JP6236948B2 - 抗体精製用溶出液および当該溶出液を用いた抗体精製方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗体を吸着可能な分離剤に吸着した前記抗体を、温和な条件下で溶出可能な溶出液、および当該溶出液を用いた前記抗体の精製方法に関する。特に本発明は、抗体を吸着可能な分離剤としてＦｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤を用いたときの、温和な条件下で抗体を溶出可能な溶出液、および当該溶出液を用いた抗体の精製方法に関する。

近年、ガンや感染症等の治療に抗体を含む医薬品（抗体医薬）が用いられている。抗体医薬に用いる抗体は、遺伝子工学的手法により得られた、当該抗体を発現可能な細胞（たとえば、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞等）を培養後、カラムクロマトグラフィー等を用いて高純度に精製し、製造する。

カラムクロマトグラフィーのうち、アフィニティークロマトグラフィーは、吸着対象物質に対し特異的に結合可能な物質（リガンド）を不溶性担体に固定化して得られる分離剤を用いたクロマトグラフィーであり、多くの夾雑物を含む培養液から吸着対象物質を特異的に吸着／分離させることができる。

抗体精製のためのアフィニティークロマトグラフィー用分離剤として一般に用いられているのは、黄色ブドウ球菌由来のタンパク質であるプロテインＡをリガンドとして不溶性担体に固定化した分離剤（プロテインＡ固定化ゲル）である。プロテインＡ固定化ゲルを用いた抗体精製は、通常、中性付近で当該ゲルに抗体を吸着させた後、当該ゲルの平衡化に用いた緩衝液で当該ゲルを洗浄することで夾雑物を除去し、最後に酸性緩衝液で当該ゲルに吸着した抗体を溶出させることで行なう。本操作を１回行なうことで抗体の純度を９０％以上まで向上させることができる。しかしながらプロテインＡは病原菌である黄色ブドウ球菌由来のタンパク質であり、プロテインＡ固定化ゲルからプロテインＡが漏れた場合における免疫原性発生のリスクが否定できない。

黄色ブドウ球菌由来のタンパク質であるプロテインＡよりも安全性が高く、かつ抗体と特異的に結合する物質として、抗体のＦｃ領域を高度に認識し特異的に結合する、Ｆｃ結合性タンパク質がある。Ｆｃ結合性タンパク質をリガンドとして不溶性担体に固定化した分離剤（Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル）を用いた抗体精製は、プロテインＡ固定化ゲルを用いたときと同様、中性付近で当該ゲルに抗体を吸着させた後、当該ゲルの平衡化に用いた緩衝液で当該ゲルを洗浄することで夾雑物を除去し、最後に酸性緩衝液で当該ゲルに吸着した抗体を溶出させることで行なう（特許文献１）。

特許文献１に開示の方法では、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルに吸着した抗体の溶出に用いる酸性緩衝液として、ｐＨ３．５以下の緩衝液を用いる。しかしながら、抗体が当該酸性緩衝液にさらされることで、抗体の構造変化や抗体同士の会合・凝集反応が生じるおそれがあった。抗体分子の酸による構造変化や会合・凝集反応は抗体の力価を落とすのみならず、抗体を医薬品として投与した際に抗原性が現れるなどの品質上の問題となることから、より温和な条件（より中性に近い条件）で抗体を溶出可能な溶液が望まれた。

特開２０１２−０７２０９１号公報

本発明の目的は、Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤に抗体を含む溶液を添加することで前記分離剤に吸着した前記抗体を、より温和な条件（より中性に近い条件）で溶出可能な溶出液、および当該溶出液を用いた抗体の精製方法を提供することにある。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、溶出液に一定濃度の溶出改善剤を添加することで、Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤（Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル）に吸着した抗体を、より温和な条件（より中性に近い条件）で溶出できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は以下の（Ａ）から（Ｈ）の態様を包含する。

（Ａ）Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤に抗体を含む溶液を添加することで前記分離剤に吸着した前記抗体を溶出させるための溶出液であって、当該溶出液が０．１Ｍから３．５Ｍのアミノ酸を含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の緩衝液である、前記溶出液。

