JP2803003B2 - 小麦ジヒドロジピコリネート・シンターゼ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ジヒドロジピコリネート・シンターゼ（以
下DHDPSと省略）活性を有するタンパク質、該タンパク
質をコードするDNA配列、該DNA配列を含む組換えベクタ
ー、該組換えベクターにより形質転換された微生物、さ
らには該微生物を培養することにより該タンパク質を遺
伝子工学的に生産する方法に関する。

［従来の技術］ コムギやトウモロコシなどの禾穀類は、人間や家畜等
にとって重要な栄養源であるが、一方これらの種子は、
必須アミノ酸の一つであるリジンの含量が低く、栄養面
で劣っている。しかしながら、現在まで、リジンの含量
が高く、且つ農業上作物としての欠点のない品種は得ら
れていない。

高等植物のリジン生合成系は大腸菌と同じく、ジアミ
ノピメリン酸（DAP）を経由するジアミノピメリン酸経
路によると考えられ、各種の高等植物から、その経路の
いくつかの酵素に関しては活性が確認されている。

この生合成系の最終産物であるリジンの細胞内での存
在量はリジン生合成系の複数の酵素の内、アスパルテー
ト・キナーゼ、およびDHDPSによって制御されているこ
とが報告されている。さらには、これら２つの酵素の酵
素的性質（リジンによるフィードバック・インヒビショ
ン）から、後者のDHDPSが主に制御を担っていると考え
られている（R.Kumpaisal et al.,（1987）,Plant Phys
iol.85,pp.145−151）。

しかし、近年の大腸菌及び高等植物のDHDPS酵素タン
パク質の酵素学的研究の知見を比較すると、両者には差
異も多く、例えば高等植物DHDPSは葉緑体中に局在する
ことなどを挙げることができる（R.M.Wallsgrove et a
l.,（1981）Phytochemistry 20,pp.2651−2655）。

一方、植物における遺伝子工学的研究の近年の進展に
より、植物に外来遺伝子を導入することが可能になって
いる。

従って、高等植物のリジン生合成系を解明し、これに
関与する酵素タンパク質あるいはこれをコードするDNA
の塩基配列に関する知見を基にしてリジン含量の改良さ
れた品種を作製することが期待される。

しかし生体中においてはDHDPSは存在量の極少ない酵
素であり、特に高等植物からの単離精製は非常に困難で
ある。さらに酵素的性質を研究するためにもDHDPSをコ
ードするDNA配列の解明、さらにはDHDPSを発現生産する
手段の確立が期待されている。

従って、高等植物のDHDPS酵素蛋白、及びこれをコー
ドするDNA配列に関する研究は非常に重要であるが、高
等植物のDHDPSに関しては、これまでに部分的精製に関
する報告はあるが、単離、または、アミノ酸配列、ある
いはこれをコードするDNA配列に関する報告はない。

遺伝子工学的手法として、タンパク質の一次配列の情
報、あるいはタンパク質に対する特異抗体をもとにすれ
ば、cDNAあるいはゲノムのクーロン遺伝子を得ることが
できる。

現在までに、DHDPSの遺伝子としては、大腸菌のもの
のみが知られている（F.Richaud et al.（1986）J.Bact
eriol.166,pp.297−300）。しかし、一般に大腸菌と高
等植物とでは、同一酵素間においても、アミノ酸配列あ
るいはこれらをコードするDNAの塩基配列の相同性は低
く、大腸菌遺伝子の塩基配列を基にして、拡酸をプロー
ブとしてcDNAやゲノムのDNA配列をライブラリーから選
択することは通常不可能であり、また、大腸菌の該タン
パク質に対する特異抗体と高等植物の該タンパク質との
免疫交差性も特異性が低いと推定される。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の目的は、従来より単離することができなかっ
た高等植物由来のDHDPSを単離し、そのアミノ酸配列を
決定し、それをコードするDNAを作製し、該DNAを組み込
んだ組換えベクターを構築し、該組換えベクターで微生
物を形質転換してDHDPS生産能を有する微生物を創製
し、さらに、該微生物を培養してDHDPSを生産する方法
を提供することである。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、鋭意研究の結果、コムギDHDPSの単離
精製法を確立し、該タンパク質のＮ−末端アミノ酸配列
を決定し、該タンパク質をコードするDNA配列を明らか
にし、この知見を基に遺伝子工学的にDHDPS活性を有す
るタンパク質を生産する手段及び方法を完成した。

