JP2519136B2 - 分子量マ−カ− - Google Patents
分子量マ−カ−Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウエスタンブロッティ
ング用その他各種の用途に広範に使用することのできる
マーカー蛋白質に関するものである。
ング用その他各種の用途に広範に使用することのできる
マーカー蛋白質に関するものである。
【０００２】バイオテクノロジーの進展に伴ない、蛋白
質の分離、同定の必要性が更に高まってきており、各種
の技術が開発されてきた。それらの内、例えばＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、蛋白質の純度を
検定したり、その分子量を推定するために一般によく用
いられている。その際、目的蛋白質の分子量は、同時に
泳動されたマーカー蛋白質の移動度を基に算出される。
目的蛋白質に対する特異抗体を用いたイミュノブロッテ
ィング法では、メンブレン上に転写された目的蛋白質
は、他の夾雑蛋白質が混在していても特異的に染色され
る。該マーカー蛋白質は、このようなメンブレン上に転
写された蛋白質についての分子量マーカーとして利用さ
れる。
質の分離、同定の必要性が更に高まってきており、各種
の技術が開発されてきた。それらの内、例えばＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法は、蛋白質の純度を
検定したり、その分子量を推定するために一般によく用
いられている。その際、目的蛋白質の分子量は、同時に
泳動されたマーカー蛋白質の移動度を基に算出される。
目的蛋白質に対する特異抗体を用いたイミュノブロッテ
ィング法では、メンブレン上に転写された目的蛋白質
は、他の夾雑蛋白質が混在していても特異的に染色され
る。該マーカー蛋白質は、このようなメンブレン上に転
写された蛋白質についての分子量マーカーとして利用さ
れる。
【０００３】本発明は、このような分子量マーカーとし
て利用されるマーカー蛋白質に関するものであり、した
がって本発明は、蛋白質工学、生化学、遺伝子工学その
他バイオテクノロジーの技術分野において重要な役割を
果すものである。
て利用されるマーカー蛋白質に関するものであり、した
がって本発明は、蛋白質工学、生化学、遺伝子工学その
他バイオテクノロジーの技術分野において重要な役割を
果すものである。
【０００４】
【従来の技術】従来よりマーカー蛋白質はいくつか知ら
れており、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動用の分子量マーカー蛋白質として既知のものは、ミ
オシン（Ｈ鎖）、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラー
ゼｂ、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、カーボニッ
クアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビター、リゾ
チームなどの適当な分子量の蛋白質を混合したものであ
る。ウエスタンブロッティングにおいては、メンブレン
上に転写されたマーカー蛋白質は、目的蛋白質のレーン
と切り放して、アミドブラックなどの色素で染色する。
また、これらのマーカー蛋白質に適当な色素を結合さ
せ、電気泳動中にも見えるようにしたもの（有色マーカ
ー）があり、これらはそのままメンブレン上にも転写さ
れる。また、ウエスタンブロッティング用の分子量マー
カーとしては、上記蛋白質をビオチン化して、アビジン
−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と反応後、発
色させるものがある（ビオチン標識マーカー）。
れており、例えばＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動用の分子量マーカー蛋白質として既知のものは、ミ
オシン（Ｈ鎖）、β−ガラクトシダーゼ、ホスホリラー
ゼｂ、ウシ血清アルブミン、オバルブミン、カーボニッ
クアンヒドラーゼ、大豆トリプシンインヒビター、リゾ
チームなどの適当な分子量の蛋白質を混合したものであ
る。ウエスタンブロッティングにおいては、メンブレン
上に転写されたマーカー蛋白質は、目的蛋白質のレーン
と切り放して、アミドブラックなどの色素で染色する。
また、これらのマーカー蛋白質に適当な色素を結合さ
せ、電気泳動中にも見えるようにしたもの（有色マーカ
ー）があり、これらはそのままメンブレン上にも転写さ
れる。また、ウエスタンブロッティング用の分子量マー
カーとしては、上記蛋白質をビオチン化して、アビジン
−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と反応後、発
