JP3149319B2 - 組換え型ｇｍｔの製造方法 - Google Patents
組換え型ｇｍｔの製造方法Info
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/10—Transferases (2.)
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ラット肝臓由来グリシ
ン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの遺伝子情報を含有
するＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクタ
ーを用いて得られる形質転換体および該形質転換体によ
り該ＤＮＡの遺伝子情報を発現して得られるラット肝臓
由来グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの製造方
法に関する。
ン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの遺伝子情報を含有
するＤＮＡを含有する組換えベクター、該組換えベクタ
ーを用いて得られる形質転換体および該形質転換体によ
り該ＤＮＡの遺伝子情報を発現して得られるラット肝臓
由来グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼの製造方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】グリシン−Ｎ−メチルトランスフェラー
ゼ（以下、ＧＭＴということもある）は、下記のような
化学反応を触媒するものであって、動物の肝臓、腎臓お
よび脾臓に主として存在することが知られている。 グリシン＋Ｓ−アデノシルメチオニン→サルコシン＋Ｓ
−アデノシルホモシステイン 本酵素を精製する試みは、ウサギ肝臓よりなされている
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７３，２４８：６９
−７２）。また、他の動物に関しては、ラット由来のも
のも記載されている。
ゼ（以下、ＧＭＴということもある）は、下記のような
化学反応を触媒するものであって、動物の肝臓、腎臓お
よび脾臓に主として存在することが知られている。 グリシン＋Ｓ−アデノシルメチオニン→サルコシン＋Ｓ
−アデノシルホモシステイン 本酵素を精製する試みは、ウサギ肝臓よりなされている
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９７３，２４８：６９
−７２）。また、他の動物に関しては、ラット由来のも
のも記載されている。
【０００３】さらには、グリシン−Ｎ−メチルトランス
フェラーゼは、その化学触媒反応を利用してグリシンの
定量に用いることができる。またグリシンを生じる反応
系と共役することにより、各種酵素活性の測定など研究
用試薬、臨床診断用試薬として極めて有効である。
フェラーゼは、その化学触媒反応を利用してグリシンの
定量に用いることができる。またグリシンを生じる反応
系と共役することにより、各種酵素活性の測定など研究
用試薬、臨床診断用試薬として極めて有効である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来より報告されてい
るグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、動物臓
器より精製されるものであるが、臓器あたりの酵素含量
が低く、大量に入手することは困難であるため製造コス
トが高価になる。
るグリシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼは、動物臓
器より精製されるものであるが、臓器あたりの酵素含量
が低く、大量に入手することは困難であるため製造コス
トが高価になる。
【０００５】グリシンの定量、もしくはグリシンを生じ
る化学触媒反応と共役した各種酵素活性と、一緒に本酵
素を用いる場合には、グリシンに対する反応性が高いこ
とが要求される。この点については、ラット肝臓のグリ
シン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼがウサギのものに
比べて、そのＫｍ値が１／１０であることが報告されて
いる。ラット肝臓のグリシン−Ｎ−メチルトランスフェ
ラーゼ活性は、ウサギに比して低いので、産業的に利用
