JP2747141B2 - 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ - Google Patents
安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、安定性が改良された変
異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ、該変異型大腸菌リボヌ
クレアーゼＨをコードしている遺伝子、該遺伝子を含有
し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発現ベクタ
ーを含有している形質転換体、および該形質転換体を用
いて変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨを製造する方法に
関する。
異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ、該変異型大腸菌リボヌ
クレアーゼＨをコードしている遺伝子、該遺伝子を含有
し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発現ベクタ
ーを含有している形質転換体、および該形質転換体を用
いて変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨを製造する方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術、および発明が解決しようとする課題】大
腸菌の天然型リボヌクレアーゼＨ(本明細書に於いて
は、単にリボヌクレアーゼＨ、またはＲＮaseＨと称す
る場合は、天然型の大腸菌リボヌクレアーゼＨを意味す
るものとする)は１５５アミノ酸からなる分子量約１９
Ｋdの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリ
ッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切断すると
いう基質特異性を有する。この酵素は、その基質特異性
に基づき、下記の如き様々な用途を有し、極めて利用価
値の高い酵素として注目されている。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。
腸菌の天然型リボヌクレアーゼＨ(本明細書に於いて
は、単にリボヌクレアーゼＨ、またはＲＮaseＨと称す
る場合は、天然型の大腸菌リボヌクレアーゼＨを意味す
るものとする)は１５５アミノ酸からなる分子量約１９
Ｋdの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリ
ッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切断すると
いう基質特異性を有する。この酵素は、その基質特異性
に基づき、下記の如き様々な用途を有し、極めて利用価
値の高い酵素として注目されている。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。
【０００３】リボヌクレアーゼＨの重要性は遺伝子工学
の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この酵
素は、大腸菌内での産生量が極めて低いことから、組換
えＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、既
にＢＲＬ、ファルマシアおよび宝酒造等から、組換えＤ
ＮＡ技術により生産されたリボヌクレアーゼＨが供給さ
れている。これらの市販の組換えリボヌクレアーゼＨ
は、大腸菌を宿主として生産されるものである(金谷
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、２６４、１１５４６−１１５４９(１９８９))。
の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この酵
素は、大腸菌内での産生量が極めて低いことから、組換
えＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、既
にＢＲＬ、ファルマシアおよび宝酒造等から、組換えＤ
ＮＡ技術により生産されたリボヌクレアーゼＨが供給さ
れている。これらの市販の組換えリボヌクレアーゼＨ
は、大腸菌を宿主として生産されるものである(金谷
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、２６４、１１５４６−１１５４９(１９８９))。
【０００４】このように利用価値の高いリボヌクレアー
ゼＨの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐性を高める
ことができれば、従来の組換えリボヌクレアーゼＨでは
利用できなかった条件下での利用が可能となる。
ゼＨの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐性を高める
ことができれば、従来の組換えリボヌクレアーゼＨでは
利用できなかった条件下での利用が可能となる。
【０００５】これまでに、本発明者らは組換えＤＮＡ技
術を用いて、天然型リボヌクレアーゼＨよりも高い安定
性を有する変異型リボヌクレアーゼＨを製造したが、そ
の安定化の程度は十分満足し得るものではなかった（特
願平０１−２８４４５４、特願平０３−１９７７０３、
