JPH02291267A - α―フェトプロテイン遺伝子のエンハンサーに結合する蛋白質をコードするＤＮＡ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 定栗よ優肌ユ分団 本発明は、α−フェトプロテインエンハンサに特異的に
結合し、該α−フエトプロテイン遺伝子の転写を促進さ
せる蛋白質をコードするＤＮＡに関する。

このＤＮＡは動物細胞における遺伝子の大量発現系に有
用である。

征１）胤 真核細胞の遺伝情報の調節は、転写（ｔｒａｎｓｃｒｉ
ｐｔｉｏｎ）ＲＮＡブロセッシング（ｐｒｏｃｅｓｓ　
ｉｎｇ）蛋白質への翻訳及び翻訳後のプロセッシングの
各段階で行われているが、このうち転写レベルでの調節
は遺伝情゜報の発現に最も強い影響を及ぼしている。

ところで、ＲＮＡポリメラーゼＨによって転写される遺
伝子の５′側には転写を制御するプロモーター及びプロ
モーター活性を調節するエンハンサーが存在する例もみ
られる。そして、最近、これらプロモーターやエンハン
サーの特異的な塩基配列を認識して結合する核内因子が
発見され、これらの因子の結合によりプロモーターの活
性が制御されることが明らかとなった。

上記因子に関しては、プロモーター領域に存在するＴＡ
ＴＡボックス、ＣＡＡＴポソクス、ＧＣボックスに結合
し、ＲＮＡポリメラーゼＨによる転写を促進させる蛋白
質の研究が進められており、ＣＡＡＴボックス結合因子
とＧＣボソクス結合因子に関してはｃＤＮＡがクローニ
ングされている。

一方、エンハンサー領域に結合する因子についても研究
が行われており、例えば、免疫グロブリンのκ鎖遺伝子
エンハンサーに結合するＢ細胞の特異的な因子Ｏ　Ｔ　
Ｆ　−２　（Ｏｃｔａｍｅｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉ
ｏｎｆａｃｔｏｒ−２）　　（Ｍｉｃｈａｅｌ　ｅｔ　
ａｌ．　ｒネイチ＋　　（Ｎａ　ｔｕｒｅ）　Ｊｙ狙，
　５４４−５５１，（１９８８））や同一エンハンサー
配列を認識するが他の組識にも汎在するＯＴＦ−１等（
Ｒ．Ａ，　Ｓｔｕｒ＋ｍ．、Ｇ．　Ｄａｓ　ａｎｄ　Ｗ
．　Ｈｅｒｒ　ｒジーンアンドディベロソブメントＪ　
（Ｇｅｎｅ　＆　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）１．　１５
８２（１９８８））のｃＤＮΔが単離されている。

ヒトα−フェトプロテイン遺伝子では、転写開始点の５
′側３．５　Ｋｂの位置にエンハンサー活性を示ず領域
の存在が確認されており、このエンハンサー領域に結合
する因子が発見され、ＡＦＰ−１と称せられている（Ｓ
ＡＷＡＤＡＩＳＨＩ　ｅｔ　ａｌ．　ｒモレキュラーア
ンドセルラーバイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄ
　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｊ　ｖｏｌ．８
．　５１７９−５１８７　（１９８８））。

しかし、ＡＦＰ−１の構造、物理化学的性質及びそれを
コードする遺伝子は未だ明らかにされていない。

允朋プ」仁（骸夫立｛】｝り策皿 本発明者らは、α−フェトプロテイン遺伝子のエンハン
サー頭域に存在するＴＴＡＡＴＡＡＴＴ’Ａ構造を中心
とする領域に特異的に結合する核内因子の研究を進めた
結果、この因子をコードする遺伝子ＤＮＡを得るととも
に該ＤＮＡの塩基配列を明らかにし、本発明をなすに至
った。

したがって、本発明は、α−フエｌ−プロテイン遺伝子
エンハンサー領域に結合する蛋白質をコドする、新規な
塩基配列で表わされるＤＮＡを提供することを課題とす
る。

課皿｛五犬工Ａｋムｑ王役 本発明に係るα〜フエトプロテイン遺伝子のエンハンサ
ー領域に結合する蛋白質は、第１図に示したアミノ酸配
列を一次配列の中に有する蛋白質であって、細胞核内に
存在し、α−フエ１・プロテイン生産細胞より抽出され
る。

したがって、本発明では、肝臓由来の細胞であって、α
−フェトプロテインを生産する細胞より目的とする遺伝
子ＤＮＡを得ることができる。

α−フエトプロテイン生産細胞としては、株化したヒト
肝癌細胞Ｈ　ｕ　Ｈ　−　７等の細胞を例示し得る。

本発明においては、如上のα−フエトプロテイン生産細
胞を培養し、得られた増殖細胞を回収した後、破砕して
ｓＲＮＡを抽出し、得られた抽出ＲＮＡ画分より、オリ
ゴ（ｄＴ）セルロースを用いてポリ（Ａ）ＲＮＡを常法
にしたがって回収する。