すなわち、本発明は、下記の式（III）： で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１
個若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加
されたアミノ酸配列を有し、且つアスパルテート・セミ
アルデヒドとピルビン酸を縮合結合することによりジヒ
ドロジピコリン酸を生成する能力を保持していることを
特徴とする、ジヒドロジピコリネート・シンターゼ活性
を有する組換えタンパク質を提供する。

また、本発明は、該タンパク質をコードするDNA配列
を提供する。

さらに本発明は、該DNA配列を含み、宿主微生物中で
複製可能で、前記本発明のタンパク質を宿主微生物中で
発現することができる組換えベクターを提供する。

本発明はさらに、該組換えベクターにより形質転換さ
れ、上記本発明のタンパク質を産生することができる微
生物を提供する。

さらに本発明は、該微生物を培養し、上記本発明のタ
ンパク質を回収する工程を含む、本発明のタンパク質の
製造方法を提供する。

［発明の具体的説明］ 以下、本発明をより具体的に説明する。

1.ジヒドロジピコリネート・シンターゼ 本発明のタンパク質は、アスパルテート・セミアルデ
ヒドとピルビン酸を縮合結合させることによりジヒドロ
ジピコリン酸を生成する、DHDPS活性を有するタンパク
質であり、上記式（III）で表わされるアミノ酸又は該
アミノ酸配列において１個若しくは複数個のアミノ酸が
置換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列を有する。

本発明のタンパク質は、上記のように、上記式（Ｉ）
で表わされるアミノ酸配列を有するもののみならず、該
アミノ酸において１個若しくは複数個のアミノ酸が置
換、欠失若しくは付加されたアミノ酸配列であって、ア
スパルテート・セミアルデヒドとピルビン酸を縮合結合
することによりジヒドロジピコリン酸を生成する能力を
有する、すなわちDHDPS活性を有するアミノ酸配列をも
包含する。すなわち、一般に、生理活性を有するタンパ
ク質において、そのアミノ酸配列のうち、少数のアミノ
酸が置換し、欠失し又は少数のアミノ酸が付加された場
合であってもその生理活性が維持されることがあること
は当業者に広く認識されている。本発明には、このよう
にアミノ酸配列は式（Ｉ）のものとは多少異なるが、DH
DPS活性を有するものも含まれる。

さらに、特に酵素タンパク質において、活性部位を構
成するアミノ酸配列が同一であれば、その活性部位を構
成するアミノ酸配列以外の部分のアミノ酸配列が大きく
異なっていても、欠失していても、また、かなり大きな
アミノ酸配列が付加されたような場合であってもその酵
素活性が失われないことも当業者によって広く認識され
ていることである。従って、本願発明においては、この
ようなものも「１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、
欠失若しくは付加された配列」に含めることを意図して
いる。例えば、下記実施例で具体的に示されるように、
コムギ培養細胞中のmRNAから調製されたcDNAがコードす
るアミノ酸配列は下記式（Ｉ）又は（II）で表わされ
る。

式（Ｉ）： 式（II）： 上記式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１
番目及び５〜49番目のアミノ酸を欠失させたものが上記
式（III）で示される配列である。下記実施例で具体的
に示されるように上記式（III）で示されるアミノ酸配
列を有するタンパク質はDHDPS活性を有する。上記式
（Ｉ）で示される配列はこのDHDPS活性を有する式（II
I）で示されるアミノ酸配列を含み、かつ、実際にクロ
ーニングされたcDNAがコードする配列であるから、上記
式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列を有するものがDHDPS
活性を有することは明らかであり、本発明で規定される
「１個若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは
付加された配列」に包含される。また、上記式（Ｉ）で
示されるアミノ酸配列のＮ末端から56番目以降のアミノ
酸配列と上記式（II）で示されるアミノ酸配列のＮ末端
から67番目以降のアミノ酸配列は完全に同一である。従
って、上記式（II）で示されるアミノ酸配列は、式（II
I）で示されるアミノ酸配列のほとんどを含み、かつ、
コムギ培養細胞から実際にクローニングされたcDNAがコ
ードする配列であるから、DHDPS活性を有することは明
らかであり、本発明で規定される「１個若しくは複数個
のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加された配列」に包
含される。一方、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列のＮ
末端から１〜55番目のアミノ酸配列と上記式（II）で示
されるアミノ酸配列のＮ末端から１〜66番目のアミノ酸
配列には相同性は見られない。そして、上記のように、
式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列のＮ末端から１番目及
び５〜49番目のアミノ酸を欠失させた式（III）で示さ
れるアミノ酸配列を有するタンパク質がDHDPS活性を有
するのであるから、式（Ｉ）のアミノ酸配列のＮ末端の
１番目〜55番目を欠失したアミノ酸配列及び式（II）の
アミノ酸配列のＮ末端の１〜66番目を欠失したアミノ酸
配列を有するタンパク質もDHDPS活性を有し、これらも
本発明で規定される「１個若しくは複数個のアミノ酸が
置換、欠失若しくは付加された配列」に包含される。

