JP2754975B2

JP2754975B2 - ファルネシル二リン酸合成酵素およびそれをコードするｄｎａ配列

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Publication number: JP2754975B2
Application number: JP3253788A
Authority: JP
Inventors: 充生小畑; あゆみ竹下; 協三小倉; 種俊古山
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 1991-10-01
Filing date: 1991-10-01
Publication date: 1998-05-20
Anticipated expiration: 2013-05-20
Also published as: EP0537553A3; DE69228037T2; EP0537553B1; US5786192A; DE69228037D1; JPH05219961A; EP0537553A2

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はバチラスステアロサー
モフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒ
ｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のファルネシル二リン酸合成酵
素活性物質を生産するためのＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配
列による形質転換体ならびにその形質転換体を用いるフ
ァルネシル二リン酸合成酵素活性物質およびファルネシ
ル二リン酸の製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ファルネシル二リン酸（以下、「ＦＰ
Ｐ」と略記することもある）はカロチノイド、コレステ
ロール、ゴム等のイソプレノイドの重要な生合成中間体
であり、イソペンテニル二リン酸と３，３−ジメチルア
リル二リン酸の縮合により生じ、その合成酵素は多くの
生物に存在することが知られている。従って、遺伝子工
学的手法を用いてＦＰＰ合成酵素の遺伝子を適当な宿主
に導入すればイソプレノイドの増産が期待でき有用であ
る。

【０００３】このような観点から微生物由来のＦＰＰ合
成酵素をコードする遺伝子およびその操作の研究、なら
びにその合成酵素の生産も試みられているが、大腸菌由
来のものが知られているにすぎない（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１０８，９９５〜１０００ページ（１９９０））。
その上、大腸菌由来のＦＰＰ合成酵素は非常に不安定で
あり、たとえば５０℃で速やかに失活してしまう。ま
た、大腸菌由来の前記遺伝子は別の大腸菌に導入されて
いるだけで、他の微生物に導入が試みられた例は公知文
献に未載である。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】ＦＰＰ合成酵素をＦＰ
Ｐの実用的な生産に利用するには、前記のような大腸菌
由来の酵素では不十分であり、さらに特に熱安定性を有
するＦＰＰ合成酵素を提供することが必要であろう。従
って、本発明の目的は熱安定性ＦＰＰ合成酵素をコード
するＤＮＡ配列を提供し、そのＤＮＡ配列を使用する熱
安定性ＦＰＰ生産系を構築することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記課題を
解決すべく広く各種微生物のファルネシル二リン酸合成
酵素について検索したところ、高温で生育し、一般的に
熱安定性の各種酵素を産生することが知られているバチ
ラスステアロサーモフィラスがＦＰＰ合成酵素も産生
することを見いだし、さらに対応する遺伝子を遺伝子工
学的手法で発現することに成功し本発明を完成した。

【０００６】従って、前記課題は、本発明により提供さ
れるバチラスステアロサーモフィラス由来のＦＰＰ合
成酵素をコードするＤＮＡ配列、そのＤＮＡ配列を組み
込んだ組換えベクター、その組換えベクターによって遺
伝子導入した組換え微生物細胞およびその使用によって
解決できる。

【０００７】

【発明の具体的な態様】本発明にいうファルネシル二リ
ン酸合成酵素をコードするＤＮＡ配列とは、それを適当
な発現ベクターに組み込んだとき、その合成酵素の遺伝
子が発現できる単位のＤＮＡ鎖からなり、実質的に同等
の酵素活性物質をコードするものをすべて包含する概念
で用いている。それらの具体的なものとしては、配列表
の配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードするすべ
てのＤＮＡ配列を挙げることができ、このようなアミノ
酸配列をコードし、その発現によって産生されるタンパ
ク質が前記活性を示す限り追加のアミノ酸を併せて（た
とえば融合タンパク質として）コードするものも含む。
このようなＤＮＡ配列の具体的なものとしては、配列表
の配列番号１で示されるようなＤＮＡ配列が挙げられ
る。なお、上記「実質的に同等の酵素活性物質」とは、
配列番号：１に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは
配列番号：１に示すアミノ酸配列に対して１個又は複数
個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸のに
よる置換によって修飾されているアミノ酸配列を有し、
且つ熱安定性ファルネシル二リン酸合成酵素の活性を維
持している蛋白質を意味し、修飾の程度は、部位特定変
異誘発法、ＰＣＲ法等、本件出願前の周知技術により実
施可能な範囲の修飾を意味する。

