JPH0642832B2 - カルモジュリンの製造 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、カルモジュリンの遺伝子組換えによる製造技
術に関する。具体的には、改良したラットカルモジュリ
ンｃＤＮＡ、該ＤＮＡで形質転換された大腸菌及びこれ
らを用いるカルモジュリンの製造法に関する。

従来技術 カルモジュリンは、真核細胞に広く分布しているカルシ
ウム結合蛋白質である。カルシウムと結合したカルモジ
ュリンは、様々な不活性状態の酵素と結合して、その酵
素を活性化する。活性化される酵素としてアデニル酸シ
クラーゼ、ホスホリラーゼｂキナーゼ、グリコーゲンシ
ンターゼ、トリプトファンやチロシンの水酸化酵素、細
胞膜のＣａ²⁺，Ｍｇ²⁺−ＡＴＰアーゼ、ＮＡＤキナー
ゼ、ホスホリパーゼ、平滑筋ミオシン軽鎖キナーゼなど
が知られている。

カルモジュリンのアミノ酸配列は公知である。すなわ
ち、ヒト、ブタ、ラットおよびウシ由来のカルモジュリ
ンは同一のアミノ酸配列を持つことが知られていて、こ
れらはいずれも１４８個のアミノ酸からなる分子量約１
６，０００の蛋白質ある。ラットカルモジュリンｃＤＮ
Ａは既に取得されている（H.NojimaおよびH.Sokabe:J.M
ol.Biol.193,p.439-445,1987）。ニワトリカルモジュリ
ンｃＤＮＡを用いたカルモジュリンの生産（A.R.Means
ら：J.Biol.Chem.260,p.4704-4712,1985）及び化学合成
されたカルモジュリン遺伝子の大腸菌における発現（D.
Martin Wattersonら：Biochemistry 24,P.5090-5098,19
85）については既に報告がある。

発明の概要 発明が解決しようとする問題点 カルモジュリンを製造する方法として、ほ乳類のカルモ
ジュリンの場合、通常臓器からの抽出、精製法が用いら
れている。一例としてウシ脳の場合、２kg当たり３５０
mgのカルモジュリンが得られた（M.Yazawa,M.Sakuma及
びK.Yagi：J.Biochem.,87,p.1313,1980）（S.Kakiuchi,
K.Sobue：続生化学実験講座 6,p.415-419,1986,東京化
学同人）。しかし精製の際に、脳血管および血液成分の
除去ならびに新鮮な脳の使用を怠ると、カルモジュリン
様の夾雑蛋白質の除去が困難になるなど操作が繁雑であ
る。故に精製度が高く、効率的なカルモジュリンの製造
には遺伝子組み換えによる方法がより優れていると言え
る。ニワトリカルモジュリンｃＤＮＡを用いた大腸菌に
よる生産に関して培地１０当たり３０mg−４０mg製造
する方法が報告されているが（A.R.Meansら：J.Biol.Ch
em.260,p.4704-4712,1985）、効率的な生産ではない。
化学合成されたカルモジュリン遺伝子の大腸菌による発
現が試みられたことは前記したところであるが、これに
関しても効率的な生産ではないと言える（D.Martin Wat
tersonら：Biochem.24,p.5090-5098,1985）。

このため、遺伝子組換え技術によるカルモジュリン活性
を有するポリペプチドないし蛋白質のより効率的な製造
技術を確立することが望まれていた。

発明の要旨 本発明は、上記の問題点を解決することを目的とし、こ
の目的を、カルモジュリン活性を有するポリペプチドな
いし蛋白質を大腸菌で効率よく製造するための手段を提
供することにより達成したものである。すなわち本発明
は、 (1)第１図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を提供するも
のである。

また、本発明は、 (2)第１図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖をその遺伝情
報が発現可能な状態で含むプラスミドによって形質転換
された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を提供するものである。

更にまた、本発明は、 (3)第１図に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖を用意し、こ
のＤＮＡ鎖を、その遺伝情報が発現可能な状態で含むプ
ラスミドの作成、このプラスミドによる大腸菌（Ｅ．ｃ
ｏｌｉ）の形質転換および得られる形質転換体の培養か
ら成る工程に付して培養物中にカルモジュリンを産生さ
せることを特徴とするカルモジュリンの製造法を提供す
るものである。

