JP6420756B2 - アフィニティークロマトグラフィーマトリックス - Google Patents

Description

本発明は、アフィニティークロマトグラフィーの分野に関し、より具体的には突然変異した１以上のプロテインＡドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）、又はプロテインＺを有するリガンドを含有する分離マトリックスに関する。本発明はまたかかる分離マトリックスによる対象とするタンパク質の分離方法にも関する。

免疫グロブリン、特にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、製造又は開発のいずれかで世界的に最も普及しているバイオ医薬品の代表である。この特定の治療市場に対する高い商業上の需要、従ってその価値のため、製薬会社は、それぞれのｍＡｂの製造プロセスの生産性を最大限にする一方で関連するコストを制御するために多大な努力を払って来ている。

アフィニティークロマトグラフィーは、殆どの場合、モノクローナル又はポリクローナル抗体のようなこれらの免疫グロブリン分子の精製における重大な工程の１つとして使用される。特に興味のある１群のアフィニティー試薬は免疫グロブリン分子の不変の部分に特異的に結合することができるタンパク質であり、かかる相互作用は抗体の抗原結合特異性とは独立している。かかる試薬は、限定されることはないが血清若しくは血漿製剤又は細胞培養由来の供給材料のようないろいろな試料からの免疫グロブリンのアフィニティークロマトグラフィー回収のために広く使用することができる。かかるタンパク質の一例は、異なる種由来のＩｇＧ免疫グロブリンのＦｃ及びＦａｂ部分に結合することができるドメインを含有するブドウ球菌のプロテインＡである。

ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）に基づく試薬は、その高い親和性及び選択性に起因して、バイオテクノロジーの分野で、例えば抗体の捕捉及び精製のため、並びに検出のためのアフィニティークロマトグラフィーにおいて、広範な用途が見出されている。現在、ＳｐＡに基づくアフィニティー媒体は、おそらく、細胞培養由来の工業用供給材料を含めていろいろな試料からモノクローナル抗体及びその断片を単離するための最も広く使用されているアフィニティー媒体である。従って、プロテインＡリガンドを含む様々なマトリックスは、例えば、天然のプロテインＡ（例えばＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）の形態で、また組換えプロテインＡ（例えばｒＰｒｏｔｅｉｎＡ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）からなるものが商業的に入手可能である。より具体的には、商業用組換えプロテインＡ製品で行われる遺伝子操作は、支持体へのその付着を容易にするためのものである。

これらの応用では、他のアフィニティークロマトグラフィー用途と同様に、汚染物質の確実な除去に総合的な配慮が必要とされる。例えば、かかる汚染物質は、例えばタンパク質、炭水化物、脂質、細菌及びウィルスを始めとする望ましくない生体分子又は微生物のような、クロマトグラフィー手法において固定相又はマトリックスに吸着し溶出されない分子であり得る。マトリックスからのかかる汚染物質の除去は、通常、所望の産物の最初の溶出後、その後の使用の前にマトリックスを再生するために行われる。かかる除去では、通常、汚染物質を固定相から溶出することができる薬剤を使用する現場洗浄（cleaning-in-place, ＣＩＰ）といわれる公知の手法を使用する。しばしば使用されるかかる種類の薬剤の１つは、固定相を通過するアルカリ性溶液である。現在最も広く使用されている洗浄・消毒用薬剤はＮａＯＨであり、その濃度は汚染の程度及び性質に応じて０．１Ｍから例えば１Ｍまでの範囲であり得る。この方策は、１３を超えるｐＨ値にマトリックスを曝露することになる。タンパク質性のアフィニティーリガンドを含有する多くのアフィニティークロマトグラフィーマトリックスの場合、かかるアルカリ性環境は極めて苛酷な条件であり、その結果関与する高いｐＨに対するリガンドの不安定性のために能力が低下する。

従って、広範な研究が、アルカリ性ｐＨ値に耐える改良された能力を示す工学処理されたタンパク質リガンドの開発に集中して来ている。例えば、Ｇｕｅｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８０（２０００）、１６９−１７８）は、連鎖球菌のアルブミン結合性ドメイン（ＡＢＤ）のアルカリ性環境における安定性を改良するためにタンパク質工学を提案している。Ｇｕｅｌｉｃｈ ｅｔ ａｌは、４つのアスパラギン残基の全てがロイシン（１つの残基）、アスパラギン酸（２つの残基）及びリシン（１つの残基）により置換されたＡＢＤの突然変異体を創成した。さらに、Ｇｕｅｌｉｃｈ ｅｔ ａｌは、彼らの突然変異体が天然のタンパク質と類似の標的タンパク質結合挙動を示し、工学処理されたリガンドを含有するアフィニティーカラムが、アルカリ性条件に繰り返して曝露された後、元の工学処理されてないリガンドを用いて製造されたカラムより高い結合能力を示すことを報告している。こうして、４つのアスパラギン残基全てを、構造及び機能に重大な影響を及ぼすことなく置換することができると結論されている。

最近の研究は、プロテインＡ（ＳｐＡ）に変化を起こさせて同様な特性を奏することも可能であることを示している。米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号は、少なくとも１つのアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に突然変異させると、ＳｐＡのＢドメイン、又はＳｐＡのＢドメインに由来する合成構築物であるプロテインＺ（米国特許第５１４３８４４号）のような親のＳｐＡと比較して、約１３〜１４までのｐＨ値において増大した化学的安定性が付与されることを開示している。著者らは、これらの突然変異したタンパク質をアフィニティーリガンドとして使用すると、その分離媒体は予想通りアルカリ性の薬剤を用いた洗浄手順により良好に耐えることができるということを示している。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５５号は、突然変異したリガンドがプロテアーゼにより良好に耐えることにより、分離プロセスにおけるリガンドの漏出を低減することができるということを示している。別の米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号は、アルカリに対して安定なＳｐＡドメインを、例えばＧ２９Ａ突然変異によりさらに変性させて、リガンドがＦａｂに対する親和性を欠くがＦｃ親和性を保持するようにすることができるということを示している。

歴史的に、５つのＩｇＧ結合性ドメインを含有する天然のプロテインＡがあらゆるプロテインＡアフィニティー媒体の生産に使用されている。組換え技術を使用して、いずれも４又は５のＩｇＧ結合性ドメインを含有する多くのプロテインＡ構築物が生産されて来ている。最近の研究では、二量体リガンドが四量体リガンドと比較して同様な、又は増大した結合能力を有することが示されている（国際公開第２０１０／０８００６５号）。

米国特許第７９９３８４８号

ある種の抗体は低いｐＨで凝集する傾向があり、又は感受性である（例えば活性を失う可能性がある）ことがよく知られている。この分野では、抗体又は関連標的に対して増大した溶出ｐＨを有するタンパク質リガンドを含有する分離マトリックスを得る必要性が相変わらず存在する。さらに、ｍＡｂプロセスの初めの捕捉工程において選択性が改良され、そのため宿主細胞タンパク質及び抗体凝集体の排除が改良される必要性がある。

本発明の第１の局面は、増大したｐＨにおける結合した免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質の放出、並びに結合した宿主細胞タンパク質及び／又は免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質の凝集体に対するよりも高いｐＨ値における単量体の免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質の選択的な放出を含めて改良された解離特性をもつ突然変異した免疫グロブリン−又はＦｃ−結合性タンパク質を提供することである。これは請求項１に定義されている突然変異した免疫グロブリン−又はＦｃ−結合性プロテインＡによって達成される。

本発明の第２の局面は、増大したｐＨにおける結合した免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質の溶出、並びに結合した宿主細胞タンパク質及び／又は免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質の凝集体に対するよりも高いｐＨ値における単量体の免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質の選択的な溶出を含めて改良された溶出特性をもつアフィニティー分離マトリックスを提供することである。これは請求項９に定義されているアフィニティー分離マトリックスによって達成される。