【０００８】本発明のＤＮＡ配列は、詳細については後
述するようなそれ自体既知の方法によって、各種微生物
の寄託機関から入手可能なバチラスステアロサーモフ
ィラスから調製することができる。また、本発明は前記
ＤＮＡ配列を含んでなる組換えベクターも提供する。か
かる組換えベクターは前記ＤＮＡ配列が担持するＦＰＰ
合成酵素遺伝子を発現調節するための機能を有するＤＮ
Ａ配列も含む。

【０００９】宿主に大腸菌を用いる場合を例にとれば、
ＤＮＡからｍＲＮＡを転写する過程とｍＲＮＡからタン
パク質を翻訳する過程など遺伝子の発現調節機能がある
ことが知られている。従って、ｍＲＮＡの合成を調節す
るプロモーター配列として、天然に存在する配列（たと
えばｌａｃ，ｔｒｐ，ｂｌａ，ｌｐｐ，Ｐ_L，Ｐ_R，ｔ
ｅｔ，Ｔ３，Ｔ７など）以外にも、それらの変異体（例
えば、ｌａｃＵＶ５）や天然にあるプロモーター配列を
人工的に融合した（例えば、ｔａｃ，ｔｒｃなど）配列
が知られており、これらが本発明にも使用できる。ｍＲ
ＮＡからタンパク質を合成する能力を調節する配列とし
て、リボソームバインディングサイト（ＧＡＧＧおよび
その類似配列）配列と開始コドンであるＡＴＧまでの距
離が重要であることは既知である。また、３’側に転写
終了を指令するターミネーター（例えば、ｒｒｎＢＴ₁
Ｔ₂を含むベクターがファルマシア社から市販されてい
る）が組換え体でのタンパク質合成効率に影響する事は
よく知られている。

【００１０】本発明で明らかになったＤＮＡ配列では、
希な開始コドンをコードするＧＴＧからＦＰＰ合成酵素
の遺伝子がはじまっていたが、通常のタンパク質合成開
始コドンであるＡＴＧからスタートさせれば合成効率が
あがることは容易に推測される。本発明の組換えベクタ
ーを調製するのに使用できるベクターとしては、市販の
ものをそのまま用いるか、または目的に応じて誘導した
各種のベクターを挙げることができる。例えば、ｐＭＢ
１由来のレプリコンを持つｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２
７，ｐＫＫ２２３−３，ｐＫＫ２３３−２，ｐＴｒｃ９
９等や、コピー数が向上するように改変したｐＵＣ１
８，ｐＵＣ１９，ｐＵＣ１１８，ｐＵＣ１１９，ｐＨＳ
Ｇ２９８，ｐＨＳＧ３９６等、またｐ１５Ａ由来のレプ
リコンを持つｐＡＣＹＣ１７７やｐＡＣＹＣ１８４等、
さらにはｐＳＣ１０１やＣｏｌＥ１やＲ１やＦ因子など
に由来するのプラスミドが挙げられる。また、プラスミ
ド以外にも、λファージやＭ１３ファージのようなウイ
ルスベクターやトランスポゾンによっても遺伝子導入が
可能である。

【００１１】大腸菌以外の微生物への遺伝子導入では、
ｐＵＢ１１０（Ｓｉｇｍａ社から販売）やｐＨＹ３００
ＰＬＫ（宝酒造より販売）などによるバチラス属への遺
伝子導入が知られている。これらベクターについてはＭ
ｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ
著ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ発行）やＣｌｏｎｉｎｇＶｅ
ｃｔｏｒ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ，Ｂ．Ｅ．Ｅｎｇｅ
ｒ・Ｖａｌｋ，Ｗ．Ｊ．Ｂｒａｍｍａｒ著Ｅｌｓｅｖｉ
ｅｒ発行）や各社カタログに記載されている。特に、ｐ
Ｔｒｃ９９（ファルマシア社より販売）は、選択マーカ
ーのアンピシリン耐性遺伝子以外に、プロモーター及び
制御遺伝子としてＰｔｒｃ及びｌａｃＩ^q、リボソーム
バインディングサイトとしてＡＧＧＡという配列、ター
ミネーターとしてｒｒｎＢＴ₁Ｔ₂を持ち、ＦＰＰ合成
酵素遺伝子の発現調節機能を持つ、好ましいベクターと
して挙げられる。