さらに、上記した本発明のタンパク質が他のタンパク
質又はポリペプチドと結合していわゆる融合タンパク質
の形態にあるものであってもDHDPS活性を有する限り本
発明の範囲内に含まれる。例えば、大腸菌内での発現効
率を高めるためにしばしば、外来タンパク質をヒト成長
ホルモンとの融合タンパク質の形態で発現させることが
あるが、このようなものも本発明の範囲内に含まれる。

本発明のタンパク質は、例えば、下記実施例２に詳細
に示す、各種クロマトグラフィーを組合わせた精製方法
によりコムギ細胞から単離することができる。また、後
述のように、本発明の組換えベクターを用いて遺伝子工
学的手法により生産することもできる。

また、下記実施例で得られたタンパク質は全てコムギ
に由来するものであるが、本発明のタンパク質は必ずし
もコムギに由来するものに限定されるものではなく、他
の高等植物に由来するものであってもよい。

2.DNA配列 本発明はまた、上記した本発明のタンパク質をコード
するDNA配列を提供する。本発明の種々のアミノ酸配列
をコードするDNAは種々の方法で得ることができる。例
えば上記のアミノ酸配列に基づいて塩基配列を設計し、
常法に従ってDNAを化学合成することができる。また、
下記実施例において詳細に述べるように、高等植物から
常法に従ってメッセンジャーRNA（mRNA）を抽出し、次
にこれに基づいて常法にしたがってcDNAライブラリーを
作製し、これを種々の方法によりスクリーニングして目
的のタンパク質のアミノ酸配列をコードするcDNAを選択
することができる。

この様にして得られたコムギDHDPSをコードするcDNA
は下記の式（IV）： で表される塩基配列（これは上記式（Ｉ）で示されるア
ミノ酸配列をコードする）、及び下記の式（Ｖ）： で表される塩基配列（これは上記式（II）で表わされる
アミノ酸配列をコードする）を有するものである。

また、上記式（III）で示されるアミノ酸配列をコー
ドする、下記実施例でクローニングされたDNAの塩基配
列を下記式（VI）に示す。

式（VI）： なお、この式（VI）で表わされる塩基配列は、上記式
（IV）に示される塩基配列から、第１番目及び第５〜49
番目のアミノ酸をコードするコドンを欠失させた配列で
ある。

本発明のDNA配列は、式（IV）ないし式（Ｖ）のDNA配
列の他、上記した本発明の種々のタンパク質をコードす
るいずれのDNA配列をも包含する。

例えば前記のごとく短縮されたDHDPSタンパク質をコ
ードするDNAは、前記の塩基配列（IV）を有しDHDPSタン
パク質の全体をコードするDNAを、適当な制限酵素で切
断して塩基配列の一部を除去した後必要であれば適当な
リンカーを介して、結合することにより得ることができ
る。

また、例えば前記（IV）の塩基配列を有するDNAを含
有するベクターを実施例９に記載する方法で操作するこ
とにより、式（Ｉ）で示されるアミノ酸配列の内のアミ
ノ酸50から377から成るタンパク質をコードするDNAを含
有するベクターを作製することができる。

遺伝子工学的にDHDPS活性を有するタンパク質を生産
するには前記したようなDNA配列にこのDNA配列を発現さ
せ得るDNA配列を結合させることが必要である。DHDPS活
性を有するタンパク質をコードするDNA配列を組替微生
物または組替植物中で発現させ得るDNA配列は選定され
た微生物あるいは植物の宿主との関係において適宜選定
して使用すればよい。このようなDNA配列として、例え
ばプロモーター系、開始コドン、終始コドン、転写終止
領域等のDNA配列が知られている。この様なDNA配列をDH
DPS活性を有するタンパク質をコードするDNA配列に結合
させるには、例えば結合させようとするDNA配列間に相
補的な付着末端を形成せしめる等して行う公知の方法等
を用いればよい。DNA配列を発現させ得るDNA配列の結合
は、本発明で提供されるDHDPS活性を有するタンパク質
をコードするDNA配列に対し、その読み取りが可能なよ
うに、即ちDNA配列が翻訳された場合に目的とするDHDPS
活性を有するタンパク質が生産されるようであれば良
い。