本発明の第３の局面は、１以上のＦｃ含有タンパク質を分離する方法を提供することであって、この方法では増大したｐＨにおける結合したＦｃ含有タンパク質の溶出並びに結合した宿主細胞タンパク質及び／又はＦｃ含有タンパク質の凝集体に対するよりも高いｐＨ値における単量体のＦｃ含有タンパク質の選択的な溶出が可能になる。これは請求項１６に記載の方法によって達成される。

本発明の第４の局面は、吸着したＦｃ含有タンパク質を有するマトリックスのための溶出バッファーを選択する方法を提供することであって、この方法では、結合した宿主細胞タンパク質及び／又はＦｃ含有タンパク質の凝集体に対するよりも高いｐＨ値における単量体のＦｃ含有タンパク質の選択的な溶出を可能にするバッファーの選択が可能になる。これは請求項２８に記載の方法によって達成される。

本発明のさらなる適切な実施形態は従属請求項に記載されている。

図１は、プロテインＺの３つの変種と共に、プロテインＡの５つのドメインの各々のアミノ酸配列のアラインメントを示す。プロテインＡのＢドメインのＨ１８に対応する位置のアスパラギン又はヒスチジンは太字で表示されている。３つのα−ヘリックスの位置も示されている（Ｇｒａｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ ２０００、９７（１０）：５３９９−５４０４；Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８１、２０（９）：２３６１−２３７０）。 図２は、プロトタイプＺ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４に対するモノクローナル抗体及び宿主細胞タンパク質のｐＨ勾配溶出クロマトグラムのオーバーレイを示す。 図３は、比較のプロトタイプＺ４に対するモノクローナル抗体及び宿主細胞タンパク質のｐＨ勾配溶出クロマトグラムのオーバーレイを示す。 図４は、図２に記載したＺ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４を用いた実験のｍＡｂ画分Ｂ７、Ｂ１２及びＣ２に対するサイズ排除クロマトグラフィーの結果を示す代表的なクロマトグラムのオーバーレイである。

定義
用語「タンパク質」は、本明細書において、タンパク質並びにその断片を記載するために使用されている。すなわち、三次元構造を示すいかなるアミノ酸の鎖も用語「タンパク質」に含まれ、従ってタンパク質断片が包含される。

タンパク質の「機能性変異体」という用語は、本明細書において、本発明に関連してアフィニティー（親和性）及び安定性と定義される機能が本質的に保持されている変異体タンパク質を意味する。従って、機能に関連しない１以上のアミノ酸は交換されてもよい。

用語「親分子」は、本明細書において、本発明による突然変異（本明細書では単に「変異」ともいう。）が導入される前の対応するタンパク質に対して使用されている。

用語「構造安定性」とは分子の三次元形態の完全性(integrity)をいい、「化学的安定性」は化学的分解に耐える能力を指す。

用語「Ｆｃ結合性」タンパク質は、そのタンパク質が免疫グロブリンのＦｃ（「断片、結晶化可能」ともいわれる）領域に結合することができることを意味する。しかしながら、Ｆｃ結合性プロテインが免疫グロブリンのＦａｂ領域のような他の領域にも結合できることを除外するわけではない。

用語「Ｆｃ含有タンパク質」は、免疫グロブリンのＦｃ領域又は断片を含むタンパク質を意味する。Ｆｃ含有タンパク質は、Ｆｃ領域／断片を含むか又は免疫グロブリン全体を含む免疫グロブリン又は融合タンパク質若しくはコンジュゲートであることができる。

本明細書において、アミノ酸は、その完全な名称でいわない場合、慣用の１文字又は３文字記号で表示する。

変異は、本明細書では、交換位置の番号の前に野生型又は非変異アミノ酸を表示し、番号の後に変異アミノ酸を表示することによって定義される。例えば、位置１８のヒスチジン（Ｈ）からグルタミン酸（Ｅ）への変異はＨ１８Ｅと表示される。欠失変異は、欠失した位置の番号の前に野生型又は突然変異してないアミノ酸を表示し、番号の後に「ｄｅｌ」を表示することにより定義される。例えば、位置１８におけるヒスチジンの欠失はＨ１８ｄｅｌと表示される。

第１の局面において、本発明は、ブドウ球菌プロテインＡの１以上の変異免疫グロブリン−又はＦｃ−結合性ドメイン（単量体ともいわれる）（すなわちＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及び／又はＣドメイン）又はプロテインＺ若しくは配列番号７又は配列番号８で定義される変異体のようなこれらの機能性変異体を含む免疫グロブリン−又はＦｃ−結合性タンパク質を開示する。１以上の変異単量体の少なくとも１つにおいて、プロテインＡのＢドメイン（配列番号４）又はプロテインＺ（配列番号６）のＨ１８に対応する位置のアスパラギン又はヒスチジンは、プロリンでもアスパラギンでもない第１のアミノ酸残基で置換されている。さらに、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＰ５７に対応する位置のアミノ酸残基がプロリンであってかつプロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＮ２８に対応する位置のアミノ酸残基がアスパラギンである場合には、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアミノ酸残基はセリン、スレオニン又はリシンのいずれでもない。この変異タンパク質の利点は、Ｈ１８変異をもたない免疫グロブリン−又はＦｃ−結合性タンパク質より高いｐＨレベルで、その変異タンパク質が免疫グロブリン及びＦｃ含有タンパク質と結合し、またそれらを放出するということである。プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアスパラギン又はヒスチジン残基の変異は、免疫グロブリン及びＦｃ含有タンパク質、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ、又はＦｃ断片を含有する融合タンパク質の溶出ｐＨを予想外に増大する。好ましくは、溶出ｐＨは０．２〜１．０超のｐＨだけ増大する。より好ましくは、溶出ｐＨは少なくとも０．３ｐＨ増大し、最も好ましくは溶出ｐＨは少なくとも０．４ｐＨ増大する。或いは、溶出ｐＨは＞４．０、好ましくはｐＨ＞４．２に増大し、一方標的分子の収率は少なくとも８０％、又は好ましくは＞９５％である。免疫グロブリン及びその他のＦｃ含有タンパク質は低いｐＨレベルで凝集する傾向があるので、バイオプロセシングにおけるタンパク質の使用にとって重要である。これらの凝集体は潜在的に免疫原性であり、免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質の医薬使用の前に除去する必要がある。このため、プロセスのコストが大きく上昇する。

プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアスパラギン又はヒスチジン残基の突然変異の追加の利点は、マトリックスに吸着する宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）又は抗体若しくはＦｃ含有タンパク質の凝集体が、抗体／Ｆｃ含有タンパク質単量体よりも高いｐＨで溶出することである。次に、ＨＣＰ及び凝集体がまだマトリックスに結合しているｐＨで溶出することによって、単量体の抗体又はＦＣ含有プロテインをより高い純度で回収することが可能である。Ｈ１８突然変異をもたないリガンドを有する比較のマトリックスの場合、結合したＨＣＰ及び凝集体は抗体の単量体と共に溶出する。

幾つかの実施形態では、リガンドはまた、例えば、ＳｐＡドメインＢ又はプロテインＺの少なくとも１つの単量体ドメインの少なくとも１つのアスパラギン残基をグルタミン以外のアミノ酸に突然変異させることによって、アルカリに対して安定にされる。既に述べたように、米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号は、少なくとも１つのアスパラギン残基がグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に突然変異すると、その突然変異によって高いｐＨにおける増大した化学的安定性がリガンドに付与される（例えば、Ｎ２３Ｔ）ことを開示している。さらに、これらのリガンドを含むアフィニティー媒体はアルカリ性薬剤を用いる洗浄手順に対してより良好に耐えることができる。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５５号は、突然変異したリガンドはまた、プロテアーゼに対してもより良好に耐えることができ、従って分離工程においてリガンドの漏出が低減することを示している。これらの出願の開示は援用によりその全体が本明細書の一部をなす。