【００１２】これらのベクターへの、ＦＰＰ合成酵素を
コードするＤＮＡ断片および必要により前記酵素の遺伝
子を発現調節する機能を有するＤＮＡ断片の組み込み
は、適当な制限酵素とリガーゼを用いる既知方法で行う
ことができ、具体的には後述の方法に従うのが都合よ
い。こうして作製される発明のプラスミドの具体的なも
のとしてはｐＥＸ１が挙げられる。このプラスミドは１
９９１年９月２６日付で工業技術院微生物工業技術研究
所に国際寄託され寄託番号微工研条寄第３５８１号（Ｆ
ＥＲＭＢＰ−３５８１）で受託されたエシェリヒア
コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０
９（ｐＥＸ１）よりそれ自体既知の方法で入手できる。

【００１３】このような組換えベクターで遺伝子導入で
きる微生物としてはエシェリヒアコリー、バチルス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）属などに属する微生物も利用すること
ができる。この形質転換も常法、たとえばＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．
Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ著Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ発行）やＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇＶｏ
ｌ．Ｉ〜III(Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編ＩＲＬＰＲＥＳＳ
発行）などに記載された、ＣａＣｌ₂法やプロトプラス
ト法により行うことができる。こうして得られる本発明
の形質転換体の代表的なものとしては、前記ＪＭ１０９
（ｐＥＸ１）（またはｐＥＸ１／ＪＭ１０９とも記載す
る）が挙げられる。

【００１４】これらの形質転換体または組換え微生物細
胞は、通常大腸菌の培養に用いられる培地で培養する
と、ファルネシル二リン酸（ＦＰＰ）を菌体内に蓄積す
る。菌体からのＦＰＰの採取は、菌体を物理的または適
当な細胞溶解性酵素の存在する環境下で処理して溶菌し
た後、細胞破砕物を除去し、次いで、酵素の一般的な単
離精製方法によって行うことができる。細胞溶解性酵素
としてはリゾチームを用いることが好ましく、また物理
的処理には超音波を用いることが好ましい。また５５℃
程度の熱処理をすることにより、多くの大腸菌由来のタ
ンパク質は不溶性の沈澱として除去できる。酵素の単離
精製には、ゲル濾過・イオン交換・疎水性・逆相・アフ
ィニティーなどの各種クロマトグラフィー処理や限外濾
過法などを単独または組み合わせて行えばよい。単離・
精製工程を通じて、目的とする酵素の安定化を図るため
の安定剤として、たとえば、β−メルカプトエタノール
やジチオスレイトールなどの還元剤、ＰＭＳＦやＢＳＡ
などのプロテアーゼへの保護剤、マグネシウムなどの金
属イオンを処理液に共存させてもよい。

【００１５】前記ＦＰＰ合成酵素活性は、たとえば次の
ように測定できるので、その酵素の単離・精製は、後述
の実施例１のｃ）で使用するアッセイ用反応液を用い
て、その酵素活性を確認しながら進めることが推奨でき
る。

【００１６】

【実施例】以下、本発明のＤＮＡ配列、プラスミド、形
質転換体の調製法の１例を記載するが、本発明の範囲は
これに限定されるものではない。

【００１７】例１実験法は主として前述のＭｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎ
ｉｎｇとＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇと宝酒造のカタログに
従った。酵素は主に宝酒造から購入した物を用いた。用
いたバチラスステアロサーモフィラスはアメリカン
タイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ：
ＡＴＣＣ）に登録されている公知の菌株である。本研究
にはＡＴＣＣ１０１４９株をもちいた