できるだけの酵素量を提供することは非常に困難であっ
た。
る化学触媒反応と共役した各種酵素活性と、一緒に本酵
素を用いる場合には、グリシンに対する反応性が高いこ
とが要求される。この点については、ラット肝臓のグリ
シン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼがウサギのものに
比べて、そのＫｍ値が１／１０であることが報告されて
いる。ラット肝臓のグリシン−Ｎ−メチルトランスフェ
ラーゼ活性は、ウサギに比して低いので、産業的に利用
できるだけの酵素量を提供することは非常に困難であっ
た。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、高純度ＧＭＴ
を効率的にまた安価に工業生産する方法を開発する目的
でなされたものである。
を効率的にまた安価に工業生産する方法を開発する目的
でなされたものである。
【０００７】本発明者らは、上記目的を達成するために
各方面から検討の結果、動物臓器からの抽出法には自ず
から限度があると判断した。本発明者らは、組換えＤＮ
Ａ技術に着目し、組換えＤＮＡ技術によるＧＭＴの大量
生産法を確立することとした。
各方面から検討の結果、動物臓器からの抽出法には自ず
から限度があると判断した。本発明者らは、組換えＤＮ
Ａ技術に着目し、組換えＤＮＡ技術によるＧＭＴの大量
生産法を確立することとした。
【０００８】この目的達成のため、本発明者らは、ま
ず、ラット肝臓由来のＧＭＴ ｃＤＮＡのクローニング
を試みた。次に、発現性にすぐれた組換えベクターを作
成した。このｃＤＮＡを持つ発現ベクターを大腸菌に入
れた。本発明者らは、形質転換体が本ＧＭＴを大量に
（菌体の１０％程度）発現することを確認したので、大
量生産への道が開けた。
ず、ラット肝臓由来のＧＭＴ ｃＤＮＡのクローニング
を試みた。次に、発現性にすぐれた組換えベクターを作
成した。このｃＤＮＡを持つ発現ベクターを大腸菌に入
れた。本発明者らは、形質転換体が本ＧＭＴを大量に
（菌体の１０％程度）発現することを確認したので、大
量生産への道が開けた。
【０００９】以下、本発明について具体的に詳述する。
【００１０】（１）発現ベクターの作成 ｉ）ラットＧＭＴ ｃＤＮＡのクローニング ラット肝ＧＭＴをウサギに免疫して得られた抗体を用い
て、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製ラット肝ｃＤＮＡライブラリ
ー（λｇｔ １１）を常法通りスクリーニングした。得
られた陽性クローンのｃＤＮＡをプラスミドに移した
後、サンガー法によって塩基配列を決定した（図１）。
また、そのアミノ酸配列は図２に示した。このｒＧＭＴ
ｃＤＮＡの翻訳開始コドンから終止コドンまでのラッ
トＧＭＴ遺伝子の塩基配列を、下記の表１、表２、表３
に示される配列表の配列番号１に示す。
て、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製ラット肝ｃＤＮＡライブラリ
ー（λｇｔ １１）を常法通りスクリーニングした。得
られた陽性クローンのｃＤＮＡをプラスミドに移した
後、サンガー法によって塩基配列を決定した（図１）。
また、そのアミノ酸配列は図２に示した。このｒＧＭＴ
ｃＤＮＡの翻訳開始コドンから終止コドンまでのラッ
トＧＭＴ遺伝子の塩基配列を、下記の表１、表２、表３
に示される配列表の配列番号１に示す。
【００１１】
【表１】
【００１２】
【表２】
【００１３】
【表３】
【００１４】ii）発現ベクターの作成 クローニング用ベクターとして、プラスミドｐＣＷ（例
えば、Ｍｕｃｈｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７７，４４−７３
（１９８９）： Ｇｅｇｎｅｒ ａｎｄ Ｄａｈｌｑｕ
ｉｓｔ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ，８８，７５０−７５４（１９９１）に記載した
方法にしたがって作成した。その制限酵素切断地図を図
３に示す。）を用い、ｒＧＭＴ ｃＤＮＡをプラスミド
ｐＣＷに挿入して発現ベクターｐＣＷ−ＧＭＴを、次の
ようにして作成した。
えば、Ｍｕｃｈｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１７７，４４−７３
（１９８９）： Ｇｅｇｎｅｒ ａｎｄ Ｄａｈｌｑｕ
ｉｓｔ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，