発明の具体的説明 本発明のＤＮＡ鎖 本発明のＤＮＡ鎖は第１図に示す塩基配列を含むもので
ある。本発明のＤＮＡ鎖が「第１図に示す塩基配列を含
む」ということは、その上流側および（または）下流側
（あるいは場合によっては鎖中）に、合目的的な任意の
塩基配列が鎖員として存在していてもよいことを意味す
るものである（詳細下記）。また、従って、このように
定義される本発明のＤＮＡ鎖は、第１図の塩基配列から
なる鎖長の鎖長の鎖状体の外に、環状体（ないしプラス
ミド）の形態であってもよい。特に環状体ないしプラス
ミドの形態は、本発明ＤＮＡを大腸菌内で発現させてカ
ルモジュリンを産生させるときの形態である。

第１図に示す塩基配列は公知のカルモジュリンのアミノ
酸配列のＮ末にＭｅｔを付加したポリペプチドをコード
するものであるが、大腸菌で高発現させるために、５′
末端の塩基配列を大腸菌の各種遺伝子の翻訳開始部位に
共通な塩基配列に近づけ、更に、大腸菌において優先的
に用いられているコドンをＭｅｔを含むＮ末１４個のア
ミノ酸に関してなるべく使用して（第３図中Ａから
Ｂ）、本発明者らが設計したものである。

尚、大腸菌各種遺伝子の翻訳開始部位に共通な塩基配列
はSchererによって報告されており（Schererら、Nucl.A
cids.Res.8p,3895-3905,1980）、また、大腸菌において
優先的に用いられているコドンは池村によって報告され
ている（池村、Jpn.J.Genet.56,p.533-555,1981）。

本発明のＤＮＡ鎖は、これを適当なベクターに結合させ
て大腸菌に導入して高発現させるためのものであるが、
このＤＮＡ鎖の高発現を実現させるためには、前記の塩
基配列の５′の末端上流側にＳＤ配列を含む下記の塩基
配列 ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＴ ＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＴＡＡ （Schererら、Nucl.Acids Res.8,p.3895-3905,1980）を
有することが好ましい。尚、この塩基配列は大腸菌の各
種遺伝子の翻訳開始部位において使用頻度の高いもので
ある。また、本発明のＤＮＡ鎖は、第１図に示す塩基配
列の３′末端に接して停止コドンを少なくとも１個（例
えばＴＧＡ）をもつものが好ましい。更にこのような遺
伝子組換操作を容易にするために適当な制限酵素部位を
付加しておくことが好ましい。

従って、本発明の好ましいＤＮＡ鎖は、第５図中Ａから
Ｂに示した塩基配列のものである。

本発明のＤＮＡ鎖の製造 本発明のＤＮＡ鎖の製造方法の一例は、下記に示す通り
である。

(1)大腸菌ＳＤ配列とＭｅｔを含んだカルモジュリンＮ
末１４個のアミノ酸をコードするＤＮＡ塩基配列、及び
発現ベクターへの挿入が出来るように数種類の制限酵素
部位を含んだ８１塩基対のオリゴヌクレオチドを、クロ
ーニングプラスミドｐＵＣ１９（C.Yanisch-Perronら：
Gene 33,p.103-119,1985）に挿入連結する。第２図の
(ハ)は、この８１塩基対のオリゴヌクレオチドの塩基配
列と制限酵素部位を示すものである。尚、このオリゴヌ
クレオチドは第２図中(イ)および(ロ)で示されるオリゴヌ
クレオチドをそれぞれ合成し、次いでこれらを会合させ
ることにより得られる。

具体的には、上記のオリゴヌクレオチドはいずれも既知
の合成法によって合成することができる（例えば、ホス
ホアミダイト法により固相合成法（Beaucageら：Tetrah
edron Letters 22,p.1859-1862,1981））。また、この
合成法に基づく自動合成機を使用することも可能であ
る。各オリゴヌクレオチドを会合した後５′末端を必要
に応じてポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化した後、
ＤＮＡリガーゼによってｐＵＣ１９のＨｉｎｄIII及び
ＢａｍＨＩによる切断片に連結して、第２図(ハ)に示す
ＤＮＡ塩基配列を含むプラスミドｐＣＡＬＮ１を得る。
このプラスミドｐＣＡＬＮ１で大腸菌ＪＭ１０９を形質
転換する。次いで、ｐＣＡＬＮ１を単離し、ダイデオキ
シ法によって塩基配列を確認する。