特願平０３−１５８３３２）。また、安定性の改良され
た変異型リボヌクレアーゼＨの中には酵素活性が低下し
たものもある（特願平０３−１９７７０７）。また、大
腸菌リボヌクレアーゼＨよりも極めて高い安定性を有す
る好熱菌リボヌクレアーゼＨの大腸菌による製造法も報
告されているが（金谷ら、第２回日本蛋白工学会年会プ
ログラム・要旨集（１９９０）、６９頁；特願平０２−
１１１０６５）、大腸菌を用いて産生された好熱菌リボ
ヌクレアーゼＨの酵素活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨ
よりも低いものであった。尚、後者の場合、精製には尿
素を用いて可溶化するという操作が必要であり、大腸菌
リボヌクレアーゼＨの場合に較べてその製造方法が複雑
であるという欠点もあった。従って、より酵素活性、安
定性にすぐれた酵素であって、その製造および精製も好
熱菌リボヌクレアーゼＨよりも容易である変異リボヌク
レアーゼＨをつくることができれば、産業上より利用価
値が高いと考えられる。
術を用いて、天然型リボヌクレアーゼＨよりも高い安定
性を有する変異型リボヌクレアーゼＨを製造したが、そ
の安定化の程度は十分満足し得るものではなかった（特
願平０１−２８４４５４、特願平０３−１９７７０３、
特願平０３−１５８３３２）。また、安定性の改良され
た変異型リボヌクレアーゼＨの中には酵素活性が低下し
たものもある（特願平０３−１９７７０７）。また、大
腸菌リボヌクレアーゼＨよりも極めて高い安定性を有す
る好熱菌リボヌクレアーゼＨの大腸菌による製造法も報
告されているが（金谷ら、第２回日本蛋白工学会年会プ
ログラム・要旨集（１９９０）、６９頁；特願平０２−
１１１０６５）、大腸菌を用いて産生された好熱菌リボ
ヌクレアーゼＨの酵素活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨ
よりも低いものであった。尚、後者の場合、精製には尿
素を用いて可溶化するという操作が必要であり、大腸菌
リボヌクレアーゼＨの場合に較べてその製造方法が複雑
であるという欠点もあった。従って、より酵素活性、安
定性にすぐれた酵素であって、その製造および精製も好
熱菌リボヌクレアーゼＨよりも容易である変異リボヌク
レアーゼＨをつくることができれば、産業上より利用価
値が高いと考えられる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の観点
から、大腸菌リボヌクレアーゼＨの酵素活性を保持しな
がら、その安定性を高めることを目的として、好熱菌リ
ボヌクレアーゼＨのアミノ酸配列を参考にして種々の改
変を試みた結果、該酵素の遺伝子に部位特異的変異を導
入することにより該酵素の第９５番目のＬys（リシン）
をＧly（グリシン）に置換した変異体が、天然型のリボ
ヌクレアーゼＨよりも熱に対する安定性が優れているこ
とを見い出し、かつ、その酵素活性も天然型リボヌクレ
アーゼＨとほぼ同等であることを確認し、本発明を完成
するに至った。
から、大腸菌リボヌクレアーゼＨの酵素活性を保持しな
がら、その安定性を高めることを目的として、好熱菌リ
ボヌクレアーゼＨのアミノ酸配列を参考にして種々の改
変を試みた結果、該酵素の遺伝子に部位特異的変異を導
入することにより該酵素の第９５番目のＬys（リシン）
をＧly（グリシン）に置換した変異体が、天然型のリボ
ヌクレアーゼＨよりも熱に対する安定性が優れているこ
とを見い出し、かつ、その酵素活性も天然型リボヌクレ
アーゼＨとほぼ同等であることを確認し、本発明を完成
するに至った。
【０００７】即ち、本発明は、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨの第９５番目のＬysがＧlyで置換されたアミノ
酸配列からなる変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨを提供
するものである。
アーゼＨの第９５番目のＬysがＧlyで置換されたアミノ
酸配列からなる変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨを提供
するものである。
【０００８】また、本発明は、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨの第９５番目のＬysをコードしているコドン、
ＡＡＡがＧlyをコードするコドンに変換されている変異
型リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子を提供するものであ
る。また、本発明は上記変異型リボヌクレアーゼＨを大
腸菌で発現させるための発現ベクターを提供するもので
ある。
アーゼＨの第９５番目のＬysをコードしているコドン、
ＡＡＡがＧlyをコードするコドンに変換されている変異
型リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子を提供するものであ
る。また、本発明は上記変異型リボヌクレアーゼＨを大
腸菌で発現させるための発現ベクターを提供するもので
ある。
【０００９】また本発明は、上記の発現ベクターで形質
転換された変異型リボヌクレアーゼＨ産生性の形質転換
体を提供するものである。さらに本発明は、該形質転換
体を培養することにより、高い安定性を有する変異型リ
ボヌクレアーゼＨを製造する方法を提供するものであ
る。大腸菌を用いての遺伝子操作法は成書(Ｍaniatis
