JP2902206B2 - タンパク質分子の安定化法 - Google Patents
タンパク質分子の安定化法Info
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- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、産業上用いられている
有用タンパク質の安定性を改良するための方法に関す
る。
有用タンパク質の安定性を改良するための方法に関す
る。
【０００２】
【従来技術とその問題点】酵素等のタンパク質の耐溶媒
性、耐熱性などタンパク質分子の安定性を高めることは
タンパク質を産業上利用する上で極めて有用な結果をも
たらすと期待される。タンパク質の安定性を高めるため
の方法としては、人工的にジスルフィド結合を導入する
方法(Wetzel等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,401-405(19
88))、イオン対または水素結合の補強(Alber等,Nature,
330,41-46(1987))、α-ヘリックスの双極子モーメント
の安定化(Nicholson等,Nature,336,651-656(1988))、金
属イオン結合部位の導入(黒木等、特願平01-077526；Ku
roki等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6903-6907(1989))
などが報告されている。一般にこれらの方法により安定
化をはかろうとする場合にはタンパク質分子の立体構造
に基づいて改変するアミノ酸残基を決定するが、タンパ
ク質によってはこれらの方法をうまく適用できるアミノ
酸残基が存在しない場合も多く、これらの方法がすべて
のタンパク質に対して適用できるというわけではない。
したがって、さらに新しい安定化法を開発し、その適用
範囲を拡大することが望まれている。
性、耐熱性などタンパク質分子の安定性を高めることは
タンパク質を産業上利用する上で極めて有用な結果をも
たらすと期待される。タンパク質の安定性を高めるため
の方法としては、人工的にジスルフィド結合を導入する
方法(Wetzel等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,401-405(19
88))、イオン対または水素結合の補強(Alber等,Nature,
330,41-46(1987))、α-ヘリックスの双極子モーメント
の安定化(Nicholson等,Nature,336,651-656(1988))、金
属イオン結合部位の導入(黒木等、特願平01-077526；Ku
roki等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,6903-6907(1989))
などが報告されている。一般にこれらの方法により安定
化をはかろうとする場合にはタンパク質分子の立体構造
に基づいて改変するアミノ酸残基を決定するが、タンパ
ク質によってはこれらの方法をうまく適用できるアミノ
酸残基が存在しない場合も多く、これらの方法がすべて
のタンパク質に対して適用できるというわけではない。
したがって、さらに新しい安定化法を開発し、その適用
範囲を拡大することが望まれている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記の従来技術はいず
れも、分子中に新しい相互作用を導入し、タンパク質分
子本来の立体構造を補強することによって、その安定性
の増大を図るものである。本発明者らは、タンパク質分
子が本来含有している不安定化要素、特に主鎖のひずみ
に着目し、このひずみを解消するような改変をタンパク
質分子に加えることによって、その安定性の増大を図り
得ることを見いだし本発明を完成したものである。
れも、分子中に新しい相互作用を導入し、タンパク質分
子本来の立体構造を補強することによって、その安定性
の増大を図るものである。本発明者らは、タンパク質分
子が本来含有している不安定化要素、特に主鎖のひずみ
に着目し、このひずみを解消するような改変をタンパク
質分子に加えることによって、その安定性の増大を図り
得ることを見いだし本発明を完成したものである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】タンパク質分子の主鎖の
二面角は制限されており、グリシン以外のアミノ酸残基
の主鎖の二面角は折りたたまれたタンパク質分子中では
「右巻きらせん型」または「伸展型」をとっている場合が多
く、「左巻きらせん型」は非常に少ない。一方、グリシン
残基の場合には、「右巻きらせん型」と「左巻きらせん型」
が同程度であることが知られている(Richardson,Advan.
Protein Chem,34,167-339(1981)；Nicholson等,J.Mol.B
iol.,210,181-193(1989))。また、グリシン以外のアミ
ノ酸残基の中ではアスパラギン残基およびアスパラギン
酸残基が「左巻きらせん型」をとりやすいことも知られて
いる(Nicholson等,J.Mol,Biol,210,181-193(1989))。
二面角は制限されており、グリシン以外のアミノ酸残基
の主鎖の二面角は折りたたまれたタンパク質分子中では
「右巻きらせん型」または「伸展型」をとっている場合が多
く、「左巻きらせん型」は非常に少ない。一方、グリシン
残基の場合には、「右巻きらせん型」と「左巻きらせん型」
が同程度であることが知られている(Richardson,Advan.
Protein Chem,34,167-339(1981)；Nicholson等,J.Mol.B
iol.,210,181-193(1989))。また、グリシン以外のアミ
ノ酸残基の中ではアスパラギン残基およびアスパラギン
酸残基が「左巻きらせん型」をとりやすいことも知られて
いる(Nicholson等,J.Mol,Biol,210,181-193(1989))。
【０００５】このように好ましい立体配置がアミノ酸残
基の種類によって異なることは、グリシン残基およびア
スパラギン残基の「左巻きらせん型」と「右巻きらせん型」
の間の構造エネルギー差が、他のアミノ酸残基の場合に
比べて小さいためと考えられている。即ち、グリシン残
基以外のＬ-アミノ酸残基では、「左巻きらせん型」は
「右巻きらせん型」よりも０.５〜２.０kcal／mol程度エ
ネルギーが高く不安定であるが、グリシン残基ではこの
エネルギー差は全くなく(Brant等,J.Mol.Biol.,23,47-6
5(1967)；Gordon等,J.Am.Chem.Soc.,113,5989-5997(199
1))、またアスパラギン残基では、その短い極性側鎖が
残基内で水素結合を作ったり、あるいはタンパク質中の
他の部分と相互作用することによってこのエネルギー差
を相殺している(Richardson & Richardson,“Predictio
n of Protein Structure and the Principles of Prote
in Conformation",Fasman編,Plenum,New York(1989))。
したがって、「左巻きらせん型」の二面角を持ち、それゆ
えにそのタンパク質の不安定化に寄与しているアミノ酸
残基を、「左巻きらせん型」をとりやすいアミノ酸残基、
例えばグリシン残基またはアスパラギン残基に置換する
ことによって、タンパク質を安定化することができると
期待できる。
基の種類によって異なることは、グリシン残基およびア
スパラギン残基の「左巻きらせん型」と「右巻きらせん型」
の間の構造エネルギー差が、他のアミノ酸残基の場合に
比べて小さいためと考えられている。即ち、グリシン残
基以外のＬ-アミノ酸残基では、「左巻きらせん型」は
「右巻きらせん型」よりも０.５〜２.０kcal／mol程度エ
ネルギーが高く不安定であるが、グリシン残基ではこの