【００１８】ａ）バチラスステアロサーモフィラスの
染色体ＤＮＡの調製ＬＢ倍地（１％Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．５％Ｙｅａｓｔ
ｅｘｔｒａｃｔ、１％ＮａＣｌ）で培養し、集菌した。
Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒに懸濁後、リゾチーム（Ｓｉ
ｇｍａ社製ニワトリ卵白由来）を１０ｍｇ／ｍｌになる
ように加えた。溶菌後、１／１０量の１ＭＴｒｉｓ・Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、１／１０量の１０％ＳＤＳ、１／
５０量の５ＭＮａＣｌを加えた。Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ
Ｋ（Ｓｉｇｍａ社製）を１０ｍｇ／ｍｌになるように加
え、５０℃に加温した。

【００１９】等量のフェノールを加え、穏やかに攪拌
後、遠心して除蛋白を行った。遠心上清を広口ピペット
でビーカーにとり、２．５倍量のエタノールを静かに重
層後、ガラス棒で染色体ＤＮＡを巻きとった。ＴＥ（１
０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴ
Ａ）に溶解後、ＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ社製）処理、
ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ処理、フェノール処理後、エタ
ノールを静かに重層し、ガラス棒で染色体ＤＮＡを巻き
とった。７０％エタノールで洗浄後、ＴＥに溶解し、以
下の実験に用いた。

【００２０】ｂ）バチラスステアロサーモフィラスの
遺伝子ライブラリーの作製染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分限定分解し
たものを、１％アガロースで電気泳動した。２ｋｂ．
ｐ．から５ｋｂ．ｐ．のＤＮＡ断片を含むアガロースを
分画し、そこからＤＮＡを抽出した。プラスミドｐＵＣ
１１８（宝酒造から購入）のＢａｍＨＩ分解物とＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し
た。以上の様に作製したライブラリーをスクリーニング
に用いた。

【００２１】ｃ）ライブラリーからのイソプレノイド合
成酵素遺伝子のスクリーニングライブラリーからとった形質転換体を５０μｇ／ｍｌの
アンピシリンを含むＬＢ培地３０ｍｌで一晩培養後、集
菌した。３ｍｌのＳｏｎｉｃｂｕｆｆｅｒに懸濁し、
超音波で菌体を破砕した。５５℃に１時間加温し、大腸
菌由来のプレニルトランスフェラーゼを失活させ、遠心
分離で大腸菌由来の変性タンパク質を除き、その中から
６００μｌをアッセイに用いた。文章末に示したアッセ
イ用反応液を１時間あるいは２時間５５℃で反応させ
た。反応液を１−ブタノールで抽出し、液体シンチレー
ションカウンターで放射活性を測定した。この様にして
スクリーニングした中に、ｐＦＥ１５に強いプレニルト
ランスフェラーゼ活性が見られた。

【００２２】次に、ｐＦＥ１５を持つＪＭ１０９を上記
のように反応させた時の１−ブタノール抽出物を薄層ク
ロマトグラフィー（ＴＬＣ）で分析した。その結果、生
成したイソプレノイドはファルネシル二リン酸であると
同定され、ｐＦＥ１５はファルネシル二リン酸合成酵素
の遺伝子を含むことが判明した。大腸菌は５５℃で活性
があるプレニルトランスフェラーゼを持っていなかった
のに対し、ｐＦＥ１５で形質転換した大腸菌は５５℃で
プレニルトランスフェラーゼを持つこととなった。ｐＦ
Ｅ１５がコードしているバチラスステアロサーモフィ
ラス由来のプレニルトランスフェラーゼは非常に安定で
あることがここに示された。結果を表１に示す。また、
組換え体が安定なファルネシル二リン酸の製造に有効で
あることがここに示された。

【００２３】

【表１】

【００２４】ｄ）ｐＦＥ１５の欠失変異体の作製とＦＰ
Ｐ合成酵素遺伝子の特定ｐＦＥ１５は、約５ｋｂ．ｐ．の挿入遺伝子を持ち、挿
入遺伝子部分の制限酵素地図を図２に示す。ｐＦＥ１５
の欠失変異体のうち、ＰｓｔＩからＮｒｕＩの領域を含
むものにはすべてプレニルトランスフェラーゼ活性が見
られた。ｐＦＥ１５のＰｓｔＩ−ＮｒｕＩの約２ｋｂ．
ｐ．のＤＮＡ断片がｐＵＣ１１８のＳｍａＩ部位に入っ
たプラスミドｐΔ１にはＦＰＰ合成酵素活性があった。
また、ｐΔ１のＮｒｕＩ側を６００ｂ．ｐ．ほど削って
も活性が残るのに対し、ＰｓｔＩ側は１００ｂ．ｐ．ほ
ど削ると活性が無くなった。従って、ＦＰＰ合成酵素遺
伝子はＮｒｕＩより少しはなれ、ＰｓｔＩの側にあると
推測された。