（Ｂ）アミノ酸が、アルギニン、プロリン、スレオニン、ヒスチジンから選ばれる１つ以上である、（Ａ）に記載の溶出液。

（Ｃ）アミノ酸が、アルギニン、プロリン、またはアルギニンおよびプロリンである、（Ｂ）に記載の溶出液。

（Ｄ）さらに以下の（１）から（３）のうちいずれか１つを含む、（Ａ）から（Ｃ）のいずれかに記載の溶出液。
（１）５％（ｖ／ｖ）から５０％（ｖ／ｖ）のエタノール
（２）０．１Ｍから３Ｍのイミダゾール
（３）０．１Ｍから３Ｍの尿素
（Ｅ）Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤に抗体を含む溶液を添加することで前記分離剤に吸着した前記抗体を溶出させるための溶出液であって、当該溶出液が５％（ｖ／ｖ）から５０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の緩衝液である、前記溶出液。

（Ｆ）Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤に抗体を含む溶液を添加することで前記分離剤に吸着した前記抗体を溶出させるための溶出液であって、当該溶出液が０．１Ｍから３Ｍのイミダゾールを含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の緩衝液である、前記溶出液。

（Ｇ）Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤に抗体を含む溶液を添加することで前記分離剤に吸着した前記抗体を溶出させるための溶出液であって、当該溶出液が０．１Ｍから３Ｍの尿素を含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の緩衝液である、前記溶出液。

（Ｈ）Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤に抗体を含む溶液を添加することで前記分離剤に前記抗体を吸着させ、前記分離剤に吸着した前記抗体を（Ａ）から（Ｇ）のいずれかに記載の溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明においてＦｃ結合性タンパク質とは、ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（具体的には天然型ヒトＦｃγＲＩの場合、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目のグルタミンから２９２番目のヒスチジンまでの領域）を構成するタンパク質のことをいう。ただし必ずしもヒトＦｃγＲＩ細胞外領域の全領域でなくてもよく、ヒトＦｃγＲＩ細胞外領域を構成するポリペプチドのうち、少なくとも抗体のＦｃ領域に結合する本来の機能を発現し得る領域のポリペプチドを含んでいればよい。当該ヒトＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
（ｉｉ）配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、があげられる。

前記（ｉｉ）の具体例としては、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質や、配列番号２に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸残基において以下の（１）から（４２）のうち少なくともいずれか１つの置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（特願２０１２−２７０３７５号）があげられる。
（１）配列番号２の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（２）配列番号２の３８番目のプロリンがセリンに置換
（３）配列番号２の５３番目のロイシンがグルタミンに置換
（４）配列番号２の６２番目のグルタミン酸がバリンに置換
（５）配列番号２の６３番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（６）配列番号２の６６番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７）配列番号２の６７番目のセリンがプロリンに置換
（８）配列番号２の６９番目のアラニンがバリンまたはスレオニンに置換
（９）配列番号２の７１番目のセリンがスレオニンまたはロイシンに置換
（１０）配列番号２の７８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１１）配列番号２の８１番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号２の８４番目のセリンがスレオニンに置換
（１３）配列番号２の８８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号２の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号２の１１９番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１６）配列番号２の１２７番目のバリンがアラニンに置換
（１７）配列番号２の１４６番目のアルギニンがリジンに置換
（１８）配列番号２の１４７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号２の１５１番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２０）配列番号２の１７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（２１）配列番号２の１９１番目のアルギニンがリジンに置換
（２２）配列番号２の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（２３）配列番号２の２００番目のロイシンがメチオニンに置換
（２４）配列番号２の２１３番目のスレオニンがアラニンに置換
（２５）配列番号２の２１６番目のバリンがアラニンに置換
（２６）配列番号２の２２１番目のロイシンがアルギニンに置換
（２７）配列番号２の２２９番目のセリンがアスパラギンに置換
（２８）配列番号２の２３６番目のイソロイシンがリジンに置換
（２９）配列番号２の２４４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（３０）配列番号２の２５３番目のスレオニンがアラニンに置換
（３１）配列番号２の２９０番目のアルギニンがグルタミンに置換
（３２）配列番号２の２９３番目のリジンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号２の２９７番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３４）配列番号２の３０６番目のプロリンがスレオニンに置換
（３５）配列番号２の３４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（３６）配列番号２の４５番目のグルタミンがリジンに置換
（３７）配列番号２の８２番目のグルタミンがプロリンに置換
（３８）配列番号２の１７７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３９）配列番号２の２１３番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号２の２４２番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４１）配列番号２の２５３番目のスレオニンがセリンに置換
（４２）配列番号２の２７１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
本発明において不溶性担体とは、抗体の吸着／溶出に用いる溶液や溶剤に対して不溶性であり、かつ前述したＦｃ結合性タンパク質を共有結合で固定化するための官能基（例えばヒドロキシ基、エポキシ基、トレシル基、ビニル基、アミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、カルボニルイミダゾール基）を有した物質であればよく、ジルコニア、ゼオライト、シリカ、皮膜シリカ等の無機系物質に由来した担体であってもよいし、セルロース、アガロース、デキストラン等の天然有機高分子物質に由来した担体であってもよいし、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリメタクリレート、ビニルポリマー等の合成有機高分子物質に由来した担体であってもよい。なお担体表面に有する官能基がヒドロキシ基の場合、活性化剤を用いて、当該ヒドロキシ基から、Ｆｃ結合性タンパク質と共有結合可能な活性化基を形成させるとよい。前記活性化剤の具体例として、エピクロロヒドリン（活性化基としてエポキシ基を形成）、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（活性化基としてエポキシ基を形成）、トレシルクロリド（活性化基としてトレシル基を形成）、ビニルブロミド（活性化基としてビニル基を形成）があげられる。またヒドロキシ基をアミノ基やカルボキシ基などに変換した後、活性化剤を作用させて活性化する手法も例示することができ、活性化剤の具体例として３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（活性化基としてマレイミド基を形成）、１，１’−カルボニルジイミダゾール（活性化基としてカルボニルイミダゾール基を形成）があげられる。

