JP3688367B2 - 変異型ｄｎａポリメラーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学用試薬として有用な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼ、該酵素をコードする遺伝子、及び該遺伝子を用いたＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的な製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今まで遺伝子工学研究用試薬として一般に使用されているＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、その改変型であるクレノウ断片、Ｔ４ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ〔タック（Taq ）ポリメラーゼ〕等がある。これらの酵素は、それらが有する性質に応じて、特定のＤＮＡの標識化やＤＮＡ塩基配列の決定などにそれぞれ利用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
一般にＤＮＡポリメラーゼはその起源によって異なった特性を有しており、その特性を生かした利用法がある。例えばバチルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax ）は生育至適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＤＮＡポリメラーゼは高温においても高い安定性を示すことから、遺伝子工学用研究試薬として使用されている。また、該酵素はＤＮＡポリメラーゼ活性のほか、５’→３’、及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しているが、その用途のほとんどにおいて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の存在は望ましくなく、この活性を失った変異型酵素が使用されている。しかしながらこの変異型酵素は、該酵素をコードする遺伝子より５’→３’エキソヌクレアーゼ活性情報部分を欠失させることによって生産されるため、野生型の酵素とはそのタンパク質としての構造が異なっている。
本発明の目的は、野生型のＤＮＡポリメラーゼと同じ構造を保持しながら、望ましくない５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼ、及びその遺伝子と遺伝子工学的製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼに関する発明であって、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列中、１８４番目のグリシンがアスパラギン酸で置換されていることを特徴とする。
また、本発明の第２の発明は変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する発明であって、該遺伝子が第１の発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードすることを特徴とし、とりわけ配列表の配列番号２で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
また、本発明の第３の発明は変異型ＤＮＡポリメラーゼの製造方法に関する発明であって、第２の発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有させた形質転換体を培養し、該培養物から第１の発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする。
【０００５】
部位特異的変異導入法を用いて活性に必須のアミノ酸残基を他のものに置換することにより、酵素タンパクの全体の構造を損なうことなくその活性を欠失させることは可能と考えられる。しかしながらバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に関しては活性に必須のアミノ酸残基が確認されていないため、該方法を直接適用することはできない。本発明者らは鋭意研究の結果、該酵素のＮ−末端より１８４番目のグリシン、又は１９２番目のグリシンが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に必須であることを見出し、更に上記のグリシンが他のアミノ酸に置換された変異型ＤＮＡポリメラーゼを作製し、本発明を完成させた。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明に使用する菌株としてはＤＮＡポリメラーゼを生産する菌株であれば何でもよく、例としてバチルス・カルドテナクスＹＴ−Ｇ株〔ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen ）の保存菌株：ＤＳＭ４０６〕がある。
バチルス・カルドテナクス由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は既に石野らによって単離されている〔ジャーナル オブ バイオケミストリー（J. Biochem. ）、第１１３巻、第４０１〜４１０頁（１９９３）〕。また、該遺伝子を含有するプラスミドｐＵＩ１０１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１は Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１と命名、表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２１として寄託されている。該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、また該アミノ酸配列をコードするプラスミドｐＵＩ１０１中のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号４に示す。
既知の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く変異型ＤＮＡポリメラーゼとしては、野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端より２８４番目のアミノ酸までの領域を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼが知られている〔ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１３巻、第４０１〜４１０頁（１９９３）〕。したがって、バチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に重要なアミノ酸残基は該変異型酵素に欠失した領域に存在することが予想される。そこで、配列表の配列番号１に示した野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、アミノ酸番号１番から２８４番までの領域に存在するアミノ酸残基のあるものをそれ以外のアミノ酸残基に置換することにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を失った変異型ＤＮＡポリメラーゼを得ることが期待される。
【０００７】
タンパク質にアミノ酸置換を導入する方法としてはいくつかの部位特異的変異導入法が知られており、例えばクンケル（Kunkel,T.A. ）の方法が利用できる〔メソッズ イン エンザイモロジー（Methods in Enzymology ）、第１５４巻、第３６７〜３８９頁（１９８７）〕。該方法は合成オリゴヌクレオチドを使用してタンパク質をコードする遺伝子上に変異を導入する方法である。表１に本発明で導入を試みたアミノ酸置換とそれに用いた合成オリゴヌクレオチド、及びその塩基配列を示す。
【０００８】
【表１】
【０００９】
また、配列表の配列番号５〜１２にそれぞれ合成オリゴヌクレオチドＤ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３Ｆ、Ｇ１４８Ｄ、Ｄ１８５Ａ、Ｄ１８８Ａ、Ｇ１９２Ｄ、及びＥ１９８Ａの塩基配列を示す。各合成オリゴヌクレオチドの名称はそれによって導入されるアミノ酸置換を示しており、例えばＤ５９Ａは５９番目のアスパラギン酸をアラニンに置換するための合成オリゴヌクレオチドである。