DNA配列を発現させ得るDNA配列を結合させる以外にも
本発明で提供されるDHDPS活性を有するタンパク質をコ
ードするDNA配列を他の、例えばヒト成長ホルモンを生
産させるために作製されたDNA配列の下流（３′側）に
読み取り可能に結合させてもよい。

DNA配列を発現させるためのDNA配列の中でも、プロモ
ーター系は重要であり、しかも選定した宿主との関係に
おいて適宜選定する必要がある。例えば近年の遺伝子工
学でよく使用される大腸菌等の細菌菌株を用いる場合に
はβ−ラクタマーゼ、及び乳糖プロモーター系、トリプ
トファンプロモーター系等、さらにはこれらのハイブリ
ッドプロモーター系を用いればよい。宿主として酵母を
用いる場合などにはGAL1/10プロモーター系などを用い
ればよい。また例えば植物を用いる場合にはNOS、CaMV3
5Sプロモーター等が知られている。

なお、本発明のDNA配列を発現させ得るDNA配列と読み
取り可能に結合したDHDPS活性を有するタンパク質をコ
ードするDNA配列は、プロモーター系、開始コドン、終
止コドン等の他に選定した宿主でのDHDPS活性を有する
タンパク質をコードするDNA配列の発現のために必要な
例えばリボソーム結合部位等を含んでいても良い。

3.発現ベクター 本発明で提供されるDHDPS活性を有するタンパク質を
コードするDNA配列を発現即ち生産し得る複製可能な発
現ベクターは前記２で説明された様なDNA配列を発現さ
せ得るDNA配列と読み取り可能に結合しているDHDPS活性
を有するタンパク質をコードするDNA配列及び宿主中で
ベクターDNAを複製するための複製起点を有し、選定さ
れた宿主を形質転換出来るものであれば制限なく適宜選
定して使用できる。例えば宿主として大腸菌等の細菌菌
株を用いる場合には、pBR322,pBR325等のプラスミド等
を例示できるが、これら以外のものであっても特別の制
限はない。またこれらベクターは、これらベクターを用
いて選定された宿主を形質転換させる操作に当り、ベク
ターが導入されなかった宿主と導入された宿主との選別
を可能にするため例えばアンピシリン等の薬剤に対する
耐性を宿主に付与するためのDNA配列を含んでいること
が好ましい。

4.宿主 本発明では特別の制限なしに通常の遺伝子工学的にタ
ンパク質を生産するために用いられる微生物が使用でき
る。たとえばＫ−12誘導体であるｘ−1776、Ｗ−3110、
MC1009等の種々の大腸菌類、枯草菌類、好熱菌属細菌
類、さらにはサルモネラ・チフィリウム、セラチア・マ
ンセサンス等の種々の腸内細菌類またさらにはシュード
モナス等の微生物あるいは酵母等を例示することができ
る。また例えば、既知の方法を用いれば植物を形質転換
することも可能である。

5.形質転換された宿主を用いたDHDPS活性を有するタン
パク質の生産 前記３で説明したベクターにより形質転換された前記
４で説明されたような宿主を培養し、ベクターDNA中のD
HDPS活性を有するタンパク質をコードするDNA配列を発
現させることによりDHDPS活性を有するタンパク質を生
産することが出来る。これはDHDPS活性を有するタンパ
ク質をコードするDNA配列と結合した該DNA配列を発現さ
せ得るDNA配列中のプロモーター系の活性化により実現
される。プロモーター系の活性化は、使用したプロモー
ター系により異なった条件下で起こる。通常の遺伝子工
学的なタンパク質の生産においては、形質転換した宿主
を目的タンパク質を生産しない状態、即ちプロモーター
系を不活性化した状態で培養し、宿主当りのベクター量
及び総宿主量（総菌体数）を増加させた後、プロモータ
ー系を活性化してタンパク質を生産させる。このため、
通常プロモーター系は例えばIPTG、IAA等の発現誘導剤
の添加などの公知の操作により人為的に活性化可能なも
のを選定するが、本発明においても、人為的に制御可能
なプロモーター系を用いることが好ましい。培養菌体か
らの本発明のタンパク質の単離は例えば下記実施例２に
記載する方法により行なうことができる。