本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルに吸着した抗体を溶出させるのに用いる溶出液として、一定濃度の溶出改善剤を添加したｐＨ３．９からｐＨ５．０の溶出液を用いることを特徴とする。なお本明細書において一定濃度の溶出改善剤は、０．１Ｍから３．５Ｍのアミノ酸、５％（ｖ／ｖ）から５０％（ｖ／ｖ）のエタノール、０．１Ｍから３Ｍのイミダゾール、０．１Ｍから３Ｍの尿素、のいずれかを指す。溶出改善剤の添加濃度は、前述した濃度範囲の中から、Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルや前記ゲルを用いて精製する抗体が変性しない条件で、適宜決定すればよい。なお前述した溶出改善剤を２種類以上組み合わせてもよい。溶出改善剤を２種類以上組み合わせた本発明の溶出液の一例として、
０．１Ｍから３．５Ｍのアミノ酸と０．１Ｍから３．５Ｍの前記アミノ酸とは異なるアミノ酸とを含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の溶出液や、
０．１Ｍから３．５Ｍのアミノ酸と５％（ｖ／ｖ）から５０％（ｖ／ｖ）のエタノールとを含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の溶出液や、
０．１Ｍから３．５Ｍのアミノ酸と０．１Ｍから３Ｍのイミダゾールとを含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の溶出液や、
０．１Ｍから３．５Ｍのアミノ酸と０．１Ｍから３Ｍの尿素とを含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の溶出液や、
０．１Ｍから３Ｍの尿素と５％（ｖ／ｖ）から５０％（ｖ／ｖ）のエタノールとを含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の溶出液、
があげられる。

溶出改善剤としてアミノ酸を用いる場合、アルギニン単独、プロリン単独、スレオニン単独、ヒスチジン単独、前記４つのアミノ酸の組み合わせ、のいずれかを用いると好ましく、アルギニン単独、プロリン単独、アルギニンとプロリンの組み合わせ、のいずれかを用いると、より好ましい。

一定濃度の溶出改善剤を添加した本発明の溶出液は、特許文献１（特開２０１２−０７２０９１号公報）に開示の方法と比較し、より温和な条件（具体的にはｐＨ３．９からｐＨ５．０の範囲）でＦｃ結合性タンパク質結合ゲルに吸着した抗体を溶出させることができる。本発明の溶出液を製造するには、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液など、ｐＨ３．９からｐＨ５．０で緩衝能を有する緩衝液に、前述した一定濃度の溶出改善剤を添加して製造すればよい。

Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルに抗体を含む溶液を添加して前記ゲルに前記抗体を吸着させた後、本発明の溶出液を用いて前記分離剤に吸着した前記抗体を溶出させることで、前記抗体を高い回収率で精製することができる。本発明の精製方法で精製可能な抗体は、リガンドであるＦｃ結合性タンパク質と結合可能なＦｃ領域を少なくとも含んだ抗体であればよく、完全な形の抗体である必要はない。具体的には、抗体のＦｃ領域を含むキメラ抗体や、抗体のＦｃ領域と他のタンパク質との融合体が例示できる。

本発明は、Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤に抗体を含む溶液を添加することで前記分離剤に吸着した前記抗体を溶出させるための溶出液として、０．１Ｍから３．５Ｍのアミノ酸を含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の緩衝液を用いることを特徴としており、特許文献１（特開２０１２−０７２０９１号公報）に開示の方法と比較し、より温和な条件（より中性に近い条件）で前記分離剤に吸着した抗体を高回収率で溶出させることができる。そのため、溶出した抗体の構造変化や当該抗体同士の会合・凝集反応が生じるリスクを低減でき、抗体医薬などを高歩留まりでかつ高品質に製造可能となる。なお、５％（ｖ／ｖ）から５０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の緩衝液や、０．１Ｍから３Ｍのイミダゾールを含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の緩衝液や、０．１Ｍから３Ｍの尿素を含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の緩衝液も、同様の効果を有する。

本発明の溶出液を用いて、Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤（Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル）に吸着した抗体を溶出させたときの、抗体の回収率を示した図。黒ひし形がクエン酸緩衝液のみを溶出液としたときの、白三角が１Ｍのアルギニンと１０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含むクエン酸緩衝液（溶出液Ａ）を溶出液としたときの、白丸が１Ｍのアルギニンと０．５Ｍのイミダゾールを含むクエン酸緩衝液（溶出液Ｂ）を溶出液としたときの、それぞれ結果である。

以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲルの調製
（１）配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドで大腸菌を形質転換して得られた形質転換体を培養し、得られた菌体から前記Ｆｃ結合性タンパク質を精製することで、不溶性担体に固定化させるリガンドを調製した。なお、配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質のうち、１番目のメチオニンから２２番目のアラニンまでがＰｅｌＢシグナルペプチド（配列番号５）のアミノ酸配列、２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、２９９番目のシステインから３００番目のグリシンまでがシステインタグ（アミノ酸配列：ＣＧ）のアミノ酸配列である。また配列番号３において、ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（２５番目のグルタミンから２９８番目のアスパラギン酸までの領域）は、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃ（配列番号４に記載のアミノ酸配列中３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域、特開２０１１−２０６０４６号公報）のうち、
配列番号４の３７番目のスレオニンがイソロイシンに、
配列番号４の６３番目のバリンがグルタミン酸に、
配列番号４の６９番目のアラニンがバリンに、
配列番号４の７１番目のセリンがロイシンに、
配列番号４の８４番目のセリンがスレオニンに、
配列番号４の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に、
配列番号４の２９２番目のプロリンがリジンに、
配列番号４の２９３番目のグルタミン酸がリジンに、
配列番号４の２９７番目のグルタミンがリジンに、
配列番号４の３０１番目のヒスチジンがリジンに、
配列番号４の３０４番目のプロリンがリジンに、
それぞれ置換したＦｃ結合性タンパク質である。またＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃのアミノ酸配列は、配列番号１に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列において１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当し、当該領域において６０箇所置換が生じている（特開２０１１−２０６０４６号公報）。
（２）ビニルポリマーゲル（トヨパール、東ソー製）に１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテルおよびエチレンジアミンを順次反応させることによってアミノ基を導入後、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルを反応させることで、活性化基としてマレイミド基を有したビニルポリマーゲルを得た。
（３）（２）で得られたマレイミド基を有したビニルポリマーゲルに、（１）で調製したリガンドを反応させることにより、Ｆｃ結合性タンパク質をビニルポリマーゲルに固定化した分離剤（Ｆｃ結合性タンパク質固定化ゲル）を調製し、当該ゲルをカラムに充填することでアフィニティーカラム（５ｍｍφ×５ｍｍ、容量０．１ｍＬ）を作製した。