エネルギー差は全くなく(Brant等,J.Mol.Biol.,23,47-6
5(1967)；Gordon等,J.Am.Chem.Soc.,113,5989-5997(199
1))、またアスパラギン残基では、その短い極性側鎖が
残基内で水素結合を作ったり、あるいはタンパク質中の
他の部分と相互作用することによってこのエネルギー差
を相殺している(Richardson & Richardson,“Predictio
n of Protein Structure and the Principles of Prote
in Conformation",Fasman編,Plenum,New York(1989))。
したがって、「左巻きらせん型」の二面角を持ち、それゆ
えにそのタンパク質の不安定化に寄与しているアミノ酸
残基を、「左巻きらせん型」をとりやすいアミノ酸残基、
例えばグリシン残基またはアスパラギン残基に置換する
ことによって、タンパク質を安定化することができると
期待できる。
【０００６】これまでに、「左巻きらせん型」の二面角を
持つグリシン以外のアミノ酸残基をグリシン残基に置換
した例としては、バクテリオファージＴ４リゾチームの
例が報告されているが、安定性の向上はなされていない
(Nicholson等,J.Mol.Biol,210,181-193(1989))。しかし
この例ではアミノ酸残基の置換に伴って側鎖間の相互作
用にも変化が生じており、このために安定性が向上しな
かった可能性も否定できない。したがって本発明の目的
のためには、側鎖間の相互作用の変化による不安定化を
引き起こさないような変異部位および導入残基を適切に
選択することが重要であると考えられる。
持つグリシン以外のアミノ酸残基をグリシン残基に置換
した例としては、バクテリオファージＴ４リゾチームの
例が報告されているが、安定性の向上はなされていない
(Nicholson等,J.Mol.Biol,210,181-193(1989))。しかし
この例ではアミノ酸残基の置換に伴って側鎖間の相互作
用にも変化が生じており、このために安定性が向上しな
かった可能性も否定できない。したがって本発明の目的
のためには、側鎖間の相互作用の変化による不安定化を
引き起こさないような変異部位および導入残基を適切に
選択することが重要であると考えられる。
【０００７】本発明者らは、上記の観点から、「左巻き
らせん型」の二面角をとっている大腸菌リボヌクレアー
ゼＨの第９５番目のＬys残基に着目し、このアミノ酸残
基を種々のアミノ酸残基に置換した結果、第９５番目の
アミノ酸残基をグリシン残基またはアスパラギン残基の
いずれかに置換することにより耐熱性が向上することを
見い出し、さらに、グリシン残基またはアスパラギン残
基に置換してもこの残基が「左巻きらせん型」を維持し
ており、しかも主鎖の二面角にほとんど変化がないこと
を変異酵素のＸ線結晶解析により確認することによって
本発明の有効性を立証した。
らせん型」の二面角をとっている大腸菌リボヌクレアー
ゼＨの第９５番目のＬys残基に着目し、このアミノ酸残
基を種々のアミノ酸残基に置換した結果、第９５番目の
アミノ酸残基をグリシン残基またはアスパラギン残基の
いずれかに置換することにより耐熱性が向上することを
見い出し、さらに、グリシン残基またはアスパラギン残
基に置換してもこの残基が「左巻きらせん型」を維持し
ており、しかも主鎖の二面角にほとんど変化がないこと
を変異酵素のＸ線結晶解析により確認することによって
本発明の有効性を立証した。
【０００８】
【詳細な説明】要するに本発明は、タンパク質分子中で
主鎖の立体配置が左巻きらせん型であるアミノ酸残基
を、主鎖の立体配置が左巻きらせん型をとる頻度の高い
他のアミノ酸残基に置換することからなる、タンパク質
分子の安定化法を提供するものである。
主鎖の立体配置が左巻きらせん型であるアミノ酸残基
を、主鎖の立体配置が左巻きらせん型をとる頻度の高い
他のアミノ酸残基に置換することからなる、タンパク質
分子の安定化法を提供するものである。
【０００９】本発明の安定化法を適用するアミノ酸残基
としては、好ましくは「左巻きらせん型」の二面角をとる
グリシン以外のアミノ酸残基であり、より好ましくはグ
リシンおよびアスパラギン以外のそのようなアミノ酸残
基であり、さらに、そのアミノ酸残基の側鎖が他のアミ
ノ酸残基と塩結合、水素結合、疎水結合などの相互作用
をしておらず、溶媒中に突き出ている状態のアミノ酸残
基が最も好ましい。これは、このような条件を満たすア
ミノ酸残基の置換が、主鎖のひずみを解消することによ
ってタンパク質の安定化に寄与し、かつ置換によって元
のアミノ酸残基側鎖の相互作用による安定化効果を減ず
ることがないと考えられるからである。
としては、好ましくは「左巻きらせん型」の二面角をとる
グリシン以外のアミノ酸残基であり、より好ましくはグ
リシンおよびアスパラギン以外のそのようなアミノ酸残
基であり、さらに、そのアミノ酸残基の側鎖が他のアミ
ノ酸残基と塩結合、水素結合、疎水結合などの相互作用
をしておらず、溶媒中に突き出ている状態のアミノ酸残
基が最も好ましい。これは、このような条件を満たすア
ミノ酸残基の置換が、主鎖のひずみを解消することによ
ってタンパク質の安定化に寄与し、かつ置換によって元
のアミノ酸残基側鎖の相互作用による安定化効果を減ず
ることがないと考えられるからである。
【００１０】左巻きらせん型立体配置を持つ上記のよう
なアミノ酸残基の二面角を大きく変えずにそのひずみを
解消するアミノ酸置換としては、主鎖のひずみを解消で
きるアミノ酸残基への置換であれば何でもよいが、多様
な二面角をとりやすいグリシン残基が最も好ましく、ま
たアスパラギン残基も好ましい。
なアミノ酸残基の二面角を大きく変えずにそのひずみを
解消するアミノ酸置換としては、主鎖のひずみを解消で
きるアミノ酸残基への置換であれば何でもよいが、多様
な二面角をとりやすいグリシン残基が最も好ましく、ま
たアスパラギン残基も好ましい。
【００１１】本発明の方法は、タンパク質分子中の主鎖
の立体配置が左巻きらせん型である上述のようなアミノ
酸残基を含み、かつそのアミノ酸残基の側鎖がタンパク
質中の他の部分と相互作用していなければ、いかなるタ
ンパク質に対してもその安定性を改良するために適用す
ることができると考えられる。
の立体配置が左巻きらせん型である上述のようなアミノ
酸残基を含み、かつそのアミノ酸残基の側鎖がタンパク
質中の他の部分と相互作用していなければ、いかなるタ
ンパク質に対してもその安定性を改良するために適用す
ることができると考えられる。
【００１２】以下、本発明の具体的な態様として、天然
型大腸菌リボヌクレアーゼＨの第９５番目のリジン残基
をグリシン残基またはアスパラギン残基で置換すること
を特徴とするリボヌクレアーゼＨの安定化法について記
載する。
型大腸菌リボヌクレアーゼＨの第９５番目のリジン残基
をグリシン残基またはアスパラギン残基で置換すること
を特徴とするリボヌクレアーゼＨの安定化法について記
載する。
【００１３】大腸菌の天然型リボヌクレアーゼＨ(本明
細書に於いて単にリボヌクレアーゼＨまたはＲＮaseＨ
と称する場合には、天然型の大腸菌リボヌクレアーゼＨ
を意味するものとする)は１５５アミノ酸からなる分子
量約１９Ｋdの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡ
ハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切
断するという基質特異性を有する。この酵素は、その基
質特異性に基づき、下記のような様々な用途を有し、極
めて利用価値の高い酵素として注目されている。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除
去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。
細書に於いて単にリボヌクレアーゼＨまたはＲＮaseＨ
と称する場合には、天然型の大腸菌リボヌクレアーゼＨ