(2)ラットカルモジュリンｃＤＮＡを含むプラスミドｐ
ＲＣＭ１（H.Nojima及びH.Sokabe：J.Mol.Biol.193,p.4
39-445,1987）をＨｉｎｄIII及びＸｂａＩにて切断する
ことによって、翻訳領域の５′末端の一部を欠損したラ
ットカルモジュリンｃＤＮＡを得る。得られたｃＤＮＡ
をプラスミドｐＣＡＬＮ１のＨｉｎｄIII及びＸｂａＩ
による大切断片に挿入して連結し、ｐＯＣＡＬ７を得、
これで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換する。次いで、ｐＯ
ＣＡＬ７を単離し、ダイデオキシ法によって塩基配列を
確認する。このようにして得られるｐＯＣＡＬ７をＡｆ
１II及びＢａｍＨＩにて消化することにより、第１図に
示す塩基配列、ＳＤ配列及び停止コドンを含む本発明の
ＤＮＡ鎖（第５図中ＡからＢ）を得ることができる。

形質転換体の作成 上記のようにして調製される本発明ＤＮＡ鎖は、カルモ
ジュリン蛋白をつくるための遺伝情報を含んでいるの
で、これを含むプラスミドを生物工学的手法によって大
腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に導入して形質転換し、得られる
形質転換体を培養することにより、カルモジュリン蛋白
をつくらせることができる。

形質転換体の作成（およびそれによるカルモジュリンの
生産）のための手順ないし方法そのものは、分子生物
学、生物工学ないし遺伝子工学の分野において慣用され
ているものでありうるので、本発明においては、下記し
たこと意外についてはこれら慣用技術に準じて実施すれ
ばよい。大腸菌中で本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を発現させ
るためには、まず大腸菌中で安定に存在するプラスミド
ベクター中にこの遺伝子をつなぎかえる必要がある。こ
のプラスミドベクターとしては、ｐＢＲ３２２等合目的
的な任意のものを用いることができる。

一方、本発明ＤＮＡ鎖の遺伝子を大腸菌で発現させるた
めには、そのＤＮＡをｍＲＮＡへ転写させる必要があ
る。そのためには、転写のためのシグナルであるプロモ
ーターを本発明ＤＮＡ鎖の５′側上流に組込めばよい。
このプロモーターについてはすでにｔｒｐ、ｌａｃ，Ｐ
Ｌ、ＯｍｐＦ等種々知られており、本発明においてこれ
らのいずれも利用することができる。

また、転写を終結させるためのターミネーターを本発明
のＤＮＡ鎖の３′側下流に組込むことが好ましい。ター
ミネーターを挿入することにより、プラスミドの安定性
を高めることができる。ターミネーターとしては、ｔｒ
ｐａ、ｒｒｎｃ、ｔｏｏｐ等を用いることができる。

また、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させる段階では、蛋白合成
の場であるリボソームが翻訳開始部位の先端に結合する
ために必要な配列（ＳＤ配列と呼ばれる）を、蛋白合成
の開始信号であるＡＴＧの前につける必要がある。更に
効率的に発現させる為には、このＳＤ配列並びにこのＳ
Ｄ配列と蛋白合成の開始信号であるＡＴＧとの間の塩基
配列を、大腸菌における翻訳開始部位に共通な塩基配列
に近づけることが好ましい。例えば、この配列を下記の
塩基配列とすることが好ましい。

ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＴ ＡＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＴＡＡ 尚、前記「本発明のＤＮＡ鎖の製造」において示した方
法によって調製される本発明のＤＮＡ鎖（第５図中Ａか
らＢ）は、この塩基配列及び停止コドンＴＧＡを含む好
ましいものである。

このようにしてつくったプラスミドによる大腸菌の形質
転換は、遺伝子工学ないし生物工学の分野で慣用されて
いる合目的的な任意の方法によって行なうことができ
る。その一般的な事項については適当な成書または総
説、例えばManiatisら、「Molecular Cloning-A Labora
tory Manual」 Cold Spring Harbor Laboratory(1982)
を参照すればよい。

形質転換体は、本発明ＤＮＡ鎖によって導入された遺伝
情報による新しい形質（すなわちカルモジュリンの生産
能）および使用ベクター由来の形質、ならびに場合によ
っては生じているかも知れない遺伝子組換時の使用ベク
ターからの一部の遺伝情報の欠落を除けば、そのゼノタ
イプないしフェノタイプあるいは菌学的性質に関しては
使用大腸菌と同じである。