色させるものがある（ビオチン標識マーカー）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来用いられてきたマ
ーカー蛋白質は、種々の蛋白質の混合物であるため、そ
れぞれのバンドの染色性や、安定性にばらつきがあり、
特に保存中に薄くなっていくバンドがあった。有色マー
カーは色素が結合することによって移動度が変化し、正
確な分子量の推定には適さず、そのバンドは一般にブロ
ードである。ビオチン標識マーカーは、アビジン−ＨＲ
Ｐを必要とし、一般的ではない。
ーカー蛋白質は、種々の蛋白質の混合物であるため、そ
れぞれのバンドの染色性や、安定性にばらつきがあり、
特に保存中に薄くなっていくバンドがあった。有色マー
カーは色素が結合することによって移動度が変化し、正
確な分子量の推定には適さず、そのバンドは一般にブロ
ードである。ビオチン標識マーカーは、アビジン−ＨＲ
Ｐを必要とし、一般的ではない。
【０００６】また、従来用いられてきたマーカー蛋白質
は、分子量が一定しない場合が多くて正確性に欠けるこ
とがあるだけでなく、分子量を変えたりして目的とする
マーカー蛋白質を自由に効率よく設計することなどはで
きなかった。
は、分子量が一定しない場合が多くて正確性に欠けるこ
とがあるだけでなく、分子量を変えたりして目的とする
マーカー蛋白質を自由に効率よく設計することなどはで
きなかった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、このような問
題点を解決する目的でなされたものであって、各方面か
ら検討の結果、遺伝子工学に着目した、そして、更に研
究を行った結果、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの
内ドメインＡとＢの部分を一単位とし、ＰＣＲ法（プラ
イマー利用遺伝子増幅法）によりこれらの遺伝子を自由
に増幅することに成功し、その結果、これらを複数個つ
なげた蛋白質を自由に製造することにはじめて成功し
た。
題点を解決する目的でなされたものであって、各方面か
ら検討の結果、遺伝子工学に着目した、そして、更に研
究を行った結果、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの
内ドメインＡとＢの部分を一単位とし、ＰＣＲ法（プラ
イマー利用遺伝子増幅法）によりこれらの遺伝子を自由
に増幅することに成功し、その結果、これらを複数個つ
なげた蛋白質を自由に製造することにはじめて成功し
た。
【０００８】本発明は、上記成功に基づき更に研究の結
果完成されたものであるが、プロテインＡ、Ｇ、Ｍなど
のＩｇＧ結合ドメインを遺伝子操作によって効率的に製
造することに工業的に成功した例は少なく、現在の技術
の状況ではドメイン数を目的どおり増加させて目的とす
る分子量のものを自由に製造する技術は工業的に確立さ
れたものとはなっていない。
果完成されたものであるが、プロテインＡ、Ｇ、Ｍなど
のＩｇＧ結合ドメインを遺伝子操作によって効率的に製
造することに工業的に成功した例は少なく、現在の技術
の状況ではドメイン数を目的どおり増加させて目的とす
る分子量のものを自由に製造する技術は工業的に確立さ
れたものとはなっていない。
【０００９】以下、本発明を、プロテインＡ、特にその
ＡＢドメイン及びＤドメインについて説明するが、他の
ドメインＥ、Ｃについても同様であり、またプロテイン
Ｇ、そのドメインＣ1、Ｃ2、Ｃ3についても同様であ
り、更にまたプロテインＭなどその他のＩｇＧ結合性蛋
白質についても同様である。
ＡＢドメイン及びＤドメインについて説明するが、他の
ドメインＥ、Ｃについても同様であり、またプロテイン
Ｇ、そのドメインＣ1、Ｃ2、Ｃ3についても同様であ
り、更にまたプロテインＭなどその他のＩｇＧ結合性蛋
白質についても同様である。
【００１０】
【実施例１】
【００１１】
【（１）プラスミドｐＴＲＰ−ＰＲＯＴ−ＡＢＩ〜ＶＩ
の構築】最も分子量の小さい基本蛋白質として、プロテ
インＡのＡＢドメインを用いることを計画し、その遺伝
子を市販のプロテインＡ融合蛋白質発現ベクターｐＲＩ
Ｔ２Ｔを鋳型としてＰＣＲ法で合成した（図２）。その
際、遺伝子の両端に制限酵素ＡｃｃＩの認識配列を導入
し、この遺伝子が一定方向に連結されるようにした。Ａ
ｃｃＩの認識配列はｎｏｎ−ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃで
あり、両末端にそのような配列を持つＤＮＡ断片は一定
方向にしか連結されない特徴がある。この様な制限酵素
としては他に、ＡｆＬＩＩＩ、ＡｖａＩ、ＢａｎＩ、Ｂ
ａｎＩＩ、ＨｇｉＡＩなどがある。ＡＢドメインの遺伝
子の合成法は図２に示したＰＣＲ法に限定されるもので
はなく、数十塩基からなるオリゴヌクレオチドに分割し
てＤＮＡ合成機により合成し、それらをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼによって順に連結していくことによっても得られ
