JPH0564585A - 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ - Google Patents
安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈInfo
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- JPH0564585A JPH0564585A JP19770791A JP19770791A JPH0564585A JP H0564585 A JPH0564585 A JP H0564585A JP 19770791 A JP19770791 A JP 19770791A JP 19770791 A JP19770791 A JP 19770791A JP H0564585 A JPH0564585 A JP H0564585A
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- Japan
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- mutant
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- phe
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 酵素活性を保持し、かつ安定性が改良された
変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨを提供する。 【構成】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨの第７４番
目から第８０番目のアミノ酸配列をＬeu−Ｌys−Ｌys−
Ａla−Ｐhe−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyで、第１１１番目から第
１２０番目のアミノ酸配列をＭet−Ａla−Ｐro−Ｈis−
Ａrg−Ｖal−Ａrg−Ｐhe−Ｈis−Ｐheで置換すると、酵
素活性を保持し、かつ安定性が改良された変異型大腸菌
リボヌクレアーゼＨが得られる。
変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨを提供する。 【構成】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨの第７４番
目から第８０番目のアミノ酸配列をＬeu−Ｌys−Ｌys−
Ａla−Ｐhe−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyで、第１１１番目から第
１２０番目のアミノ酸配列をＭet−Ａla−Ｐro−Ｈis−
Ａrg−Ｖal−Ａrg−Ｐhe−Ｈis−Ｐheで置換すると、酵
素活性を保持し、かつ安定性が改良された変異型大腸菌
リボヌクレアーゼＨが得られる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、安定性が改良された変
異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ、該変異型大腸菌リボヌ
クレアーゼＨをコードしている遺伝子、該遺伝子を含有
し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発現ベクタ
ーを含有している形質転換体、および該形質転換体を用
いて変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨを製造する方法に
関する。
異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ、該変異型大腸菌リボヌ
クレアーゼＨをコードしている遺伝子、該遺伝子を含有
し、大腸菌内で発現可能な発現ベクター、該発現ベクタ
ーを含有している形質転換体、および該形質転換体を用
いて変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨを製造する方法に
関する。
【０００２】
【従来の技術、および発明が解決しようとする課題】大
腸菌の天然型リボヌクレアーゼＨ(本明細書に於いて
は、単にリボヌクレアーゼＨ、またはＲＮaseＨと称す
る場合は、天然型の大腸菌リボヌクレアーゼＨを意味す
るものとする)は１５５アミノ酸からなる分子量約１７
Ｋdの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリ
ッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切断すると
いう基質特異性を有する。この酵素は、その基質特異性
に基づき、下記の如き様々な用途を有し、極めて利用価
値の高い酵素として注目されている。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。
腸菌の天然型リボヌクレアーゼＨ(本明細書に於いて
は、単にリボヌクレアーゼＨ、またはＲＮaseＨと称す
る場合は、天然型の大腸菌リボヌクレアーゼＨを意味す