カルモジュリンの生産 上記のようにして得られる形質転換体のクローンは、こ
れを培養すれば培養物の菌体中にカルモジュリン蛋白を
生産する。

形質転換体の培養ないし増殖条件は、使用大腸菌に対す
るそれと本質的には変らない。また、培養物すなわち菌
体および（または）培養液からの生産蛋白の回収も合目
的的な任意の方法（例えば、後記実施例５記載の方法）
に従って行なうことができる。カルモジュリンは大腸菌
中に生産されるので、菌体破砕後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（pH８．０）緩衝液などを用いてカルモジュリン活性を
有する蛋白質を抽出し、常法に従って精製することが好
ましい。

実施例 以下、本発明を実施例でもって更に詳しく説明する。

実施例１：オリゴヌクレオチドの合成及びクローニング
ベクターへの挿入 第２図(イ)及び(ロ)に示す２本のオリゴヌクレオチドは、
ホスホアミダイト法（Beaucageら：Tetrahedron Letter
s 22,p.1859-1862,1981）を用いたＤＮＡ自動合成機
（アプライドバイオシステムズ社製３８０Ａ型、M.Hunk
apillerら：Nature 310,p.105-111,1984）を使用して合
成した。

合成終了後、濃アンモニア水で６０℃で５時間処理し
て、塩基の保護基を除くとともに担体からの切り出しを
行なった。得られたオリゴヌクレオチドを８Ｍ尿素を含
む１２％ポリアクリルアミドを用いた電気泳動にかけ
た。電気泳動後ゲルの下に蛍光色素を含む薄層クロマト
のプレートを置き、ＵＶランプを用いて目的のバンドの
存在を確認した。目的とするオリゴヌクレオチドを含む
ゲル片を、透析チユーブ内に封入し、ＤＮＡをゲルから
電気的に溶出した。この透析チユーブ内液をセファデッ
クスＧ−２５（ファルマシア社製）のゲルろ過カラム
（φ１．５×４３cm）にかけ、０．０５Ｍトリエチルア
ミン重炭酸緩衝液（pH７．５）にて溶出して、脱塩し
た。目的とするオリゴヌクレオチドを含む溶出液を減圧
濃縮して、純粋なオリゴヌクレオチドを得た。

このようにして得られたオリゴヌクレオチド２本（各１
nmol）の各５′末端を、各々２０μｌのリン酸化反応液
（５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）、１０mMＭｇＣ
ｌ_２、１０mMＤＴＴ、５mMＡＴＰ、１５ユニットのＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガー・マンハイム
社））中で、３７℃３０分間反応させることにより完全
にリン酸化した。

次いで、反応溶液を混合し、９５℃５分間加熱し２時間
かけて常温まで戻して、二重鎖ＤＮＡを調製した。

クローニングベクターには大腸菌のプラスミドｐＵＣ１
９（ファルマシア社）を用いた。１μｇのｐＵＣ１９Ｄ
ＮＡを３０μｌの反応液 （１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１０mMＭｇＣ
ｌ_２、１mMＤＴＴ、５０mMＮａＣｌ、１０ユニットのＨ
ｉｎｄIII（宝酒造）、１０ユニットのＢａｍＨＩ（宝
酒造））中で、３７℃２時間反応させた後、０．８％ア
ガロース電気泳動により大フラグメントを分離した。ゲ
ル片をチユーブに入れ、泳動緩衝液中で電気泳動するこ
とにより溶出した。溶出液にエタノールを加えて沈澱さ
せ、２０μｌのＴＥ溶液（１０mMＴｒｉｓ、１mMＥＤＴ
Ａ、pH８．０）にてこの沈澱を溶解した。前記のように
して調製した８１塩基対の二重鎖ＤＮＡの０．１μｇ
を、上記のｐＣＵ１９ＤＮＡ断片ＴＥ溶液に加え、反応
液３０μｌ（６６mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４）、
６．６mMＭｇＣｌ_２、１０mMＤＴＴ、０．１mMＡＴＰ、
３ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マン
ハイム社））中で、１４℃で６時間反応させた。

この反応液を用い、大腸菌ＪＭ１０９株（宝酒造
（株））（C.Yanisch-Perronら：Gene 33.P.103-119,19
85）を既知の方法（D.Hanahan：J.Mol.Biol.p.557-580.
1980）により形質転換させた。その際、プレートには５
０μｇ／mlのアンピシリンを含むＬＢプレートを用い
た。