る。この場合は大腸菌で効率よく発現させる目的で、大
腸菌の至適コドンを用いた遺伝子の塩基配列を用いるこ
とは当業者によって一般的に行われている。
の構築】最も分子量の小さい基本蛋白質として、プロテ
インＡのＡＢドメインを用いることを計画し、その遺伝
子を市販のプロテインＡ融合蛋白質発現ベクターｐＲＩ
Ｔ２Ｔを鋳型としてＰＣＲ法で合成した（図２）。その
際、遺伝子の両端に制限酵素ＡｃｃＩの認識配列を導入
し、この遺伝子が一定方向に連結されるようにした。Ａ
ｃｃＩの認識配列はｎｏｎ−ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃで
あり、両末端にそのような配列を持つＤＮＡ断片は一定
方向にしか連結されない特徴がある。この様な制限酵素
としては他に、ＡｆＬＩＩＩ、ＡｖａＩ、ＢａｎＩ、Ｂ
ａｎＩＩ、ＨｇｉＡＩなどがある。ＡＢドメインの遺伝
子の合成法は図２に示したＰＣＲ法に限定されるもので
はなく、数十塩基からなるオリゴヌクレオチドに分割し
てＤＮＡ合成機により合成し、それらをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼによって順に連結していくことによっても得られ
る。この場合は大腸菌で効率よく発現させる目的で、大
腸菌の至適コドンを用いた遺伝子の塩基配列を用いるこ
とは当業者によって一般的に行われている。
【００１２】発現ベクターとしては、ｔｒｐプロモータ
と、クローニング部位としてＡｃｃＩサイトを持ち、大
腸菌で高発現させるために、Ｎ末端アミノ酸のＭｅｔの
次のアミノ酸をＬｙｓとし、そのコドンをＡＡＡとし
て、いわゆるＡＴＧベクター（ｐＴＲＰＡＣＣ）を作製
した。この発現ベクターに上記プロテインＡのＡＢドメ
インの遺伝子を基本単位として、それらが１個から６個
連結されたものを挿入した。ＰＣＲ反応は、ｐＲＩＴ２
ＴをＨｉｎｃＩＩで切断したものを鋳型とし、センスプ
ライマーとして、５’−ＧＧＴＡＧＡＣＧＣＴＧＡＴＡ
ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡ−３’（図３、ＰＲＯＴ
Ｓ）を、アンチセンスプライマーとして、５’−ＧＧＴ
ＣＴＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＡＴＴ
ＴＡ−３’（図３、ＰＰＯＴＡＳ）を用い、Ｔａｑポリ
メラーゼ（２．５単位）を用いて、９４℃、１分、５０
℃、１分、７２℃、５分を３０サイクル行って、目的の
ＡＢドメインの遺伝子を増幅した。発現ベクターも同様
のＰＣＲ反応を利用して、クローニング部位を導入し
た。この場合に用いたセンスプライマー（ＡＣＣＳ）及
びアンチセンスプライマー（ＡＣＣＡＳ）は、図３に示
すとおりである。
と、クローニング部位としてＡｃｃＩサイトを持ち、大
腸菌で高発現させるために、Ｎ末端アミノ酸のＭｅｔの
次のアミノ酸をＬｙｓとし、そのコドンをＡＡＡとし
て、いわゆるＡＴＧベクター（ｐＴＲＰＡＣＣ）を作製
した。この発現ベクターに上記プロテインＡのＡＢドメ
インの遺伝子を基本単位として、それらが１個から６個
連結されたものを挿入した。ＰＣＲ反応は、ｐＲＩＴ２
ＴをＨｉｎｃＩＩで切断したものを鋳型とし、センスプ
ライマーとして、５’−ＧＧＴＡＧＡＣＧＣＴＧＡＴＡ
ＡＣＡＡＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡ−３’（図３、ＰＲＯＴ
Ｓ）を、アンチセンスプライマーとして、５’−ＧＧＴ
ＣＴＡＣＴＴＴＴＧＧＴＧＣＴＴＧＡＧＣＡＴＣＡＴＴ
ＴＡ−３’（図３、ＰＰＯＴＡＳ）を用い、Ｔａｑポリ
メラーゼ（２．５単位）を用いて、９４℃、１分、５０
℃、１分、７２℃、５分を３０サイクル行って、目的の
ＡＢドメインの遺伝子を増幅した。発現ベクターも同様
のＰＣＲ反応を利用して、クローニング部位を導入し
た。この場合に用いたセンスプライマー（ＡＣＣＳ）及
びアンチセンスプライマー（ＡＣＣＡＳ）は、図３に示
すとおりである。
【００１３】ライゲーション反応は、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼ（３５０単位）を用いて、１４℃、１６時間行った。
この反応生成物を用いて、大腸菌ＪＭ１０９（ｒｅｃＡ
ｌ，ｅｎｄＡｌ，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１
７，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡｌ，λ-，Δ（ｌａｃ−ｐ
ｒｏＡＢ），［Ｆ’，ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａ
ｃＩｑ，ｌａｃＺΔＭ１５］）の形質転換を行った後、
受容菌を寒天０．７％およびアンピシリンを１ｍｌ当た
り１００μｇ含むＬ寒天培地（組成：１リットル当たり
トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、食塩１０ｇ、