【００１０】
変異導入に使用する鋳型ＤＮＡは、上記プラスミドｐＵＩ１０１に組込まれた野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当なベクターにサブクローニングした上、ｄＵ（デオキシウリジン）を含む一本鎖ＤＮＡを調製して作製することができる。次に該鋳型ＤＮＡと上記の合成オリゴヌクレオチドとを用いて該遺伝子上にアミノ酸置換を導入することができる。変異導入に当ってはミュータンＫキット（宝酒造社製）が使用できる。しかしながらオリゴヌクレオチドの設計によっては変異導入効率が悪く、目的の変異が得られない場合がある。また、変異が導入された場合でも、導入されたアミノ酸置換の種類によっては発現された変異型タンパク質が宿主に対して負荷となって形質転換体が得られなかったり、酵素タンパク質全体の構造が破壊されてＤＮＡポリメラーゼ活性まで失われてしまう可能性もある。
本発明に使用した合成オリゴヌクレオチドのうち、Ｄ１８５Ａを除く７つを使用した場合については変異が導入された遺伝子を得ることができる。これらの遺伝子については通常の方法、例えばジデオキシ法を用いてその塩基配列を調べ、目的とする変異が導入できたかどうかを確認することができる。
【００１１】
次に、得られた変異導入遺伝子を組込んだプラスミドで形質転換した適当な微生物を培養し、該培養物中に発現されるＤＮＡポリメラーゼ活性を調べることにより、ＤＮＡポリメラーゼ活性を発現可能な変異導入遺伝子を得ることができる。更に、ＤＮＡポリメラーゼ活性が認められたものについては酵素を精製した上で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を調べ、目的とする変異型ＤＮＡポリメラーゼを発現する変異導入遺伝子を得ることができる。
ただし導入された変異の種類によっては発現された変異型ＤＮＡポリメラーゼの安定性が低下しているために酵素の精製が困難な場合があり、例えば合成オリゴヌクレオチドＤ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３Ｆを用いて作製された変異導入遺伝子によって発現される変異型ＤＮＡポリメラーゼについては精製酵素標品が得られない。一方、合成オリゴヌクレオチドＧ１８４Ｄ、Ｇ１９２Ｄ、Ｅ１９８Ａを用いたものでは精製された酵素標品を用いて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を調べることができる。この結果、Ｅ１９８Ａを用いたものでは野生型酵素の約７０％の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が残存しているのに対し、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１９２Ｄでは活性が全く認められない。
このように、ＤＮＡポリメラーゼ活性を保持し、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼを発現する２種の変異導入遺伝子を得ることができる。こうして得られた変異導入遺伝子を組込んだプラスミドのうち、合成オリゴヌクレオチドＧ１８４Ｄを用いて作製された、野生型ＤＮＡポリメラーゼの１８４番目に存在するグリシンがアスパラギン酸に置換された変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする変異導入遺伝子を組込んだプラスミドはプラスミドｐＵＩＴ１０４と命名され、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０４と命名されている。
また、合成オリゴヌクレオチドＧ１９２Ｄを用いて作製された、野生型ＤＮＡポリメラーゼの１９２番目に存在するグリシンがアスパラギン酸に置換された変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする変異導入遺伝子を組込んだプラスミドはプラスミドｐＵＩＴ１０６と命名され、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０６と命名されている。プラスミドｐＵＩＴ１０４、及びプラスミドｐＵＩＴ１０６に組込まれた変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号２、及び配列番号３に示す。
【００１２】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼは上記の変異導入遺伝子を組込んだプラスミドで形質転換した形質転換体、例えば Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０４、あるいは Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０６を通常の培地、例えば１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で培養することにより、その菌体内に発現させることができる。次に、得られた培養菌体に適当な精製操作を施すことによって精製された変異型ＤＮＡポリメラーゼ標品を得ることができる。こうして得られた変異型ＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同じ約１０万の分子量を示す。また、該標品について各種酵素活性を測定することにより、該変異型酵素がＤＮＡポリメラーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を保持しているが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は失っていることを確かめることができる。
【００１３】
以上のようにバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、１８４番目のグリシンを、アスパラギン酸残基に変換することにより、該酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を選択的に欠失させた変異型ＤＮＡポリメラーゼが得られることが明らかとなった。
上記のグリシン残基は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性には必須であるが、ＤＮＡポリメラーゼ活性、及び酵素タンパクの安定性に関しては重要な役割を果たしてはいない。
該変異型酵素は野生型酵素の構造を保持し、かつ望ましくない５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、遺伝子工学研究用試薬として有用である。更に、該変異型酵素をコードする遺伝子が得られたことにより該変異型酵素の遺伝子工学的生産が可能となった。
【００１４】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１ 鋳型ＤＮＡの作成
Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２１）を培養し、培養菌体よりバチルス・カルドテナクス由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＵＩ１０１を調製した。得られたプラスミドをＮｃｏＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約３．３KbのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片の末端をＤＮＡブランティングキット（宝酒造社製）を用いて平滑化し、先にＨｉｎｃII（宝酒造社製）で消化しておいたプラスミドベクターｐＴＶ１１８Ｎと混合してライゲーションを行った。ライゲーション反応液の一部を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して得られる形質転換体よりプラスミドを調製し、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５’−側がプラスミドベクター上のｌａｃプロモーター下流に位置しているものを選び、これをプラスミドｐＵＩ１０２と命名した。
次に、プラスミドｐＵＩ１０２をＮｃｏＩで部分消化し、ＤＮＡブランティングキットを用いて末端を平滑化した後、セルフライゲーション反応を行って大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３’−末端側のＮｃｏＩサイトのみが失われたものを選び、これをプラスミドｐＵＩ１０３と命名した。プラスミドｐＵＩ１０３の構築の工程を図１に示す。