るものとする)は１５５アミノ酸からなる分子量約１７
Ｋdの加水分解酵素であって、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリ
ッドのＲＮＡ鎖のみを特異的にエンド作用で切断すると
いう基質特異性を有する。この酵素は、その基質特異性
に基づき、下記の如き様々な用途を有し、極めて利用価
値の高い酵素として注目されている。 １) cＤＮＡのクローニングの際の鋳型mＲＮＡの除去。 ２) mＲＮＡのポリＡ領域の除去。 ３) ＲＮＡの断片化。
【０００３】リボヌクレアーゼＨの重要性は遺伝子工学
の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この酵
素は、大腸菌内での産生量が極めて低いことから、組換
えＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、既
にＢＲＬ、ファルマシアおよび宝酒造等から、組換えＤ
ＮＡ技術により生産されたリボヌクレアーゼＨが供給さ
れている。これらの市販の組換えリボヌクレアーゼＨ
は、大腸菌を宿主として生産されるものである(金谷
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、２６４、１１５４６−１１５４９(１９８９))。
の発展に伴ってますます増大すると思われるが、この酵
素は、大腸菌内での産生量が極めて低いことから、組換
えＤＮＡ技術による該酵素の生産が試みられており、既
にＢＲＬ、ファルマシアおよび宝酒造等から、組換えＤ
ＮＡ技術により生産されたリボヌクレアーゼＨが供給さ
れている。これらの市販の組換えリボヌクレアーゼＨ
は、大腸菌を宿主として生産されるものである(金谷
ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、２６４、１１５４６−１１５４９(１９８９))。
【０００４】このように利用価値の高いリボヌクレアー
ゼＨの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐性を高める
ことができれば、従来の組換えリボヌクレアーゼＨでは
利用できなかった条件下での利用が可能となる。
ゼＨの安定性、例えば変性剤や熱に対する耐性を高める
ことができれば、従来の組換えリボヌクレアーゼＨでは
利用できなかった条件下での利用が可能となる。
【０００５】これまでに、本発明者らは組換えＤＮＡ技
術を用いて、変性剤に対して天然型リボヌクレアーゼＨ
よりも高い耐性を有する変異型リボヌクレアーゼＨを製
造したが、その安定化の程度は十分満足し得るものでは
ない（特願平０１−２８４４５４）。また、大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨよりも極めて高い安定性を有する好熱菌
リボヌクレアーゼＨの大腸菌による製造法も報告されて
いるが（金谷ら、第２回日本蛋白工学会年会プログラム
・要旨集（１９９０）、６９頁；特願平０２−１１１０
６５）、大腸菌を用いて産生された好熱菌リボヌクレア
ーゼＨの酵素活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨよりも低
いものであった。尚、後者の場合、精製には尿素を用い
て可溶化するという操作が必要であり、大腸菌リボヌク
レアーゼＨの場合に較べてその製造方法が複雑であると
いう欠点もあった。従って、酵素活性を保持し、より安
定性にすぐれた酵素であって、その製造および精製も好
熱菌リボヌクレアーゼＨよりも容易である変異リボヌク
レアーゼＨをつくることができれば、産業上より利用価
値が高いと考えられる。
術を用いて、変性剤に対して天然型リボヌクレアーゼＨ
よりも高い耐性を有する変異型リボヌクレアーゼＨを製
造したが、その安定化の程度は十分満足し得るものでは
ない（特願平０１−２８４４５４）。また、大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨよりも極めて高い安定性を有する好熱菌
リボヌクレアーゼＨの大腸菌による製造法も報告されて
いるが（金谷ら、第２回日本蛋白工学会年会プログラム
・要旨集（１９９０）、６９頁；特願平０２−１１１０
６５）、大腸菌を用いて産生された好熱菌リボヌクレア
ーゼＨの酵素活性は大腸菌リボヌクレアーゼＨよりも低
いものであった。尚、後者の場合、精製には尿素を用い
て可溶化するという操作が必要であり、大腸菌リボヌク
レアーゼＨの場合に較べてその製造方法が複雑であると
いう欠点もあった。従って、酵素活性を保持し、より安
定性にすぐれた酵素であって、その製造および精製も好
熱菌リボヌクレアーゼＨよりも容易である変異リボヌク
レアーゼＨをつくることができれば、産業上より利用価
値が高いと考えられる。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の観点
から酵素活性を保持しながら、その安定性を高めること
を目的として、好熱菌リボヌクレアーゼＨのアミノ酸配
列を参考にして種々の改変を試みた結果、該酵素の遺伝
子に部位特異的変異を導入することにより該酵素の第７
４番目から第８０番目までのアミノ酸配列および第１１