幾つかの実施形態では、そのように製造されたリガンドは抗体のＦａｂ部分／領域に対する実質的な親和性を欠如しているが、Ｆｃ部分／領域に対する親和性を有している。幾つかの実施形態では、リガンドの少なくとも１つのグリシンはアラニンで置換されている。米国特許出願公開第２００６／０１９４９５０号は、アルカリ安定なドメインを、例えばＧ２９Ａ突然変異によりさらに変性させて、リガンドがＦａｂに対する親和性を欠くがＦｃ親和性を保持するようにすることができるということを示している。この出願の開示は援用によりその全体が本明細書の内容の一部をなす。本明細書で使用するアミノ酸の番号付けは当技術分野で従来から使用されており、プロテインＡのドメインＢ上の位置によって例示され、当業者はＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃの各ドメインに対する突然変異するべき位置を容易に認識することができる。

幾つかの実施形態ではは、ロイシン残基とグルタミン残基との間に位置するアスパラギン残基も、例えばスレオニン残基に突然変異されている。すなわち、１つの実施形態では、配列番号６で定義される配列の位置２３のアスパラギン残基は、例えばスレオニン残基に突然変異されている。特定の実施形態ではは、配列番号６で定義される配列の位置４３のアスパラギン残基も、例えばグルタミン酸に突然変異されている。アミノ酸位置４３が突然変異されている実施形態ではは、Ｎ２３Ｔのような少なくとも１つの追加の突然変異と組み合わせるのが最も有利のようである。

従って、幾つかの実施形態では、本発明の突然変異したタンパク質は配列番号４又は６で定義される配列の少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％又は好ましくは少なくとも約９５％を含み、但しアスパラギン突然変異が位置２１にはない。

本明細書で、配列番号４はＳｐＡのＢドメインのアミノ酸配列を定義する。
ＡＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＧＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
配列番号６はプロテインＺとして公知のタンパク質を規定する。
ＶＤＮＫＦＮＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＨＬＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫ
プロテインＺはＳｐＡのＢドメインに由来する合成の構築物であり、位置２９のグリシンがアラニンに交換されている。例えば、Ｓｔaｈｌ ｅｔ ａｌ、１９９９：Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｆｏｃｕｓ ｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ、ｉｎ Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ、Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｍ．Ｃ．Ｆｌｅｃｋｉｎｇｅｒ及びＳ．Ｗ．Ｄｒｅｗ編 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、８−２２参照。

１つの実施形態では、上記突然変異体タンパク質は、配列番号４、５、６、７又は８で定義されるアミノ酸配列からなるか、又はその機能性変異体であって、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のヒスチジンが置換されている機能性変異体である。もう１つ別の実施形態では、上記突然変異体タンパク質は、配列番号１、２又は３で定義されるアミノ酸配列からなるか、又はその機能性変異体であって、プロテインＡのＢドメインのＨ１８に対応する位置のアスパラギンが置換されている機能性変異体である。この関連で使用されている用語「機能性変異体」は、突然変異体タンパク質の、免疫グロブリン又はＦｃ含有タンパク質に対する親和性又は増大したｐＨ値の環境における改良された化学的安定性に影響を及ぼさないアミノ酸位置に１以上の追加の変化を含むあらゆる類似の配列を包含する。

上述したように、長期間アルカリ性条件で高い結合能力を有するリガンドとして有用な突然変異体タンパク質を達成するために、位置２１のアスパラギン残基の突然変異は回避される。１つの実施形態では、位置３のアスパラギン残基は突然変異させない。

当業者には容易に理解されるように、位置１８でのアスパラギン又はヒスチジンの突然変異、位置５７及び２８の突然変異、アルカリ安定性を提供するための突然変異、並びにＧからＡへの突然変異は慣用の分子生物学技術を用いていかなる順序でも実施できる。さらに、リガンドは、突然変異したタンパク質リガンドをコードする核酸配列を含有するベクターによって発現することができる。或いは、タンパク質合成技術によって作成することもできる。所定の配列のペプチド及びタンパク質を合成する方法は当技術分野で周知であり一般に利用可能である。

幾つかの実施形態では、嵩高い側鎖を有するアミノ酸、例えばチロシン、トリプトファン又はメチオニンはＨ１８位での置換基として回避することができる。嵩高い側鎖はタンパク質の三次構造を乱し得、そのため免疫グロブリン又はＦｃ結合特性に影響を及ぼし得る。

幾つかの実施形態では、加えて、位置５７でのプロリン及び位置２８でのアスパラギンの少なくとも１つが第２のアミノ酸残基で置換されている。これの利点は、より高い結合能力と共にさらにより高い溶出ｐＨ値を達成することができるということである。幾つかの実施形態では、位置５７及び２８のアミノ酸残基はプロリンでもアスパラギンでもない。

幾つかの実施形態では、位置１８のアミノ酸残基はセリン、グルタミン酸、アスパラギン酸、スレオニン及びリシンからなる群から選択される。これらのアミノ酸で、特に高い溶出ｐＨレベルを達成することができる。

幾つかの実施形態では、位置５７及び２８のアミノ酸残基の少なくとも１つはアラニン及びイソロイシンからなる群から選択される。

幾つかの実施形態では、タンパク質は、配列番号５、６、７又は８で定義され親分子に由来する１以上の突然変異した単量体を含み、突然変異はＨ１８Ｅ、Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ、Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ、Ｎ２８Ａ，Ｐ５７Ｉ、及びＨ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ，Ｐ５７Ｉからなる群から選択される。

幾つかの実施形態では、タンパク質は、配列番号１４、１６、１７又は１８で定義される１以上の突然変異した単量体を含む。

幾つかの実施形態では、タンパク質は、３、４、５又は６量体のように少なくとも２つの突然変異した単量体を含み、多量体タンパク質を形成する。単量体は共有結合し得、例えば単一のポリペプチド鎖の一部を形成し得る。突然変異した単量体は同一であってもよいが、本発明のいろいろ異なる突然変異した単量体であることもできる。多量体タンパク質は、本発明の単量体に加えて、プロテインＡの他の突然変異した又は突然変異してないＩｇＧ結合性ドメインも含み得る。幾つかの実施形態では、多量体リガンドの単量体ドメインの少なくとも１つにおいてプロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアスパラギン又はヒスチジンが置換される。他の実施形態では、多量体リガンドの全ての単量体ドメインのアスパラギン又はヒスチジン残基が置換される。

幾つかの実施形態では、本発明の多量体タンパク質は、一続き、好ましくは０〜１５のアミノ酸、例えば０〜５、０〜１０又は５〜１０のアミノ酸の範囲のアミノ酸により互いに結合した単量体単位を含む。好ましくは、かかる結合の性質はタンパク質単位の空間的立体構造を不安定化しない。これは、例えば、その結合中におけるプロリンの存在を回避することによって達成することができる。さらにまた、結合は、好ましくは、アルカリ性環境中で、突然変異したタンパク質単位の特性を損なわない程充分に安定であるべきである。このために、結合がアスパラギンを含有しなければ有利である。結合がグルタミンを含有しなければさらに有利であり得る。