前記のようにして調製した二重鎖ＤＮＡがｐＵＣ１９の
ＨｉｎｄIII及びＢａｍＨＩの間に挿入された場合、挿
入されたＤＮＡによるユニークなＡｆｌII制限酵素部位
が存在する。そこで、プラスミドＤＮＡをアルカリ法
（T.Maniatisら：Molecular Cloning,p,368-369,1982,C
old Spring Harbor）にて大腸菌株より分離し、ＡｆｌI
I（宝酒造）によって消化されることを確認した。この
ようにして得られたプラスミドｐＣＡＬＮ１に挿入され
たＤＮＡについてダイデオキシ法（Hattoriら：Anal.Bi
ochem.152,p.232-238,1986）を用いてその塩基配列を確
認した。菌株をｐＣＡＬＮ１／ＪＭ１０９と命名した
（第６図参照）。

実施例２：ラットカルモジュリンｃＤＮＡのサブクロー
ニング ラットカルモジュリンｃＤＮＡは、ラット脳ｍＲＮＡか
らOkayama-Berg法によって作成したｃＤＮＡライブラリ
ーをラットカルモジュリン偽遺伝子（H.NojimaおよびH.
Sokabe：J.Mol.Biol.190,p.391-400,1986）をプローブ
としてスクリーニングを行うことによってクローニング
することができる（H.NojimaおよびH.Sokabe：J.Mol.Bi
ol.193,p.439-455,1987）。

ラットカルモジュリンｃＤＮＡがクローニングされてい
るプラスミドｐＲＣＭ１で形質転換されている大腸菌Ｄ
Ｈ１株より、アルカリ法（T.Maniatisら：Molecular Cl
oning p.368-369,1982,Cold Spring Harbor）を用いて
ｐＲＣＭ１を単離した（第４図中Ａ〜ＢはｐＲＣＭ１中
のラットカルモジュリンｃＤＮＡを示す）。１μｇのｐ
ＲＣＭ１ＤＮＡを３０μｌの反応液（１０mMＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５）、１０mMＭｇＣｌ_２、１mMＤＴＴ、
５０mMＮａＣｌ、１０ユニットのＨｉｎｄIII（宝酒
造）、１０ユニットのＸｂａＩ（宝酒造））中で３７℃
２時間反応させた後、０．８％アガロース電気泳動によ
り小フラグメントを分離した。ゲル片をチューブに入
れ、泳動緩衝液中で電気泳動することにより溶出した。
溶出液にエタノールを加えて沈殿させ、２０μｌのＴＥ
溶液（１０mMＴｒｉｓ、１mMＥＤＴＡ、pH８．０）にて
この沈澱を溶解した。

実施例１で得られたプラスミドｐＣＡＬＮ１を３０μｌ
の反応液（１０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５）、１０
mMＭｇＣｌ_２、１mMＤＴＴ、５０mMＮａＣｌ、１０ユニ
ットのＸｂａＩ（宝酒造））中で、３７℃２時間反応さ
せた後、０．８％アガロース電気泳動により大フラグメ
ントを分離した。ゲル片をチューブに入れ、泳動緩衝液
中で電気泳動することにより溶出した。溶出液にエタノ
ールを加えて沈澱させ、２０μｌのＴＥ溶液（１０mMＴ
ｒｉｓ、１mMＥＤＴＡ、pH８．０）にてこの沈澱を溶解
した。このＴＥ溶液に、前記のようにして調製した４３
３塩基対のＮ末の一部を欠損したカルモジュリンｃＤＮ
Ａ０．２μｇを反応液３０μｌ（６６mMＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH７．４）、６．６mMＭｇＣｌ_２、１０mMＤＴＴ、
０．１mMＡＴＰ、３ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベ
ーリンガー・マンハイム社））中で、１４℃で６時間反
応させた。この反応液を用い、大腸菌ＪＭ１０９株（C.
Yanisch-Perronら：Gene 33,P.103-119,1985）を既知の
方法（D.Hanahan：J.Mol.Biol.166,p.557-580,1980）に
より形質転換させた。その際、プレートには５０μｇ／
mlのアンピシリンを含むＬＢプレートを用いた。アンピ
シリン耐性のコロニーよりプラスミドＤＮＡをアルカリ
法（T.Maniatisら：Molecular Cloning,p.368-369,198
2,Cold Spring Harbor）にて大腸菌株より分離し、Ａｆ
ｌII及びＢａｍＨＩにて消化し、約５００塩基対のＳＤ
配列を含むのカルモジュリンをコードするＤＮＡが挿入
された事を確認した。ついでダイデオキシ法（Hatttori
ら：Anal.Biochem.,152,p.232-238,1986）を用いて塩基
配列を確認した（第５図）。得られた菌株をｐＯＣＡＬ
７／ＪＭ１０９と命名した（第６図参照）。