を意味するものとする)は１５５アミノ酸からなる分子
量約１９Ｋdの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡ
ハイブリッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切
断するという基質特異性を有する。この酵素は、その基
質特異性に基づき、下記のような様々な用途を有し、極
めて利用価値の高い酵素として注目されている。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除
去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。
【００１４】リボヌクレアーゼＨの重要性は遺伝子工学
の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この酵
素は大腸菌内での産生量が極めて低いことから、組換え
ＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、既に
ＢＲＬ、ファルマシアおよび宝酒造等から、組換えＤＮ
Ａ技術によって生産されたリボヌクレアーゼＨが供給さ
れている。これらの市販の組換えリボヌクレアーゼＨ
は、大腸菌を宿主として生産されるものである(金谷等,
J.Biol.Chem.,264,11546-11549(1989))。
の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この酵
素は大腸菌内での産生量が極めて低いことから、組換え
ＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、既に
ＢＲＬ、ファルマシアおよび宝酒造等から、組換えＤＮ
Ａ技術によって生産されたリボヌクレアーゼＨが供給さ
れている。これらの市販の組換えリボヌクレアーゼＨ
は、大腸菌を宿主として生産されるものである(金谷等,
J.Biol.Chem.,264,11546-11549(1989))。
【００１５】このように利用価値の高いリボヌクレアー
ゼＨの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐性を高める
ことができれば、従来の組換えリボヌクレアーゼＨでは
利用できなかった条件下での利用が可能となる。
ゼＨの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐性を高める
ことができれば、従来の組換えリボヌクレアーゼＨでは
利用できなかった条件下での利用が可能となる。
【００１６】これまでに、本発明者らは組換えＤＮＡ技
術を用いて、天然型リボヌクレアーゼＨよりも高い安定
性を有する変異型リボヌクレアーゼＨを製造したが、そ
の安定化の程度は十分満足し得るものではなかった(特
願平01-284454、特願平03-197703、特願平03-158332)。
また、安定性の改良された変異型リボヌクレアーゼＨの
中には酵素活性が低下したものもある(特願平03-19770
7)。また、大腸菌リボヌクレアーゼＨよりも極めて高い
安定性を有する好熱菌リボヌクレアーゼＨの大腸菌によ
る製造法も報告されているが(金谷等、第2回日本蛋白工
学会年会プログラム・要旨集(1990)、69頁；特願平02-11
1065)、大腸菌を用いて生産した好熱菌リボヌクレアー
ゼＨの酵素活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨよりも低い
ものであった。さらに、好熱菌リボヌクレアーゼＨの場
合、精製には尿素を用いて可溶化するという操作が必要
であり、大腸菌リボヌクレアーゼＨの場合に較べてその
製造方法が複雑であるという欠点もあった。したがっ
て、より酵素活性が高く、安定性にすぐれた酵素であっ
て、その製造および精製も好熱菌リボヌクレアーゼＨよ
りも容易である変異リボヌクレアーゼＨをつくることが
できれば、産業上の利用価値がより高いと考えられる。
術を用いて、天然型リボヌクレアーゼＨよりも高い安定
性を有する変異型リボヌクレアーゼＨを製造したが、そ
の安定化の程度は十分満足し得るものではなかった(特
願平01-284454、特願平03-197703、特願平03-158332)。
また、安定性の改良された変異型リボヌクレアーゼＨの
中には酵素活性が低下したものもある(特願平03-19770
7)。また、大腸菌リボヌクレアーゼＨよりも極めて高い
安定性を有する好熱菌リボヌクレアーゼＨの大腸菌によ
る製造法も報告されているが(金谷等、第2回日本蛋白工
学会年会プログラム・要旨集(1990)、69頁；特願平02-11
1065)、大腸菌を用いて生産した好熱菌リボヌクレアー
ゼＨの酵素活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨよりも低い
ものであった。さらに、好熱菌リボヌクレアーゼＨの場
合、精製には尿素を用いて可溶化するという操作が必要
であり、大腸菌リボヌクレアーゼＨの場合に較べてその
製造方法が複雑であるという欠点もあった。したがっ
て、より酵素活性が高く、安定性にすぐれた酵素であっ
て、その製造および精製も好熱菌リボヌクレアーゼＨよ
りも容易である変異リボヌクレアーゼＨをつくることが
できれば、産業上の利用価値がより高いと考えられる。
【００１７】
【発明の効果】上記の目的を達成するために、本発明の
方法をその具体的な態様としてリボヌクレアーゼＨ分子
に適用した。本発明に従って改変したリボヌクレアーゼ
Ｈ分子は、その主鎖のひずみの解消によって安定性が増
大している事が確認され、これにより、本発明の方法の
有効性が立証された。即ち、本法により安定性が高めら
れた変異型リボヌクレアーゼＨは、従来のリボヌクレア
ーゼＨでは変性してしまう温度よりも高い温度でさえも
変性することがない(実施例３参照)ので、このような条
件下での取扱いが可能である。また変異型酵素のＸ線結
晶構造解析の結果（実施例５)は、本発明の方法に従っ
て選択した変異部位(Ｌys９５)および導入残基(Ｇly)
が、従来技術（変異型バクテリオファージＴ４リゾチー
ム、上述）に見られるような問題を伴わない事を明らか
にしている。本発明の方法によって作成した変異型リボ
ヌクレアーゼＨは、このような熱安定性の向上だけでな
く耐変性剤性や耐久性等も向上していると期待され(Pfe
il,W.等,“Thermodynamic Datafor Biochemistry and B
iotechnology",349-376頁,Hinz,H.-J.編,Springer-Verl
ag,Berlin,1986；田村等,第2回日本蛋白工学会年会プロ
グラム・要旨集(1990),25頁；Tamura等,Biochemistry,30
(21),5275-5286(1991))、従来のリボヌクレアーゼＨよ
りも熱失活しにくく安定に保存することができるので、
取り扱いが容易になることは理解されるであろう。
方法をその具体的な態様としてリボヌクレアーゼＨ分子
に適用した。本発明に従って改変したリボヌクレアーゼ
Ｈ分子は、その主鎖のひずみの解消によって安定性が増
大している事が確認され、これにより、本発明の方法の
有効性が立証された。即ち、本法により安定性が高めら
れた変異型リボヌクレアーゼＨは、従来のリボヌクレア
ーゼＨでは変性してしまう温度よりも高い温度でさえも
変性することがない(実施例３参照)ので、このような条
件下での取扱いが可能である。また変異型酵素のＸ線結
晶構造解析の結果（実施例５)は、本発明の方法に従っ
て選択した変異部位(Ｌys９５)および導入残基(Ｇly)
が、従来技術（変異型バクテリオファージＴ４リゾチー
ム、上述）に見られるような問題を伴わない事を明らか
にしている。本発明の方法によって作成した変異型リボ
ヌクレアーゼＨは、このような熱安定性の向上だけでな
く耐変性剤性や耐久性等も向上していると期待され(Pfe