幾つかの実施形態では、本二量体リガンドは配列番号９の配列を含む。
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＥＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＥＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
幾つかの実施形態では、本四量体リガンドは配列番号１１の配列を含む。
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＩＫＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＩＫＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＩＫＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＮＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＩＫＣ
幾つかの実施形態では、本四量体リガンドは配列番号１２の配列を含む。
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＰＫＣ
幾つかの実施形態では、本四量体リガンドは配列番号１３の配列を含む。
ＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＩＫＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＩＫＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＩＫＶＤＡＫＦＤＫＥＱＱＮＡＦＹＥＩＬＳＬＰＮＬＴＥＥＱＲＡＡＦＩＱＳＬＫＤＤＰＳＱＳＡＮＬＬＡＥＡＫＫＬＮＤＡＱＡＩＫＣ
幾つかの実施形態では、タンパク質はさらにＣ末端のシステインを含む。システインは、本発明のタンパク質のＣ末端の単量体に直接結合することができるし、又は一続き、好ましくは０〜１５のアミノ酸、例えば０〜５、０〜１０又は５〜１０のアミノ酸の範囲のアミノ酸を介して結合することもできる。また好ましくは、この一続きは、アルカリ性環境で、突然変異したタンパク質の性質を損なわない程充分に安定であるべきである。このために、一続きがアスパラギンを含有しなければ有利である。加えて、一続きがグルタミンを含有しなければ有利であることができる。Ｃ末端のシステインを有することの利点は、タンパク質のエンドポイントカップリングが、システインチオールと支持体上の親電子性の基との反応によって達成することができるということである。これは、結合能力にとって重要なカップリングしたタンパク質の優れた可動性を提供する。

第２の局面において、本発明はアフィニティー分離マトリックスを開示し、これは支持体にカップリングされた上記実施形態のいずれかのタンパク質を含む。このマトリックスは免疫グロブリン及びその他のＦｃ含有タンパク質のクロマトグラフィー分離に有用であり、より高い溶出ｐＨ及び改良された溶出選択性のために最初の捕捉工程後のより良好な回収率及びより低い不純物レベルが可能になる。

当業者には理解されるように、発現されたタンパク質は支持体に固定化される前に適当な程度に精製されなければならない。かかる精製方法は当技術分野で周知であり、タンパク質に基づくリガンドの支持体への固定化は標準的な方法を用いて容易に行われる。適切な方法及び支持体は以下でより詳細に述べる。

本発明のマトリックスの固体支持体はいかなる適切な周知の種類のものであることができる。慣用のアフィニティー分離マトリックスは、有機性であって、親水性の表面を使用する水性媒体に曝露する、すなわちその外面上、及び存在するならばその内面上のヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキシ（−ＣＯＯＨ）、カルボキサミド（−ＣＯＮＨ₂、おそらくＮ−置換形態）、アミノ（−ＮＨ₂、おそらく置換形態）、オリゴ−若しくはポリエチレンオキシ基を曝露するポリマーに基づくことが多い。

リガンドは、例えばリガンドに存在するアミノ及び／又はカルボキシ基を利用する慣用のカップリング技術によって支持体に結合され得る。ビスエポキシド、エピクロロヒドリン、ＣＮＢｒ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等が周知のカップリング試薬である。支持体とリガンドとの間に、リガンドの利用性を改良し、リガンドと支持体の化学的カップリングを容易にするスペーサーといわれる分子を導入することができる。或いは、リガンドは、物理的吸着又は生物特異的な吸着のような非共有結合によって支持体に結合されてもよい。

幾つかの実施形態では、マトリックスは、支持体とカップリングした５〜１５ｍｇ／ｍｌ、例えば６〜１１ｍｇ／ｍｌのタンパク質を含む。カップリングしたタンパク質の量は、カップリングプロセスに使用するタンパク質の濃度、使用するカップリング条件及び使用する支持体の細孔構造によって調節することができる。一般原則として、マトリックスの絶対的な結合能力は、少なくとも細孔がカップリングしたタンパク質により著しく狭窄されるようになるまでは、カップリングしたタンパク質の量と共に増大する。カップリングしたタンパク質１ｍｇ当たりの相対的な結合能力は高いカップリングレベルで低下し、上記範囲内で最適な費用便益となる。

幾つかの実施形態では、タンパク質はチオエーテル架橋を介して支持体にカップリングする。かかるカップリングを実施する方法は当技術分野で周知であり、標準的な技術及び装置を用いて当業者により容易に実施される。

幾つかの実施形態では、タンパク質は、上記のようにタンパク質上に存在するＣ末端のシステインを介してカップリングする。これにより、システインチオールと、支持体上の親電子性の基、例えばエポキシド基、ハロヒドリン基等との効率的なカップリングが可能となり、チオエーテル架橋結合が生じる。

幾つかの実施形態では、支持体は、多糖類のようなポリヒドロキシポリマーを含む。多糖類の例としては、例えばデキストラン、デンプン、セルロース、プルラン、寒天、アガロース等がある。多糖類は本来親水性で、非特異的な相互作用の程度が低く、反応性の（活性化可能な）ヒドロキシル基の高い含有量を提供し、バイオプロセシングで使用するアルカリ性の洗浄溶液に対して一般に安定である。

幾つかの実施形態では、支持体は、寒天又はアガロースを含む。本発明で使用する支持体は逆懸濁ゲル化(inverse suspension gelation)（Ｓ Ｈｊｅｒｔeｎ：Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７９（２）、３９３−３９８（１９６４））のような標準的な方法に従って容易に製造することができる。或いは、ベースマトリックスはＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような市販の製品である。大規模の分離に殊に有利な１つの実施形態では、支持体は米国特許第６６０２９９０号又は同第７３９６４６７号に記載されている方法を用いてその剛性を増大するように適合させられており、従ってマトリックスは高い流量に対してより適切になっている。

幾つかの実施形態では、支持体は、例えばヒドロキシアルキルエーテル架橋により架橋されている。かかる架橋を生成する架橋剤試薬は、例えばエピクロロヒドリンのようなエピハロヒドリン、ブタンジオールジグリシジルエーテルのようなジエポキシド、アリルハライド又はアリルグリシジルエーテルのようなアリル化試薬であることができる。架橋は、支持体の剛性に有益であり、化学的安定性を改良する。ヒドロキシアルキルエーテル架橋はアルカリに対して安定であり、有意な非特異的吸着を生じない。

或いは、固体支持体は、ポリビニルアルコール、ポリヒドロキシアルキルアクリレート、ポリヒドロキシアルキルメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド等のような合成のポリマーをベースとする。ジビニル及びモノビニル−置換ベンゼンをベースとするマトリックスのような疎水性ポリマーの場合、マトリックスの表面は、上で定義したような親水性の基を回りの水性液体に曝すように親水化されることが多い。かかるポリマーは標準的な方法に従って容易に製造される。例えば、「Ｓｔｙｒｅｎｅ ｂａｓｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂｙ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」（Ｒ Ａｒｓｈａｄｙ：Ｃｈｉｍｉｃａ ｅ Ｌ’Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ ７０（９）、７０−７５（１９８８））参照。或いは、ＳＯＵＲＣＥ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のような市販の製品が使用される。もう１つ別の選択肢において、本発明の固体支持体は、支持体、例えばシリカ、酸化ジルコニウム等を含む。

さらに別の実施形態では、固体支持体は表面、チップ、毛細管、又はフィルターのような別の形態である。

本発明のマトリックスの形状に関して、１つの実施形態では、マトリックスは多孔質モノリスの形態である。代わりの実施形態では、マトリックスは、多孔質又は非多孔質であることができるビーズ状又は粒子形態である。ビーズ状又は粒子形態のマトリックスは充填層として、又は懸濁形態で使用することができる。懸濁形態には膨張床及び純粋な懸濁物として公知のものがあり、粒子又はビーズは移動が自由である。モノリス、充填層及び膨張床の場合、分離手順は一般に濃度勾配を有する慣用のクロマトグラフィーに従う。純粋な懸濁液の場合、バッチ式モードが使用される。