【００２５】ｅ）ｐΔ１のＤＮＡシークエンスＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅIII や制限酵素を用いて作製し
た欠失変異体を、アプライドバイシステム３７３Ａ蛍光
ＤＮＡシーケンサーでＤＮＡ配列を解析した。その結
果、配列表の配列番号１に示す塩基配列が明らかにな
り、さらに同時に示すアミノ酸配列が推測された。予想
されるアミノ酸配列を大腸菌のファルネシル二リン酸合
成酵素（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０８，９９５〜１００
０ページ（１９９０））と比較すると約４０％の相同性
があり、バチラスステアロサーモフィラスのファルネ
シル二リン酸合成酵素であることが確認された。

【００２６】ｆ）ｌａｃプロモーターを使ったプレニル
トランスフェラーゼの生産ｐΔ１のＫｐｎＩ−ＰｓｔＩ断片がｐＵＣ１１９のＫｐ
ｎＩ−ＰｓｔＩ部位に挿入されたプラスミドｐＥＸ１を
作製した（図１）。ｐΔ１はｌａｃプロモーターとＦＰ
Ｐ合成酵素遺伝子が逆向きであるのに対し、ｐＥＸ１は
ｌａｃプロモーターとＦＰＰ合成酵素遺伝子が同じ向き
である。次に、ｐＥＸ１およびｐΔ１で大腸菌ＪＭ１０
９を形質転換してｃ）に記載の方法でプレニルトランス
フェラーゼ活性を測定した。その結果、ｐＥＸ１／ＪＭ
１０９はｐΔ１／ＪＭ１０９の１５倍のプレニルトラン
スフェラーゼ活性があることがわかり、ｌａｃプロモー
ターによりＦＰＰ合成酵素の生産性を向上させることに
成功した。

【００２７】（緩衝液Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）シュークロース０．３ＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）２５ｍＭＥＤＴＡ１０ｍＭ

【００２８】（緩衝液Ｓｏｎｉｃｂｕｆｆｅｒ）Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）５０ｍＭＥＤＴＡ１ｍＭ β−メルカプトエタノール１０ｍＭＰＭＳＦ１μｇ／ｍｌフォスフォラミドン１μｇ／ｍｌ

【００２９】（アッセイ用反応液（全溶１ｍｌ）の組成）［１−¹⁴Ｃ］イソペンテニルピロリン酸２５ｎｍｏｌ（アマシャム社製、約５．５×１０⁵ｄｐｍに相当）ゲラニルピロリン酸２５ｎｍｏｌＭｇＣｌ₂ ５μｍｏｌＮＨ₄Ｃｌ５０μｍｏｌＫＦ５μｍｏｌ β−メルカプトエタノール５０μｍｏｌＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ８．５）５０μｍｏｌ無細胞抽出液６００μｌ

【００３０】

【発明の効果】本発明によれば、バチラスステアロサ
ーモフィラス由来のファルネシル二リン酸合成酵素をコ
ードするＤＮＡ配列が提供される。このようなＤＮＡ配
列を発現ベクターに組み込み、適当な大腸菌を形質転換
した組換え微生物細胞は、安定な、特に熱に安定なファ
ルネシル二リン酸合成活性物質を生産する。この効果
は、従来技術文献に未載のバチラスステアロサーモフ
ィラス染色体から前記ＤＮＡ配列を調製することによっ
て得られる。