［実施例］ 以下本発明をさらに詳細に説明するために実施例を示
すが本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例1.DHDPSの存在の確認 DHDPSは、アスパルテート・セミアルデヒドとピルビ
ン酸を特異的に縮合結合してジヒドロジピコリン酸を生
成する。ジヒドロジピコリン酸は酸性条件下でオルト−
アミノベンズアルデヒドと反応させることにより呈色
し、545nm付近にピークを持つ吸光度の変化を示すの
で、これを利用して以下のような方法により活性（力
価）を測定することができる。すなわち、100mMトリス
塩酸（pH8.0）−20mMピルビン酸ナトリウム−0.8mM L−
アスパラギン酸セミアルデヒド−1mg/mlθ−アミノベン
ズアルデヒドの組成を有する溶液1mlに適当量の酵素を
加え、30℃で30分間インキュベートする。次いで0.2ml
の６％トリクロロ酢酸−1.5N塩酸を加えて反応を停止さ
せ、30℃で30分間インキュベートする。次いで、540nm
の吸光度を測定し、吸光度0.001を１分間に上げる活性
を１単位と定義する。

この方法を用いて、コムギ（Triticum aestivum cv.
Chinese Spring）未熟胚から誘導した培養細胞抽出液中
のDHDPS活性を測定することができる。尚、DHDPS活性は
リジンの存在により阻害されるので該抽出液は硫安沈殿
さらにはゲルろ過により、低分子を除去しておくことが
好ましい。

この方法により、コムギ培養細胞中にDHDPS活性が確
認された。

実施例2.コムギDHDPSの精製 湿重量600gの上記コムギ培養細胞を液体窒素で凍結
後、グラインダーで破砕した。細胞100g当り、50mMリン
酸ナトリウム（pH7.0）−10mMピルピン酸（Pyr）−2mM
ジエチルジチオカルバミン酸−2mMジチオスレイトール
（DTT）−1mMエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）の組
成を有する溶液180mlを加え、懸濁した。少量の海砂を
加えた乳鉢でこれを破砕し、矢活防止剤として細胞100g
当り50gの水不溶性のポリビニルピロリドン（和光純薬
社製polyclar AT）を加え、さらに破砕を行ない、ガー
ゼでろ過し、8000 x g、40分間遠心した。上清に最終濃
度が30％飽和になるように固体硫酸アンモニウムを加
え、遠心し、上清に最終濃度が60％飽和になるように固
体硫酸アンモニウムを加え、遠心した。沈殿を50mMリン
酸ナトリウム（pH7.0）−10mMピルビン酸（Pyr）−2mM
ジエチルジチオカルバミン酸−2mMジチオスレイトール
（DTT）−1mMエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）−1.
25M硫酸アンモニウムの組成を有する溶液に懸濁し、30
分間放置した。これを8000 x gで20分間遠心した。

得られた上清を以下のようにして疎水クロマトグラフ
ィーにかけた。市販の疎水クロマトグラフィー用カラム
（東ソー社製Butyl−Toyopearl650M、22mm x 300mm）を
50mMリン酸ナトリウム（pH7.0）−10mM Pyr−2mM DTT−
1mM EDTA−1.25M硫酸アンモニウムで平衡化し（流速１
〜2ml/分）、上記上清をカラムにかけ、300ml〜400mlの
上記溶液で洗浄した。次いで、上記溶液の硫酸アンモニ
ウム濃度を0.8Mにした溶出液で溶出を行なったところ、
DHDPS活性が溶出された。

次いで、活性画分をゲルろ過クロマトグラフィーにか
けた。すなわち、セファデックスＧ−25（ファルマシア
社製）カラムを用い、20mMトリス塩酸（pH7.5）−10mM
Pyr−2mM DTT−1mM EDTA−0.1M NaClで平衡化、展開し
てゲルろ過を行ない、タンパク質含有画分を分取した。

得られたタンパク質含有画分を次いで陰イオン交換ク
ロマトグラフィーにかけた。すなわち、DEAE−セファロ
ースFFカラム（22mm x 200mm）（ファルマシア社製）を
用い、20mMトリス塩酸（pH7.5）−10mM Pyr−2mM DTT−
1mM EDTA−0.1M NaCl及び20mMトリス塩酸（pH7.5）−10
mM Pyr−2mM DTT−1mM EDTA−0.35M NaClの各500mlを用
いたリニアグラジエントで溶出したところ、DHDPS活性
はおよそ0.18〜0.26M NaCl画分に溶出された。DHDPS活
性画分の減量を減らすために、活性画分を80％飽和硫酸
アンモニウムで沈殿させ（一夜放置）、遠心して沈殿を
回収した。

次いで、これを亜鉛キレートクロマトグラフィーかけ
た。すなわち、キレーティングセファロースカラム（フ
ァルマシア社製、22mm x 150mm）に塩化亜鉛水溶液を通
して亜鉛で飽和させた後、50mM HEPES（pH7.5）−10mM
Pyr−1mM DTT−0.5M NaClで平衡化した。一方、上記沈
殿を、5mlの同緩衝液に懸濁し、これを上記のように平
衡化したカラムにかけた。DHDPS活性は、素通り画分の
第１ピーク中に存在した。活性画分に固体硫酸アンモニ
ウムを最終濃度1.25Mになるように加え、さらに1MDTTを
最終濃度2mMになるように加えた。