変異導入の鋳型となるｄＵ（デオキシウリジン）を含む一本鎖ＤＮＡは以下のようにして調製した。プラスミドｐＵＩ１０３で大腸菌ＣＪ２３６（宝酒造社製）を形質転換し、得られた形質転換体を１５０μg/mlのアンピシリンと３０μg/mlのクロラムフェニコールを含む２×ＴＹ培地（トリプトン１６ｇ／リットル、酵母エキス１０ｇ／リットル、ＮａＣl ５ｇ／リットル、ｐＨ７．６）中で培養した。培養中の適当な時期にヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造社製）を感染させた後、更に７０μg/mlとなるようカナマイシンを添加して培養を継続し、培養終了後の培養液上清よりファージ粒子を回収した。得られたファージ粒子についてフェノール、及びフェノール−クロロホルムを用いた除タンパク処理を行い、更にエタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収し、これを変異導入実験の鋳型とした。
【００１６】
実施例２ 変異導入遺伝子の作成
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上の変異導入位置として７箇所のアミノ酸残基を選び、８種類のアミノ酸置換の導入を計画した。この変異導入に使用する８種類のオリゴヌクレオチド、Ｄ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３Ｆ、Ｇ１４８Ｄ、Ｄ１８５Ａ、Ｄ１８８Ａ、Ｇ１９２Ｄ、およびＥ１９８Ａを化学的に合成した。これらの合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号５〜１２に示す。
実施例１で得られた鋳型ＤＮＡ、及び上記の変異導入用合成オリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上へのアミノ酸置換の導入を行った。変異導入にはミュータンＫキット（宝酒造社製）を用い、キット添付の使用説明書に従って実験操作を行った。変異導入操作後に得られたプラスミドについてジデオキシ法による塩基配列の確認を行い、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上に目的のアミノ酸置換が導入されていることを確かめた。この結果、Ｄ１８５Ａ以外の合成オリゴヌクレオチドを使用したものでは目的通りのアミノ酸置換が起こった変異導入遺伝子を含むプラスミドが得られた。合成オリゴヌクレオチド、Ｄ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３Ｆ、Ｇ１４８Ｄ、Ｄ１８８Ａ、Ｇ１９２Ｄ、及びＥ１９８Ａを用いて得られた変異導入遺伝子を含むプラスミドを、それぞれｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩＴ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０５、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７と命名した。
【００１７】
実施例３ 形質転換体の培養及び粗抽出液の調製
上記の変異導入ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド、ｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩＴ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０５、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、それぞれ１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で培養した。培養液の濁度（Ａ600 ）が０．６の時に誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に１５時間培養を行った。培養液１mlより菌体を集め、５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５％スクロース溶液で洗浄した。同じ溶液に菌体を再懸濁した後、同量のリシス溶液〔５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５％スクロース、６０mMスペルミジン・一塩酸、２０mM ＮａＣｌ、１２mM ＤＴＴ〕を加え、４℃で４５分間静置した。更に５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００（Triton Ｘ−１００）２０μl を加え、３７℃で５分間静置した後、遠心分離により上清を回収し、６０℃、２０分間静置した後再度遠心分離して上清を回収し、粗抽出液とした。
【００１８】
実施例４ ＤＮＡポリメラーゼ活性測定
反応溶液として６７mMリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、６．７mM ＭｇＣｌ2 、１mM２−メルカプトエタノール、２０μg/ml 活性化ＤＮＡ、３３μM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、６０nM〔 3Ｈ〕ｄＴＴＰを用意し、この溶液１５０μｌに対して適当量の粗抽出液を加え、６０℃、５分間反応させた後、５０mMピロリン酸、１０％トリクロロ酢酸を１ml加えて反応を停止させた。氷中で５分間静置した後、反応液全量をガラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。１０％トリクロロ酢酸で数回洗浄した後、７０％エタノールで洗浄し、フィルターを乾燥させて液体シンチレーションカウンターを用いてフィルター上の放射活性を測定した。組換えプラスミド、ｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩＴ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌より得られた粗抽出液にはＤＮＡポリメラーゼ活性が確認された。
【００１９】
実施例５ 精製酵素標品の調製
上記の変異導入ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド、ｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩＴ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、それぞれ１００μg/mlのアンピシリンを含む１２５mlのＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で１５時間培養した。菌体を集めて２０mlの緩衝液Ａ〔５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２mM２−メルカプトエタノール、１０％グリセリン、４μM ＰＭＳＦ〕に懸濁した後、超音波処理を行って菌体を破砕し、遠心分離して上清を集めた。次いで６０℃、３０分間の熱処理を行った後、再度遠心分離を行って上清を集め、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析を行ったところ、プラスミドｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌より得られたものでのみ野生型ＤＮＡポリメラーゼと同じ分子量のタンパクが発現されているのが確認された。野生型ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングによる分析を行うと、上記の３種のプラスミド以外で形質転換された大腸菌由来の粗酵素液では野生型ＤＮＡポリメラーゼに比べて低分子量のタンパクにシグナルが認められており、これらの形質転換体では発現された変異型ＤＮＡポリメラーゼの安定性が低下しているために培養中、あるいは精製操作の初期段階に酵素タンパクの分解が起こっていることが示された。このため、以降の精製操作は上記の３種類の形質転換体由来の粗酵素液についてのみ実施した。