第３の局面において、本発明は、
ａ）上記実施形態のいずれかによるアフィニティー分離マトリックスを準備し、
ｂ）Ｆｃ含有タンパク質及び少なくとも１種の他の物質を含む溶液を準備し、
ｃ）溶液を分離マトリックスと接触させ、
ｄ）場合により、分離マトリックスを少なくとも１種の洗浄用緩衝液で洗浄し、
ｅ）分離マトリックスを溶出バッファー、又はｐＨが低下する溶出バッファー勾配で溶出して、Ｆｃ含有タンパク質を含む溶出液を得、
ｆ）溶出液を回収する
工程を含む、Ｆｃ含有タンパク質を他の物質から分離する方法に関する。

本質的に一定のｐＨを有する溶出バッファーを使用する場合（溶出工程）溶出バッファーは４．０〜６．０のｐＨを有し、溶出バッファー勾配を使用する場合（勾配溶出）溶出バッファー勾配の少なくとも一部分は６．０〜４．０のｐＨ範囲である。

天然又は組換えプロテインＡ（例えば、ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ（商標）及びｒＰｒｏｔｅｉｎＡ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）に基づく普通のプロテインＡ媒体は通常、主としてそのＶＨ３結合に依存して、ｐＨ３．１〜４．０（ピーク頂点で測定）で溶出する（例えば、Ｇｈｏｓｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９２ ６６５−６７３［２００５］参照）。プロテインＡのＢドメインに由来するアルカリ性で安定化された製品ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ ＳＵＲＥ（商標）は、本質的にＶＨ３結合を欠如し、より高い溶出ｐＨ：３．７〜４．０を与える。アフィニティークロマトグラフィーの原理の一般的な概論については、例えばＷｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．及びＣｈａｉｋｅｎ，Ｉ． ２０００．Ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１−６を参照されたい。

プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアスパラギン又はヒスチジン残基の置換は意外にも免疫グロブリン、又はＦｃ断片を含有する融合タンパク質の溶出ｐＨを増大する。従って、この置換は、ｐＨ４．０超、好ましくは４．２超での溶出を可能とするリガンドを提供し、一方標的分子の収率は少なくとも８０％又は好ましくは＞９５％である。この結果、標的分子の凝集又は不活性化のリスクを最小化するより穏やかな溶出条件が得られる。

単量体からの凝集体分離は抗体精製において、殊により高い分解能では難問であった。本リガンドは単量体と凝集体との改良された分離を示し、そのため大規模であっても捕捉工程における凝集体除去のための実行可能なアプローチとなる（図５及び６参照）。また、本発明の方法で、例えばＤＮＡ、望ましくない抗体アイソフォーム（例えば、ある種の電荷アイソフォーム及び糖型）、エンドトキシン、ウィルス、発酵添加物（例えば抗生物質）等のような他の汚染物質を除去することも可能である。

本発明の幾つかの実施形態では、吸着工程の条件は慣用的に使用されているものであり得、標的抗体のｐＩのような特性に応じて適当に適合させる。任意の洗浄工程はＰＢＳバッファーのような一般に使用されるバッファーを用いて実施することができる。また、１種以上の洗浄用緩衝液、例えば異なるｐＨ、イオン強度又は添加物を用いて実施してもよい。溶媒、塩若しくは洗浄剤又はこれらの混合物のような添加物を１以上の洗浄用緩衝液中に使用し得る。

本方法は、例えば治療又は診断用の抗体の精製プロトコルにおける最初の工程などで標的抗体を捕捉するのに有用である。１つの実施形態では、少なくとも７５％の抗体が回収される。１つの有利な実施形態では、特定のリガンド系に適切なｐＨを有する溶出液を用いて少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％の抗体が回収される。こうして、特定の実施形態では、約９８％を超える抗体が回収される。本方法では次いで、他のクロマトグラフィー工程のような１以上の追加の工程を実施し得る。追加の工程（複数でもよい）は、例えばカチオン交換クロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、多モードクロマトグラフィー（正又は負に荷電したマトリックスを用いる）、チオ親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及び／又はゲルろ過からなり得る。追加のクロマトグラフィー工程は結合−溶出又はフロースルーモードのいずれかで実施することができ、充填層で、又は膜吸収体若しくはモノリスカラムを用いて実施することができる。保持タンクを工程間に使用してもしなくてもよく、工程間の保持タンクを回避するために例えばインライン条件を使用することが可能である。

幾つかの実施形態では、方法はさらに、工程ｅ）の終了時に、溶出バッファーのｐＨ又は溶出バッファー勾配のｐＨより少なくとも０．１ｐＨ単位低いｐＨを有するストリッピングバッファーで分離マトリックスをストリップする工程ｇ）を含む。結合した宿主細胞タンパク質、凝集体及びその他の不純物がより低いｐＨで溶出する場合、低ｐＨストリップはこれらの物質をマトリックスから効率的に除去する。さらに不純物を除去するためにアルカリ性洗浄工程を後に行うとしても、低ｐＨストリップはアルカリ性洗浄の効率を増大することができ、アルカリ性工程中の詰まり(fouling)を防ぎ得る。

幾つかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質及び少なくとも１種の他の物質を含む溶液は宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、例えばＣＨＯ細胞又は大腸菌タンパク質を含む。ＣＨＯ細胞及び大腸菌タンパク質の含有量はこれらのタンパク質に向けたイムノアッセイ、例えばＣｙｇｎｕｓ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣＨＯ ＨＣＰ又はＥ Ｃｏｌｉ ＨＣＰ ＥＬＩＳＡキットにより都合よく決定することができる。

幾つかの実施形態では、宿主細胞タンパク質又はＣＨＯ細胞／大腸菌タンパク質は工程ｇ）中に脱着する。

幾つかの実施形態では、Ｆｃ含有タンパク質及び少なくとも１種の他の物質を含む溶液は、Ｆｃ含有タンパク質の凝集体を、例えば、溶液中のＦｃ含有タンパク質の総量に基づいて計算して少なくとも１％、少なくとも５％又は少なくとも１０％の凝集体を含む。多くの場合、抗体又はその他のＦｃ含有タンパク質は発酵ブロス内で既に凝集体を含有する。大量の凝集体の存在はその後の精製中の主要な困難を創成し、凝集体を捕捉工程で直接除去することができることは本発明の１つの利点である。凝集体のレベルは、例えば、凝集体が単量体Ｆｃ含有タンパク質の前に溶出する分析的ゲルろ過によって便利に決定することができる。

幾つかの実施形態では、凝集体は工程ｇ）中に脱着する。

幾つかの実施形態では、回収された溶出液中の凝集体含有率は、回収された溶出液中のＦｃ含有タンパク質の総量に基づいて計算して１％未満、例えば０．５％未満又は０．２％未満の凝集体である。上記したように、捕捉工程における凝集体の有意なクリアランスは本プロセスにおけるその後の精製工程を容易にする。他の場合には高過ぎる凝集体含有率のために生産に使用できない供給材料を使用することも可能になり得る。

溶出は、プロテインＡ媒体からの溶出に使用するのに適した任意の溶液を使用して実施することができる。幾つかの実施形態では、溶出バッファー又は溶出バッファー勾配は酢酸イオン、クエン酸イオン、グリシン、コハク酸イオン、リン酸イオン、及びギ酸イオンからなる群から選択される少なくとも１種のアニオン種を含む。

幾つかの実施形態では、溶出バッファー又は溶出バッファー勾配はアルギニン又は尿素のような少なくとも１種の溶出添加剤を含む。かかる添加剤の使用は、Ｆｃ含有タンパク質の溶出のためのｐＨレベルをさらに増大することができる。

幾つかの実施形態では、工程ｆ）の溶出液はプールに収集され、プールのｐＨは工程ｅ）の終了時の溶出バッファーのｐＨ又は溶出バッファー勾配のｐＨより少なくとも０．５ｐＨ単位高い。プールのｐＨレベルは少なくとも４．５、例えば少なくとも５．０若しくは少なくとも５．５、又は４．５〜６．５若しくは５．０〜６．５であることができる。タンパク質はかなりの長期間（少なくとも数時間）プール条件に曝露されるので、プール内の高いｐＨレベルは、溶出した単量体のＦｃ含有タンパク質からの凝集体の形成を防止するために重要である。