ＵＳＡ，８８，７５０−７５４（１９９１）に記載した
方法にしたがって作成した。その制限酵素切断地図を図
３に示す。）を用い、ｒＧＭＴ ｃＤＮＡをプラスミド
ｐＣＷに挿入して発現ベクターｐＣＷ−ＧＭＴを、次の
ようにして作成した。
【００１５】すなわち、プラスミドｐＣＷのマルチクロ
ーニングサイトをＮｄｅＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗでｆ
ｉｌｌ−ｉｎし、次にＨｉｎｄIIIで消化する。次に、
ｒＧＭＴ ｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧの一部から
の配列（５’ＴＧＧＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＴＴＡＣＣＧ
（Ｔ／Ｇ）ＡＣＣＣＧＣ）を合成した。なお、翻訳効率
を高めるために、天然型の残基を一部Ｔ（アンダーライ
ンしてある）に代えた（アミノ酸配列は変化しない）。
ーニングサイトをＮｄｅＩで消化し、Ｋｌｅｎｏｗでｆ
ｉｌｌ−ｉｎし、次にＨｉｎｄIIIで消化する。次に、
ｒＧＭＴ ｃＤＮＡの翻訳開始コドンＡＴＧの一部から
の配列（５’ＴＧＧＴＴＧＡＴＡＧＴＧＴＴＴＡＣＣＧ
（Ｔ／Ｇ）ＡＣＣＣＧＣ）を合成した。なお、翻訳効率
を高めるために、天然型の残基を一部Ｔ（アンダーライ
ンしてある）に代えた（アミノ酸配列は変化しない）。
【００１６】また終止コドンの下流の配列の一部に、Ｈ
ｉｎｄIII（ＡＡＧＣＴＴ）配列を含むように、配列
（５’ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＧＧＧＡＧＣＣ
Ｇ）を合成した。これらの配列をプライマーとし、ｃＤ
ＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェ
ーン反応）を行った。
ｉｎｄIII（ＡＡＧＣＴＴ）配列を含むように、配列
（５’ＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＡＧＧＧＴＧＧＧＡＧＣＣ
Ｇ）を合成した。これらの配列をプライマーとし、ｃＤ
ＮＡをテンプレートとして、ＰＣＲ（ポリメラーゼチェ
ーン反応）を行った。
【００１７】得られた断片をＨｉｎｄIII処理して、プ
ラスミドベクターｐＣＷに挿入して、発現ベクターであ
る組換えベクターｐＣＷ−ＧＭＴを得た。
ラスミドベクターｐＣＷに挿入して、発現ベクターであ
る組換えベクターｐＣＷ−ＧＭＴを得た。
【００１８】（２）形質転換体の作成及び寄託 組換えＤＮＡの宿主微生物への導入は常法により行い、
宿主微生物が大腸菌の場合は、例えば、一般的には、塩
化ルビジウム法が用いられ、またカルシウム法（Ｌｅｄ
ｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１１９，１０７２（１９７４））なども利用
することができ、エシェリヒア・コリＫ−１２に属する
エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９を宿主とし、これに発
現ベクターｐＣＷ−ＧＭＴを導入して形質転換を行っ
た。
宿主微生物が大腸菌の場合は、例えば、一般的には、塩
化ルビジウム法が用いられ、またカルシウム法（Ｌｅｄ
ｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ；Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．，１１９，１０７２（１９７４））なども利用
することができ、エシェリヒア・コリＫ−１２に属する
エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９を宿主とし、これに発
現ベクターｐＣＷ−ＧＭＴを導入して形質転換を行っ
た。
【００１９】組換えプラスミドｐＣＷ−ＧＭＴが導入さ
れた宿主微生物（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）は、きわ
めて高いＧＭＴ活性を示した。このようにして得た形質
転換株は、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＣＷ−
ＧＭＴ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０