ｐＨ７．４）と混合した後、寒天１．５％およびアンピ
シリンを１ｍｌ当たり１００μｇ含むＬ寒天培地のプレ
ート上に重層して３７℃にて一昼夜培養を行い、アルカ
リ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを分離し、アガロ
ースゲル電気泳動を行って、目的のＤＮＡ断片が挿入さ
れたクローンを選択した。また、得られたプラスミドＤ
ＮＡをＡｃｃＩで部分消化することにより、何単位のプ
ロテインＡのＡＢドメインの遺伝子が挿入されているか
を調べ、１個から６個連結されたものをそれぞれ、ｐＴ
ＲＰ−ＰＲＯＴ−ＡＢＩからｐＴＲＰ−ＰＲＯＴ−ＡＢ
ＶＩと名付けた。
ゼ（３５０単位）を用いて、１４℃、１６時間行った。
この反応生成物を用いて、大腸菌ＪＭ１０９（ｒｅｃＡ
ｌ，ｅｎｄＡｌ，ｇｙｒＡ９６，ｔｈｉ，ｈｓｄＲ１
７，ｓｕｐＥ４４，ｒｅｌＡｌ，λ-，Δ（ｌａｃ−ｐ
ｒｏＡＢ），［Ｆ’，ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ，ｌａ
ｃＩｑ，ｌａｃＺΔＭ１５］）の形質転換を行った後、
受容菌を寒天０．７％およびアンピシリンを１ｍｌ当た
り１００μｇ含むＬ寒天培地（組成：１リットル当たり
トリプトン１０ｇ、イーストエキス５ｇ、食塩１０ｇ、
ｐＨ７．４）と混合した後、寒天１．５％およびアンピ
シリンを１ｍｌ当たり１００μｇ含むＬ寒天培地のプレ
ート上に重層して３７℃にて一昼夜培養を行い、アルカ
リ−ＳＤＳ法によりプラスミドＤＮＡを分離し、アガロ
ースゲル電気泳動を行って、目的のＤＮＡ断片が挿入さ
れたクローンを選択した。また、得られたプラスミドＤ
ＮＡをＡｃｃＩで部分消化することにより、何単位のプ
ロテインＡのＡＢドメインの遺伝子が挿入されているか
を調べ、１個から６個連結されたものをそれぞれ、ｐＴ
ＲＰ−ＰＲＯＴ−ＡＢＩからｐＴＲＰ−ＰＲＯＴ−ＡＢ
ＶＩと名付けた。
【００１４】
【（２）形質転換大腸菌ＪＭ１０９／ｐＴＲＰ−ＰＲＯ
Ｔ−ＡＢＩ〜ＶＩの培養】 プラスミドｐＴＲＰ−ＰＲ
ＯＴ−ＡＢＩ〜ＶＩで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を
アンピシリンを１ｍｌ当たり１００μｇ含むＬＢ培地
中、３７℃で２４時間培養した。このようにして得た菌
体は−２０℃で凍結保存した。
Ｔ−ＡＢＩ〜ＶＩの培養】 プラスミドｐＴＲＰ−ＰＲ
ＯＴ−ＡＢＩ〜ＶＩで形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を
アンピシリンを１ｍｌ当たり１００μｇ含むＬＢ培地
中、３７℃で２４時間培養した。このようにして得た菌
体は−２０℃で凍結保存した。
【００１５】
【（３）菌の粉砕と各マーカー蛋白質の精製】凍結して
あった菌体を室温で融解した後、菌体の３倍量の０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ダイノミルにより
菌を破砕した。これに１／５０容量の１０％ Ｌｕｂｒ
ｏｌＰＸを加え、０℃で１５分間撹拌した後、１５，０
００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心し、その遠心上清に硫
安を加えて３０％飽和にし、さらにその遠心上清に硫安
を加えて６０％飽和にして遠心し、３０−６０％飽和硫
安沈澱画分を得た。これを少量の緩衝液Ａ（０．１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．５）に
溶解し、セファデックスＧ−２５カラムで脱塩後、緩衝
液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムにアプ
ライした。目的蛋白質はこの条件でＤＥＡＥ−セファロ
ースに吸着する。緩衝液Ａでカラムを十分洗浄後、０−
１Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。目的蛋白質
は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いたＥＬＩ
ＳＡにより検出した。目的蛋白質画分を０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したＩｇＧ−セフ
ァロースカラムにアプライし、同緩衝液で十分カラムを
洗浄後、０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．
４）で溶出した。溶出画分を８０％飽和硫安で沈澱さ
せ、少量の緩衝液Ａで溶解後、０．２Ｍ ＮａＣｌを含
む０．１Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化されたＴＳ
Ｋｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムによる高速分子篩クロ