【配列表】配列番号：１配列の長さ：８９４配列の型：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：バチラスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）配列： GTG GCG CAG CTT TCA GTT GAA CAG TTT CTC AAC GAG CAA AAA CAG 45 Met Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln 5 10 15 GCG GTG GAA ACA GCG CTC TCC CGT TAT ATA GAG CGC TTA GAA GGG 90 Ala Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly 20 25 30 CCG GCG AAG CTG AAA AAG GCG ATG GCG TAC TCA TTG GAG GCC GGC 135 Pro Ala Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly 35 40 45 GGC AAA CGA ATC CGT CCG TTG CTG CTT CTG TCC ACC GTT CGG GCG 180 Gly Lys Arg Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala 50 55 60 CTC GGC AAA GAC CCG GCG GTC GGA TTG CCC GTC GCC TGC GCG ATT 225 Leu Gly Lys Asp Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile 65 70 75 GAA ATG ATC CAT ACG TAC TCT TTG ATC CAT GAT GAT TTG CCG AGC 270 Glu Met Ile His Thr Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser 80 85 90 ATG GAC AAC GAT GAT TTG CGG CGC GGC AAG CCG ACG AAC CAT AAA 315 Met Asp Asn Asp Asp Leu Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys 95 100 105 GTG TTC GGC GAG GCG ATG GCC ATC TTG GCG GGG GAC GGG TTG TTG 360 Val Phe Gly Glu Ala Met Ala Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu 110 115 120 ACG TAC GCG TTT CAA TTG ATC ACC GAA ATC GAC GAT GAG CGC ATC 405 Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile 125 130 135 CCT CCT TCC GTC CGG CTT CGG CTC ATC GAA CGG CTG GCG AAA GCG 450 Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ile Glu Arg Leu Ala Lys Ala 140 145 150 GCC GGT CCG GAA GGG ATG GTC GCC GGT CAG GCA GCC GAT ATG GAA 495 Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gln Ala Ala Asp Met Glu 155 160 165 GGA GAG GGG AAA ACG CTG ACG CTT TCG GAG CTC GAA TAC ATT CAT 540 Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu Glu Tyr Ile His 170 175 180 CGG CAT AAA ACC GGG AAA ATG CTG CAA TAC AGC GTG CAC GCC GGC 585 Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val His Ala Gly 185 190 195 GCC TTG ATC GGC GGC GCT GAT GCC CGG CAA ACG CGG GAG CTT GAC 630 Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu Leu Asp 200 205 210 GAA TTC GCC GCC CAT CTA GGC CTT GCC TTT CAA ATT CGC GAT GAT 675 Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp Asp 215 220 225 ATT CTC GAT ATT GAA GGG GCA GAA GAA AAA ATC GGC AAG CCG GTC 720 Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Pro Val 230 235 240 GGC AGC GAC CAA AGC AAC AAC AAA GCG ACG TAT CCA GCG TTG CTG 765 Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu 245 250 255 TCG CTT GCC GGC GCG AAG GAA AAG TTG GCG TTC CAT ATC GAG GCG 810 Ser Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His Ile Glu Ala 260 265 270 GCG CAG CGC CAT TTA CGG AAC GCC GAC GTT GAC GGC GCC GCG CTC 855 Ala Gln Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu 275 280 285 GCC TAT ATT TGC GAA CTG GTC GCC GCC CGC GAC CAT TAA 894 Ala Tyr Ile Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His *** 290 295

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のプラスミド作製の流れ図である。

【図２】本発明のプラスミド（ｐＦＥ１５）の制限酵素
地図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:07） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/10 - 9/12 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（ＧＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号：１に示すアミノ酸配列を有す
るか、あるいは配列番号：１に示すアミノ酸配列に対し
て１個又は複数個のアミノ酸の欠失、付加及び／又は他
のアミノ酸による置換により修飾されているアミノ酸配
列を有し、且つ熱安定性ファルネシル二リン酸合成酵素
の活性を有する蛋白質。
【請求項２】請求項１に記載の蛋白質をコードするＤ
ＮＡ。
【請求項３】請求項２に記載のＤＮＡを含んで成る組
換えベクター。
【請求項４】請求項３に記載の組換えベクターにより
形質転換された微生物。
【請求項５】前記微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ）属に属する微生物である、請求項４に記
載の微生物。
【請求項６】請求項１に記載の蛋白質の製造方法にお
いて、該蛋白質をコードするＤＮＡを含んで成る組換え
ベクターにより形質転換された微生物を培養し、培養物
から該蛋白質を採取することを特徴とする方法。