１番目から第１２０番目までのアミノ酸配列をそれぞれ
Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−Ｐhe−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyおよ
びＭet−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal−Ａrg−Ｐhe−
Ｈis−Ｐheである好熱菌リボヌクレアーゼＨ型のアミノ
酸配列に置換した変異体が、天然型のリボヌクレアーゼ
Ｈよりも熱に対する安定性が優れていることを見い出
し、かつ、酵素活性を保持していることを確認し、本発
明を完成するに至った。
から酵素活性を保持しながら、その安定性を高めること
を目的として、好熱菌リボヌクレアーゼＨのアミノ酸配
列を参考にして種々の改変を試みた結果、該酵素の遺伝
子に部位特異的変異を導入することにより該酵素の第７
４番目から第８０番目までのアミノ酸配列および第１１
１番目から第１２０番目までのアミノ酸配列をそれぞれ
Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−Ｐhe−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyおよ
びＭet−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal−Ａrg−Ｐhe−
Ｈis−Ｐheである好熱菌リボヌクレアーゼＨ型のアミノ
酸配列に置換した変異体が、天然型のリボヌクレアーゼ
Ｈよりも熱に対する安定性が優れていることを見い出
し、かつ、酵素活性を保持していることを確認し、本発
明を完成するに至った。
【０００７】即ち、本発明は、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨの第７４番目から第８０番目のアミノ酸配列を
Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−Ｐhe−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyで、
また、第１１１番目から第１２０番目までのアミノ酸配
列をＭet−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal−Ａrg−Ｐhe
−Ｈis−Ｐheで置換したアミノ酸配列からなる変異型大
腸菌リボヌクレアーゼＨを提供するものである。
アーゼＨの第７４番目から第８０番目のアミノ酸配列を
Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−Ｐhe−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyで、
また、第１１１番目から第１２０番目までのアミノ酸配
列をＭet−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal−Ａrg−Ｐhe
−Ｈis−Ｐheで置換したアミノ酸配列からなる変異型大
腸菌リボヌクレアーゼＨを提供するものである。
【０００８】また、本発明は、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨの第７４番目から第８０番目のアミノ酸をコー
ドしているるコドンが、Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−Ｐhe
−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyをコードするコドンに、また、第１
１１番目から第１２０番目までのアミノ酸をコードして
いるコドンが、Ｍet−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal−
Ａrg−Ｐhe−Ｈis−Ｐheをコードするコドンに変換され
ている変異型リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子を提供する
ものである。また、本発明は上記変異型リボヌクレアー
ゼＨを大腸菌で発現させるための発現ベクターを提供す
るものである。
アーゼＨの第７４番目から第８０番目のアミノ酸をコー
ドしているるコドンが、Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−Ｐhe
−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyをコードするコドンに、また、第１
１１番目から第１２０番目までのアミノ酸をコードして
いるコドンが、Ｍet−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal−
Ａrg−Ｐhe−Ｈis−Ｐheをコードするコドンに変換され
ている変異型リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子を提供する
ものである。また、本発明は上記変異型リボヌクレアー
ゼＨを大腸菌で発現させるための発現ベクターを提供す