実施例３：カルモジュリンの発現用プラスミドの構築 既に提案されてあるヒト顆粒球マクロファージコロニー
刺激因子の発現用プラスミド（ｈＧＭ−ＣＳＦ）ｐＳＴ
６３１１（第６図）（特願昭６２−１０６１４８号明細
書参照）を用いて、カルモジュリンの発現用プラスミド
ｐＴＣＡＬ７を構築した。

ｐＳＴ６３１１は、ｐＢＲ３２２由来のｐＡＴ１５３
（アマシャム・ジャパン）を基にして構築されたもので
あって、ＥｃｏＲＩとＡｆｌIIの間に化学合成した大腸
菌のトリプトファンオペロンのプロモーター、オペレー
ター及び転写開始点よりＳＤ配列直前までの塩基配列
を、ＡｆｌIIとＢａｍＨＩの間に化学合成したＳＤ配列
及び ｈＧＭ−ＣＳＦの構造遺伝子を、更に、 ＢａｍＨＩとＳｐｈＩの間に化学合成した ｔｒｐａのターミネーターを、それぞれ含んでいる、ｈ
ＧＭ−ＣＳＦ発現用ベクターである。

実施例２で得られたｐＯＣＡＬ７をＡｆｌII及びＢａｍ
ＨＩにて消化後、０．８％アガロース電気泳動により、
４９８塩基対のＤＮＡ断片を精製した。上記発現用ベク
ターｐＳＴ６３１１をＡｆｌII及びＢａｍＨＩにより消
化後、上記４９８塩基対のＳＤ配列を含むカルモジュリ
ンをＴ４リガーゼによりライゲーションして挿入し、次
いで大腸菌Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ２７３２５）を形質
転換した。アンピシリン耐性のコロニーよりプラスミド
を単離し、ＡｆｌII及びＢａｍＨＩにて消化して、約５
００塩基対のＤＮＡ断片を得、本発明のＳＤ配列を含む
遺伝子（第５図中ＡからＢ）が挿入された事を確認し
た。得られた菌株をｐＴＣＡＬ７／Ｗ３１１０と命名し
た（第６図参照）。

実施例４：カルモジュリンの製造法（第１図のＤＮＡ鎖
の発現） プラスミドｐＴＣＡＬ７／Ｗ３１１０の発現 実施例３で得られたｐＴＣＡＬ７／Ｗ３１１０をアンピ
シリンを含むＬ培地にて３７℃で一晩振とう培養した。
この培養液５０mlを１０００mlのＭ９培地（０．８％グ
ルコース，０．４％カザミノ酸、１０μｇ／mlチアミ
ン、５０μｇ／mlアンピシリンを含む）に加え、３７℃
にて３時間振とうした。インドールアクリル酸を最終濃
度２０μｇ／mlになるように添加した。このまま更に４
時間振とう培養した。得られた大腸菌の一部をサンプル
緩衝液中で煮沸（５分）し、煮沸液についてＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行な
って、カルモジュリンの含有量を調べた。この条件にお
いては、カルモジュリン含有量は大腸菌細胞蛋白質の約
２５％以上であった。

この培養液を遠心分離して菌体を得た。得られた菌体を
２０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）２５０mlに懸濁
し、この懸濁液にリゾチームを最終濃度１０mg/mlにな
るように添加し、氷中で１時間放置した後、１mMジチオ
スレイトール、１mMＥＤＴＡに調整して超音波処理を氷
中で行なった。この懸濁液を９０℃で５分間加熱後、氷
中にて冷却し、１００，０００×ｇで超遠心を３０分間
４℃にて行ない、上清を回収した。

予め５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５、１mMＥＤＴ
Ａ）１５０mlにて平衡化しておいたフェニルセファロー
スＣＬ−４Ｂカラム（ファルマシア社：φ１×１９cm）
に上記で得られた上清を添加し、５０mMＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（pH７．５、１mMＥＤＴＡ）１５０mlにて溶出した。