粗酵素液に３０％飽和となるよう硫安を加え、遠心分離を行って上清を集めた後、更に８０％飽和となるように硫安を加えた。遠心分離を行って集めた沈殿を緩衝液Ｂ〔５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２mM２−メルカプトエタノール、１０％グリセリン、４μM ＰＭＳＦ〕に溶かし、同緩衝液に対して透析を行った後、透析後の試料をＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）を用いたモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑカラム（ファルマシア社製）クロマトグラフィーに供した。カラムは緩衝液Ｂで平衡化しておき、０−３００mMのＮａＣｌ濃度勾配により溶出を行うとＤＮＡポリメラーゼ活性は約１７０ｍＭ ＮａＣｌに相当する画分に回収された。得られたＤＮＡポリメラーゼ活性画分を１０mMリン酸カリウム（ｐＨ６．８）、７mM２−メルカプトエタノール、５０μM ＣａＣｌ2 、１０％グリセリンで平衡化したハイドロキシルアパタイトカラム（ＫＢカラム、高研社製）にアプライした。吸着した酵素活性は１０−８００mMリン酸カリウムの濃度勾配によって溶出し、約４２０mMリン酸カリウムに相当する画分に溶出したＤＮＡポリメラーゼ活性を回収し、これを精製酵素標品とした。
このようにして３種の形質転換体より得られた精製酵素標品は、どれもＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分子量約１０万の単一のバンドを示した。
【００２０】
実施例６ ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の測定
基質としてλ−ＢｓｔＰＩ消化物（宝酒造社製）を［γ−32Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）で末端標識したものを準備した。６７mMリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、６．７mM ＭｇＣｌ2 、１mM２−メルカプトエタノールを含む溶液中に実施例５で得られた精製酵素標品と上記基質を混合し、６０℃で２、５、１０、３０分間反応させた後、エタノールを加えて基質ＤＮＡを沈殿させた。この沈殿中に存在する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定することにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解反応後にＤＮＡの末端に残存する32Ｐの量を求めた。また、野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼ、及び野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端より２８４番目のアミノ酸までの領域を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼであるＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）をそれぞれ上記酵素標品の代りに加えたものについても同様の測定を行い、これを対照とした。測定の結果を図２に示す。図中横軸は反応時間（分）を、縦軸はＤＮＡの末端に残存する放射活性（ｃｐｍ）を示す。また、図中白三角、白四角、黒四角はそれぞれプラスミドｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌より得られた精製酵素標品について得られた結果を、更に図中白丸、黒丸はそれぞれ野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼについて得られた結果を示す。図２に示されるように、プラスミドｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌より得られた精製酵素標品では野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼの約７０％の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が認められるのに対し、プラスミドｐＵＩＴ１０４、及びｐＵＩＴ１０６由来のものではＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼと同様に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が失われていることが示された。
配列表の配列番号２、及び配列番号３にそれぞれプラスミドｐＵＩＴ１０４、及びｐＵＩＴ１０６に含まれる変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
【００２１】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明により５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を失った新規変異型ＤＮＡポリメラーゼ、及び遺伝子工学的な該酵素の製造方法が提供される。該酵素は遺伝子工学研究用試薬として有用である。
【００２２】
【配列表】
【００２３】
配列番号：1
配列の長さ：877
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
【００２４】
配列番号：2
配列の長さ：2631
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列：
【００２５】
配列番号：3
配列の長さ：2631
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列：
【００２６】
配列番号：4
配列の長さ：2631
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
起源：生物名：バチルス カルドテナクス(Bacillus caldotenax)
株名：YT-G(DSM406)
配列：
【００２７】
配列番号：5
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
【００２８】
配列番号：6
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
【００２９】
配列番号：7
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
【００３０】
配列番号：8
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
【００３１】
配列番号：9
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
【００３２】
配列番号：10
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
【００３３】
配列番号：11
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
【００３４】
配列番号：12
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＵＩ１０３の構築を示す工程図である。
【図２】変異型ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、遺伝子工学用試薬として有用な５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼ、該酵素をコードする遺伝子、及び該遺伝子を用いたＤＮＡポリメラーゼの遺伝子工学的な製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
今まで遺伝子工学研究用試薬として一般に使用されているＤＮＡポリメラーゼには、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、その改変型であるクレノウ断片、Ｔ４ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ファージ由来ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス由来耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ〔タック（Taq ）ポリメラーゼ〕等がある。これらの酵素は、それらが有する性質に応じて、特定のＤＮＡの標識化やＤＮＡ塩基配列の決定などにそれぞれ利用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