幾つかの実施形態では、本方法はさらに、場合により工程ｇ）の後に行われる工程ｈ）を含み、ｐＨ１３〜１４のアルカリ性溶液、例えば０．１Ｍ〜０．５Ｍの水酸化ナトリウムを含む溶液を使用してマトリックスを清浄化する。既に述べたように、ＳｐＡ（ドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）又はプロテインＺのリガンドの場合、少なくとも１つのアスパラギン残基をグルタミン又はアスパラギン酸以外のアミノ酸に突然変異させると、これらの突然変異リガンドを含むアフィニティー媒体はアルカリ性薬剤を用いる洗浄手順により良好に耐えることができる（米国特許出願公開第２００５／０１４３５６６号）。増大した安定性とは、免疫グロブリンに対する突然変異したタンパク質の初めの親和性が長期間本質的に保持されることを意味する。従って、その結合能力は、アルカリ性環境中で親の分子より遅く低下する。この環境はアルカリ性として定義することができ、一般的に表示されるアルカリ性条件で増大したｐＨ値、例えば約１０超、例えば約１３又は１４まで、すなわち１０〜１３又は１０〜１４を意味する。或いは、これらの条件はＮａＯＨの濃度によって定義することができ、約１．０Ｍ以下、例えば０．７Ｍ又は特に約０．５Ｍ以下、従って０．７〜１．０Ｍの範囲内であることができる。

このように、既に述べたアスパラギン突然変異の存在下でのリガンドの免疫グロブリンに対する親和性、すなわち結合特性、従ってマトリックスの能力は、アルカリ性薬剤による処理によって本質的に変化しない。従来、アフィニティー分離マトリックスの現場洗浄処理の場合、使用されるアルカリ性薬剤はＮａＯＨで、その濃度は０．７５Ｍ、例えば０．５Ｍ以下である。従って、その結合能力は、０．５ＭのＮａＯＨで７．５時間処理した後、約７０％未満、好ましくは約５０％未満、より好ましくは約３０％未満、例えば約２８％に低下する。

幾つかの実施形態では、本方法はさらに、溶出液又はプールのｐＨを調節することなく溶出液又はプールをａ カチオン交換樹脂に適用するという工程ｉ）を含む。本発明の方法で生成した溶出液（及び従ってプール）は慣用のプロテインＡ媒体の場合より高いので、溶出液／プールを中間でｐＨ調節することなくカチオン交換体に直接適用することが可能である。このため、プロセスが簡略化され、直接の加工処理が可能になる。

幾つかの実施形態では、方法はさらに、工程ｉ）の前に、溶媒−洗浄剤ウィルス不活化の工程を含む。一般に使用される２つのウィルス不活化方法は低ｐＨ不活化及び溶媒−洗浄剤不活化である。低いｐＨへの曝露は凝集を起こすので、タンパク質を低いｐＨに曝露することなく分離を可能にする現在の方法ではあまり望ましくない。しかし、溶媒−洗浄剤不活化は、例えばカチオン交換工程に適用する前にプール／溶出液への適用が可能である。この方法では、洗浄剤（例えば０．３〜１．５％の非イオン性界面活性剤、例えばＤｏｗ ＣｈｅｍｉｃａｌのＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００又はＵｎｉｑｅｍａのＴｗｅｅｎ（商標）８０）及び溶媒（例えば０．１〜０．５％リン酸トリ−ｎ−ブチル）を溶出液／プールに適用し、３０〜９０分間、例えば約４５分間作用させる。

本発明は、本発明のリガンド又はマトリックスを使用する、ＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭのような免疫グロブリンを単離する方法に関する。従って、本発明は、上記リガンド又はマトリックスへの吸着によって少なくとも１種の標的化合物を液体から分離する、クロマトグラフィープロセスを包含する。目的とする生成物は分離された化合物又は液体であることができる。従って、本発明のこの局面は、広く使用されている周知の分離技術であるアフィニティークロマトグラフィーに関する。手短に言うと、最初の工程において、標的化合物、好ましくは上述したような抗体を含む溶液を、分離マトリックス上に存在するリガンドへの標的化合物の吸着を可能にする条件下でマトリックスに通す。かかる条件は溶液中の、例えばｐＨ及び／又は塩濃度、すなわちイオン強度により制御される。マトリックスの容積を越えないように注意すべきであり、すなわち流れは申し分のない吸着が可能となるように充分に遅くするべきである。この工程において、溶液の他の成分は原則として妨げられることなく通過する。

第４の局面において、本発明は、Ｆｃ含有タンパク質が吸着した上記いずれかの実施形態のマトリックスのための溶出バッファーを選択する方法を開示し、この方法は、
ａ）Ｆｃ含有タンパク質及び少なくとも１種の他の物質を含む溶液を準備し、
ｂ）Ｆｃ含有タンパク質及び他の物質の少なくとも一部が分離マトリックスに吸着する条件下で溶液を分離マトリックスに接触させ、
ｃ）場合により、分離マトリックスを少なくとも１種の洗浄用緩衝液で洗浄し、
ｄ）ｐＨが低下する溶出バッファー勾配を用いて分離マトリックスを溶出させ、ここで溶出バッファー勾配の少なくとも一部は６．０〜４．０のｐＨ範囲にあり、
ｅ）工程ｄ）で得られた溶出液中のＦｃ含有タンパク質及び他の物質の含有量を測定し、
ｆ）Ｆｃ含有タンパク質の少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％が溶出し、吸着した他の物質の２５％未満、例えば１０％未満が溶出するバッファー勾配のｐＨを有する溶出バッファーを選択する
工程を含む。

幾つかの実施形態では、他の物質は宿主細胞タンパク質、例えばＣＨＯ細胞タンパク質、又はＦｃ含有タンパク質の凝集体を含む。

以下、例示の目的のみで提供され、従って添付の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲を限定するものと考えるべきでない実施例を用いて本発明を説明する。以下及び本出願中で挙げる文献は全て援用により本明細書の内容の一部をなす。

タンパク質の突然変異誘発
定義されたアミノ酸置換体をコードするオリゴヌクレオチドを用いるツーステップＰＣＲにより部位特異的な突然変異誘発を行った。鋳型として、野生型のＺ（配列番号６）又は突然変異したＺ（２以上の突然変異体を創成した）の単一のドメインを含有するプラスミドを使用した。ＰＣＲ断片を大腸菌(E.coli)発現ベクター（ｐＧＯ）に連結した。ＤＮＡ配列決定法を使用して挿入された断片の正しい配列を確認した。

Ｚ（Ｈ１８Ｅ）、Ｚ（Ｈ１８ｄｅｌ）、Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）、Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ）及びＺ（Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ，Ｐ５７Ｉ）の多量体を形成するために、Ｃ又はＺドメインのアミノ酸ＶＤに対応する開始コドン（ＧＴＡ ＧＡＣ）内に位置するＡｃｃＩ部位を使用した。ｐＧＯ Ｚ（Ｈ１８Ｅ）１、ｐＧＯ Ｚ（Ｈ１８ｄｅｌ）１、ｐＧＯ Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）１、ｐＧＯ Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ）１及びｐＧＯ Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ，Ｐ５７Ｉ）１をＡｃｃＩで消化し、ＣＩＰ処理した。各変異体に特異的なＡｃｃＩ粘着末端プライマーを設計し、２つのオーバーラップするＰＣＲ産物を各々の鋳型から生成した。ＰＣＲ産物を精製し、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で比較することによってその濃度を評価した。等量の対合ＰＣＲ産物を連結バッファー中でハイブリダイズさせた（４５分で９０℃→２５℃）。得られた産物はＡｃｃＩ部位（正しいＰＣＲ断片及び／又は消化したベクター）に連結されそうな断片のおよそ１／４である。連結及び形質転換の後コロニーをＰＣＲでスクリーニングして、Ｚ（Ｈ１８Ｅ）２、Ｚ（Ｈ１８ｄｅｌ）２、Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４、Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ）４及びＺ（Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ，Ｐ５７Ｉ）４を含有する構築物を同定した。ＤＮＡ配列決定法によってポジティブなクローンを確認した。

