体由来物質を溶出させることを特徴とする抗体または抗体由来物質の精製方法。 - 前記抗体または抗体由来物質の溶出を酸性pHでかつイオン強度のグラジエントで行う請求項1または2に記載の精製方法。
- 前記抗体または抗体由来物質の溶出を酸性pHでかつイオン強度のステップワイズで行う請求項1または2に記載の精製方法。
- 前記一体型カラムまたは混合型カラムを平衡化溶液で平衡化し、前記抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷し、この負荷後溶出開始前に平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液よりも低いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液する請求項2〜4のいずれかに記載の精製方法。
- 前記一体型カラムまたは混合型カラムを平衡化溶液で平衡化し、前記抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷し、この負荷後溶出開始前に平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液と同じまたはより高いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液し、次いで平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液よりも低いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液する請求項2〜4のいずれかに記載の精製方法。
- 前記アフィニティリガンドを有する担体1がプロテインA、プロテインG、プロテインLまたはそれらの類縁物質をリガンドとする担体である請求項1〜6のいずれかに記載の精製方法。
- 前記アフィニティリガンドを有する担体1がプロテインAまたはそれらの類縁物質をリガンドとする担体である請求項1〜7のいずれかに記載の精製方法。
- 前記抗体または抗体由来物質が、免疫グロブリンG、免疫グロブリンG誘導体、または、Fc含有分子である請求項1〜8のいずれかに記載の精製方法。
- 前記抗体または抗体由来物質が、Fab、scFv、diabody、または抗原結合部位含有分子である請求項1〜9のいずれかに記載の精製方法。
- 前記陽イオン交換基を有する担体2が、カルボキシル基をリガンドとする担体である請求項1〜10のいずれかに記載の精製方法。
- 前記カルボキシル基が酸性アミノ酸に由来する請求項11に記載の精製方法。
- 前記抗体または抗体由来物質の溶出pHが5.0未満である請求項1〜12のいずれかに記載の精製方法。
- 前記担体1のIgGに対する滞留時間6分での10%DBCが1mg/mL以上100mg/mL以下である請求項1〜13のいずれかに記載の精製方法。
- 前記担体2のイオン交換容量が0.001mmol/mL以上0.5mmol/mL以下である請求項1〜14のいずれかに記載の精製方法。
- 前記担体1の体積平均粒径が1μm以上1000μm以下であり、前記担体2の体積平均粒径が1μm以上1000μm以下である請求項1〜15のいずれかに記載の精製方法。
- pKaが4.0以上であるカルボキシル基含有リガンドを有する陽イオン交換基を有する担体2に抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷した後、pH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する請求項1〜16のいずれかに記載の精製方法。
- 前記カルボキシル基含有リガンドを有する陽イオン交換基を有する担体2のIgGに対する滞留時間6分での10%DBCが1mg/mL以上200mg/mL以下である請求項1〜17のいずれかに記載の精製方法。
- 前記陽イオン交換基を有する担体2を充填したカラムの前にアフィニティリガンドを有する担体1を充填したカラムを連結して一体型カラムを作製し、中性pH条件で抗体または抗体由来物質含有溶液を前記一体型カラムに負荷した後に、pH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する請求項2〜18のいずれかに記載の精製方法。
- 前記一体型カラムを構成する担体1と担体2の割合が、体積基準で、1/20以上20/1以下である請求項2〜19のいずれかに記載の精製方法。
- 前記陽イオン交換基を有する担体2をアフィニティリガンドを有する担体1と共に混合状態で有する混合型カラムを作製し、中性pH条件で抗体又は抗体由来物質含有溶液を負荷してpH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する請求項2〜18のいずれかに記載の精製方法。
- 前記混合型カラムを構成する担体1と担体2の割合が、体積基準で、1/20以上20/1以下である請求項2〜18、21のいずれかに記載の精製方法。
- 吸着条件下における担体1のIgGに対する滞留時間6分での10%DBCに対する、担体2のIgGに対する滞留時間6分での10%DBCが、1/10倍以上10倍以下である請求項1〜22のいずれかに記載の精製方法。
- 請求項1〜23のいずれかに記載の精製方法で精製された抗体または抗体由来物質。
- pKaが4.0以上であるカルボキシル基含有リガンドを有する陽イオン交換基を有する担体2に抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷した後、pH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する陽イオン交換基を有する担体の使用方法。
- 前記カルボキシル基含有リガンドが酸性アミノ酸に由来する請求項25に記載の使用方法。
- 前記カルボキシル基含有リガンドを有する陽イオン交換基を有する担体2のIgGに対する滞留時間6分での10%DBCが1mg/mL以上200mg/mL以下である請求項25または26に記載の使用方法。
- 前記陽イオン交換基を有する担体2のイオン交換容量が0.001mmol/mL以上0.5mmol/mL以下である請求項25〜27のいずれかに記載の使用方法。
- 前記陽イオン交換基を有する担体2の体積平均粒径が1μm以上1000μm以下である請求項25〜28のいずれかに記載の使用方法。
- 前記陽イオン交換基を有する担体2を充填したカラムの前にアフィニティリガンドを有する担体1を充填したカラムを連結して一体型カラムを作製し、中性pH条件で抗体または抗体由来物質含有溶液を前記一体型カラムに負荷した後に、pH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する請求項25〜29のいずれかに記載の使用方法。
- 前記陽イオン交換基を有する担体2をアフィニティリガンドを有する担体1と共に混合状態で有する混合型カラムを作製し、中性pH条件で抗体又は抗体由来物質含有溶液を負荷してpH4.0以下の酸性バッファーを使用して抗体または抗体由来物質を溶出する請求項25〜29のいずれかに記載の使用方法。
- 前記一体型カラムまたは混合型カラムを平衡化溶液で平衡化し、前記抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷し、この負荷後溶出開始前に平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液よりも低イオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液する請求項30または31に記載の使用方法。
- 前記一体型カラムまたは混合型カラムを平衡化溶液で平衡化し、前記抗体または抗体由来物質含有溶液を負荷し、この負荷後溶出開始前に平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液と同じまたはより高いイオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液し、次いで平衡化溶液および抗体または抗体由来物質含有溶液よりも低イオン強度の、かつ溶出液よりも高いpHの洗浄液を通液する請求項30または31に記載の使用方法。
- 前記抗体または抗体由来物質が免疫グロブリンG、免疫グロブリンG誘導体、Fc含有分子、またはFab、scFv、diabodyもしくは抗原結合部位含有分子である請求項25〜33のいずれかに記載の使用方法。
- 前記抗体または抗体由来物質の溶出を酸性pHでかつイオン強度のグラジエントで行う請求項25〜34のいずれかに記載の使用方法。
- 前記抗体または抗体由来物質の溶出を酸性pHでかつイオン強度のステップワイズで行う請求項25〜34のいずれかに記載の使用方法。
- 請求項25〜36のいずれかに記載の使用方法で精製された抗体または抗体由来物質。
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