il,W.等,“Thermodynamic Datafor Biochemistry and B
iotechnology",349-376頁,Hinz,H.-J.編,Springer-Verl
ag,Berlin,1986；田村等,第2回日本蛋白工学会年会プロ
グラム・要旨集(1990),25頁；Tamura等,Biochemistry,30
(21),5275-5286(1991))、従来のリボヌクレアーゼＨよ
りも熱失活しにくく安定に保存することができるので、
取り扱いが容易になることは理解されるであろう。
【００１８】また、分子内の「左巻きらせん型」構造を安
定化することによってタンパク質分子を安定化すること
を特徴とする、リボヌクレアーゼＨを用いてその有効性
が実証された本発明の方法は、リボヌクレアーゼＨ以外
のタンパク質についても適用可能であることは明らかで
ある。例えば本発明の安定化法を適用することによって
安定化できると考えられるタンパク質として、マレート
デヒドロゲナーゼ(ブタ心臓)、トリプトファン合成酵素
(ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium))α-サブユ
ニットなどがある。マレートデヒドロゲナーゼではリジ
ン２３８((φ,ψ)＝(６５°,１１°))およびリジン２９
４(同(５９°,１２°))、またトリプトファン合成酵素
(ネズミチフス菌)α-サブユニットではリジン１５(同
(４１°,６８°))が、それぞれ「左巻きらせん型」の主鎖
構造を有しており、しかもタンパク質の他の部分とこれ
らの残基との相互作用は認められない。したがって、こ
れらの残基のそれぞれまたは一部をグリシン残基あるい
はアスパラギン残基に置換することによって、その活性
に不利な影響を与えることなくこれらのタンパク質を安
定化することが可能と考えられる。またこれ以外のタン
パク質分子でも、その立体構造が明らかにされれば、本
安定化法が適用できる例は多いと考えられる。
定化することによってタンパク質分子を安定化すること
を特徴とする、リボヌクレアーゼＨを用いてその有効性
が実証された本発明の方法は、リボヌクレアーゼＨ以外
のタンパク質についても適用可能であることは明らかで
ある。例えば本発明の安定化法を適用することによって
安定化できると考えられるタンパク質として、マレート
デヒドロゲナーゼ(ブタ心臓)、トリプトファン合成酵素
(ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium))α-サブユ
ニットなどがある。マレートデヒドロゲナーゼではリジ
ン２３８((φ,ψ)＝(６５°,１１°))およびリジン２９
４(同(５９°,１２°))、またトリプトファン合成酵素
(ネズミチフス菌)α-サブユニットではリジン１５(同
(４１°,６８°))が、それぞれ「左巻きらせん型」の主鎖
構造を有しており、しかもタンパク質の他の部分とこれ
らの残基との相互作用は認められない。したがって、こ
れらの残基のそれぞれまたは一部をグリシン残基あるい
はアスパラギン残基に置換することによって、その活性
に不利な影響を与えることなくこれらのタンパク質を安
定化することが可能と考えられる。またこれ以外のタン
パク質分子でも、その立体構造が明らかにされれば、本
安定化法が適用できる例は多いと考えられる。
【００１９】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Maniatis等,MolecularCloning(1982)：A
Laboratoy Manual,Cold Sping Harbor Laboratoy)およ
び試薬の仕様書に従った。
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Maniatis等,MolecularCloning(1982)：A
Laboratoy Manual,Cold Sping Harbor Laboratoy)およ
び試薬の仕様書に従った。
【００２０】
【実施例】実施例１ 変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨの設計 大腸菌リボヌクレアーゼＨの立体構造はＸ線解析により
１.４８Å分解能で決定されている(Katayanagi等,Natur
e,347,306-309(1990)；Katayanagi等,J.Mol.Biol.,223,
1029-1052(1992))。その解析結果によれば、ヘリックス
αIIIとαIVをつなぐループ部分にある９５位のリジン
残基の主鎖の二面角(φ,ψ)は(６４°,２９°)であり、
「左巻きらせん型」の二面角をとっている。また、このル
ープは立体構造上比較的独立した領域を形成しており、
溶媒中に突き出ている。Lys９５の側鎖は溶媒中に突き
出ており溶媒分子と水素結合を形成しているが、他のア
ミノ酸残基との相互作用はみられない(図１参照)。通常
Ｌys残基が「左巻きらせん型」の二面角をとることはまれ
である。一方、グリシン残基およびアスパラギン残基は
リジン残基よりも「左巻きらせん型」の二面角をとりやす
いことがすでに知られている(Nicholson等,J.Mol.Biol,
210,181-193(1989))。そこで、「左巻きらせん型」をとり
やすいアミノ酸残基に置換することによってタンパク質
分子の安定性を改良するために、本酵素の９５位のＬys
をＧlyまたはＡsnのいずれかに変換した変異型大腸菌Ｒ
ＮaseＨ(それぞれＫ９５ＧおよびＫ９５Ｎと命名する)
を作成することにした。またこのＬys９５を、側鎖がβ
−メチル基のみであり「左巻きらせん型」の二面角をとり
にくいＡlaに変換した変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ
(Ｋ９５Ａ)(金谷等,J.Biol.Chem,266,11621-11627(199
1))についても比較の意味で安定性を調べた。
１.４８Å分解能で決定されている(Katayanagi等,Natur
e,347,306-309(1990)；Katayanagi等,J.Mol.Biol.,223,
1029-1052(1992))。その解析結果によれば、ヘリックス
αIIIとαIVをつなぐループ部分にある９５位のリジン
残基の主鎖の二面角(φ,ψ)は(６４°,２９°)であり、
「左巻きらせん型」の二面角をとっている。また、このル
ープは立体構造上比較的独立した領域を形成しており、
溶媒中に突き出ている。Lys９５の側鎖は溶媒中に突き
出ており溶媒分子と水素結合を形成しているが、他のア
ミノ酸残基との相互作用はみられない(図１参照)。通常
Ｌys残基が「左巻きらせん型」の二面角をとることはまれ
である。一方、グリシン残基およびアスパラギン残基は
リジン残基よりも「左巻きらせん型」の二面角をとりやす
いことがすでに知られている(Nicholson等,J.Mol.Biol,
210,181-193(1989))。そこで、「左巻きらせん型」をとり
やすいアミノ酸残基に置換することによってタンパク質
分子の安定性を改良するために、本酵素の９５位のＬys
をＧlyまたはＡsnのいずれかに変換した変異型大腸菌Ｒ
ＮaseＨ(それぞれＫ９５ＧおよびＫ９５Ｎと命名する)
を作成することにした。またこのＬys９５を、側鎖がβ
−メチル基のみであり「左巻きらせん型」の二面角をとり
にくいＡlaに変換した変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ
(Ｋ９５Ａ)(金谷等,J.Biol.Chem,266,11621-11627(199
1))についても比較の意味で安定性を調べた。
【００２１】実施例２ 変異型大腸菌リボヌクレアーゼ
Ｈ(Ｋ９５Ｇ)の作成 変異型リボヌクレアーゼＨ,Ｋ９５Ｇを次のようにして
作成した。変異型リボヌクレアーゼＨ,Ｋ９５Ｇを発現
するプラスミドpＪＫ９５Ｇの作成の概略を図２に示
す。
Ｈ(Ｋ９５Ｇ)の作成 変異型リボヌクレアーゼＨ,Ｋ９５Ｇを次のようにして