構築物の発現及び精製
構築物を、標準的な媒体内においてＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２の発酵により細菌のペリプラズム内で発現させた。発酵後細胞を熱処理してペリプラズムの中味を媒体中に放出させた。媒体中に放出された構築物を、０．２μｍの細孔径を有する膜を用いた精密ろ過により回収した。

この時点ではろ過工程からの透過液中にある各々の構築物を親和性により精製した。この透過液を、固定化されたＩｇＧを含有するクロマトグラフィー媒体上にロードした。ロードした産物をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、ｐＨを下げることによって溶出した。

溶出プールを中性のｐＨに調節し、ジチオトレイトールの添加により還元した。次に、試料をアニオン交換体上にロードした。洗浄工程後構築物をＮａＣｌ勾配で溶出し、あらゆる汚染物質から分離した。溶出プールを限外ろ過で４０〜５０ｍｇ／ｍｌに濃縮した。

精製されたリガンドをＬＣ−ＭＳで分析して、純度を決定し、その分子量が（アミノ酸配列に基づいて）期待されたものに対応することを確認した。

突然変異体Ｚ（Ｈ１８ｄｅｌ）２（配列番号１０）はアフィニティー工程でＩｇＧ媒体に結合しなかった。従って、この突然変異はＩｇＧ結合能力の喪失を起こすと結論し、Ｈ１８ｄｅｌ変異体ではそれ以上実験を行わなかった。

活性化
使用したベースマトリックスは平均直径８５ミクロンの堅い架橋アガロースビーズであり、米国特許第６６０２９９０号の方法に従って製造され、細孔径はＧｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９１，ｐｐ ６−１３に記載されている方法に従ってＭｗ１１０ｋＤａのデキストランに対して０．７０の逆ゲルろ過クロマトグラフィーＫａｖ値に対応する。

１００ｍＬのフラスコ中で、２５ｍＬ（ｇ）のドレインしたベースマトリックス、１０．０ｍＬの蒸留水及び２．０２ｇのＮａＯＨ（ｓ）を機械的に撹拌しながら１０分間２５℃で混合した。４．０ｍＬのエピクロロヒドリンを加え、２時間反応を進行させた。活性化されたゲルを１０ゲル堆積容積（ＧＶ）の水で洗浄した。

カップリング
５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブ内の２０ｍＬのリガンド溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）に、１６９ｍｇのＮａＨＣＯ₃、２１ｍｇのＮａ₂ＣＯ₃、１７５ｍｇのＮａＣｌ及び７ｍｇのＥＤＴＡを加えた。Ｆａｌｃｏｎチューブをローラーテーブル上に５〜１０分間載せた後、７７ｍｇのＤＴＥを加えた。還元を４５分より長く続行した。その後リガンド溶液を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５を充填したＰＤ１０カラム上で脱塩した。２７６ｎｍのＵＶ吸収を測定することによって、脱塩した溶液中のリガンド含有量を決定した。

活性化されたゲルを３〜５ＧＶ｛０．１Ｍのリン酸塩／１ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８．６｝で洗浄し、次にリガンドを米国特許第６３９９７５０号に記載されている方法に従ってカップリングした。実験で使用した全てのバッファーは少なくとも５〜１０分間窒素ガスでガス抜きした。

固定化後ゲルを３ｘＧＶの蒸留水で洗浄した。ゲル＋１ＧＶ｛０．１Ｍリン酸塩／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１０％チオグリセロール ｐＨ８．６｝を混合し、チューブを室温で一晩振動台に載せておいた。次にゲルを３ｘＧＶ｛０．１Ｍ ＴＲＩＳ／０．１５Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．６｝及び０．５Ｍ ＨＡｃ及び次に８〜１０ｘＧＶの蒸留水で交互に洗浄した。ゲル試料をアミノ酸分析のために外部の試験所に送り、リガンド含有量（ｍｇ／ｍｌゲル）を総アミノ酸含有量から計算した。

プロトタイプ
変異体Ｚ（Ｈ１８Ｅ）２（配列番号９）：各々がＨ１８Ｅ置換（Ｚ（Ｈ１８Ｅ）２）を含有するプロテインＺの２つのコピーを含有するリガンド二量体、リガンド密度５．２ｍｇ／ｍｌ、
比較プロトタイプＺ２（配列番号９と類似だが、Ｈ１８はＥに置換されてない）：プロテインＺｖａｒ２（Ｚ２）の２つのコピーを含有するリガンド二量体、リガンド密度５．９ｍｇ／ｍｌ、
変異体Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４（配列番号１１）：各々がＨ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ置換Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４を含有するプロテインＺの４つのコピーを含有するリガンド四量体、リガンド密度５．３ｍｇ／ｍｌ、
変異体Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ）４（配列番号１２）：各々がＨ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ置換を含有するプロテインＺの４つのコピーを含有するリガンド四量体、リガンド密度６．９ｍｇ／ｍｌ、
比較プロトタイプＺ４（配列番号１１と類似だが、Ｈ１８とＰ５７はそれぞれＳとＩに置換されてない）：プロテインＺｖａｒ２（Ｚ２）の４つのコピーを含有するリガンド四量体、リガンド密度６．０ｍｇ／ｍｌ、
比較プロトタイプＺ（Ｈ１８Ｓ）４（配列番号１２と類似だが、Ｎ２８はＡに置換されてない）：各々がＨ１８Ｓ置換を含有するプロテインＺの４つのコピーを含有するリガンド四量体、リガンド密度６．７ｍｇ／ｍｌ、
比較プロトタイプＺ（Ｎ２８Ａ）４（配列番号１２と類似だが、Ｈ１８はＳに置換されてない）：各々がＮ２８Ａ置換を含有するプロテインＺの４つのコピーを含有するリガンド四量体、リガンド密度７．７ｍｇ／ｍｌ。

各々のプロトタイプで、２ｍｌの樹脂をＴｒｉｃｏｒｎ ５ １００カラムに充填した。

タンパク質
Ｇａｍｍａｎｏｒｍ １６５ｍｇ／ｍｌ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、平衡化バッファー中１ｍｇ／ｍｌに希釈。

平衡化バッファー
ＡＰＢリン酸塩バッファー２０ｍＭ＋０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４（Ｅｌｓｉｃｈｒｏｍ ＡＢ）。

溶出バッファー
クエン酸塩バッファー０．１Ｍ、ｐＨ６
クエン酸塩バッファー０．１Ｍ、ｐＨ３。

ＣＩＰ
０．１Ｍ ＮａＯＨ。

実験の詳細と結果
貫流容量(breakthrough capacity)は、ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ １０システムを用いて２．４分の滞留時間で決定された。安定なベースラインが得られるまで平衡バッファーをバイパスカラムに貫流させた。これは、オートゼロ化(auto zeroing)の前に行った。試料は、１００％ＵＶシグナルが得られるまでバイパスを通して適用した。その後、安定なベースラインが得られるまで再び平衡バッファーをカラムに適用した。最大吸光度の８５％のＵＶシグナルに達するまで試料をカラムにロードした。その後、ＵＶシグナルが最大吸光度の２０％になるまでカラムを平衡バッファーにより流量０．５ｍｌ／ｍｉｎで洗浄した。タンパク質は、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量でｐＨ６．０から出発しｐＨ３．０で終了するまで１０カラム容積に渡り直線勾配で溶出した。その後、カラムを流量０．５ｍｌ／ｍｉｎの０．１Ｍ ＮａＯＨで清浄化し、平衡バッファーで再平衡化した後２０％エタノールを加えた。この最後の工程は、１００％ＵＶシグナルが得られるまでバイパスカラムを通して試料をロードすることにより試料濃度をチェックするためのものであった。