ら、Ｍolecular Ｃloning(１９８２):Ａ Ｌaboratoy Ｍ
anual, Ｃold Ｓpring ＨarborＬaboratoy)に詳述され
ており、上記変異型リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子、発
現ベクター、形質転換体は、この成書に記載の一般的手
法に従って、例えば後記実施例に示した様に常法通り作
製することができる。尚、本発明の発現ベクターは、大
腸菌内で機能するものであれば特に制限はないが、バク
テリオファージλのＰLおよびＰRプロモーターの支配下
に上記変異型リボヌクレアーゼＨ遺伝子を含有している
ものが好ましい。
転換された変異型リボヌクレアーゼＨ産生性の形質転換
体を提供するものである。さらに本発明は、該形質転換
体を培養することにより、高い安定性を有する変異型リ
ボヌクレアーゼＨを製造する方法を提供するものであ
る。大腸菌を用いての遺伝子操作法は成書(Ｍaniatis
ら、Ｍolecular Ｃloning(１９８２):Ａ Ｌaboratoy Ｍ
anual, Ｃold Ｓpring ＨarborＬaboratoy)に詳述され
ており、上記変異型リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子、発
現ベクター、形質転換体は、この成書に記載の一般的手
法に従って、例えば後記実施例に示した様に常法通り作
製することができる。尚、本発明の発現ベクターは、大
腸菌内で機能するものであれば特に制限はないが、バク
テリオファージλのＰLおよびＰRプロモーターの支配下
に上記変異型リボヌクレアーゼＨ遺伝子を含有している
ものが好ましい。
【００１０】
【発明の効果】本発明により安定性が高められた変異型
大腸菌リボヌクレアーゼＨは、従来のリボヌクレアーゼ
Ｈでは変性してしまう高い温度下でさえも変性すること
がない（実施例３参照）ので、このような条件下での取
扱いが可能である。さらに、本発明の変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨは、耐久性等も向上していると期待さ
れ、従来のリボヌクレアーゼＨよりも失活しにくく、安
定に保存することができるので、取り扱いが容易になる
ことは理解されるであろう。また、本発明の変異型大腸
菌リボヌクレアーゼＨは天然型リボヌクレアーゼＨと同
等の酵素活性を有し、これを用いることにより、天然型
リボヌクレアーゼＨと同量で、ほぼ同等の酵素活性を得
ることができる。
大腸菌リボヌクレアーゼＨは、従来のリボヌクレアーゼ
Ｈでは変性してしまう高い温度下でさえも変性すること
がない（実施例３参照）ので、このような条件下での取
扱いが可能である。さらに、本発明の変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨは、耐久性等も向上していると期待さ
れ、従来のリボヌクレアーゼＨよりも失活しにくく、安
定に保存することができるので、取り扱いが容易になる
ことは理解されるであろう。また、本発明の変異型大腸
菌リボヌクレアーゼＨは天然型リボヌクレアーゼＨと同
等の酵素活性を有し、これを用いることにより、天然型
リボヌクレアーゼＨと同量で、ほぼ同等の酵素活性を得
ることができる。
【００１１】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９
８２): Ａ Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓping Ｈarbor
Ｌaboratoy)および試薬の仕様書に従った。
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９
８２): Ａ Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓping Ｈarbor
Ｌaboratoy)および試薬の仕様書に従った。
【００１２】実施例１ プラスミドpＪＫ９５Ｇの作製 プラスミドpＪＫ９５Ｇの作製の概略を図１に示す。ま
ず、天然型リボヌクレアーゼＨの大腸菌での発現プラス
ミドpＡＫ６００（特開平０３−０６５１８８参照）のr
nh遺伝子を鋳型とし、プライマーを用いてＰＣＲ法によ
りrnh遺伝子への点突然変異の導入を行った。
ず、天然型リボヌクレアーゼＨの大腸菌での発現プラス
ミドpＡＫ６００（特開平０３−０６５１８８参照）のr
nh遺伝子を鋳型とし、プライマーを用いてＰＣＲ法によ
りrnh遺伝子への点突然変異の導入を行った。
【００１３】プライマーとしては、図２に示す化学合成
したオリゴヌクレオチドを用いた。図１および図２に示
すように、まず、pＡＫ６００を鋳型ＤＮＡとし、Ｓph
Ｉの制限酵素部位を含む５'−プライマー(１)と変異導
入用３'−プライマー(４)により約３００bpのＤＮＡ断
片を、また、変異導入用５'−プライマー(３)とＳalＩ
部位を含む３'−プライマー(２)により約２５０bpのＤ
ＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、遺伝子断
片２種を得た。ＰＣＲ反応は市販のＧene ＡmpＫit(Ｔa
kara)の説明書に従って行った。得られた約３００bpの
遺伝子断片を制限酵素ＳphＩおよびＰstＩで、約２５０
bpのＤＮＡ断片を制限酵素ＰstＩおよびＳalＩで消化し
た後、消化物を１.５％アガロースゲル電気泳動にか
け、それぞれ約３００bp、約２５０bpのＤＮＡ断片を得