一般にＤＮＡポリメラーゼはその起源によって異なった特性を有しており、その特性を生かした利用法がある。例えばバチルス・カルドテナクス（Bacillus caldotenax ）は生育至適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＤＮＡポリメラーゼは高温においても高い安定性を示すことから、遺伝子工学用研究試薬として使用されている。また、該酵素はＤＮＡポリメラーゼ活性のほか、５’→３’、及び３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有しているが、その用途のほとんどにおいて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の存在は望ましくなく、この活性を失った変異型酵素が使用されている。しかしながらこの変異型酵素は、該酵素をコードする遺伝子より５’→３’エキソヌクレアーゼ活性情報部分を欠失させることによって生産されるため、野生型の酵素とはそのタンパク質としての構造が異なっている。
本発明の目的は、野生型のＤＮＡポリメラーゼと同じ構造を保持しながら、望ましくない５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼ、及びその遺伝子と遺伝子工学的製造方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼに関する発明であって、配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配列中、１８４番目のグリシンがアスパラギン酸で置換されていることを特徴とする。
また、本発明の第２の発明は変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子に関する発明であって、該遺伝子が第１の発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードすることを特徴とし、とりわけ配列表の配列番号２で表される塩基配列を含むことを特徴とする。
また、本発明の第３の発明は変異型ＤＮＡポリメラーゼの製造方法に関する発明であって、第２の発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有させた形質転換体を培養し、該培養物から第１の発明の変異型ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする。
【０００５】
部位特異的変異導入法を用いて活性に必須のアミノ酸残基を他のものに置換することにより、酵素タンパクの全体の構造を損なうことなくその活性を欠失させることは可能と考えられる。しかしながらバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に関しては活性に必須のアミノ酸残基が確認されていないため、該方法を直接適用することはできない。本発明者らは鋭意研究の結果、該酵素のＮ−末端より１８４番目のグリシン、又は１９２番目のグリシンが５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に必須であることを見出し、更に上記のグリシンが他のアミノ酸に置換された変異型ＤＮＡポリメラーゼを作製し、本発明を完成させた。
【０００６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を具体的に説明する。
本発明に使用する菌株としてはＤＮＡポリメラーゼを生産する菌株であれば何でもよく、例としてバチルス・カルドテナクスＹＴ−Ｇ株〔ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen ）の保存菌株：ＤＳＭ４０６〕がある。
バチルス・カルドテナクス由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は既に石野らによって単離されている〔ジャーナル オブ バイオケミストリー（J. Biochem. ）、第１１３巻、第４０１〜４１０頁（１９９３）〕。また、該遺伝子を含有するプラスミドｐＵＩ１０１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１は Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１と命名、表示され、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２１として寄託されている。該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に、また該アミノ酸配列をコードするプラスミドｐＵＩ１０１中のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号４に示す。
既知の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く変異型ＤＮＡポリメラーゼとしては、野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端より２８４番目のアミノ酸までの領域を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼが知られている〔ジャーナル オブ バイオケミストリー、第１１３巻、第４０１〜４１０頁（１９９３）〕。したがって、バチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に重要なアミノ酸残基は該変異型酵素に欠失した領域に存在することが予想される。そこで、配列表の配列番号１に示した野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、アミノ酸番号１番から２８４番までの領域に存在するアミノ酸残基のあるものをそれ以外のアミノ酸残基に置換することにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を失った変異型ＤＮＡポリメラーゼを得ることが期待される。
【０００７】
タンパク質にアミノ酸置換を導入する方法としてはいくつかの部位特異的変異導入法が知られており、例えばクンケル（Kunkel,T.A. ）の方法が利用できる〔メソッズ イン エンザイモロジー（Methods in Enzymology ）、第１５４巻、第３６７〜３８９頁（１９８７）〕。該方法は合成オリゴヌクレオチドを使用してタンパク質をコードする遺伝子上に変異を導入する方法である。表１に本発明で導入を試みたアミノ酸置換とそれに用いた合成オリゴヌクレオチド、及びその塩基配列を示す。
【０００８】
【表１】
また、配列表の配列番号５〜１２にそれぞれ合成オリゴヌクレオチドＤ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３Ｆ、Ｇ１４８Ｄ、Ｄ１８５Ａ、Ｄ１８８Ａ、Ｇ１９２Ｄ、及びＥ１９８Ａの塩基配列を示す。各合成オリゴヌクレオチドの名称はそれによって導入されるアミノ酸置換を示しており、例えばＤ５９Ａは５９番目のアスパラギン酸をアラニンに置換するための合成オリゴヌクレオチドである。
【００１０】
変異導入に使用する鋳型ＤＮＡは、上記プラスミドｐＵＩ１０１に組込まれた野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を適当なベクターにサブクローニングした上、ｄＵ（デオキシウリジン）を含む一本鎖ＤＮＡを調製して作製することができる。次に該鋳型ＤＮＡと上記の合成オリゴヌクレオチドとを用いて該遺伝子上にアミノ酸置換を導入することができる。変異導入に当ってはミュータンＫキット（宝酒造社製）が使用できる。しかしながらオリゴヌクレオチドの設計によっては変異導入効率が悪く、目的の変異が得られない場合がある。また、変異が導入された場合でも、導入されたアミノ酸置換の種類によっては発現された変異型タンパク質が宿主に対して負荷となって形質転換体が得られなかったり、酵素タンパク質全体の構造が破壊されてＤＮＡポリメラーゼ活性まで失われてしまう可能性もある。