作成した。変異型リボヌクレアーゼＨ,Ｋ９５Ｇを発現
するプラスミドpＪＫ９５Ｇの作成の概略を図２に示
す。
【００２２】まず、天然型リボヌクレアーゼＨの大腸菌
での発現プラスミドpＡＫ６００(特開平03-065188参照)
のrnh遺伝子を鋳型とし、プライマーを用いてＰＣＲ法
によりrnh遺伝子への点突然変異の導入を行った。
での発現プラスミドpＡＫ６００(特開平03-065188参照)
のrnh遺伝子を鋳型とし、プライマーを用いてＰＣＲ法
によりrnh遺伝子への点突然変異の導入を行った。
【００２３】プライマーとしては、図３に示す化学合成
したオリゴヌクレオチドを用いた。図２および図３に示
すように、まず、pＡＫ６００を鋳型ＤＮＡとして、Ｓp
hＩの制限酵素部位を含む５'-プライマー(1)と３'-プラ
イマー(4)により約３００bpのＤＮＡ断片を、また、変
異導入用５'-プライマー(3)とＳalＩ部位を含む３'-プ
ライマー(2)により約２５０bpのＤＮＡ断片を、それぞ
れＰＣＲ反応により増幅し、２種類の遺伝子断片を得
た。ＰＣＲ反応は市販のGene Amp Kit(Takara)の説明書
に従って行った。得られた約３００bpの遺伝子断片を制
限酵素ＳphＩおよびＰstＩで、また約２５０bpのＤＮＡ
断片を制限酵素ＰstＩおよびＳalＩで消化した後、消化
物を１.５％アガロースゲル電気泳動にかけ、それぞれ
約３００bpおよび約２５０bpのＤＮＡ断片を得た。この
うち、約２５０bp断片には変異導入部位が含まれてい
る。
したオリゴヌクレオチドを用いた。図２および図３に示
すように、まず、pＡＫ６００を鋳型ＤＮＡとして、Ｓp
hＩの制限酵素部位を含む５'-プライマー(1)と３'-プラ
イマー(4)により約３００bpのＤＮＡ断片を、また、変
異導入用５'-プライマー(3)とＳalＩ部位を含む３'-プ
ライマー(2)により約２５０bpのＤＮＡ断片を、それぞ
れＰＣＲ反応により増幅し、２種類の遺伝子断片を得
た。ＰＣＲ反応は市販のGene Amp Kit(Takara)の説明書
に従って行った。得られた約３００bpの遺伝子断片を制
限酵素ＳphＩおよびＰstＩで、また約２５０bpのＤＮＡ
断片を制限酵素ＰstＩおよびＳalＩで消化した後、消化
物を１.５％アガロースゲル電気泳動にかけ、それぞれ
約３００bpおよび約２５０bpのＤＮＡ断片を得た。この
うち、約２５０bp断片には変異導入部位が含まれてい
る。
【００２４】次に、このようにして得られた変異遺伝子
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニングす
ることによって発現ベクターを作製した。プラスミドp
ＪＬＡ５０４(ドイツMedac社より購入)をＳphＩおよび
ＳalＩで消化し、約４.９kbの断片を０.７％アガロース
電気泳動により精製した後、上記の約３００bpおよび約
２５０bp断片からなる変異rnh遺伝子ＳphＩ−ＳalＩ断
片とライゲーションすることにより環化した。ライゲー
ションは市販のライゲーションキット(Takara)を用い、
添付の説明書に正確に従って行った。このようにして得
られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、
形質転換体から変異型リボヌクレアーゼＨ発現用プラス
ミドベクターpＪＫ９５Ｇを得た。
断片を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニングす
ることによって発現ベクターを作製した。プラスミドp
ＪＬＡ５０４(ドイツMedac社より購入)をＳphＩおよび
ＳalＩで消化し、約４.９kbの断片を０.７％アガロース
電気泳動により精製した後、上記の約３００bpおよび約
２５０bp断片からなる変異rnh遺伝子ＳphＩ−ＳalＩ断
片とライゲーションすることにより環化した。ライゲー
ションは市販のライゲーションキット(Takara)を用い、
添付の説明書に正確に従って行った。このようにして得
られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形質転換し、
形質転換体から変異型リボヌクレアーゼＨ発現用プラス
ミドベクターpＪＫ９５Ｇを得た。
【００２５】上記のようにして得られた形質転換菌エシ
エリシア・コリ(E.coli)ＨＢ１０１／pＪＫ９５Ｇは工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている(微工
研菌寄第１２４９５号、受託日:平成３年９月１０日)。
エリシア・コリ(E.coli)ＨＢ１０１／pＪＫ９５Ｇは工
業技術院微生物工業技術研究所に寄託されている(微工
研菌寄第１２４９５号、受託日:平成３年９月１０日)。
【００２６】次に、変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５
Ｇ)の生産と精製を以下のようにして行った。大腸菌形
質転換体ＨＢ１０１／pＪＫ９５Ｇを１００μg／lのア
ンピシリンを含むＬＢ培地５００ml中、３０℃で振盪培
養した。培養液の濁度がクレット値で約１００まで生育
した時点で、培養温度を４２℃に上げ、更に３.５時間
振盪を続け、次いで遠心して集菌した。この時のクレット
値は約２５０であった。
Ｇ)の生産と精製を以下のようにして行った。大腸菌形
質転換体ＨＢ１０１／pＪＫ９５Ｇを１００μg／lのア
ンピシリンを含むＬＢ培地５００ml中、３０℃で振盪培
養した。培養液の濁度がクレット値で約１００まで生育
した時点で、培養温度を４２℃に上げ、更に３.５時間
振盪を続け、次いで遠心して集菌した。この時のクレット
値は約２５０であった。
【００２７】得られた菌体を１mＭ ＥＤＴＡを含む１０
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)１５mlに懸濁し
た後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,
０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗
抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５１に対して４℃で一夜透
析した。透析後の粗抽出液を同緩衝液で平衡化したＤＥ
-５２カラム(５ml)およびＰ-１１カラム(２ml)にこの順
序で通した。この条件下で、変異型リボヌクレアーゼＨ
(Ｋ９５Ｇ)はＤＥ-５２カラムを素通りし、Ｐ-１１カラ
ムに吸着した。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、ＮaＣl
濃度を０.５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ-１
１カラムから変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ｇ)を溶
出させた。変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ｇ)を含む
Ｐ-１１溶出画分をまとめ、精製標品とした。精製標品
は１５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相Ｈ
ＰＬＣでも単一ピークを示した。精製収量は５４.２mg
／ｌ培養液であった。精製標品の同定は、アクロモバク
タープロテアーゼＩで消化して得られるペプチドフラグ
メントを、逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメン
トピークの溶出位置を確認するとともに、９５位のアミ
ノ酸残基を含むペプチドを分取後アミノ酸配列分析する
ことによって行った。
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)１５mlに懸濁し
た後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,