た。このうち、約２５０bp断片には変異導入部位が含ま
れる。
したオリゴヌクレオチドを用いた。図１および図２に示
すように、まず、pＡＫ６００を鋳型ＤＮＡとし、Ｓph
Ｉの制限酵素部位を含む５'−プライマー(１)と変異導
入用３'−プライマー(４)により約３００bpのＤＮＡ断
片を、また、変異導入用５'−プライマー(３)とＳalＩ
部位を含む３'−プライマー(２)により約２５０bpのＤ
ＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ反応により増幅し、遺伝子断
片２種を得た。ＰＣＲ反応は市販のＧene ＡmpＫit(Ｔa
kara)の説明書に従って行った。得られた約３００bpの
遺伝子断片を制限酵素ＳphＩおよびＰstＩで、約２５０
bpのＤＮＡ断片を制限酵素ＰstＩおよびＳalＩで消化し
た後、消化物を１.５％アガロースゲル電気泳動にか
け、それぞれ約３００bp、約２５０bpのＤＮＡ断片を得
た。このうち、約２５０bp断片には変異導入部位が含ま
れる。
【００１４】次に、このようにして得られた変異遺伝子
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニング
し、発現ベクターを作製した。プラスミドpＪＬＡ５０
４(ドイツ：Ｍedac社より購入)をＳphＩおよびＳalＩで
消化し、約４.９kbの断片を０.７％アガロース電気泳動
により精製した後、上記約３００bp、約２５０bpの変異
rnh遺伝子ＳphＩ−ＳalＩ断片とライゲーションするこ
とにより環化した。ライゲーションは市販のライゲーシ
ョンキット(Ｔakara)を用い、添付の説明書に正確に従
って行った。このようにして得られたプラスミドで大腸
菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換体より変異型リ
ボヌクレアーゼＨ発現用プラスミドベクターpＪＫ９５
Ｇを得た。
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニング
し、発現ベクターを作製した。プラスミドpＪＬＡ５０
４(ドイツ：Ｍedac社より購入)をＳphＩおよびＳalＩで
消化し、約４.９kbの断片を０.７％アガロース電気泳動
により精製した後、上記約３００bp、約２５０bpの変異
rnh遺伝子ＳphＩ−ＳalＩ断片とライゲーションするこ
とにより環化した。ライゲーションは市販のライゲーシ
ョンキット(Ｔakara)を用い、添付の説明書に正確に従
って行った。このようにして得られたプラスミドで大腸
菌ＨＢ１０１株を形質転換し、形質転換体より変異型リ
ボヌクレアーゼＨ発現用プラスミドベクターpＪＫ９５
Ｇを得た。
【００１５】上記のようにして得られた形質転換菌エシ
エリシア・コリ(Ｅ.coli)ＨＢ１０１／pＪＫ９５Ｇは工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（微工
研菌寄第１２４９５号、受託日：平成３年９月１０
日）。
エリシア・コリ(Ｅ.coli)ＨＢ１０１／pＪＫ９５Ｇは工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（微工
研菌寄第１２４９５号、受託日：平成３年９月１０
日）。
【００１６】実施例２ 変異型リボヌクレアーゼＨ（Ｋ
９５Ｇ）の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＫ９５Ｇを１００μg
／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５００ml中、３０℃
で振盪培養した。培養液の濁度がクレット値で約１００
まで生育した時点で、培養温度を４２℃に上げ、更に
３.５時間振盪を続け、次いで遠心して集菌した。この
時のクレット値は約２５０であった。
９５Ｇ）の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＫ９５Ｇを１００μg
／ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５００ml中、３０℃
で振盪培養した。培養液の濁度がクレット値で約１００
まで生育した時点で、培養温度を４２℃に上げ、更に
３.５時間振盪を続け、次いで遠心して集菌した。この
時のクレット値は約２５０であった。
【００１７】得られた菌体を１mＭ ＥＤＴＡを含む１０
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)１５mlに懸濁し
た後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,
０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗
抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５lに対して４℃で一夜透析
した。透析後の粗抽出液を同緩衝液で平衡化したＤＥ−
５２カラム(５ml)およびＰ−１１カラム(２ml)にこの順
序で通した。この条件下、変異型リボヌクレアーゼＨ
(Ｋ９５Ｇ)は、ＤＥ−５２カラムを素通りし、Ｐ−１１
カラムに吸着する。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、Ｎ
aＣl濃度を０.５Ｍまで直線的に上昇させることにより
Ｐ−１１カラムから変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５