本発明に使用した合成オリゴヌクレオチドのうち、Ｄ１８５Ａを除く７つを使用した場合については変異が導入された遺伝子を得ることができる。これらの遺伝子については通常の方法、例えばジデオキシ法を用いてその塩基配列を調べ、目的とする変異が導入できたかどうかを確認することができる。
【００１１】
次に、得られた変異導入遺伝子を組込んだプラスミドで形質転換した適当な微生物を培養し、該培養物中に発現されるＤＮＡポリメラーゼ活性を調べることにより、ＤＮＡポリメラーゼ活性を発現可能な変異導入遺伝子を得ることができる。更に、ＤＮＡポリメラーゼ活性が認められたものについては酵素を精製した上で５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を調べ、目的とする変異型ＤＮＡポリメラーゼを発現する変異導入遺伝子を得ることができる。
ただし導入された変異の種類によっては発現された変異型ＤＮＡポリメラーゼの安定性が低下しているために酵素の精製が困難な場合があり、例えば合成オリゴヌクレオチドＤ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３Ｆを用いて作製された変異導入遺伝子によって発現される変異型ＤＮＡポリメラーゼについては精製酵素標品が得られない。一方、合成オリゴヌクレオチドＧ１８４Ｄ、Ｇ１９２Ｄ、Ｅ１９８Ａを用いたものでは精製された酵素標品を用いて５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を調べることができる。この結果、Ｅ１９８Ａを用いたものでは野生型酵素の約７０％の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が残存しているのに対し、Ｇ１８４Ｄ、Ｇ１９２Ｄでは活性が全く認められない。
このように、ＤＮＡポリメラーゼ活性を保持し、かつ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼを発現する２種の変異導入遺伝子を得ることができる。こうして得られた変異導入遺伝子を組込んだプラスミドのうち、合成オリゴヌクレオチドＧ１８４Ｄを用いて作製された、野生型ＤＮＡポリメラーゼの１８４番目に存在するグリシンがアスパラギン酸に置換された変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする変異導入遺伝子を組込んだプラスミドはプラスミドｐＵＩＴ１０４と命名され、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０４と命名されている。
また、合成オリゴヌクレオチドＧ１９２Ｄを用いて作製された、野生型ＤＮＡポリメラーゼの１９２番目に存在するグリシンがアスパラギン酸に置換された変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする変異導入遺伝子を組込んだプラスミドはプラスミドｐＵＩＴ１０６と命名され、該プラスミドで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０６と命名されている。プラスミドｐＵＩＴ１０４、及びプラスミドｐＵＩＴ１０６に組込まれた変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号２、及び配列番号３に示す。
【００１２】
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼは上記の変異導入遺伝子を組込んだプラスミドで形質転換した形質転換体、例えば Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０４、あるいは Escherichia coli ＪＭ１０９／ｐＵＩＴ１０６を通常の培地、例えば１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で培養することにより、その菌体内に発現させることができる。次に、得られた培養菌体に適当な精製操作を施すことによって精製された変異型ＤＮＡポリメラーゼ標品を得ることができる。こうして得られた変異型ＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、野生型ＤＮＡポリメラーゼと同じ約１０万の分子量を示す。また、該標品について各種酵素活性を測定することにより、該変異型酵素がＤＮＡポリメラーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を保持しているが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は失っていることを確かめることができる。
【００１３】
以上のようにバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中、１８４番目のグリシンを、アスパラギン酸残基に変換することにより、該酵素の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を選択的に欠失させた変異型ＤＮＡポリメラーゼが得られることが明らかとなった。
上記のグリシン残基は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性には必須であるが、ＤＮＡポリメラーゼ活性、及び酵素タンパクの安定性に関しては重要な役割を果たしてはいない。
該変異型酵素は野生型酵素の構造を保持し、かつ望ましくない５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失しており、遺伝子工学研究用試薬として有用である。更に、該変異型酵素をコードする遺伝子が得られたことにより該変異型酵素の遺伝子工学的生産が可能となった。
【００１４】
【実施例】
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１５】
実施例１ 鋳型ＤＮＡの作成
Escherichia coli ＨＢ１０１／ｐＵＩ１０１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２１）を培養し、培養菌体よりバチルス・カルドテナクス由来のＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するプラスミドｐＵＩ１０１を調製した。得られたプラスミドをＮｃｏＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、分離された約３．３KbのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片の末端をＤＮＡブランティングキット（宝酒造社製）を用いて平滑化し、先にＨｉｎｃII（宝酒造社製）で消化しておいたプラスミドベクターｐＴＶ１１８Ｎと混合してライゲーションを行った。ライゲーション反応液の一部を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換して得られる形質転換体よりプラスミドを調製し、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の５’−側がプラスミドベクター上のｌａｃプロモーター下流に位置しているものを選び、これをプラスミドｐＵＩ１０２と命名した。
次に、プラスミドｐＵＩ１０２をＮｃｏＩで部分消化し、ＤＮＡブランティングキットを用いて末端を平滑化した後、セルフライゲーション反応を行って大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の３’−末端側のＮｃｏＩサイトのみが失われたものを選び、これをプラスミドｐＵＩ１０３と命名した。プラスミドｐＵＩ１０３の構築の工程を図１に示す。
変異導入の鋳型となるｄＵ（デオキシウリジン）を含む一本鎖ＤＮＡは以下のようにして調製した。プラスミドｐＵＩ１０３で大腸菌ＣＪ２３６（宝酒造社製）を形質転換し、得られた形質転換体を１５０μg/mlのアンピシリンと３０μg/mlのクロラムフェニコールを含む２×ＴＹ培地（トリプトン１６ｇ／リットル、酵母エキス１０ｇ／リットル、ＮａＣl ５ｇ／リットル、ｐＨ７．６）中で培養した。培養中の適当な時期にヘルパーファージＭ１３ＫＯ７（宝酒造社製）を感染させた後、更に７０μg/mlとなるようカナマイシンを添加して培養を継続し、培養終了後の培養液上清よりファージ粒子を回収した。得られたファージ粒子についてフェノール、及びフェノール−クロロホルムを用いた除タンパク処理を行い、更にエタノール沈殿を行ってＤＮＡを回収し、これを変異導入実験の鋳型とした。
【００１６】
実施例２ 変異導入遺伝子の作成