０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗
抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５１に対して４℃で一夜透
析した。透析後の粗抽出液を同緩衝液で平衡化したＤＥ
-５２カラム(５ml)およびＰ-１１カラム(２ml)にこの順
序で通した。この条件下で、変異型リボヌクレアーゼＨ
(Ｋ９５Ｇ)はＤＥ-５２カラムを素通りし、Ｐ-１１カラ
ムに吸着した。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、ＮaＣl
濃度を０.５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ-１
１カラムから変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ｇ)を溶
出させた。変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ｇ)を含む
Ｐ-１１溶出画分をまとめ、精製標品とした。精製標品
は１５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相Ｈ
ＰＬＣでも単一ピークを示した。精製収量は５４.２mg
／ｌ培養液であった。精製標品の同定は、アクロモバク
タープロテアーゼＩで消化して得られるペプチドフラグ
メントを、逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメン
トピークの溶出位置を確認するとともに、９５位のアミ
ノ酸残基を含むペプチドを分取後アミノ酸配列分析する
ことによって行った。
【００２８】実施例３ 変異型大腸菌リボヌクレアーゼ
Ｈ(Ｋ９５Ｎ)の作成 変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ（Ｋ９５Ｎ)の作成を
以下のようにして行った。変異型大腸菌リボヌクレアー
ゼＨ(Ｋ９５Ｎ)を発現するプラスミドpＪＫ９５Ｎの作
成の概略を図４に示す。pＪＫ９５Ｎの作成は、実施例
２で述べたpＪＫ９５Ｇの作成と同様な方法で行った。
ただし、pＪＫ９５Ｎの作成では、pＪＫ９５Ｇの作成に
用いたオリゴヌクレオチドプライマー(3)のかわりにオ
リゴヌクレオチドプライマー(5)を用いた(図３参照)。
Ｈ(Ｋ９５Ｎ)の作成 変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ（Ｋ９５Ｎ)の作成を
以下のようにして行った。変異型大腸菌リボヌクレアー
ゼＨ(Ｋ９５Ｎ)を発現するプラスミドpＪＫ９５Ｎの作
成の概略を図４に示す。pＪＫ９５Ｎの作成は、実施例
２で述べたpＪＫ９５Ｇの作成と同様な方法で行った。
ただし、pＪＫ９５Ｎの作成では、pＪＫ９５Ｇの作成に
用いたオリゴヌクレオチドプライマー(3)のかわりにオ
リゴヌクレオチドプライマー(5)を用いた(図３参照)。
【００２９】得られたプラスミドpＪＫ９５Ｎで大腸菌
ＨＢ１０１株を形質転換して、変異型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨ(Ｋ９５Ｎ)発現用プラスミドを持つ大腸菌株Ｈ
Ｂ１０１／pＪＫ９５Ｎを得た。この形質転換菌は工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている(微工研
菌寄第１２７０６号、受託日：平成４年１月１０日)。
大腸菌株ＨＢ１０１／ｐＪＫ９５Ｎを用いて、実施例２
に記載した変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ｇ)の場合
と同じ方法により目的の変異型大腸菌リボヌクレアーゼ
Ｈ(Ｋ９５Ｇ)を生産し、精製した。精製標品は１５％Ｓ
ＤＳ-ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相ＨＰＬＣでも
単一ピークを示した。精製収量は５１.９mg／ｌ培養液
であった。精製標品の同定は、アクロモバクタープロテ
アーゼＩで消化して得られるペプチドフラグメントを、
逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメントピークの
溶出位置を確認すると共に、９５位のアミノ酸残基を含
むペプチドを分取後アミノ酸配列分析することによって
行った。
ＨＢ１０１株を形質転換して、変異型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨ(Ｋ９５Ｎ)発現用プラスミドを持つ大腸菌株Ｈ
Ｂ１０１／pＪＫ９５Ｎを得た。この形質転換菌は工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている(微工研
菌寄第１２７０６号、受託日：平成４年１月１０日)。
大腸菌株ＨＢ１０１／ｐＪＫ９５Ｎを用いて、実施例２
に記載した変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ｇ)の場合
と同じ方法により目的の変異型大腸菌リボヌクレアーゼ
Ｈ(Ｋ９５Ｇ)を生産し、精製した。精製標品は１５％Ｓ
ＤＳ-ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相ＨＰＬＣでも
単一ピークを示した。精製収量は５１.９mg／ｌ培養液
であった。精製標品の同定は、アクロモバクタープロテ
アーゼＩで消化して得られるペプチドフラグメントを、
逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメントピークの
溶出位置を確認すると共に、９５位のアミノ酸残基を含
むペプチドを分取後アミノ酸配列分析することによって
行った。
【００３０】実施例４ 変異型大腸菌リボヌクレアーゼ
Ｈの酵素活性と安定性 実施例２および３で作成した変異型大腸菌リボヌクレア
ーゼＨ(Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎ)の酵素活性と安定性
を、変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ａ)と共に
以下のように測定し、天然型酵素と比較した。尚、変異
型大腸菌リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ａ)は金谷らの方法
(J.Boil.Chem,266,11621-11627(1991))に従って調製し
たものを用いた。
Ｈの酵素活性と安定性 実施例２および３で作成した変異型大腸菌リボヌクレア
ーゼＨ(Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎ)の酵素活性と安定性
を、変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ａ)と共に
以下のように測定し、天然型酵素と比較した。尚、変異
型大腸菌リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ａ)は金谷らの方法
(J.Boil.Chem,266,11621-11627(1991))に従って調製し
たものを用いた。
【００３１】変異型酵素の酵素活性は、[3Ｈ]-Ｍ１３Ｄ
ＮＡ／ＲＮＡを基質として用い、３７℃で１分間に１μ
molの酸可溶性物質を遊離する酵素活性を１ユニット
(Ｕ)と定義した。タンパク質量は変異型リボヌクレアー
ゼＨが天然型リボヌクレアーゼＨと同じ吸光係数を持つ
という仮定のもとにε280＝１５７６Ｍ-1・cm-1を用い
て２８０nmにおける吸光度を測定することにより求め
た。得られた結果を表１に示す。
ＮＡ／ＲＮＡを基質として用い、３７℃で１分間に１μ
molの酸可溶性物質を遊離する酵素活性を１ユニット
(Ｕ)と定義した。タンパク質量は変異型リボヌクレアー