次いで、上清を液体クロマトグラフィーにかけた。す
なわち、東ソー社製Pheny1−5PWを用い、50mMリン酸ナ
トリウム（pH7.0）−10mM Pyr−2mM DTT−1mM EDTA−1.
25M硫酸アンモニウムと50mMリン酸ナトリウム（pH7.0）
−10mM Pyr−2mM DTT−1mM EDTA−0M硫酸アンモニウム
のリニアグラジエントで流速1ml/分で150分間かけて溶
出した。DHDPS活性は硫酸アンモニウム濃度約0.7M〜0.8
Mの間で溶出した。

次いで、活性画分をゲルろ過クロマトグラフィーにか
け、脱塩した。すなわち、ファルマシア社製PD−10カラ
ム（セファデックスＧ−25を詰めた小型カラム）を用
い、20mMトリス塩酸（pH7.5）−10mM Pyr−2mM DTT−1m
M EDTA−0.1M NaClで展開し、タンパク質溶出画分を回
収した。

次いでこの画分を陰イオン交換クロマトグラフィーに
かけた。すなわち、MonoQ HR5/5カラム（ファルマシア
社製）を用い、20mMトリス塩酸（pH7.5）−10mM Pyr−2
mM DTT−1mM EDTA−0.1M NaClと20mMトリス塩酸（pH7.
5）−10mM Pyr−2mM DTT−1mM EDTA−0.5M NaClの200分
間のリニアグラジエントで流速0.5ml/分で溶出した。DH
DPS活性は、0.25M NaCl付近をピークとして溶出され
た。試料を1ml以下にまで濃縮した。

次いで、活性画分をゲルろ過クロマトグラフィーにか
けた。すなわち、Superose6 HR10/30（ファルマシア社
製）を用い、20mMリン酸ナトリウム（pH7.0）−10mM Py
r−2mM DTT−1mM EDTAで展開した。第８図に示すよう
に、タンパク質のピークとDHDPS活性のピークとが相似
形をしていたので、この段階でDHDPSが精製されたもの
と考えられる（もっとも、後述のように、この段階では
アミノ酸配列が若干異なる複数のDHDPSが含まれてい
る）。なお、第８図中、実線は280nmにおける吸光度
を、破線はDHDPS活性を示す。

さらに、後述のようにＮ末端のアミノ酸配列を決定す
る場合には、以下の逆相クロマトグラフィーを２回行な
った。すなわち、Cosmosil 5C₁₈−300カラム（ナカライ
テスク社製）を用い、30％アセトニトリル−0.1％トリ
クロロ酢酸と65％アセトニトリル−0.1％トリクロロ酢
酸の75分間のリニアグラジエントで0.7ml/分の流速で溶
出した。その結果、DHDPS活性を有する４つのピークが
得られ、この段階でDHDPSはタンパク質レベルで単離さ
れた。

単離されたことを確認するためにSDSポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を行なった。SDS−PAGE
はLaemliの方法に基づいて行なった（U.K.Laemli,Natur
e227巻、680頁、1970年）。すなわち、先ず、電気泳動
装置を用いて、泳動用ガラス板間に10％（w/v）アクリ
ルアミド−0.26％（w/v）ビスアクリルアミド−0.375M
トリス塩酸（pH8.8）−0.1％ラウリル硫酸ナトリウム
（SDS）よりなる分離ゲルを作製し、さらに2.5％（w/
v）アクリルアミド00.6％（w/v）とビスアクリルアミド
0.125Mトリス塩酸（pH6.8）−0.1％ SDSからなる濃縮ゲ
ルを重層した。タンパク質試料を、0.0625Mトリス塩酸
（pH6.8）−２％SDS−５％２−メルカプトエタノール中
に溶解した後、ゲル上に展開した。泳動用緩衝液として
は、0.025Mトリス塩酸（pH8.3）−0.192Mグリシン−0.1
％SDSを用いた。通電はゲルの大きさにより20〜200mAで
実施した。マーカーとしては試料中にブロムフェノール
ブルーを使用した。泳動後のタンパク質の染色には銀染
色法を行なった（バイオラッド・ラボラトリーズ社製の
測定キットを使用）。