マトグラフィにかけた。このようにして得られた画分は
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンド
を示した。それぞれの分子量を示す蛋白質を同量ずつ混
合してウエスタンブロッティング用分子量マーカーとし
た。下記の表１に各マーカー蛋白質の分子量を示した。
ＡＢドメイン１個は１１６アミノ酸からなり、その分子
量は１３２０５．２４である。各マーカー蛋白質のＮ末
端にはＭｅｔＬｙｓＶａｌＡｓｐの４アミノ酸がついて
おり、Ｃ末端にはＴｈｒＧｌｙＡｒｇＡｒｇＰｈｅＴｈ
ｒＴｈｒＳｅｒの８アミノ酸がついている。また各ＡＢ
ドメインはＶａｌＡｓｐの２アミノ酸で連結されてい
る。表１に各マーカー蛋白質におけるＡＢドメインの連
結数とその分子量についてまとめた。
あった菌体を室温で融解した後、菌体の３倍量の０．１
ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ ＮａＣｌを含む５０ｍＭ
燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁し、ダイノミルにより
菌を破砕した。これに１／５０容量の１０％ Ｌｕｂｒ
ｏｌＰＸを加え、０℃で１５分間撹拌した後、１５，０
００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心し、その遠心上清に硫
安を加えて３０％飽和にし、さらにその遠心上清に硫安
を加えて６０％飽和にして遠心し、３０−６０％飽和硫
安沈澱画分を得た。これを少量の緩衝液Ａ（０．１ｍＭ
ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ燐酸緩衝液、ｐＨ７．５）に
溶解し、セファデックスＧ−２５カラムで脱塩後、緩衝
液Ａで平衡化したＤＥＡＥ−セファロースカラムにアプ
ライした。目的蛋白質はこの条件でＤＥＡＥ−セファロ
ースに吸着する。緩衝液Ａでカラムを十分洗浄後、０−
１Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出した。目的蛋白質
は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を用いたＥＬＩ
ＳＡにより検出した。目的蛋白質画分を０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む５０ｍＭト
リス塩酸緩衝液、ｐＨ７．４で平衡化したＩｇＧ−セフ
ァロースカラムにアプライし、同緩衝液で十分カラムを
洗浄後、０．５Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ３．
４）で溶出した。溶出画分を８０％飽和硫安で沈澱さ
せ、少量の緩衝液Ａで溶解後、０．２Ｍ ＮａＣｌを含
む０．１Ｍ燐酸緩衝液、ｐＨ７．０で平衡化されたＴＳ
Ｋｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムによる高速分子篩クロ
マトグラフィにかけた。このようにして得られた画分は
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で単一バンド
を示した。それぞれの分子量を示す蛋白質を同量ずつ混
合してウエスタンブロッティング用分子量マーカーとし
た。下記の表１に各マーカー蛋白質の分子量を示した。
ＡＢドメイン１個は１１６アミノ酸からなり、その分子
量は１３２０５．２４である。各マーカー蛋白質のＮ末
端にはＭｅｔＬｙｓＶａｌＡｓｐの４アミノ酸がついて
おり、Ｃ末端にはＴｈｒＧｌｙＡｒｇＡｒｇＰｈｅＴｈ
ｒＴｈｒＳｅｒの８アミノ酸がついている。また各ＡＢ
ドメインはＶａｌＡｓｐの２アミノ酸で連結されてい
る。表１に各マーカー蛋白質におけるＡＢドメインの連
結数とその分子量についてまとめた。
【００１６】
【表１】
【００１７】このようにして調製した６種類の分子量マ
ーカー蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、そのゲルをＣＢＢＲで染色したところ、図４
の結果を得た。図中、レーンＭはＢＲＬ社の分子量マー
カー、レーン１〜６は本発明に係るＰＲＯＴ−ＡＢＩ〜
ＶＩ、レーン７はレーン１〜６の混合物であるが、レー
ン１〜７は目的とする所定の分子量を有していることが
明瞭に認められる。
ーカー蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動にかけ、そのゲルをＣＢＢＲで染色したところ、図４
の結果を得た。図中、レーンＭはＢＲＬ社の分子量マー
カー、レーン１〜６は本発明に係るＰＲＯＴ−ＡＢＩ〜
ＶＩ、レーン７はレーン１〜６の混合物であるが、レー
ン１〜７は目的とする所定の分子量を有していることが
明瞭に認められる。
【００１８】同様にして上記のように各分子量マーカー
蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けた後、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットし、一次抗体
としてウサギの血清を、二次抗体として西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギ抗体を結合さ
せ、発色剤４−クロロ−１−ナフトールで発色させ、図
５の結果を得た。各レーンは図４と同じものを指すが、
図５からも明らかなように、本発明に係る分子量マーカ
ー蛋白質（レーン１〜６）は分子量マーカーとして充分
に機能することが実証された。なお、レーン７、８、
９、１０はレーン１〜６の混合物であり、レーン９、１
０はアミドブラックで染色したものである。
蛋白質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
けた後、ＰＶＤＦ膜にエレクトロブロットし、一次抗体
としてウサギの血清を、二次抗体として西洋ワサビペル
オキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギ抗体を結合さ
せ、発色剤４−クロロ−１−ナフトールで発色させ、図
５の結果を得た。各レーンは図４と同じものを指すが、
図５からも明らかなように、本発明に係る分子量マーカ
ー蛋白質（レーン１〜６）は分子量マーカーとして充分
に機能することが実証された。なお、レーン７、８、
９、１０はレーン１〜６の混合物であり、レーン９、１
０はアミドブラックで染色したものである。
【００１９】
【実施例２】実施例１と同様にして、プロテインＡのＤ
ドメインを用いて各種のマーカー蛋白質を調製した。そ
の結果を下記の表２に示す。表２は、Ｄドメインを単位
とした場合の連結数と各マーカー蛋白質の分子量につい
てまとめたものである。
ドメインを用いて各種のマーカー蛋白質を調製した。そ
の結果を下記の表２に示す。表２は、Ｄドメインを単位
とした場合の連結数と各マーカー蛋白質の分子量につい
てまとめたものである。
【００２０】
【表２】
【００２１】上記結果から明らかなように、本発明によ
れば各種分子量を有するマーカー蛋白質を目的に応じて
自由に調製することができる。またプロテインＡのＩｇ
Ｇ結合ドメインには上記したＡ、Ｂ、Ｄのほか、Ｅ、Ｃ
があるので（これのアミノ酸配列は図１に示した）、上
記したと同様の手法によって、Ｅ、Ｃのドメインについ
ても、目的とするマーカー蛋白質を同種又は異種のドメ
インの間で自由に調製することができる。
れば各種分子量を有するマーカー蛋白質を目的に応じて
自由に調製することができる。またプロテインＡのＩｇ
Ｇ結合ドメインには上記したＡ、Ｂ、Ｄのほか、Ｅ、Ｃ
があるので（これのアミノ酸配列は図１に示した）、上
記したと同様の手法によって、Ｅ、Ｃのドメインについ
ても、目的とするマーカー蛋白質を同種又は異種のドメ
インの間で自由に調製することができる。
【００２２】
【発明の効果】本発明は、遺伝子工学の手法を利用する
ことによってマーカー蛋白質を製造するものであって、
各ドメインを選択、結合することによって目的とする正
確な分子量を有するマーカー蛋白質を自由に製造するこ
とができる。
ことによってマーカー蛋白質を製造するものであって、
各ドメインを選択、結合することによって目的とする正
確な分子量を有するマーカー蛋白質を自由に製造するこ
とができる。
【００２３】したがって、本発明によって得られたウエ
スタンブロッティング用分子量マーカーは、イミュノブ
ロッティング法のみならず、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法における一般的な分子量マーカーとし
ても広く使用できる。
スタンブロッティング用分子量マーカーは、イミュノブ
ロッティング法のみならず、ＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法における一般的な分子量マーカーとし
ても広く使用できる。
【図１】プロテインＡの５つのＩｇＧ結合ドメイン
（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）のアミノ酸配列を比較した図で
あり、図中、５種の間で完全に一致しない部分につい
て、共通でないアミノ酸にアンダーラインを示した。
（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ、Ｃ）のアミノ酸配列を比較した図で
あり、図中、５種の間で完全に一致しない部分につい
て、共通でないアミノ酸にアンダーラインを示した。
【図２】本発明に係る発現プラスミドの構築図である。
【図３】ＰＣＲ法にプロティンＡのＡＢドメインの遺伝
子を増幅するための２種のプライマー（ＰＲＯＴＳ、Ｐ
ＲＯＴＡＳ）および、発現ベクターに開始コドンとＡｃ
ｃＩサイトを導入するための２種のプライマー（ＡＣＣ