比較例１ クエン酸緩衝液を溶出液としたときの各ｐＨにおける抗体回収率評価
実施例１で作製したアフィニティーカラムをクロマトグラフ（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ、ＧＥヘルスケア社製）に取り付け、以下に示す方法にて抗体回収率評価を行なった。なお、流速は０．５ｍＬ／分、検出器の波長は２８０ｎｍにて実施した。
（１）カラムをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で平衡化し、３ｍｇ／ｍＬのガンマグロブリン溶液２ｍＬをカラムにアプライする。
（２）カラムにＰＢＳを６ｍＬ流し、カラム未吸着の抗体を洗浄する。
（３）ｐＨ３．０、ｐＨ３．４、ｐＨ３．８、ｐＨ４．２、ｐＨ４．６またはｐＨ５．０に調整した５０ｍＭクエン酸緩衝液をカラムに２ｍＬ流し、カラムから溶出した液を回収する（回収液１）。
（４）カラムにＰＢＳを１．５ｍＬ流し、カラムを中性に戻す。
（５）ｐＨ３．０に調整した５０ｍＭクエン酸緩衝液をカラムに２ｍＬ流し、カラムに残留した抗体を完全に溶出させる（回収液２）。
（６）（３）で得られた回収液１、および（５）で得られた回収液２にそれぞれ含まれる抗体を、２８０ｎｍの吸光度測定にて定量し、下記の式に従って回収率を算出する。
回収率［％］＝回収液１の抗体量／（回収液１の抗体量＋回収液２の抗体量）×１００
結果を表１に示す。ｐＨ３．８以下の酸性緩衝液を用いると抗体をほぼ回収することができるが、ｐＨ３．８よりも中性側の緩衝液を用いると抗体の回収率が大きく低下するのがわかる。

実施例２ アルギニンまたは塩化ナトリウムを添加した溶出液の抗体回収率評価
実施例１で作製したアフィニティーカラムをクロマトグラフ（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ、ＧＥヘルスケア社製）に取り付け、以下に示す方法にてアルギニンまたは塩化ナトリウムを含む溶出液の抗体回収率評価を行なった。なお、流速は０．５ｍＬ／分、検出器の波長は２８０ｎｍにて実施した。
（１）カラムをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で平衡化し、３ｍｇ／ｍＬのガンマグロブリン溶液２ｍＬをカラムにアプライする。
（２）カラムにＰＢＳを６ｍＬ流し、カラム未吸着の抗体を洗浄する。
（３）アルギニンまたは塩化ナトリウム（それぞれ濃度は１Ｍまたは３Ｍ）を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）をカラムに２ｍＬ流し、カラムから溶出した液を回収する（回収液１）。
（４）カラムにＰＢＳを１．５ｍＬ流し、カラムを中性に戻す。
（５）ｐＨ３．０に調整した５０ｍＭクエン酸緩衝液をカラムに２ｍＬ流し、カラムに残留した抗体を完全に溶出させる（回収液２）。
（６）比較例１（６）と同様な方法で回収率を算出する。

結果を表２に示す。クエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）にアルギニンを１Ｍから３Ｍ添加した溶出液を用いることで、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）のみを溶出液として用いたときと比較し、抗体の回収率が大幅に向上することがわかる。一方、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）に塩化ナトリウムを添加した溶出液を用いると、抗体の回収率が大幅に低下するため、溶出液への塩化ナトリウムの添加は好ましくないといえる。

実施例３ アルギニンを添加した溶出液の各ｐＨにおける抗体回収率評価
実施例１で作製したアフィニティーカラムをクロマトグラフ（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ、ＧＥヘルスケア社製）に取り付け、以下に示す方法にてアルギニンを含む溶出液の抗体回収率評価を行なった。なお、流速は０．５ｍＬ／分、検出器の波長は２８０ｎｍにて実施した。
（１）カラムをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で平衡化し、３ｍｇ／ｍＬのガンマグロブリン溶液２ｍＬをカラムにアプライする。
（２）カラムにＰＢＳを６ｍＬ流し、カラム未吸着の抗体を洗浄する。
（３）アルギニン（濃度は１Ｍまたは３Ｍ）を含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．４、ｐＨ３．８、ｐＨ４．２またはｐＨ４．６）をカラムに２ｍＬ流し、カラムから溶出した液を回収する（回収液１）。
（４）カラムにＰＢＳを１．５ｍＬ流し、カラムを中性に戻す。
（５）ｐＨ３．０に調整した５０ｍＭクエン酸緩衝液をカラムに２ｍＬ流し、カラムに残留した抗体を完全に溶出させる（回収液２）。
（６）比較例１（６）と同様な方法で回収率を算出する。