結果を第９図に示す。第９図に示すように、逆相クロ
マトグラフィーの４つのピークについてはそれぞれ単一
のバンドが得られ（レーン１〜４）、逆相クロマトグラ
フィーを行なう前の段階（レーン５）のものについては
これらのバンドに対応する太目のバンドが得られた。こ
のことからDHDPSはタンパク質レベルで単離されたと判
断される。

実施例３ DHDPSの酵素的性質 実施例２で精製されたDHDPSの酵素的性質を調べたと
ころ、以下の結果が得られた。

（ｉ） 至適pH 8.0付近 安定pH 6.0〜8.5 （ii）力価の測定法 実施例１に記載。

（iii）熱安定性 60℃１分間で50％失活 60℃３分間で100％失活 （iv）失活条件 pH9.5、トリス緩衝液中16時間４℃で50％失活。

60℃３分間の熱処理で100％失活 （ｖ）阻害剤 Ｌ−リジン0.05mMで50％阻害 ｐ−クロロ安息香酸第二水銀0.01mMで約90％阻害 ｐ−クロロンフェニルスルホン酸水銀−ナトリウム0.
01mMで約90％阻害 ZnCl₂1mMで約86％阻害 CdCl₂1mMで約95％阻害 HgCl₂1mMで約88％阻害 （vi）安定剤 DTT等のSH基保護剤 ピルビン酸 実施例4.DHDPSタンパク質のＮ−末端アミノ酸配列の決
定 実施例２のようにして得たDHDPSタンパク質を気相法
アミノ酸配列分析計（アプライド・バイオシステムズ）
を用いて、各々のＮ−末端アミノ酸配列を決定した。決
定したＮ−末端アミノ酸配列を第１図に示す。

実施例5.プローブの作製 実施例４で得られたアミノ酸配列をコードし得るDNA
配列に対して相補的なDNA配列をDNA合成機（アプライド
・バイオシステムズ）を用いて合成した。合成したDNA
配列を第１図に示す。

実施例6.mRNAの単離 mRNAの単離は既知の方法（Molecular Cloning,Clod S
pring Harbor Laboratory,1982）に記載された方法に基
づいて行なった。

コムギ培養細胞を50％グアニジンイソチオシアネート
溶液に懸濁破砕し、5M塩化セシウム溶液に重層し、3200
0rpm,20時間の遠心分離にかけ、沈殿に種々のRNAを得
た。これらをフェノール抽出、エタノール沈殿後オリゴ
dTセルロースを用いたクロマトグラフィーにかけ、mRNA
を単離した。

実施例7.cDNAライブラリーの作製 実施例６の様にして得たmRNAを鋳型として、これらに
相補的なcDNAを常法に従い、ガブラー・ホフマンの方法
に基づいて調製した（U.Gubler.B.J.Hoffman（1983）Ge
ne,25,263）） 実施例8.DHDPSをコードするcDNAの選択 ベクターとしてBluescript（ストラトジーン社製）を
用いた。このベクターのマルチクローニング・サイト中
に実施例６の様にして作製したcDNAを挿入し、このプラ
スミドを用いて大腸菌SCS−１（ストラトジーン社より
入手）を形質転換した。

この様にして得られる大腸菌を用いて、実施例４で説
明したプローブによりコロニー・ハイブリダイゼーショ
ンを行って目的とするcDNAによって形質転換された大腸
菌を選択した（P.J.Masson,J.G.Williams（1985）Nucle
ic Acid Hybridization,IRL Press,pp.113−137）。

この様にして得られたDHDPSをコードするcDNAを含む
プラスミドベクターをpDA26およびpDA17と称する。

実施例9.DHDPSをコードするcDNAの解析 この様にして得られたDNAの制限酵素地図と塩基配列
を決定した（F.Sanger et al.,（1981）Science,214,12
05）。

制限酵素地図を第２図、及び第３図に示す。また、塩
基配列を第４図及び第５図に示す。

実施例10.DHDPS活性を有するタンパク質の発現 前記プラスミドベクターpDA26と５′、３′の両末端
の長さのみが異なるcDNAを含有するプラスミドベクター
pDA08（pDA26のポリＡの上流に余剰の塩基配列を含み、
pDA26の５′末端からタンパク質コード領域までの配列
が欠失しているが、発現ベクターに組込めばpDA26と同
一のタンパク質が発現する）を制限酵素Pvu II,Xho Iで
断片化した後、修飾酵素クレノー断片を用いて平滑末端
化し、12塩基の長さを持つNco Iリンカー（５′−CAGCC
ATGGCTG−３′）を両末端に結合させ、制限酵素Nco Iで
切断した。この様にして得られる両末端に制限酵素Nco
Iの付着末端を持ち、DHDPS蛋白質のアミノ酸配列51から
377をコードするDNA配列を、pTV118N（宝酒造株式会
社）のNco I切断部位に挿入した。この作製方法の手順
を第６図に示す。この様にして得られたプラスミドベク
ターを用いて大腸菌株JE7627（国立遺伝学研究所）を形
質転換した。前記大腸菌JE7627はDHDPS活性を失った変
異株であり、ジアミノピメリン酸を含まない培地、たと
えばLB培地上では増殖することができない。しかし該プ
ラスミドベクターにより形質転換されたJE7627はLB培地
上で増殖を示した。