Ｇ)を溶出させた。変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５
Ｇ)を含むＰ−１１溶出画分をまとめ、精製標品とし
た。精製標品は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを
与え、逆相ＨＰＬＣでも単一ピークを示した。精製収量
は５４.２mg／l培養液であった。精製標品の同定は、ア
クロモバクタープロテアーゼIにより消化して得られる
ペプチドフラグメントを逆相ＨＰＬＣでマッピングして
各フラグメントピークの溶出位置を確認するとともに、
９５位のアミノ酸を含むペプチドを分取後アミノ酸配列
分析により行った。
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)１５mlに懸濁し
た後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,
０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗
抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５lに対して４℃で一夜透析
した。透析後の粗抽出液を同緩衝液で平衡化したＤＥ−
５２カラム(５ml)およびＰ−１１カラム(２ml)にこの順
序で通した。この条件下、変異型リボヌクレアーゼＨ
(Ｋ９５Ｇ)は、ＤＥ−５２カラムを素通りし、Ｐ−１１
カラムに吸着する。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、Ｎ
aＣl濃度を０.５Ｍまで直線的に上昇させることにより
Ｐ−１１カラムから変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５
Ｇ)を溶出させた。変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５
Ｇ)を含むＰ−１１溶出画分をまとめ、精製標品とし
た。精製標品は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを
与え、逆相ＨＰＬＣでも単一ピークを示した。精製収量
は５４.２mg／l培養液であった。精製標品の同定は、ア
クロモバクタープロテアーゼIにより消化して得られる
ペプチドフラグメントを逆相ＨＰＬＣでマッピングして
各フラグメントピークの溶出位置を確認するとともに、
９５位のアミノ酸を含むペプチドを分取後アミノ酸配列
分析により行った。
【００１８】得られた精製標品の０.１Ｍ ＮaＣlを含む
１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.５)中における２
００〜２５０nmでのＣＤスペクトルは天然型と同一であ
り、ＣＤスペクトルで検出できるような２次構造の変化
は見られなかった。また、以下の方法により酵素活性を
測定し、比活性を測定したところ、得られた変異型酵素
は２３Ｕ／mgの比活性を有しており、天然型酵素の約１
２０％の酵素活性を保持していた。得られた比較結果を
以下の表１に示す。
１０mＭ酢酸ナトリウム緩衝液(pＨ５.５)中における２
００〜２５０nmでのＣＤスペクトルは天然型と同一であ
り、ＣＤスペクトルで検出できるような２次構造の変化
は見られなかった。また、以下の方法により酵素活性を
測定し、比活性を測定したところ、得られた変異型酵素
は２３Ｕ／mgの比活性を有しており、天然型酵素の約１
２０％の酵素活性を保持していた。得られた比較結果を
以下の表１に示す。
【００１９】活性は、[3Ｈ]−Ｍ１３ＤＮＡ／ＲＮＡを
基質として用い、３７℃、１分間に１μmolの酸可溶性
物質を遊離する酵素活性を１ユニット(Ｕ)と定義した。
タンパク量は変異型リボヌクレアーゼＨと天然型リボヌ
クレアーゼＨとが同じ吸光係数を持つという仮定のもと
にε280＝１５７６Ｍ-1・cm-1を用いて２８０nmにおけ
る吸光度を測定することにより求めた。
基質として用い、３７℃、１分間に１μmolの酸可溶性
物質を遊離する酵素活性を１ユニット(Ｕ)と定義した。
タンパク量は変異型リボヌクレアーゼＨと天然型リボヌ
クレアーゼＨとが同じ吸光係数を持つという仮定のもと
にε280＝１５７６Ｍ-1・cm-1を用いて２８０nmにおけ
る吸光度を測定することにより求めた。
【表１】 天然型と変異型リボヌクレアーゼＨの酵素活性の比較 酵素名 比活性(Ｕ／mg) 天然型リボヌクレアーゼＨ ２０ 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ｇ) ２３
【００２０】実施例３ 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ
９５Ｇ)の安定性の評価 天然型リボヌクレアーゼＨと変異型リボヌクレアーゼＨ
（Ｋ９５Ｇ）の熱安定性について測定し、比較した。測
定はpＨ５.５での変性の割合を２２０nmにおけるＣＤ値
で熱変性曲線を測定することにより行った。熱変性実験
は光路長２mmのセルを用い、１Ｍ塩酸グアニジンおよび
１mＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む２０mＭ酢酸
ナトリウム（pＨ５.５）中で行った。変異型リボヌクレ
アーゼＨ（Ｋ９５Ｇ）の熱変性曲線は天然型の熱変性曲
線よりも高温側へシフトしており、明らかに熱安定性が
増加していた。全体の５０％が変性するときの温度を比