るものである。
【０００９】また本発明は、上記の発現ベクターで形質
転換された変異型リボヌクレアーゼＨ産生性の形質転換
体を提供するものである。さらに本発明は、該形質転換
体を培養することにより、高い安定性を有する変異型リ
ボヌクレアーゼＨを製造する方法を提供するものであ
る。大腸菌を用いての遺伝子操作法は成書(Ｍaniatis
ら、Ｍolecular Ｃloning(１９８２):Ａ Ｌaboratoy Ｍ
anual, Ｃold Ｓpring ＨarborＬaboratoy)に詳述され
ており、上記変異型リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子、発
現ベクター、形質転換体は、この成書に記載の一般的手
法に従って、例えば後記実施例に示した様に常法通り作
製することができる。尚、本発明の発現ベクターは、大
腸菌内で機能するものであれば特に制限はないが、バク
テリオファージλのＰLおよびＰRプロモーターの支配下
に上記変異型リボヌクレアーゼＨ遺伝子を含有している
ものが好ましい。
転換された変異型リボヌクレアーゼＨ産生性の形質転換
体を提供するものである。さらに本発明は、該形質転換
体を培養することにより、高い安定性を有する変異型リ
ボヌクレアーゼＨを製造する方法を提供するものであ
る。大腸菌を用いての遺伝子操作法は成書(Ｍaniatis
ら、Ｍolecular Ｃloning(１９８２):Ａ Ｌaboratoy Ｍ
anual, Ｃold Ｓpring ＨarborＬaboratoy)に詳述され
ており、上記変異型リボヌクレアーゼＨ構造遺伝子、発
現ベクター、形質転換体は、この成書に記載の一般的手
法に従って、例えば後記実施例に示した様に常法通り作
製することができる。尚、本発明の発現ベクターは、大
腸菌内で機能するものであれば特に制限はないが、バク
テリオファージλのＰLおよびＰRプロモーターの支配下
に上記変異型リボヌクレアーゼＨ遺伝子を含有している
ものが好ましい。
【００１０】
【発明の効果】本発明により安定性が高められた変異型
大腸菌リボヌクレアーゼＨは、従来のリボヌクレアーゼ
Ｈでは失活してしまう高い温度下でさえも変性すること
がない（実施例３参照）ので、このような条件下での取
扱いが可能である。さらに、本発明の変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨは、耐久性等も向上していると期待さ
れ、従来のリボヌクレアーゼＨよりも失活しにくく、安
定に保存することができるので、取り扱いが容易になる
ことは理解されるであろう。
大腸菌リボヌクレアーゼＨは、従来のリボヌクレアーゼ
Ｈでは失活してしまう高い温度下でさえも変性すること
がない（実施例３参照）ので、このような条件下での取
扱いが可能である。さらに、本発明の変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨは、耐久性等も向上していると期待さ
れ、従来のリボヌクレアーゼＨよりも失活しにくく、安
定に保存することができるので、取り扱いが容易になる
ことは理解されるであろう。
【００１１】以下に実施例を挙げて本発明をさらに詳細
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９
８２): Ａ Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓping Ｈarbor
Ｌaboratoy)および試薬の仕様書に従った。
に説明する。以下に述べる遺伝子操作の一般的手法は、
マニュアル書(Ｍaniatisら、Ｍolecular Ｃloning(１９
８２): Ａ Ｌaboratoy Ｍanual, Ｃold Ｓping Ｈarbor
Ｌaboratoy)および試薬の仕様書に従った。
【００１２】実施例１ プラスミドpＪＦＮＣの作製 プラスミドpＪＦＮＣの作製の概略を図１、図２および
図３に示す。まず、天然型リボヌクレアーゼＨの大腸菌
での発現プラスミドpＡＫ６００（特開平０３−０６５
１８８参照）のrnh遺伝子を鋳型として合成オリゴヌク
レオチドプライマーを用いてＰＣＲ法によりrnh遺伝子
への点突然変異の導入を行った。
図３に示す。まず、天然型リボヌクレアーゼＨの大腸菌
での発現プラスミドpＡＫ６００（特開平０３−０６５
１８８参照）のrnh遺伝子を鋳型として合成オリゴヌク
レオチドプライマーを用いてＰＣＲ法によりrnh遺伝子
への点突然変異の導入を行った。
【００１３】合成オリゴヌクレオチドとしては、化学合
成したオリゴヌクレオチドを用いた。用いたオリゴヌク
レオチドを図４に示す。まず、第７４位から８０位のア
ミノ酸配列を変換した変異体、ＦＮを発現するプラスミ
ドpＪＦＮを構築した。図１に示すように、まず、pＡＫ
６００を鋳型ＤＮＡとし、ＳphＩの制限酵素部位を含む
５'−プライマー(１)と変異導入用３'−プライマー(４)
により約２６０bpのＤＮＡ断片を、また、変異導入用
５'−プライマー(３)とＳalＩ部位を含む３'−プライマ
ー(２)により約３４０bpのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ
反応により増幅し、第７４−８０位のＶal−Ａrg−Ｇln
−Ｇly−Ｉle−Ｔhr−ＧlnをＬeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−
Ｐhe−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyに変換するための変異rnh遺伝
子断片２種を得た。ＰＣＲ反応は市販のＧene Ａmp Ｋi
t(Ｔakara)の説明書に従って行った。上記rnh遺伝子断
片をアガロースゲル電気泳動により精製した後、両者を
混合し、５'−プライマー(１)と３'−プライマー(２)を
添加して再度ＰＣＲ反応を行うことにより、ＳphＩ、Ｓ
alＩ制限酵素部位を両端にもつ変異rnh遺伝子断片を得
た。得られた約５００bpの変異rnh断片の両端にあるＳp
hＩおよびＳalＩ部位を制限酵素ＳphＩおよびＳalＩで
切断した後、消化物を１.５％アガロースゲル電気泳動
にかけ、約５００bpの変異rnhＳphＩ−ＳalＩ遺伝子断
片を切り出し抽出して精製した。
成したオリゴヌクレオチドを用いた。用いたオリゴヌク
レオチドを図４に示す。まず、第７４位から８０位のア
ミノ酸配列を変換した変異体、ＦＮを発現するプラスミ
ドpＪＦＮを構築した。図１に示すように、まず、pＡＫ
６００を鋳型ＤＮＡとし、ＳphＩの制限酵素部位を含む
５'−プライマー(１)と変異導入用３'−プライマー(４)
により約２６０bpのＤＮＡ断片を、また、変異導入用
５'−プライマー(３)とＳalＩ部位を含む３'−プライマ
ー(２)により約３４０bpのＤＮＡ断片をそれぞれＰＣＲ
反応により増幅し、第７４−８０位のＶal−Ａrg−Ｇln
−Ｇly−Ｉle−Ｔhr−ＧlnをＬeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−
Ｐhe−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyに変換するための変異rnh遺伝
子断片２種を得た。ＰＣＲ反応は市販のＧene Ａmp Ｋi
t(Ｔakara)の説明書に従って行った。上記rnh遺伝子断
片をアガロースゲル電気泳動により精製した後、両者を
混合し、５'−プライマー(１)と３'−プライマー(２)を
添加して再度ＰＣＲ反応を行うことにより、ＳphＩ、Ｓ
alＩ制限酵素部位を両端にもつ変異rnh遺伝子断片を得
た。得られた約５００bpの変異rnh断片の両端にあるＳp
hＩおよびＳalＩ部位を制限酵素ＳphＩおよびＳalＩで
切断した後、消化物を１.５％アガロースゲル電気泳動
にかけ、約５００bpの変異rnhＳphＩ−ＳalＩ遺伝子断
片を切り出し抽出して精製した。
【００１４】このようにして得られた変異遺伝子断片
を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニングし、発
現ベクターを作製した。プラスミドpＪＬＡ５０４(ドイ
ツ：Ｍedac社より購入)をＳphＩおよびＳalＩで消化
し、約４.９kbの断片を０.７％アガロース電気泳動によ
り精製した後、上記約５００bpの変異rnh遺伝子ＳphＩ
−ＳalＩ断片とライゲーションすることにより環化し
た。ライゲーションは市販のライゲーションキット(Ｔa
kara)を用い、添付の説明書に正確に従って行った。こ
のようにして得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株
を形質転換し、形質転換体より変異型リボヌクレアーゼ
Ｈ発現用プラスミドベクターpＪＦＮを得た。
を、大腸菌での発現ベクターにサブクローニングし、発
現ベクターを作製した。プラスミドpＪＬＡ５０４(ドイ
ツ：Ｍedac社より購入)をＳphＩおよびＳalＩで消化
し、約４.９kbの断片を０.７％アガロース電気泳動によ
り精製した後、上記約５００bpの変異rnh遺伝子ＳphＩ
−ＳalＩ断片とライゲーションすることにより環化し
た。ライゲーションは市販のライゲーションキット(Ｔa
kara)を用い、添付の説明書に正確に従って行った。こ
のようにして得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株
を形質転換し、形質転換体より変異型リボヌクレアーゼ
Ｈ発現用プラスミドベクターpＪＦＮを得た。
【００１５】次に、第１１１位から第１２０位のアミノ
酸配列Ｌeu−Ｇly−Ｇln−Ｈis−Ｇln−Ｉle−Ｌys−Ｔ
rp−Ｇlu−ＴrpをＭet−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal
−Ａrg−Ｐhe−Ｈis−Ｐheに置換した変異体（ＦＣ）を
発現するプラスミド、pＪＦＣを構築した。pＪＦＣの構
築は図２に示すように、pＪＦＮの構築と同様にして行
った。ただし、pＪＦＣの構築においてはプライマー
（５）、（６）をpＪＦＮの構築の場合のプライマー
（３）、（４）の代わりにそれぞれ用いた。
酸配列Ｌeu−Ｇly−Ｇln−Ｈis−Ｇln−Ｉle−Ｌys−Ｔ
rp−Ｇlu−ＴrpをＭet−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal
−Ａrg−Ｐhe−Ｈis−Ｐheに置換した変異体（ＦＣ）を
発現するプラスミド、pＪＦＣを構築した。pＪＦＣの構
築は図２に示すように、pＪＦＮの構築と同様にして行
った。ただし、pＪＦＣの構築においてはプライマー
（５）、（６）をpＪＦＮの構築の場合のプライマー
（３）、（４）の代わりにそれぞれ用いた。
【００１６】このようにして得られた２種の変異リボヌ
クレアーゼＨ、ＦＮおよびＦＣをそれぞれ発現するベク
ターpＪＦＮ、pＪＦＣから目的のプラスミドpＪＦＮＣ
を作成した。図３に示すようにまず、pＪＦＮをＢamＨ
ＩおよびＳalＩで消化し、消化物を０.７％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、約５.３kbの断片を得た。また、p
ＪＦＣについてもＢamＨＩおよびＳalＩで消化し、消化
物を１.５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約２５０b
pの断片を得た。次に、これら２種のＢamＨＩ−ＳalＩ
断片をライゲーションすることにより環化した。このよ
うにして得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換し、形質転換体より目的の変異リボヌクレアーゼ
Ｈ（ＦＮＣ）発現用プラスミドベクターpＪＦＮＣを得
た。
クレアーゼＨ、ＦＮおよびＦＣをそれぞれ発現するベク
ターpＪＦＮ、pＪＦＣから目的のプラスミドpＪＦＮＣ
を作成した。図３に示すようにまず、pＪＦＮをＢamＨ
ＩおよびＳalＩで消化し、消化物を０.７％アガロース
ゲル電気泳動にかけ、約５.３kbの断片を得た。また、p
ＪＦＣについてもＢamＨＩおよびＳalＩで消化し、消化
物を１.５％アガロースゲル電気泳動にかけ、約２５０b
pの断片を得た。次に、これら２種のＢamＨＩ−ＳalＩ
断片をライゲーションすることにより環化した。このよ
うにして得られたプラスミドで大腸菌ＨＢ１０１株を形
質転換し、形質転換体より目的の変異リボヌクレアーゼ
Ｈ（ＦＮＣ）発現用プラスミドベクターpＪＦＮＣを得
た。
【００１７】上記のようにして得られた形質転換菌エシ
エリシア・コリ(Ｅ.coli)ＨＢ１０１／pＪＦＮＣは工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（微工研
菌寄第１２３２２号、受託日：平成３年６月２１日）。
エリシア・コリ(Ｅ.coli)ＨＢ１０１／pＪＦＮＣは工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている（微工研
菌寄第１２３２２号、受託日：平成３年６月２１日）。
【００１８】実施例２ 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｆ
ＮＣ)の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＦＮＣを１００μg／
ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５００ml中、３０℃で
振盪培養した。培養液の濁度がクレット値で約８０まで
生育した時点で、培養温度を４２℃に上げ、更に３.５
時間振盪を続け、次いで遠心して集菌した。この時のク
レット値は約１８０であった。
ＮＣ)の大腸菌における生産と精製 大腸菌形質転換体ＨＢ１０１／pＪＦＮＣを１００μg／
ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５００ml中、３０℃で
振盪培養した。培養液の濁度がクレット値で約８０まで
生育した時点で、培養温度を４２℃に上げ、更に３.５
時間振盪を続け、次いで遠心して集菌した。この時のク
レット値は約１８０であった。
【００１９】得られた菌体を１mＭ ＥＤＴＡを含む１０
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)１５mlに懸濁し
た後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,
０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗
抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５lに対して４℃で一夜透析
した。透析後の粗抽出液を同緩衝液で平衡化したＤＥ−
５２カラム(５ml)およびＰ−１１カラム(２ml)にこの順
序で通した。この条件下、変異型リボヌクレアーゼＨ
(ＦＮＣ)は、ＤＥ−５２カラムを素通りし、Ｐ−１１カ
ラムに吸着する。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、Ｎa
Ｃl濃度を０.５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ
−１１カラムから変異型リボヌクレアーゼＨ(ＦＮＣ)を
溶出させた。変異型リボヌクレアーゼＨ(ＦＮＣ)を含む
Ｐ−１１溶出画分をまとめ、精製標品とした。精製標品
は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相Ｈ