１０％での貫流容量の計算には、下記式を用いた。すなわち、カラム流出液中のＩｇＧの濃度が供給材料中のＩｇＧ濃度の１０％になるまでカラムにロードしたＩｇＧの量である。

Ａ_100% ＝ １００％ＵＶシグナル；
Ａ_sub ＝ 非結合性ＩｇＧサブクラスによる吸光度寄与；
Ａ（Ｖ） ＝ 所与の適用容積での吸光度；
Ｖ_c ＝ カラム容積；
Ｖ_app ＝ １０％貫流までの適用容積；
Ｖ_sys ＝ システムの死容積；
Ｃ₀ ＝ 供給材料濃度。

１０％貫流での動的結合容量（ＤＢＣ）を計算し、曲線の外観を検討した。また曲線を結合、溶出及びＣＩＰピークに関しても検討した。５、１０及び８０％貫流について動的結合容量（ＤＢＣ）を計算した。幾つかの結果を表１に示す。親のＨ１８リガンド（Ｚ２又はＺ４）と比較してＨ１８Ｓ置換を有するリガンドについて類似の容量が観察された。

ポリクローナルヒトＩｇＧ及びいろいろなｍＡＢに対するＩｇＧ容量及び溶出の検討をＺ（Ｈ１８Ｅ）２、Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４、Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ）４、Ｚ２及びＺ４について行った。幾つかの例を表１に示す。

異なる細胞培養上清（ｍＡｂ Ｃ、ｍＡｂ Ｄ）又はポリクローナルヒトＩｇＧについてリン酸塩バッファーにおける溶出研究を行った。溶出ｐＨはＺ（Ｈ１８Ｅ）２、Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４及びＺ（Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ）４についてＺ２及びＺ４と比較して０．６〜１．８ｐＨ単位増大する。最大の差はポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）で示されるが、ｍＡｂ Ｄは幾つか小さい差を示す。これらの溶出研究においてはおよそ１０ｍｇの細胞培養上清（いろいろな細胞培養上清を使用、表２参照）をカラムにロードした。ｐＨ６からｐＨ３の勾配溶出は０．１Ｍのクエン酸塩バッファーを用いて行った。ピーク頂点のｐＨを記録した（表２参照）。

注：ｐＨ ｈＩｇＧ（最初のピーク）及びｐＨ ｈＩｇＧ（第２のピーク）はポリクローナルＩｇＧ（Ｇａｍｍａｎｏｒｍ）である。

Ｚ（Ｈ１８Ｅ）２、Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４及びＺ（Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ）４に対するより高い溶出ｐＨを除いて、Ｚ２及びＺ４よりも良好な分離特性を示す。図２及び３は、低下するｐＨ勾配におけるＺ４（図３）及びＺ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４（図２）からの抗体Ｅ及び吸着した宿主細胞タンパク質の溶出を示す。Ｚ４（並びにＨ１８突然変異をもたない他のマトリックス）の場合、抗体及びＨＣＰは共溶出し、マトリックスに結合したＨＣＰがクロマトグラフィー工程で除去されないことを意味する。Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４の場合、ＨＣＰは勾配中で後に溶出し、このため、勾配溶出により、又は抗体が溶出するｐＨを有する溶出バッファーを適用した後、例えばより低いｐＨでストリッピングバッファーを適用してＨＣＰを除去することにより、結合したＨＣＰを除去する選択的な溶出の可能性が生まれる。

また、抗体凝集体も、図４に示されているように、抗体単量体より低いｐＨで溶出する。この図は、Ｚ（Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ）４でのモノクローナル抗体の溶出液画分（図２に示したのと同じ画分）に対するＳＥＣクロマトグラムを示す。主要な抗体ピーク（画分Ｂ７）は凝集体を含有しないが、Ｂ１２で凝集体が現れ始め、その後の画分Ｃ１は殆ど全部が凝集体からなることが分かる。

上記実施例は本発明の特定の局面を例証しており、いかなる意味でもその範囲を限定するものではなく、そのように解するべきではない。上に記載した本発明の教示に接した当業者は数多くの修正を加えることができる。これらの修正は、後続の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内に包含されると考えられたい。

Claims (11)

1. ブドウ球菌プロテインＡ若しくはプロテインＺの１以上の変異免疫グロブリン結合性ドメイン（単量体）を含む免疫グロブリン結合性タンパク質であって、１以上の変異単量体の少なくとも１つにおいて、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアスパラギン又はヒスチジンがプロリンでもアスパラギンでもない第１のアミノ酸残基で置換されており、位置５７のアミノ酸残基がプロリンであってかつ位置２８のアミノ酸残基がアスパラギンである場合には、プロテインＡのＢドメイン又はプロテインＺのＨ１８に対応する位置のアミノ酸残基がセリン、スレオニン又はリシンのいずれでもなく、タンパク質が、配列番号５、６、７又は８で定義される親分子から誘導された１以上の変異単量体を含み、変異がＨ１８Ｅ、Ｈ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ、Ｈ１８Ｓ，Ｐ５７Ｉ及びＨ１８Ｓ，Ｎ２８Ａ，Ｐ５７Ｉからなる群から選択される、タンパク質。
2. タンパク質が配列番号１４、１６、１７又は１８で定義される１以上の変異単量体を含む、請求項１記載のタンパク質。
3. 少なくとも２つの変異単量体を含む、請求項１又は請求項２記載のタンパク質。
4. Ｃ末端のシステインをさらに含む、請求項１乃至請求項３のいずれか１項記載のタンパク質。
5. 請求項４記載のタンパク質を、Ｃ末端のシステインを介して支持体にカップリングしてなるアフィニティー分離マトリックス。
6. 支持体にカップリングしたタンパク質を５〜１５ｍｇ／ｍｌ含んでいる、請求項５記載のアフィニティー分離マトリックス。
7. Ｆｃ含有タンパク質を他の物質から分離する方法であって、
   ａ）請求項５又は請求項６記載のアフィニティー分離マトリックスを準備する工程と、
   ｂ）Ｆｃ含有タンパク質及び少なくとも１種の他の物質を含む溶液を準備する工程と、
   ｃ）溶液を分離マトリックスと接触させる工程と、
   ｅ）分離マトリックスを、溶出バッファー、又はｐＨが低下する溶出バッファー勾配で溶出して、Ｆｃ含有タンパク質を含む溶出液を得る工程と、
   ｆ）溶出液を回収する工程と
   を含み、溶出バッファーが４．０〜６．０のｐＨを有するか、又は溶出バッファー勾配の少なくとも一部が６．０〜４．０のｐＨ範囲内である、方法。
8. 工程ｅ）の前に、ｄ）分離マトリックスを少なくとも１種の洗浄用緩衝液で洗浄する工程をさらに含む、請求項７記載の方法。
9. さらに、ｇ）溶出バッファーのｐＨ又は工程ｅ）の終了時の溶出バッファー勾配のｐＨより少なくとも０．１ｐＨ単位低いｐＨを有するストリッピングバッファーを用いて分離マトリックスをストリッピングする工程を含む、請求項７又は請求項８記載の方法。
10. さらに、ｈ）ｐＨ１３〜１４のアルカリ性溶液の適用によりマトリックスを清浄化する工程を含む、請求項７乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
11. さらに、ｉ）溶出液のｐＨを調節することなく溶出液又は収集した溶出液のプールをカチオン交換樹脂に適用する工程を含む、請求項７乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。