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上の変異導入位置として７箇所のアミノ酸残基を選び、８種類のアミノ酸置換の導入を計画した。この変異導入に使用する８種類のオリゴヌクレオチド、Ｄ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３Ｆ、Ｇ１４８Ｄ、Ｄ１８５Ａ、Ｄ１８８Ａ、Ｇ１９２Ｄ、およびＥ１９８Ａを化学的に合成した。これらの合成オリゴヌクレオチドの塩基配列を、それぞれ配列表の配列番号５〜１２に示す。
実施例１で得られた鋳型ＤＮＡ、及び上記の変異導入用合成オリゴヌクレオチドを用いてＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上へのアミノ酸置換の導入を行った。変異導入にはミュータンＫキット（宝酒造社製）を用い、キット添付の使用説明書に従って実験操作を行った。変異導入操作後に得られたプラスミドについてジデオキシ法による塩基配列の確認を行い、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子上に目的のアミノ酸置換が導入されていることを確かめた。この結果、Ｄ１８５Ａ以外の合成オリゴヌクレオチドを使用したものでは目的通りのアミノ酸置換が起こった変異導入遺伝子を含むプラスミドが得られた。合成オリゴヌクレオチド、Ｄ５９Ａ、Ｙ７３Ａ、Ｙ７３Ｆ、Ｇ１４８Ｄ、Ｄ１８８Ａ、Ｇ１９２Ｄ、及びＥ１９８Ａを用いて得られた変異導入遺伝子を含むプラスミドを、それぞれｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩＴ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０５、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７と命名した。
【００１７】
実施例３ 形質転換体の培養及び粗抽出液の調製
上記の変異導入ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド、ｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩＴ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０５、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、それぞれ１００μg/mlのアンピシリンを含むＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で培養した。培養液の濁度（Ａ600 ）が０．６の時に誘導物質であるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、更に１５時間培養を行った。培養液１mlより菌体を集め、５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２５％スクロース溶液で洗浄した。同じ溶液に菌体を再懸濁した後、同量のリシス溶液〔５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２５％スクロース、６０mMスペルミジン・一塩酸、２０mM ＮａＣｌ、１２mM ＤＴＴ〕を加え、４℃で４５分間静置した。更に５％（ｗ／ｖ）トリトンＸ−１００（Triton Ｘ−１００）２０μl を加え、３７℃で５分間静置した後、遠心分離により上清を回収し、６０℃、２０分間静置した後再度遠心分離して上清を回収し、粗抽出液とした。
【００１８】
実施例４ ＤＮＡポリメラーゼ活性測定
反応溶液として６７mMリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、６．７mM ＭｇＣｌ2 、１mM２−メルカプトエタノール、２０μg/ml 活性化ＤＮＡ、３３μM ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、６０nM〔 3Ｈ〕ｄＴＴＰを用意し、この溶液１５０μｌに対して適当量の粗抽出液を加え、６０℃、５分間反応させた後、５０mMピロリン酸、１０％トリクロロ酢酸を１ml加えて反応を停止させた。氷中で５分間静置した後、反応液全量をガラスフィルター上に移し、吸引ろ過した。１０％トリクロロ酢酸で数回洗浄した後、７０％エタノールで洗浄し、フィルターを乾燥させて液体シンチレーションカウンターを用いてフィルター上の放射活性を測定した。組換えプラスミド、ｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩＴ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌より得られた粗抽出液にはＤＮＡポリメラーゼ活性が確認された。
【００１９】
実施例５ 精製酵素標品の調製
上記の変異導入ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む組換えプラスミド、ｐＵＩＴ１０１、ｐＵＩＴ１０２、ｐＵＩＴ１０３、ｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を、それぞれ１００μg/mlのアンピシリンを含む１２５mlのＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）中、３７℃で１５時間培養した。菌体を集めて２０mlの緩衝液Ａ〔５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、２mM２−メルカプトエタノール、１０％グリセリン、４μM ＰＭＳＦ〕に懸濁した後、超音波処理を行って菌体を破砕し、遠心分離して上清を集めた。次いで６０℃、３０分間の熱処理を行った後、再度遠心分離を行って上清を集め、これを粗酵素液とした。
この粗酵素液についてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析を行ったところ、プラスミドｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌より得られたものでのみ野生型ＤＮＡポリメラーゼと同じ分子量のタンパクが発現されているのが確認された。野生型ＤＮＡポリメラーゼに対する抗体を用いてウエスタンブロッティングによる分析を行うと、上記の３種のプラスミド以外で形質転換された大腸菌由来の粗酵素液では野生型ＤＮＡポリメラーゼに比べて低分子量のタンパクにシグナルが認められており、これらの形質転換体では発現された変異型ＤＮＡポリメラーゼの安定性が低下しているために培養中、あるいは精製操作の初期段階に酵素タンパクの分解が起こっていることが示された。このため、以降の精製操作は上記の３種類の形質転換体由来の粗酵素液についてのみ実施した。
粗酵素液に３０％飽和となるよう硫安を加え、遠心分離を行って上清を集めた後、更に８０％飽和となるように硫安を加えた。遠心分離を行って集めた沈殿を緩衝液Ｂ〔５０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２mM２−メルカプトエタノール、１０％グリセリン、４μM ＰＭＳＦ〕に溶かし、同緩衝液に対して透析を行った後、透析後の試料をＦＰＬＣシステム（ファルマシア社製）を用いたモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑカラム（ファルマシア社製）クロマトグラフィーに供した。カラムは緩衝液Ｂで平衡化しておき、０−３００mMのＮａＣｌ濃度勾配により溶出を行うとＤＮＡポリメラーゼ活性は約１７０ｍＭ ＮａＣｌに相当する画分に回収された。得られたＤＮＡポリメラーゼ活性画分を１０mMリン酸カリウム（ｐＨ６．８）、７mM２−メルカプトエタノール、５０μM ＣａＣｌ2 、１０％グリセリンで平衡化したハイドロキシルアパタイトカラム（ＫＢカラム、高研社製）にアプライした。吸着した酵素活性は１０−８００mMリン酸カリウムの濃度勾配によって溶出し、約４２０mMリン酸カリウムに相当する画分に溶出したＤＮＡポリメラーゼ活性を回収し、これを精製酵素標品とした。
このようにして３種の形質転換体より得られた精製酵素標品は、どれもＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分子量約１０万の単一のバンドを示した。
【００２０】
実施例６ ５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の測定