較すると変異型リボヌクレアーゼＨ（Ｋ９５Ｇ）は天然
型よりも６.８℃安定化していた。得られた結果を以下
の表２に示す。
９５Ｇ)の安定性の評価 天然型リボヌクレアーゼＨと変異型リボヌクレアーゼＨ
（Ｋ９５Ｇ）の熱安定性について測定し、比較した。測
定はpＨ５.５での変性の割合を２２０nmにおけるＣＤ値
で熱変性曲線を測定することにより行った。熱変性実験
は光路長２mmのセルを用い、１Ｍ塩酸グアニジンおよび
１mＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む２０mＭ酢酸
ナトリウム（pＨ５.５）中で行った。変異型リボヌクレ
アーゼＨ（Ｋ９５Ｇ）の熱変性曲線は天然型の熱変性曲
線よりも高温側へシフトしており、明らかに熱安定性が
増加していた。全体の５０％が変性するときの温度を比
較すると変異型リボヌクレアーゼＨ（Ｋ９５Ｇ）は天然
型よりも６.８℃安定化していた。得られた結果を以下
の表２に示す。
【表２】 天然型および変異型リボヌクレアーゼＨの熱安定性の比較 酵 素 名 ５０％変性するときの温度（℃） 天然型リボヌクレアーゼＨ ５１.９ 変異型リボヌクレアーゼ(Ｋ９５Ｇ) ５８.７
【００２１】以上の結果から、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨの第９５番目のＬysをＧlyに変換することによ
り、熱に対する安定性が向上することが確認された。
アーゼＨの第９５番目のＬysをＧlyに変換することによ
り、熱に対する安定性が向上することが確認された。
【図１】 プラスミドpＪＫ９５Ｇの構築を示す模式図
である。
である。
【図２】 部位特異的突然変異を導入するための合成オ
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中、下線は制
限酵素部位を、●印は変異アミノ酸に対応する塩基（Ｇ
ly95に対応する塩基）をそれぞれ示すものである。
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中、下線は制
限酵素部位を、●印は変異アミノ酸に対応する塩基（Ｇ
ly95に対応する塩基）をそれぞれ示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/22 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨのアミ
ノ酸配列において、第９５番目のリシンがグリシンで置
換されたアミノ酸配列を有する変異型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨ。 - 【請求項２】 請求項１に記載の変異型大腸菌リボヌク
レアーゼＨを暗号化している変異型大腸菌リボヌクレア
ーゼＨ構造遺伝子。 - 【請求項３】 請求項２に記載の変異型大腸菌リボヌク
レアーゼＨ構造遺伝子を大腸菌の遺伝子発現系制御下に
含有している組換え体プラスミド。 - 【請求項４】 pＪＫ９５Ｇである請求項３に記載の組
換え体プラスミド。 - 【請求項５】 請求項３または４のいずれかに記載の組
換え体プラスミドで形質転換された大腸菌株。 - 【請求項６】 ＨＢ１０１／pＪＫ９５Ｇである請求項
５に記載の大腸菌株。 - 【請求項７】 請求項５または６のいずれかに記載の大
腸菌株を培養し、得られた培養液から変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨを回収することを特徴とする変異型大腸
菌リボヌクレアーゼＨの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24744191A JP2747141B2 (ja) | 1991-09-26 | 1991-09-26 | 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24744191A JP2747141B2 (ja) | 1991-09-26 | 1991-09-26 | 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0576359A JPH0576359A (ja) | 1993-03-30 |
| JP2747141B2 true JP2747141B2 (ja) | 1998-05-06 |
Family
ID=17163492
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24744191A Expired - Lifetime JP2747141B2 (ja) | 1991-09-26 | 1991-09-26 | 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2747141B2 (ja) |
-
1991
- 1991-09-26 JP JP24744191A patent/JP2747141B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＢＩＯＬ．ＣＨＥＭ．２６７（３１） Ｐ．２２０１４−２２０１７ （１９９２） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0576359A (ja) | 1993-03-30 |
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