９／ｐＣＷ−ＧＭＴ）と命名し、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４４３５として寄託し
た。
れた宿主微生物（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）は、きわ
めて高いＧＭＴ活性を示した。このようにして得た形質
転換株は、エシェリヒア・コリ ＪＭ１０９／ｐＣＷ−
ＧＭＴ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０
９／ｐＣＷ−ＧＭＴ）と命名し、工業技術院生命工学工
業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１４４３５として寄託し
た。
【００２０】（３）形質転換体の培養 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＣＷ−ＧＭＴ（ＦＥＲＭ
Ｐ−１４４３５）を、２ＹＴ培地（ポリペプトン１６
ｇ、イーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ、アンピシリン５
０ｍｇ、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｒ
ａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ） ２３８ｍ
ｇ／１リットル）を用いて以下の培養条件で培養した。
Ｐ−１４４３５）を、２ＹＴ培地（ポリペプトン１６
ｇ、イーストエキス１０ｇ、食塩５ｇ、アンピシリン５
０ｍｇ、Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｒ
ａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ） ２３８ｍ
ｇ／１リットル）を用いて以下の培養条件で培養した。
【００２１】（培養条件） ｉ）坂口フラスコ（２リットル容）に培地５００ｍｌで
培養（但し、アンピシリンはオートクレーブで処理する
と分解するため、培養直前に添加した。また、ＩＰＴＧ
は大腸菌増殖期に添加した。） ii）培養温度：３５〜３９℃、好適温度３７℃ iii)攪拌速度：レシプロ振とう機で８０〜１２０回／
分、好適値９５回／分（通気条件は高い方が好ましく、
９５回／分以上で良い成績が得られた。） iv）培養時間：１０〜２４時間、好ましくは１５〜１８
時間
培養（但し、アンピシリンはオートクレーブで処理する
と分解するため、培養直前に添加した。また、ＩＰＴＧ
は大腸菌増殖期に添加した。） ii）培養温度：３５〜３９℃、好適温度３７℃ iii)攪拌速度：レシプロ振とう機で８０〜１２０回／
分、好適値９５回／分（通気条件は高い方が好ましく、
９５回／分以上で良い成績が得られた。） iv）培養時間：１０〜２４時間、好ましくは１５〜１８
時間
【００２２】先ず、本菌を２ＹＴ培地で３７℃、一晩培
養した後、培養液を同培地５００ｍｌ収容の２本の坂口
フラスコに１／１００量を注ぎ、本培養を開始した。Ａ
600値が０．２以上に達したところで、ＩＰＴＧを最終
濃度１ｍＭになるように添加し、３７℃、１夜振とう培
養を行った。
養した後、培養液を同培地５００ｍｌ収容の２本の坂口
フラスコに１／１００量を注ぎ、本培養を開始した。Ａ
600値が０．２以上に達したところで、ＩＰＴＧを最終
濃度１ｍＭになるように添加し、３７℃、１夜振とう培
養を行った。
【００２３】（４）ＧＭＴの回収及び精製 培養終了後、培養液を９，０００ｒｐｍで７分間遠心分
離して集菌した。菌体を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）／２ｍＭ ＥＤＴＡ／１０ｍＭメルカプ
トエタノール液５０ｍｌに懸濁した後、リゾチーム（１
ｍｇ／ｍｌ）を添加して、氷上で時々攪拌しながら３０
分間保持した。次いで、−８０℃に３０分間凍結保持し
た。（なお、−８０℃で長期間保存しておき、必要なと
きに更に以下の処理を行うことが可能である。）
離して集菌した。菌体を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．５）／２ｍＭ ＥＤＴＡ／１０ｍＭメルカプ
トエタノール液５０ｍｌに懸濁した後、リゾチーム（１
ｍｇ／ｍｌ）を添加して、氷上で時々攪拌しながら３０
分間保持した。次いで、−８０℃に３０分間凍結保持し
た。（なお、−８０℃で長期間保存しておき、必要なと
きに更に以下の処理を行うことが可能である。）
【００２４】凍結菌体を流水を用いて融解した後、超音