基質としてλ−ＢｓｔＰＩ消化物（宝酒造社製）を［γ−32Ｐ］ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造社製）で末端標識したものを準備した。６７mMリン酸カリウム（ｐＨ７．４）、６．７mM ＭｇＣｌ2 、１mM２−メルカプトエタノールを含む溶液中に実施例５で得られた精製酵素標品と上記基質を混合し、６０℃で２、５、１０、３０分間反応させた後、エタノールを加えて基質ＤＮＡを沈殿させた。この沈殿中に存在する放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定することにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による分解反応後にＤＮＡの末端に残存する32Ｐの量を求めた。また、野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼ、及び野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端より２８４番目のアミノ酸までの領域を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼであるＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）をそれぞれ上記酵素標品の代りに加えたものについても同様の測定を行い、これを対照とした。測定の結果を図２に示す。図中横軸は反応時間（分）を、縦軸はＤＮＡの末端に残存する放射活性（ｃｐｍ）を示す。また、図中白三角、白四角、黒四角はそれぞれプラスミドｐＵＩＴ１０４、ｐＵＩＴ１０６、及びｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌より得られた精製酵素標品について得られた結果を、更に図中白丸、黒丸はそれぞれ野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼについて得られた結果を示す。図２に示されるように、プラスミドｐＵＩＴ１０７で形質転換された大腸菌より得られた精製酵素標品では野生型のバチルス・カルドテナクス由来ＤＮＡポリメラーゼの約７０％の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が認められるのに対し、プラスミドｐＵＩＴ１０４、及びｐＵＩＴ１０６由来のものではＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼと同様に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性が失われていることが示された。
配列表の配列番号２、及び配列番号３にそれぞれプラスミドｐＵＩＴ１０４、及びｐＵＩＴ１０６に含まれる変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を示す。
【００２１】
【発明の効果】
以上詳細に説明したように、本発明により５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を失った新規変異型ＤＮＡポリメラーゼ、及び遺伝子工学的な該酵素の製造方法が提供される。該酵素は遺伝子工学研究用試薬として有用である。
【００２２】
【配列表】
【００２３】
配列番号：1
配列の長さ：877
配列の型：アミノ酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列：
配列番号：2
配列の長さ：2631
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列：
配列番号：3
配列の長さ：2631
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
配列：
配列番号：4
配列の長さ：2631
配列の型：核酸
鎖の数：２本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：genomic DNA
起源：生物名：バチルス カルドテナクス(Bacillus caldotenax)
株名：YT-G(DSM406)
配列：
配列番号：5
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：6
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：7
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：8
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：9
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：10
配列の長さ：21
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：11
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
配列番号：12
配列の長さ：27
配列の型：核酸
鎖の数：１本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ）
配列：
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＵＩ１０３の構築を示す工程図である。
【図２】変異型ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示す図である。
Claims (4)
- 配列番号１に示されるアミノ酸配列のうち、１８４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されていることを特徴とする５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異型ＤＮＡポリメラーゼ。
- 請求項１に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼをコードすることを特徴とする変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。
- 請求項２に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子が、配列番号２に示される塩基配列を含むことを特徴とする変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子。
- 請求項２に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有させた形質転換体を培養し、該培養物から請求項１に記載の変異型ＤＮＡポリメラーゼを採取することを特徴とする変異型ＤＮＡポリメラーゼの製造方法。
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| JP31701795A JP3688367B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | 変異型ｄｎａポリメラーゼ |
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|---|---|---|---|
| JP31701795A JP3688367B2 (ja) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | 変異型ｄｎａポリメラーゼ |
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| JPH09131181A JPH09131181A (ja) | 1997-05-20 |
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-
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- 1995-11-13 JP JP31701795A patent/JP3688367B2/ja not_active Expired - Fee Related
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