結果を表３に示す。ｐＨ３．８以下の酸性領域ではアルギニン添加による抗体回収率の向上はみられなかった。一方、ｐＨ３．８よりも中性側の領域では、溶出液にアルギニンを添加することで、クエン酸緩衝液のみを溶出液として用いたときと比較し、抗体の回収率が向上することがわかる。

実施例４ 溶出改善剤の検討
実施例１で作製したアフィニティーカラムをクロマトグラフ（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ、ＧＥヘルスケア社製）に取り付け、以下に示す方法にて緩衝液に添加する添加剤の検討を行なった。なお、流速は０．５ｍＬ／分、検出器の波長は２８０ｎｍにて実施した。
（１）カラムをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で平衡化し、３ｍｇ／ｍＬのガンマグロブリン溶液２ｍＬをカラムにアプライする。
（２）カラムにＰＢＳを６ｍＬ流し、カラム未吸着の抗体を洗浄する。
（３）以下に示す添加剤のいずれかを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）をカラムに２ｍＬ流し、カラムから溶出した液を回収する（回収液１）。
検討した添加剤：１Ｍのアルギニン、０．５Ｍまたは１Ｍのプロリン、０．５Ｍのスレオニン、０．５Ｍのヒスチジン、１０％（ｖ／ｖ）のエタノール、０．５Ｍのイミダゾール、０．５Ｍの尿素、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０（商品名）
（４）カラムにＰＢＳを１．５ｍＬ流し、カラムを中性に戻す。
（５）ｐＨ３．０に調整した５０ｍＭクエン酸緩衝液をカラムに２ｍＬ流し、カラムに残留した抗体を完全に溶出させる（回収液２）。
（６）比較例１（６）と同様な方法で回収率を算出する。なお２８０ｎｍの光を吸収する成分を含む回収液は、事前に透析により緩衝液交換を行なっている。

結果を表４に示す。Ｔｗｅｅｎ２０を添加したときはクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）のみを溶出液として用いたときとほぼ同じ抗体回収率であったが、アミノ酸（アルギニン、プロリン、スレオニン、ヒスチジン）、エタノール、イミダゾール、尿素を添加したときは、クエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）のみを溶出液として用いたときと比較し抗体回収率が向上していた。従って、アミノ酸、エタノール、イミダゾール、尿素は溶出改善剤として使用可能といえる。中でも、アルギニン、プロリン、尿素は、クエン酸緩衝液への添加により抗体回収率が特に向上しているため、好ましい溶出改善剤といえる。

実施例５ 溶出改善剤を組み合わせたときの抗体回収率評価
実施例４よりアミノ酸、エタノール、イミダゾール、尿素が溶出改善剤として使用可能であることが判明した。そこで、これらの溶出改善剤を組み合わせることで抗体回収率がさらに向上するか、検討した。検討は、実施例１で作製したアフィニティーカラムをクロマトグラフ（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ、ＧＥヘルスケア社製）に取り付けた後、以下に示す方法で行なった。なお、流速は０．５ｍＬ／分、検出器の波長は２８０ｎｍにて実施した。
（１）カラムをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で平衡化し、３ｍｇ／ｍＬのガンマグロブリン溶液２ｍＬをカラムにアプライする。
（２）カラムにＰＢＳを６ｍＬ流し、カラム未吸着の抗体を洗浄する。
（３）以下に示す溶出改善剤の組み合わせのいずれかを含む５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）をカラムに２ｍＬ流し、カラムから溶出した液を回収する（回収液１）。
検討した溶出改善剤の組み合わせ：１Ｍのアルギニンと０．５Ｍのプロリンとの組み合わせ、１Ｍのアルギニンと１０％（ｖ／ｖ）のエタノールとの組み合わせ、１Ｍのアルギニンと０．５Ｍのイミダゾールとの組み合わせ、１Ｍのアルギニンと０．５Ｍの尿素との組み合わせ、０．５Ｍのプロリンと１０％（ｖ／ｖ）のエタノールとの組み合わせ、０．５Ｍのプロリンと０．５Ｍの尿素との組み合わせ、０．５Ｍの尿素と１０％（ｖ／ｖ）のエタノールとの組み合わせ
（４）カラムにＰＢＳを１．５ｍＬ流し、カラムを中性に戻す。
（５）ｐＨ３．０に調整した５０ｍＭクエン酸緩衝液をカラムに２ｍＬ流し、カラムに残留した抗体を完全に溶出させる（回収液２）。
（６）比較例１（６）と同様な方法で回収率を算出する。なお２８０ｎｍの光を吸収する成分を含む回収液は、事前に透析により緩衝液交換を行なっている。