ＰＬＣでも単一ピークを示した。精製収量は約３５mg／
l培養液であった。精製標品の同定は、アクロモバクタ
ープロテアーゼIにより消化して得られるペプチドフラ
グメントを逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメン
トピークの溶出位置を確認するとともに、変異部位アミ
ノ酸を含むペプチドを分取後アミノ酸配列分析により行
った。
mＭトリス塩酸緩衝液(ＴＥ)(pＨ７.５)１５mlに懸濁し
た後、氷中で超音波処理により菌体を破砕した。１５,
０００rpmで３０分間、４℃で遠心して得た遠心上清(粗
抽出液)を、ＴＥ(pＨ７.５)５lに対して４℃で一夜透析
した。透析後の粗抽出液を同緩衝液で平衡化したＤＥ−
５２カラム(５ml)およびＰ−１１カラム(２ml)にこの順
序で通した。この条件下、変異型リボヌクレアーゼＨ
(ＦＮＣ)は、ＤＥ−５２カラムを素通りし、Ｐ−１１カ
ラムに吸着する。ＴＥ(pＨ７.５)を４ml流した後、Ｎa
Ｃl濃度を０.５Ｍまで直線的に上昇させることによりＰ
−１１カラムから変異型リボヌクレアーゼＨ(ＦＮＣ)を
溶出させた。変異型リボヌクレアーゼＨ(ＦＮＣ)を含む
Ｐ−１１溶出画分をまとめ、精製標品とした。精製標品
は１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで単一バンドを与え、逆相Ｈ
ＰＬＣでも単一ピークを示した。精製収量は約３５mg／
l培養液であった。精製標品の同定は、アクロモバクタ
ープロテアーゼIにより消化して得られるペプチドフラ
グメントを逆相ＨＰＬＣでマッピングして各フラグメン
トピークの溶出位置を確認するとともに、変異部位アミ
ノ酸を含むペプチドを分取後アミノ酸配列分析により行
った。
【００２０】得られた精製標品について、以下の方法に
より酵素活性を測定し、比活性を測定したところ、得ら
れた変異型酵素は２.８Ｕ／mgの比活性を有しており、
天然型酵素の約１４％の酵素活性を保持していた。得ら
れた比較結果を以下の表１に示す。
より酵素活性を測定し、比活性を測定したところ、得ら
れた変異型酵素は２.８Ｕ／mgの比活性を有しており、
天然型酵素の約１４％の酵素活性を保持していた。得ら
れた比較結果を以下の表１に示す。
【００２１】活性は、[3Ｈ]−Ｍ１３ＤＮＡ／ＲＮＡを
基質として用い、３７℃、１分間に１μmolの酸可溶性
物質を遊離する酵素活性を１ユニット(Ｕ)と定義した。
タンパク量はＢio−Ｒad社のプロテインアッセイキット
を用いて、発色率を天然型リボヌクレアーゼと比較する
ことにより求めた分子吸光係数ε280＝１０８９Ｍ-1・c
m-1を用いて２８０nmにおける吸光度を測定することに
より求めた。
基質として用い、３７℃、１分間に１μmolの酸可溶性
物質を遊離する酵素活性を１ユニット(Ｕ)と定義した。
タンパク量はＢio−Ｒad社のプロテインアッセイキット
を用いて、発色率を天然型リボヌクレアーゼと比較する
ことにより求めた分子吸光係数ε280＝１０８９Ｍ-1・c
m-1を用いて２８０nmにおける吸光度を測定することに
より求めた。
【表１】 天然型と変異型リボヌクレアーゼＨの酵素活性の比較 酵素名 比活性(Ｕ／mg) 天然型リボヌクレアーゼＨ ２０ 変異型リボヌクレアーゼＨ(ＦＮＣ) ２.８
【００２２】実施例３ 変異型リボヌクレアーゼＨ(Ｆ
ＮＣ)の安定性の評価 天然型リボヌクレアーゼＨと変異型リボヌクレアーゼＨ
（ＦＮＣ）の熱安定性について測定し、比較した。測定
はpＨ５.５での変性の割合を２２０nmにおけるＣＤ値で
熱変性曲線を測定することにより行った。熱変性実験は
光路長２mmのセルを用い、１Ｍ塩酸グアニジンおよび１
mＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む２０mＭ酢酸ナ
トリウム（pＨ５.５）中で行った。測定により得られた
変性曲線を図５に示す。変異型リボヌクレアーゼＨ（Ｆ
ＮＣ）の熱変性曲線は天然型の熱変性曲線よりも高温側
へシフトしており、明らかに熱安定性が増加していた。
全体の５０％が変性するときの温度を比較すると変異型
リボヌクレアーゼＨ（ＦＮＣ）は天然型よりも８.２℃
安定化していた。得られた結果を以下の表２に示す。
ＮＣ)の安定性の評価 天然型リボヌクレアーゼＨと変異型リボヌクレアーゼＨ
（ＦＮＣ）の熱安定性について測定し、比較した。測定
はpＨ５.５での変性の割合を２２０nmにおけるＣＤ値で
熱変性曲線を測定することにより行った。熱変性実験は
光路長２mmのセルを用い、１Ｍ塩酸グアニジンおよび１
mＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む２０mＭ酢酸ナ
トリウム（pＨ５.５）中で行った。測定により得られた
変性曲線を図５に示す。変異型リボヌクレアーゼＨ（Ｆ
ＮＣ）の熱変性曲線は天然型の熱変性曲線よりも高温側
へシフトしており、明らかに熱安定性が増加していた。
全体の５０％が変性するときの温度を比較すると変異型
リボヌクレアーゼＨ（ＦＮＣ）は天然型よりも８.２℃
安定化していた。得られた結果を以下の表２に示す。
【表２】 天然型および変異型リボヌクレアーゼＨの熱安定性の比較 酵 素 名 ５０％変性するときの温度（℃） 天然型リボヌクレアーゼＨ ５１.８ 変異型リボヌクレアーゼ(ＦＮＣ) ６０.０