Ｓ，ＡＣＣＡＳ）の塩基配列である。
子を増幅するための２種のプライマー（ＰＲＯＴＳ、Ｐ
ＲＯＴＡＳ）および、発現ベクターに開始コドンとＡｃ
ｃＩサイトを導入するための２種のプライマー（ＡＣＣ
Ｓ，ＡＣＣＡＳ）の塩基配列である。
【図４】本発明にしたがって作製された分子量マーカー
蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＣＢＢＲ
で染色した図面である。
蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＣＢＢＲ
で染色した図面である。
【図５】本発明にしたがって作製された分子量マーカー
蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＰＶＤＦ
膜にエレクトロブロットし、一次抗体としてウサギの血
清を、二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体を結
合させて、４−クロロ−１−ナフトールで発色させた図
面である。図４及び図５において各レーンはそれぞれ次
のものを示す：レーンＭ．ＢＲＬ社分子量マーカー；
１，ＰＲＯＴ−ＡＢＩ；２，ＰＲＯＴ−ＡＢＩＩ；３，
ＰＲＯＴ−ＡＢＩＩＩ；４，ＰＲＯＴ−ＡＢＩＶ；５，
ＰＲＯＴ−ＡＢＶ；６，ＰＲＯＴ−ＡＢＶＩ；７，８，
９，１０，レーン２〜７の混合物。ＣＢＢＲ染色ではＰ
ＲＯＴ−ＡＢＩ，ＩＩは１．０μｇ、ＰＲＯＴ−ＡＢＩ
ＩＩ−ＶＩは０．５μｇ、ブロッティングした方のレー
ン１−７ではＰＲＯＴ−ＡＢＩ，ＩＩは０．１μｇ、Ｐ
ＲＯＴ−ＡＢＩＩＩ−ＶＩは０．０５μｇ、レーン８，
９ではＰＲＯＴ−ＡＢＩ，ＩＩは０．５μｇ、ＰＲＯＴ
−ＡＢＩＩＩ−ＶＩは０．２５μｇ、レーン１０ではＰ
ＲＯＴ−ＡＢＩ，ＩＩは１．０μｇ、ＰＲＯＴ−ＡＢＩ
ＩＩ−ＶＩは０．５μｇを用いた。
蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、そのゲルをＰＶＤＦ
膜にエレクトロブロットし、一次抗体としてウサギの血
清を、二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ抗体を結
合させて、４−クロロ−１−ナフトールで発色させた図
面である。図４及び図５において各レーンはそれぞれ次
のものを示す：レーンＭ．ＢＲＬ社分子量マーカー；
１，ＰＲＯＴ−ＡＢＩ；２，ＰＲＯＴ−ＡＢＩＩ；３，
ＰＲＯＴ−ＡＢＩＩＩ；４，ＰＲＯＴ−ＡＢＩＶ；５，
ＰＲＯＴ−ＡＢＶ；６，ＰＲＯＴ−ＡＢＶＩ；７，８，
９，１０，レーン２〜７の混合物。ＣＢＢＲ染色ではＰ
ＲＯＴ−ＡＢＩ，ＩＩは１．０μｇ、ＰＲＯＴ−ＡＢＩ
ＩＩ−ＶＩは０．５μｇ、ブロッティングした方のレー
ン１−７ではＰＲＯＴ−ＡＢＩ，ＩＩは０．１μｇ、Ｐ
ＲＯＴ−ＡＢＩＩＩ−ＶＩは０．０５μｇ、レーン８，
９ではＰＲＯＴ−ＡＢＩ，ＩＩは０．５μｇ、ＰＲＯＴ
−ＡＢＩＩＩ−ＶＩは０．２５μｇ、レーン１０ではＰ
ＲＯＴ−ＡＢＩ，ＩＩは１．０μｇ、ＰＲＯＴ−ＡＢＩ
ＩＩ−ＶＩは０．５μｇを用いた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ
Claims (4)
- 【請求項１】 少なくとも２つのＩｇＧ結合性人工蛋白
質の連結物からなる分子量マーカーであり、各マーカー
は、異なる分子量を有するものであり、そして少なくと
も２つのくり返し単位を有し、且つそのくり返し単位の
各々はプロテインＡのドメインＥ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣか
らなるグループから選択される少なくともひとつのＩｇ
Ｇ結合性ドメインを含むものであること、を特徴とする
分子量マーカー。 - 【請求項２】 マーカー蛋白質が、ウエスタンブロッテ
ィングにおいて、目的蛋白質の検出をその目的蛋白質に
対する特異抗体を用いた酵素抗体法により行う場合、マ
ーカーのレーンを切り放すことなく同様の操作で発色し
てくるものであることを特徴とする、下記（イ）〜
（ニ）のいずれか１項に記載のマーカー蛋白質。 （イ） プロテインＡ、プロテインＧ又はプロテインＭ
などのＩｇＧ結合ドメインのいずれか、もしくはその内
のいくつかを単位として、それ（ら）を複数個連結させ
てなることを特徴とするマーカー蛋白質。 （ロ） プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインがＥ、Ｄ、
Ａ、Ｂ及び／又はＣであることを特徴とする（イ）に記
載のマーカー蛋白質。 （ハ） プロテインＧのＩｇＧ結合ドメインがＣ１、Ｃ
２及び／又はＣ３であることを特徴とする（イ）に記載
のマーカー蛋白質。 （ニ） プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのいずれ
か、もしくはその内のいくつかを単位として、それを１
種又は２種以上連結させてなることを特徴とするマーカ