結果を表５に示す。溶出改善剤（アミノ酸、エタノール、イミダゾール、尿素）を組み合わせることで、一種類の溶出改善剤を用いたときと比較し、抗体の回収率がさらに向上することがわかる。

実施例６ 改善された溶出液による、各ｐＨにおける抗体回収率評価
実施例５で検討した溶出液のうち、１Ｍのアルギニンと１０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含むクエン酸緩衝液（溶出液Ａ）と、１Ｍのアルギニンと０．５Ｍのイミダゾールを含むクエン酸緩衝液（溶出液Ｂ）について、各溶出液のｐＨにおける抗体回収率の変化を確認した。確認は、実施例１で作製したアフィニティーカラムをクロマトグラフ（ＡＫＴＡｐｒｉｍｅ、ＧＥヘルスケア社製）に取り付けた後、以下に示す方法で行なった。なお、流速は０．５ｍＬ／分、検出器の波長は２８０ｎｍにて実施した。
（１）カラムをＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で平衡化し、３ｍｇ／ｍＬのガンマグロブリン溶液２ｍＬをカラムにアプライする。
（２）カラムにＰＢＳを６ｍＬ流し、カラム未吸着の抗体を洗浄する。
（３）溶出液Ａまたは溶出液Ｂ（溶出液のｐＨは、ｐＨ３．４、ｐＨ３．８、ｐＨ４．２またはｐＨ４．６）をカラムに２ｍＬ流し、カラムから溶出した液を回収する（回収液１）。
（４）カラムにＰＢＳを１．５ｍＬ流し、カラムを中性に戻す。
（５）ｐＨ３．０に調整した５０ｍＭクエン酸緩衝液をカラムに２ｍＬ流し、カラムに残留した抗体を完全に溶出させる（回収液２）。
（６）比較例１（６）と同様な方法で回収率を算出する。なお２８０ｎｍの光を吸収する成分を含む回収液は、事前に透析により緩衝液交換を行なっている。

結果を表６および図１に示す。クエン酸緩衝液のみを溶出液としたときはｐＨ３．８よりも中性側では抗体の回収率が大幅に減少している一方、溶出液Ａおよび溶出液Ｂを溶出液としたときはｐＨ３．８よりも中性側であっても高い回収率を保っていることがわかる。

本発明により、抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製において、従来よりも中性に近い温和な条件で、かつ高い回収率で精製することができる。これにより、抗体の品質劣化を抑制しながら、歩留り良く製造することが可能となる。すなわち、抗体医薬品の安全性を向上させると同時にコスト削減が可能であり、産業上大変有益である。

Claims (4)

1. Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤に抗体を含む溶液を添加することで前記分離剤に吸着した前記抗体を溶出させるための溶出液であって、当該溶出液が０．１Ｍから３．５Ｍのアミノ酸および５％（ｖ／ｖ）から５０％（ｖ／ｖ）のエタノールを含むｐＨ３．９からｐＨ５．０の緩衝液であり、前記アミノ酸がアルギニンおよびプロリンから選択される１つ以上である、前記溶出液。
2. 前記アミノ酸がアルギニンである、請求項１に記載の溶出液。
3. 前記アミノ酸がプロリンである、請求項１に記載の溶出液。
4. Ｆｃ結合性タンパク質を不溶性担体に固定化した分離剤に抗体を含む溶液を添加することで前記分離剤に前記抗体を吸着させ、前記分離剤に吸着した前記抗体を請求項１から３のいずれか一項に記載の溶出液を用いて溶出させる、抗体の精製方法。

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