ゼＨが天然型リボヌクレアーゼＨと同じ吸光係数を持つ
という仮定のもとにε280＝１５７６Ｍ-1・cm-1を用い
て２８０nmにおける吸光度を測定することにより求め
た。得られた結果を表１に示す。
【表１】 天然型および変異型リボヌクレアーゼＨの酵素活性の比較 酵素名 比活性(Ｕ／mg) 天然型リボヌクレアーゼＨ ２０ 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ｇ) ２３ 〃 (Ｋ９５Ｎ) １９ 〃 (Ｋ９５Ａ) １９ いずれの変異型リボヌクレアーゼＨも天然型酵素とほぼ
同等の酵素活性を保持していた。
同等の酵素活性を保持していた。
【００３２】次に、天然型リボヌクレアーゼＨと変異型
リボヌクレアーゼＨの熱安定性について測定し、比較し
た。測定はpＨ５.５での変性の割合を２２０nmにおける
ＣＤ値で熱変性曲線を測定することにより行った。熱変
性実験は光路長２mmセルを用い、１Ｍ塩酸グアニジンお
よび１mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)を含む２０mＭ酢
酸ナトリウム(pＨ５.５)中で行った。熱安定性は全体の
５０％が変性するときの温度(Ｔｍ)で比較した。Ｔｍの
測定誤差は６７％の有意水準で±０.３℃であった。得
られた結果を次の表２に示す。
リボヌクレアーゼＨの熱安定性について測定し、比較し
た。測定はpＨ５.５での変性の割合を２２０nmにおける
ＣＤ値で熱変性曲線を測定することにより行った。熱変
性実験は光路長２mmセルを用い、１Ｍ塩酸グアニジンお
よび１mＭジチオトレイトール(ＤＴＴ)を含む２０mＭ酢
酸ナトリウム(pＨ５.５)中で行った。熱安定性は全体の
５０％が変性するときの温度(Ｔｍ)で比較した。Ｔｍの
測定誤差は６７％の有意水準で±０.３℃であった。得
られた結果を次の表２に示す。
【表２】 天然型および変異型リボヌクレアーゼＨの熱安定性の比較 酵素名 ５０％変性するときの温度(Ｔｍ(℃)) 天然型リボヌクレアーゼＨ ５１.９ 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ｇ) ５８.７ 〃 (Ｋ９５Ｎ) ５５.１ 〃 (Ｋ９５Ａ) ５２.３
【００３３】天然型酵素に対し、変異型リボヌクレアー
ゼＫ９５ＧおよびＫ９５Ｎではそれぞれ６.８℃および
３.２℃の熱安定性の上昇がみられた。これらの変異体
はいずれも本発明の方法に従って、９５位の主鎖のひず
みを解消する目的で作成した変異体である。左巻きらせ
ん型の二面角をもつ９５位のリジン残基を、本発明の方
法に従って、リジン残基よりも左巻きらせん型の二面角
をとりやすいグリシンまたはアスパラギン残基に置換す
ることによって、予測されたように(実施例１参照)、タ
ンパク質の熱安定性の向上がもたらされた。また本発明
の基礎をなす理論から予測され得るように、アスパラギ
ン残基よりも左巻きらせん型をとりやすいグリシン残基
に置換した変異体Ｋ９５Ｇの方が、Ｋ９５Ｎよりも安定
化の効果が大きかった。
ゼＫ９５ＧおよびＫ９５Ｎではそれぞれ６.８℃および
３.２℃の熱安定性の上昇がみられた。これらの変異体
はいずれも本発明の方法に従って、９５位の主鎖のひず
みを解消する目的で作成した変異体である。左巻きらせ
ん型の二面角をもつ９５位のリジン残基を、本発明の方
法に従って、リジン残基よりも左巻きらせん型の二面角
をとりやすいグリシンまたはアスパラギン残基に置換す
ることによって、予測されたように(実施例１参照)、タ
ンパク質の熱安定性の向上がもたらされた。また本発明
の基礎をなす理論から予測され得るように、アスパラギ
ン残基よりも左巻きらせん型をとりやすいグリシン残基
に置換した変異体Ｋ９５Ｇの方が、Ｋ９５Ｎよりも安定
化の効果が大きかった。
【００３４】これに対し、左巻きらせん型の二面角をと
りにくいアラニン残基に置換した変異体Ｋ９５Ａでは熱
安定性が天然型よりも０.４℃上昇したに過ぎず、Ｔｍ
値の測定誤差を考慮すると有意な安定性の増加は認めら
れなかった。
りにくいアラニン残基に置換した変異体Ｋ９５Ａでは熱
安定性が天然型よりも０.４℃上昇したに過ぎず、Ｔｍ
値の測定誤差を考慮すると有意な安定性の増加は認めら
れなかった。
【００３５】実施例５ 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ
９５ＧおよびＫ９５Ｎ)のＸ線結晶構造解析 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎ)の
立体構造を天然型酵素の立体構造と比較することによっ
て変異による立体構造の変化を明らかにするために、変
異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎ)Ｘ線
結晶解析を以下のように行った。
９５ＧおよびＫ９５Ｎ)のＸ線結晶構造解析 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎ)の
立体構造を天然型酵素の立体構造と比較することによっ
て変異による立体構造の変化を明らかにするために、変
異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎ)Ｘ線
結晶解析を以下のように行った。
【００３６】Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎの結晶を天然型酵
素結晶化条件(金谷等,J.Biol.Chem.264,11546-11549(19
90))に従って行い、天然型酵素と同型の結晶を得た(表
３)。
素結晶化条件(金谷等,J.Biol.Chem.264,11546-11549(19
90))に従って行い、天然型酵素と同型の結晶を得た(表
３)。
【表３】 天然型リボヌクレアーゼＨと変異型リボヌクレアーゼＨの結晶の比較 天然型ＲＮaseＨの結晶 変異型ＲＮaseＨの結晶 Ｋ９５Ｇ Ｋ９５Ｎ 空間群 Ｐ２1２1２1 Ｐ２1２1２1 Ｐ２1２1２1 a(Å) ４４.０６ ４４.０４ ４４.１４ b(Å) ８６.８５ ８６.６３ ８７.０１ c(Å） ３５.４７ ３５.４８ ３５.４５
【００３７】Ｘ線強度の測定はＥnraf-Ｎonius社のＣＡ
Ｄ４を用いて行い、１.８Åまでのデータを得た。天然
型酵素の結晶構造(片柳等,Nature 347,306-309(1990))
の結晶構造を初期構造とし、束縛条件下での最小２乗法
による精密化プログラムＰＲＯＬＳＱ、及びモデル−電
子密度適合プログラムＦＲＯＤＯを用いて精密化を行っ
た。最終的に、５.０〜１.８Ａ(Ｆ＞１.０σ(Ｆ))のデ
ータを用いたＲ値は０.１８５、結合距離の理想値から
のずれの平均２乗の平方根(r.m.s.)はどちらの変異型リ
ボヌクレアーゼＨに対しても０.０１５Åとなった。
Ｄ４を用いて行い、１.８Åまでのデータを得た。天然
型酵素の結晶構造(片柳等,Nature 347,306-309(1990))
の結晶構造を初期構造とし、束縛条件下での最小２乗法
による精密化プログラムＰＲＯＬＳＱ、及びモデル−電
子密度適合プログラムＦＲＯＤＯを用いて精密化を行っ
た。最終的に、５.０〜１.８Ａ(Ｆ＞１.０σ(Ｆ))のデ
ータを用いたＲ値は０.１８５、結合距離の理想値から
のずれの平均２乗の平方根(r.m.s.)はどちらの変異型リ
ボヌクレアーゼＨに対しても０.０１５Åとなった。
【００３８】１.８Å分解能で決定した変異型リボヌク
レアーゼＨ(Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎ)の結晶構造は、い
ずれも変異部位近傍のわずかな構造変化を除いてほとん
ど天然型酵素と同一であった。変異型酵素の天然型酵素
に対する(９５位のアミノ酸残基側鎖を除く)全原子の相
対的変位のｒ.m.s.は、Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎに対し