波処理して菌を破壊し、次いで、１０，０００ｒｐｍで
３０分間遠心分離した。
波処理して菌を破壊し、次いで、１０，０００ｒｐｍで
３０分間遠心分離した。
【００２５】得られた上清を、ＤＥＡＥセルロースカラ
ム（ＤＥ ５２，ワットマン社製：径２２ｍｍ、高さ１
０ｃｍ、ベッドボリューム３５ｍｌ）に通液した。な
お、平衡化及び流出バッファーとしては、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１
０ｍＭメルカプトエタノール／５０ｍＭ ＮａＣｌを用
い、Ａ280の吸収が約０．５になるまで流した。この条
件下では、ＧＭＴは樹脂に吸着されない。
ム（ＤＥ ５２，ワットマン社製：径２２ｍｍ、高さ１
０ｃｍ、ベッドボリューム３５ｍｌ）に通液した。な
お、平衡化及び流出バッファーとしては、１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡ／１
０ｍＭメルカプトエタノール／５０ｍＭ ＮａＣｌを用
い、Ａ280の吸収が約０．５になるまで流した。この条
件下では、ＧＭＴは樹脂に吸着されない。
【００２６】上記流出液（約１５０ｍｌ）１００ｍｌ当
り２１ｇの硫安を加え、３０分間以上氷上に保持した
後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。得ら
れた上清に１００ｍｌ当り１０ｇの硫安を加え、３０分
間以上氷上に保持した後、１０，０００ｒｐｍで３０分
間遠心分離した。
り２１ｇの硫安を加え、３０分間以上氷上に保持した
後、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。得ら
れた上清に１００ｍｌ当り１０ｇの硫安を加え、３０分
間以上氷上に保持した後、１０，０００ｒｐｍで３０分
間遠心分離した。
【００２７】得られた沈殿を２ｍｌのバッファーＡ（１
０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）／１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ／１０ｍＭメルカプトエタノール／５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ）に溶解し、セファクリルＳ−３００（径３２ｍｍ
×９８０ｍｍ；バッファーＡにて平衡化）にかけた。
０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）／１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ／１０ｍＭメルカプトエタノール／５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ）に溶解し、セファクリルＳ−３００（径３２ｍｍ
×９８０ｍｍ；バッファーＡにて平衡化）にかけた。
【００２８】活性画分を硫安濃縮（３０ｇ／１００ｍ
ｌ）した。遠心分離後、沈殿を少量のバッファーＡに溶
かし、透析膜としてヴィスキングチューブを用いて、１
０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）／１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／１０ｍＭメルカプトエタノールで、４℃、一夜透析
した。次いで、上記バッファーで平衡化したＤＥＡＥ−
セルロースカラムを素通りさせた。活性のある画分をコ
ロジオンバック（限外ろ過）又は硫安濃縮して、４０〜
８０ｍｇ／ｌ培養液のＧＭＴを得た（本標品は、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動でシングルバンドであっ
た）。本ＧＭＴは、サブユニット分子量が約３２，６０
０で、ラット肝由来のものとほとんど同じであるが、Ｎ
−末端Ｖａｌはブロックされていなかった。また、組換
え体ＧＭＴは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加す
ることで安定化される。
ｌ）した。遠心分離後、沈殿を少量のバッファーＡに溶
かし、透析膜としてヴィスキングチューブを用いて、１
０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．２）／１ｍＭ ＥＤＴ
Ａ／１０ｍＭメルカプトエタノールで、４℃、一夜透析
した。次いで、上記バッファーで平衡化したＤＥＡＥ−
