JP7159642B2 - カラムの抗体に対する保持力の測定方法 - Google Patents
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(1)溶離液
クエン酸水素二ナトリウム1.5水和物(ナカライテスク製)を6.578g取り、ミリQ水に溶解後、メスフラスコで500mLにメスアップした。溶液を0.2μmのフィルターでろ過し、50mMクエン酸二ナトリウム水溶液を調製した。同様の手順で、10mMから300mMのクエン酸二ナトリウム水溶液も調製した。
(2)カラム洗浄緩衝液
(1)と同様の手順で、50mMのクエン酸緩衝液(pH4.5)を調製した。
(3)抗体サンプル
市販の抗体2種(サングロポール:CSLベーリング製、グロブリン筋注:JB製)を終濃度2g/Lとなるように50mMのクエン酸二ナトリウム水溶液で希釈し、調製した。
溶離液(濃度 50mM)と抗体サンプル(サングロポール)をクロマト装置(東ソー製)に設置した。カラムオーブン温度は25℃、流速は0.3mL/分、検出器は280nmの吸光度測定に設定した。様々な抗体保持力を有する5種のヒトFcγRIIIA固定化カラムを、それぞれクロマト装置に設置後、溶離液にて平衡化した。抗体を負荷量10μLにてカラムに添加後、アイソクラティック法で溶出することで抗体保持力を評価した結果を図1に示す。各々のカラムが抗体を4つのピークに分離することが判明した。また、抗体保持力に準じた保持時間の増減が確認できた。
溶離液(濃度:50mM)と抗体サンプル(サングロポールおよびグロブリン筋注)をクロマト装置(島津製)に設置した。カラムオーブン温度は25℃、抗体負荷量は10μL、流速は0.3mL/分、検出器は280nmの吸光度測定に設定した。2本のヒトFcγRIIIA固定化カラムについて、それぞれクロマト装置に設置後、溶離液にて平衡化した。抗体をカラムに添加後、アイソクラティック法で溶出することで抗体保持力を測定した。測定終了後、カラム洗浄液(50mMのクエン酸緩衝液(pH4.5))にて5分間カラムを洗浄し、溶離液にて再平衡化することでカラム性能を再生した。本操作を3回繰り返し分析した。得られたクロマトグラムを解析し、ピーク3の保持時間とバラつきの評価をした結果を表1に示す。CV%値より、本法はバラつきの少ない優れた分析再現性があることが判明した。
溶離液(濃度:10~300mM)と抗体サンプル(サングロポール)をクロマト装置(東ソー製)に設置した。カラムオーブン温度は25℃、サンプル負荷量は10μL、流速は0.3mL/分、検出器は280nmの吸光度測定に設定した。2種のカラム(低親和性型FcγRIIIA固定化カラムおよび高親和性型FcγRIIIA固定化カラム)を用いて、溶離液によるカラム平衡化、抗体添加、アイソクラティック法による分析、カラム洗浄液による再生、溶離液による再平衡化を各溶離液条件にて行った。溶離液濃度の影響を評価した結果を表2に示す。溶離液濃度が高いほど溶出力が強くなり、保持時間が短くなることが判明した。リガンド密度やFc結合性タンパク質の親和性が高い場合は、クエン酸二ナトリウム水溶液の濃度を調整することで対応できることが判明した。
溶離液(濃度:50mM)と抗体サンプル(サングロポール)をクロマト装置(東ソー製)に設置した。カラムオーブン温度は15℃から35℃、サンプル負荷量は10μL、流速は0.3mL/分、検出器は280nmの吸光度測定に設定した。単一のカラムを用いて、溶離液によるカラム平衡化、抗体添加、アイソクラティック法による分析、カラム洗浄液による再生、溶離液による再平衡化を各温度条件にて行った。測定温度の影響を評価した結果を表3に示す。温度が高いほど保持時間が短くなることが判明した。
Claims (4)
- Fc結合性タンパク質を固定化した不溶性担体を充填したカラムに、クエン酸二ナトリウム水溶液を添加して前記カラムを平衡化する工程と、
平衡化した前記カラムに抗体を含む溶液を添加する工程と、
クエン酸二ナトリウム水溶液を溶離液として用いたアイソクラティック法で前記抗体を溶出させる工程と、
を含んでなる、
前記抗体に対する保持力として保持時間又は保持係数を指標とすることを特徴とする、
前記カラムの前記抗体に対する保持力の測定方法。 - Fc結合性タンパク質として、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIおよびそのアミノ酸変異体を使用することを特徴とする、請求項1に記載の測定方法。
- 溶離液が10mM以上1000mM以下のクエン酸二ナトリウムを含むことを特徴とする、請求項1又は2のいずれかに記載の測定方法。
- 測定温度として4℃以上50℃以下で実施することを特徴とする、請求項1~3のいずれかに記載の測定方法。
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