該プラスミドのプロモーター下流付近について実施例
８と同様に塩基配列を決定し開始コドンからDHDPSのア
ミノ酸配列50以降が読み取り可能に結合されていること
を確認した。これを第７図に示す。

該プラスミドベクターをpED0801と称する。

実施例11.DHDPS活性を有する蛋白質の製造 実施例10に示すpED0801を用いて形質転換された大腸
菌MV1184（Methods in Enzymology vol.153、宝酒造株
式会社から市販）を100μg/mlのアンピシリンを含む2YT
培地で一夜培養した後、同様の培地に300分の１になる
ように植菌した。１時間の培養後、最終0.3mMになるよ
うにIPTGを添加し、さらに３時間培養した。この菌体を
遠心分離により回収し、実施例１に示す方法でDHDPS活
性を測定した。尚、対照として、形質転換されていない
MV1184を同様にして測定した。その結果、ベクターDNA
のみによって形質転換されたMV1184ではDHDPSの比活性
が450単位/mg蛋白質であったのに対し、DHDPSの発現ベ
クターであるpED0801で形質転換したMV1184では4560単
位/mg蛋白質であり、通常の大腸菌での発現に対し10倍
の値を示した。

［発明の効果］ 本発明は高等植物DHDPS蛋白質、該蛋白質をコードす
るDNA配列、該蛋白質を発現させる方法を提供するもの
であり、DHDPS蛋白質の性質の研究、また該蛋白質をコ
ードするDNA配列を用いて微生物あるいは植物を形質転
換することを可能にしたものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は精製されたDHDPSから決定されたＮ−末端アミ
ノ酸配列と、これを基に合成されたDNAの配列を示す。 第２図はcDNAライブラリーより得られたDNA（pDA26）の
制限酵素地図を示す。 第３図はcDA17ライブラリーより得られたDNA（pDA17）
の制限酵素地図を示す。 第４図はcDNAライブラリーより得られたDNA（pDA26）の
塩基配列とコードされるアミノ酸配列を示す。 第５図はcDNAライブラリーより得られたDNA（pDA17）の
塩基配列とコードされるアミノ酸配列を示す。 第６図はpDA08より、DHDPSの発現ベクターpED0801を作
製した手順を示す。 第７図はDHDPS発現ベクターpED0801の塩基配列とコード
されるアミノ酸配列を示す。 第８図は単離された本発明のDHDPSのゲルろ過クロマト
グラムとDHDPS活性のピークを示す。 第９図はタンパク質レベルで単離されたDHDPSのSDSポリ
アクリルアミドゲル電気泳動の結果を模式的に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献 Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ, 85［１］ （1987），Ｐ．145−151 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/00 C12N 15/52 C12P 21/02 ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎＫ（Ｇ ｅｎｅｔｙｘ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の式（III）： で表されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において１
   個若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加
   されたアミノ酸配列を有し、且つアスパルテート・セミ
   アルデヒドとピルビン酸を縮合結合することによりジヒ
   ドロジピコリン酸を生成する能力を保持していることを
   特徴とする、ジヒドロピコリネート・シンターゼ活性を
   有する組換えタンパク質。
2. 【請求項２】式（III）に示されるアミノ酸配列を有す
   る請求項１記載のタンパク質。
3. 【請求項３】請求項１又は２記載のタンパク質をコード
   するDNA配列。
4. 【請求項４】下記の式（VI）： で表される塩基配列を有する請求項３記載のDNA配列。
5. 【請求項５】請求項３又は４に記載のDNA配列を保持
   し、宿主微生物中で複製可能で請求項１又は２記載のタ
   ンパク質を宿主微生物中で発現することができる組換え
   ベクター。
6. 【請求項６】請求項５記載の組換えベクターにより形質
   転換され、請求項１又は２記載のタンパク質を産生する
   ことができる微生物。
7. 【請求項７】請求項６に記載の微生物を培養し、請求項
   １又は２記載のタンパク質を回収する工程を含む、請求
   項１又は２記載のタンパク質の製造方法。