セルロースカラムを素通りさせた。活性のある画分をコ
ロジオンバック（限外ろ過）又は硫安濃縮して、４０〜
８０ｍｇ／ｌ培養液のＧＭＴを得た（本標品は、ＳＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動でシングルバンドであっ
た）。本ＧＭＴは、サブユニット分子量が約３２，６０
０で、ラット肝由来のものとほとんど同じであるが、Ｎ
−末端Ｖａｌはブロックされていなかった。また、組換
え体ＧＭＴは、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を添加す
ることで安定化される。
【００２９】（５）活性測定 活性測定は、下記表４に示す測定原理に従い、分光光度
計により、Ａ265の吸収の減少を測定した。反応液は、
２ｍｌ当り、ＡｄｏＭｅｔ ０．１ｍＭ、Ｇｌｙ １０
ｍＭ、リン酸カリウム（ｐＨ７．４）５０ｍＭ、ＡＤＡ
（アデノシンデアミナーゼ：シグマ社より購入）、Ａｄ
ｏＨＣｙ（Ｓ−アデノシルホモシステイン）ヒドロラー
ゼ（本発明者らにより精製）を含む。測定温度は、２５
−３５℃で行う。
計により、Ａ265の吸収の減少を測定した。反応液は、
２ｍｌ当り、ＡｄｏＭｅｔ ０．１ｍＭ、Ｇｌｙ １０
ｍＭ、リン酸カリウム（ｐＨ７．４）５０ｍＭ、ＡＤＡ
（アデノシンデアミナーゼ：シグマ社より購入）、Ａｄ
ｏＨＣｙ（Ｓ−アデノシルホモシステイン）ヒドロラー
ゼ（本発明者らにより精製）を含む。測定温度は、２５
−３５℃で行う。
【００３０】
【表４】
【００３１】
【発明の効果】本発明によって、ラット肝由来のＧＭＴ
の遺伝子を用いて、これを実際に発現させるのに成功
し、大量にＧＭＴを製造することがはじめて可能となっ
た。したがって本発明によれば、新規形質転換体を培養
することによって、通常の発酵生産と同様にして大量の
ＧＭＴを製造することがはじめて可能となった。しか
も、従来の抽出法に比して、収率が高いだけでなく、臓
器に由来する夾雑物が少ないため、純度の高いＧＭＴが
得られる。
の遺伝子を用いて、これを実際に発現させるのに成功
し、大量にＧＭＴを製造することがはじめて可能となっ
た。したがって本発明によれば、新規形質転換体を培養
することによって、通常の発酵生産と同様にして大量の
ＧＭＴを製造することがはじめて可能となった。しか
も、従来の抽出法に比して、収率が高いだけでなく、臓
器に由来する夾雑物が少ないため、純度の高いＧＭＴが
得られる。
【００３２】本ＧＭＴは、純度が高く、高活性を有する
うえ、工業生産することが可能であるので、各種酵素活
性の測定など研究用試薬及び臨床診断用試薬等として極
めて有効である。
うえ、工業生産することが可能であるので、各種酵素活
性の測定など研究用試薬及び臨床診断用試薬等として極
めて有効である。
【図１】ラット肝由来ＧＭＴのｃＤＮＡの塩基配列を示
す。
す。
【図２】ラット肝由来ＧＭＴのアミノ酸配列を示す。
【図３】ｐＣＷの制限酵素切断地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１で表わされる塩基配
列を有するＧＭＴ（グリシン−Ｎ−メチルトランスフェ
ラーゼ）遺伝子のｃＤＮＡをテンプレートとし、 配列：TGGTTGATAGTGTTTACCG(T/G)ACCCGC 及び 配列：CGATAAGCTTAGGGTGGGAGCCG をプライマーとしてＰＣＲ（ポリメラーゼチェーン反
応）を行い、得られたＤＮＡ断片をＨｉｎｄIII処理し
て、あらかじめＨｉｎｄIII消化しておいたプラスミド
に挿入してなる、 ＧＭＴ遺伝子含有組換えベクター。 - 【請求項２】 該プラスミドがプラスミドｐＣＷである
こと、を特徴とする請求項１に記載のベクター。 - 【請求項３】 請求項１又は請求項２に記載のベクター
を宿主微生物に導入してなる形質転換体。 - 【請求項４】 宿主微生物がエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴とする
請求項３に記載の形質転換体。 - 【請求項５】 形質転換体がエシェリヒア・コリ ＪＭ
１０９／ｐＣＷ−ＧＭＴ（ＦＥＲＭ Ｐ−１４４３５）
であることを特徴とする請求項４に記載の形質転換体。 - 【請求項６】 請求項３〜請求項５のいずれか１項に記
載の形質転換体を培養することによりＧＭＴを生産させ
ることを特徴とする組換え型ＧＭＴの製造方法。
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