ー蛋白質。 - 【請求項３】 各マーカー蛋白質の分子量の差が適宜の
間隔となるような組み合わせからなり、しかも同種の蛋
白質からなることを特徴とする請求項１〜請求項２のい
ずれか１項に記載のマーカー蛋白質。 - 【請求項４】 プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインＡＢ
を単位とし、このＡＢドメインを１〜複数個連結してな
ることを特徴とするマーカー蛋白質。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3207150A JP2519136B2 (ja) | 1991-07-25 | 1991-07-25 | 分子量マ−カ− |
| EP92916247A EP0550771B1 (en) | 1991-07-25 | 1992-07-23 | Immunoglobulin-binding artificial protein |
| PCT/JP1992/000938 WO1993002107A1 (en) | 1991-07-25 | 1992-07-23 | Immunoglobulin-combining artificial protein |
| EP97122254A EP0863210A3 (en) | 1991-07-25 | 1992-07-23 | Immunoglobulin-binding artificial protein |
| DE69230061T DE69230061T2 (de) | 1991-07-25 | 1992-07-23 | Künstliches immunoglobulin-bindendes protein |
| US08/406,809 US5580788A (en) | 1991-07-25 | 1995-03-20 | Use of immunoglogulin-binding artificial proteins as molecular weight markers |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3207150A JP2519136B2 (ja) | 1991-07-25 | 1991-07-25 | 分子量マ−カ− |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0532699A JPH0532699A (ja) | 1993-02-09 |
| JP2519136B2 true JP2519136B2 (ja) | 1996-07-31 |
Family
ID=16535047
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3207150A Expired - Lifetime JP2519136B2 (ja) | 1991-07-25 | 1991-07-25 | 分子量マ−カ− |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2519136B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5278940B2 (ja) * | 2007-11-12 | 2013-09-04 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 安定な抗体結合性タンパク質 |
| JP5645155B2 (ja) * | 2009-08-31 | 2014-12-24 | 国立大学法人 琉球大学 | 分子量マーカー及び分子量マーカーの作製方法 |
| US10189891B2 (en) | 2012-03-28 | 2019-01-29 | Ge Healthcare Bioprocess R&D Ab | Affinity chromatography matrix |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5151350A (en) * | 1982-10-27 | 1992-09-29 | Repligen Corporation | Cloned genes encoding recombinant protein a |
| JPS6217705A (ja) * | 1985-07-16 | 1987-01-26 | Nippon Kogaku Kk <Nikon> | テレセントリツク光学系用照明装置 |
-
1991
- 1991-07-25 JP JP3207150A patent/JP2519136B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0532699A (ja) | 1993-02-09 |
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