てそれぞれ０.２８４Åおよび０.２８６Åであった。変
異型酵素Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎの変異部位近傍の結晶
構造を第５図に示す。Ｋ９５ＧのＧly９５並びにＫ９５
ＮのＡsn９５の主鎖の二面角(φ,ψ)はそれぞれ(８５
°,９°)および(７１°,４０°)であり、「左巻きらせん
型」を維持していた。観測されたこのグリシン残基の二
面角は、一般にグリシン残基が取り易い二面角でありエ
ネルギー的にも安定であると報告されている値(φ,ψ)
＝(９０°,０°)(Nicholson等,J.Mol.Biol.,210,181-19
3(1989))に近い値となっている。またＫ９５ＮのＡsn９
５の側鎖アミノ基のＮδ原子は、主鎖のカルボキシル基
の酸素原子と水素結合を形成しており(Ｎδ-Ｏ間の距離
は２.７Åであった)、Ｋ９５Ｎの安定化に寄与している
と考えられる。
レアーゼＨ(Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎ)の結晶構造は、い
ずれも変異部位近傍のわずかな構造変化を除いてほとん
ど天然型酵素と同一であった。変異型酵素の天然型酵素
に対する(９５位のアミノ酸残基側鎖を除く)全原子の相
対的変位のｒ.m.s.は、Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎに対し
てそれぞれ０.２８４Åおよび０.２８６Åであった。変
異型酵素Ｋ９５ＧおよびＫ９５Ｎの変異部位近傍の結晶
構造を第５図に示す。Ｋ９５ＧのＧly９５並びにＫ９５
ＮのＡsn９５の主鎖の二面角(φ,ψ)はそれぞれ(８５
°,９°)および(７１°,４０°)であり、「左巻きらせん
型」を維持していた。観測されたこのグリシン残基の二
面角は、一般にグリシン残基が取り易い二面角でありエ
ネルギー的にも安定であると報告されている値(φ,ψ)
＝(９０°,０°)(Nicholson等,J.Mol.Biol.,210,181-19
3(1989))に近い値となっている。またＫ９５ＮのＡsn９
５の側鎖アミノ基のＮδ原子は、主鎖のカルボキシル基
の酸素原子と水素結合を形成しており(Ｎδ-Ｏ間の距離
は２.７Åであった)、Ｋ９５Ｎの安定化に寄与している
と考えられる。
【００３９】これらのＸ線結晶構造解析結果は、グリシ
ン残基またはアスパラギン残基への置換によって９５位
の「左巻きらせん型」構造が安定化され、しかもこの置換
がタンパク質の立体構造を大きく変化させなかったこと
を示しており、実施例４で立証された変異型酵素Ｋ９５
ＧおよびＫ９５Ｎの安定化が、この「左巻きらせん型」構
造の安定化によることが確認できた。
ン残基またはアスパラギン残基への置換によって９５位
の「左巻きらせん型」構造が安定化され、しかもこの置換
がタンパク質の立体構造を大きく変化させなかったこと
を示しており、実施例４で立証された変異型酵素Ｋ９５
ＧおよびＫ９５Ｎの安定化が、この「左巻きらせん型」構
造の安定化によることが確認できた。
【図１】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨの立体構造
を示す図である。Ａは主鎖のみを示した図であり、Ｌys
９５の位置を矢印で示した。ＢはＬys９５近傍のループ
部分のステレオ図である。破線は水素結合を、黒丸は水分
子を表わす。
を示す図である。Ａは主鎖のみを示した図であり、Ｌys
９５の位置を矢印で示した。ＢはＬys９５近傍のループ
部分のステレオ図である。破線は水素結合を、黒丸は水分
子を表わす。
【図２】 プラスミドpＪＫ９５Ｇの構築を示す模式図
である。
である。
【図３】 部位特異的突然変異を導入するための合成オ
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中の下線は制
限酵素部位を、・印は変異アミノ酸に対応する塩基をそ
れぞれ示すものである。
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中の下線は制
限酵素部位を、・印は変異アミノ酸に対応する塩基をそ
れぞれ示すものである。
【図４】 プラスミドpＪＫ９５Ｎの構築を示す模式図
である。
である。
【図５】 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｋ９５Ｇおよび
Ｋ９５Ｎ)の立体構造を示す図である。Ａは変異型酵素
Ｋ９５Ｇの９５位近傍のループ部分のステレオ図であ
り、Ｂは変異型酵素Ｋ９５Ｎのの９５位近傍のループ部
分のステレオ図である。破線は水素結合を表す。
Ｋ９５Ｎ)の立体構造を示す図である。Ａは変異型酵素
Ｋ９５Ｇの９５位近傍のループ部分のステレオ図であ
り、Ｂは変異型酵素Ｋ９５Ｎのの９５位近傍のループ部
分のステレオ図である。破線は水素結合を表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 タンパク質分子中のアミノ酸残基のう
ち、主鎖の立体配置が左巻きらせん型であって、そのア
ミノ酸残基側鎖が関わる分子内および分子間相互作用が
該タンパク質の機能の発現および安定化に重要でないこ
とが知られているグリシン残基およびアスパラギン残基
以外のアミノ酸残基を、主鎖の立体配置が左巻きらせん
型をとる頻度の高いグリシン残基またはアスパラギン残
基に置換することを特徴とする安定化したタンパク質分
子の製造方法。 - 【請求項２】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨのアミ
ノ酸配列中第９５番目のリジン残基をアスパラギン残基
に置換することを特徴とする請求項１に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4115877A JP2902206B2 (ja) | 1992-05-08 | 1992-05-08 | タンパク質分子の安定化法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4115877A JP2902206B2 (ja) | 1992-05-08 | 1992-05-08 | タンパク質分子の安定化法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05308963A JPH05308963A (ja) | 1993-11-22 |
| JP2902206B2 true JP2902206B2 (ja) | 1999-06-07 |
Family
ID=14673381
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4115877A Expired - Lifetime JP2902206B2 (ja) | 1992-05-08 | 1992-05-08 | タンパク質分子の安定化法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2902206B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6951722B2 (en) | 1999-03-19 | 2005-10-04 | Takara Bio Inc. | Method for amplifying nucleic acid sequence |
-
1992
- 1992-05-08 JP JP4115877A patent/JP2902206B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１０ ｐ．１８１−１９３（１９８９） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05308963A (ja) | 1993-11-22 |
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