【００２３】以上の結果から、天然型大腸菌リボヌクレ
アーゼＨの第７４番目から第８０番目のアミノ酸配列を
Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−Ｐhe−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyに、
第１１１番目から第１２０番目までのアミノ酸配列をＭ
et−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal−Ａrg−Ｐhe−Ｈis
−Ｐheに変換することにより、変性剤および熱に対する
安定性が向上することが確認された。
アーゼＨの第７４番目から第８０番目のアミノ酸配列を
Ｌeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−Ｐhe−Ｔhr−Ｇlu−Ｇlyに、
第１１１番目から第１２０番目までのアミノ酸配列をＭ
et−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal−Ａrg−Ｐhe−Ｈis
−Ｐheに変換することにより、変性剤および熱に対する
安定性が向上することが確認された。
【図１】 プラスミドpＪＦＮの構築を示す模式図であ
る。
る。
【図２】 プラスミドpＪＦＣの構築を示す模式図であ
る。
る。
【図３】 プラスミドpＪＦＮＣの構築を示す模式図で
ある。
ある。
【図４】 部位特異的突然変異を導入するための合成オ
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中、下線は制
限酵素部位を、●印は変異アミノ酸に対応する塩基をそ
れぞれ示すものである。
リゴヌクレオチドを示す模式図であり、図中、下線は制
限酵素部位を、●印は変異アミノ酸に対応する塩基をそ
れぞれ示すものである。
【図５】 天然型リボヌクレアーゼＨおよび変異型リボ
ヌクレアーゼＨ(ＦＮＣ)の熱変性曲線を示すグラフであ
る。
ヌクレアーゼＨ(ＦＮＣ)の熱変性曲線を示すグラフであ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/55 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】 天然型大腸菌リボヌクレアーゼＨのアミ
ノ酸配列において、第７４番目から第８０番目までのア
ミノ酸配列がＬeu−Ｌys−Ｌys−Ａla−Ｐhe−Ｔhr−Ｇ
lu−Ｇlyで、第１１１番目から第１２０番目までのアミ
ノ酸配列がＭet−Ａla−Ｐro−Ｈis−Ａrg−Ｖal−Ａrg
−Ｐhe−Ｈis−Ｐheで置換されたアミノ酸配列を有する
変異型大腸菌リボヌクレアーゼＨ。 - 【請求項２】 請求項１に記載の変異型大腸菌リボヌク
レアーゼＨを暗号化している変異型大腸菌リボヌクレア
ーゼＨ構造遺伝子。 - 【請求項３】 請求項２に記載の変異型大腸菌リボヌク
レアーゼＨ構造遺伝子を大腸菌の遺伝子発現系制御下に
含有している組換え体プラスミド。 - 【請求項４】 pＪＦＮＣである請求項３に記載の組換
え体プラスミド。 - 【請求項５】 請求項３または４のいずれかに記載の組
換え体プラスミドで形質転換された大腸菌株。 - 【請求項６】 ＨＢ１０１／pＪＦＮＣである請求項５
に記載の大腸菌株。 - 【請求項７】 請求項５または６のいずれかに記載の大
腸菌株を培養し、得られた培養液から変異型大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨを回収することを特徴とする変異型大腸
菌リボヌクレアーゼＨの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19770791A JPH0564585A (ja) | 1991-08-07 | 1991-08-07 | 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP19770791A JPH0564585A (ja) | 1991-08-07 | 1991-08-07 | 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0564585A true JPH0564585A (ja) | 1993-03-19 |
Family
ID=16379025
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP19770791A Pending JPH0564585A (ja) | 1991-08-07 | 1991-08-07 | 安定性が改良された変異型大腸菌リボヌクレアーゼｈ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0564585A (ja) |
-
1991
- 1991-08-07 JP JP19770791A patent/JPH0564585A/ja active Pending
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