素通り画分を集め、５mMＣａＣｌ_２に調整し、予め５０
mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５、１mMＣａＣｌ_２）３０
０mlにて平衡化しておいたフェニルセファロースＣＬ−
４Ｂカラム（ファルマシア社：φ１×３８cm）に添加し
た。初め５０mMＴｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．５、１mMＣａ
Ｃｌ_２）３００mlにて溶出した。次に５０mMＴｒｉｓ−
ＨＣｌ（pH７．５、１mMＣａＣｌ_２、０．５ＭＮａＣ
ｌ）３００mlにて溶出した。最後に５０mMＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（pH７．５、１mMＥＤＴＡ）３００mlにて溶出し、
目的のカルモジュリン蛋白画分を回収した。回収した溶
液を水に対して３回透析を繰り返し、凍結乾燥を行なっ
て、粉末のカルモジュリン蛋白質（約１００mg）を得
た。

実施例５：カルモジュリンの活性 各種カルモジュリンによる、ラットの脳から調製したＣ
ｙｃｌｉｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ）ホスホジエステラーゼの
活性化を測定した。

反応液０．５ml（８０mMイミダゾール塩酸緩衝液（pH
６．９）、３mMＭｇＣｌ_２、０．３mMジチオスレイトー
ル、０．２mMＣａＣｌ_２、１mg/mlウシ血清アルブミ
ン、ホスホジエステラーゼ２００μｇ／ml、カルモジュ
リン（大腸菌におて発現されたカルモジュリン（実施例
４で得られた凍結乾燥粉末）あるいはラット脳から調製
されたカルモジュリン）、２mMｃＡＭＰ）３０℃で３０
分間反応後、１００℃、３分間加熱して反応を停止し
た。これに０．２mlの５′−ヌクレオチダーゼ溶液
（０．５mg/ml５′−ヌクレオチダーゼ、３０mMｎＣｌ
_２）を加え３０℃で２０分間インキュベートして、Ｐｉ
形成を行なった （S.Kakiuchiら(1982)：J.Biochem.,92,p.1041）。

１６．７％過塩素酸を０．３ml添加して反応を停止後、
３０００rpmで５分間遠心して、蛋白質の除去を行な
い、上澄み画分のＰｉを無機リン定量法（B.N.Ames：
“Methods in Enzymology”，E.F.Neufeld編、V.Ginsbu
rg,Academic Press,New York,Vol.8,p.115,1966）を用
いて定量した。すなわち、反応液２．１ml（０．７ml
（上記上澄み画分＋Ｈ_２Ｏ）、１．４ml（０．２ml１０
％アスコルビン酸＋１．２ml１０．４２％アンモニウム
モリブデン酸、１Ｎ硫酸中））を、４５℃で２０分間イ
ンキュベートし、その後室温に戻して７７０nmでの吸光
度を測定して、Ｐｉの定量を行なった。その結果、大腸
菌で発現されたカルモジュリン蛋白質は脳から調製され
たカルモジュリンとほぼ同等の活性を示した。測定結果
は以下の通りである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、カルモジュリンのアミノ酸配列とこれをコー
ドする本発明によるＤＮＡ塩基配列を示す説明図であ
る。 第２図は、化学合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列
と制限酵素部位を示す説明図である。 第３図は、第２図のＤＮＡ塩基配列にコードされるアミ
ノ酸配列を示す説明図である。 第４図は、ｐＲＣＭ１中のラットカルモジュリンｃＤＮ
Ａの塩基配列と制限酵素部位を示す説明図である。 第５図は、カルモジュリンをコードする塩基配列、ＳＤ
配列及び停止コドンを含む本発明の好ましいＤＮＡ鎖を
示す説明図である。 第６図は、カルモジュリンの発現ベクターの構築を示す
説明図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記に示す塩基配列を含むＤＮＡ鎖。
2. 【請求項２】請求項１に記載のＤＮＡ鎖をその遺伝情報
   が発現可能な状態で含むプラスミドによって形質転換さ
   れたものであること特徴とする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
   ｉ）。
3. 【請求項３】請求項１に記載のＤＮＡ鎖を用意し、この
   ＤＮＡ鎖を、これをその遺伝情報が発現可能な状態で含
   むプラスミドの作成、このプラスミドによる大腸菌
   （Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換および得られる形質転換体
   の培養から成る工程に付して培養物中にカルモジュリン
   を産生させることを特徴とするカルモジュリンの製造
   法。