なお、上記ｍＲＮＡの抽出はグアニジンチオシアネート
塩化セシウム法（Ｊ．　Ｍ．　Ｃｈｉｒｇｗｉｎ　ｅｔ
　ａｌ．＋「バイオケミストリーＪ　（Ｂｉｏ−Ｃｈｅ
＋＋＋ｉｓｔｒｙ）■，　５２９４，（１９７９）　）
等の方法を採用して行うとよい。

次いで、上述のようにして回収したポリ（Ａ）ＲＮＡを
鋳型として逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、さら
に、このｃＤＮＡを２本鎖ｃ　ＤＮＡになした後、λフ
ァ一．ジにバッケージングして組換えファージを作製す
る。

ここで用いるλファージとしては市販のバフケージング
システム、例えばバッカージーンバ．７ケジングシステ
ム（ブロメガ社製）等が使用できる。

次に、上述のようにして作製した組換え体をホストであ
る大腸菌、例えばＥ．ｃｏｌｉ　Ｙ　１０９０（ｒ−’
）に導入し、さらに、この大腸菌をアガロースブレト上
で増殖させてｃＤＮＡライブラリーを作製する。このよ
うにして作製したｃ　ＤＮＡライブラリーよりα−フエ
トブロティン遺伝子のエンハンサー頭域のＤＮＡをプロ
ーブとしてスクリーニングすることにより、目的とする
α−フェ１・プロテイン遺伝子エンハンサー領域に結合
する蛋白質をコードするＤＮＡを得ることができる。

以下実施例により本発明を詳しく説明する。

実施例 本例ではヒト肝癌細胞由来の株化細胞Ｈ　ｕ　Ｈ　−７
よりα−フエトプロテイン遺伝子エンハンサー結合蛋白
質をコードするＤＮＡの調製を示す。

■α−フェトプロテイン生産細胞の培養原料細胞として
ヒト肝臓由来の細胞であって、α−フェトプロテイン遺
伝子の生産能を有する株化ヒト肝癌細胞Ｈ　ｕ　Ｈ−７
を用い、下記条件で培養を行った。

なお、上記細胞株は、岡山大学医学部付属癌源研究施設
、病理研究部門佐藤二郎教授の研究室より分譲可能であ
る。

培養条件： 培地としては、ラクトアルブミンの加水分解物（ギプコ
）を３％（一ｔ）添加したＲ　ＰＭ　Ｉ　−１６４０培
地あるいは牛胎児血清を５〜１０％（Ｖ／ν）を加えた
Ｒ　Ｐ　Ｍ　［−１６４０培地を用いた。この培養液は
適宜交換し、培養は５％炭酸ガスを含む空気を満たした
培養器内で行った。

■上記培養細胞からボＩＪ（Ａ）ＲＮＡの調製培養細胞
２Ｘ１０’個からグアニジンイソチオシアネート塩化セ
シウム法〔「バイオケミストリー」（ＢｉｏｃｈｅＩＩ
ｌｉｓｔｒｙ）　１８，　５２９４，（１９７９））を
用い、下記手順によりトータルＲＮＡを抽出した。

細胞に２０艷の６Ｍグアニジンイソチオシアネート、５
ＩＩＩＭクエン酸ナトリウム、０．１Ｍ　２−メルヵブ
トエタノール、０．５％Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナ
ト゛リウム溶液を添加し、ホモジナイズしたのち、この
ホモジネート１〇一当り１ｇの塩化セシウムを熔解した
。５．７Ｍ塩化セシウム、０．　ＬＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ
　（ｐＨ　７．５）２．５−をボリアロマー遠心管に入
れ、その上からホモジネート１０−を重層したのち、日
立超遠心ロクーＲＰＳ　４０Ｔ　ニよッ７３４，００Ｏ
ｒｐｍ　テ１８時間、２０℃で遠心を行った。遠心後、
沈渣をｌｍｌのｌＯｍＭ｝　’Ｊ　ス−ＨＣＩ（ｐＨ　
７．４）、５ｗＭ　ＥＤＴＡ，１％ＳＤＳに溶解し、こ
の溶液に等量のクロロホルム：ｎ−フタノール（４：１
、ν／ｖ）を加え、十分混合したのち、遠心分離して、
水層を得た。この水層に１／ｌｏｇの３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ　５．５）と２．５倍量のエタノルを加え混合
し、−７０’Ｃに２時間以上放置後遠心して沈澱を得た
。沈澱を７０％エタノールで洗った後乾固し、これをト
ータルＲＮＡとした。

トータルＲＮＡからポリ（Ａ）　Ｒ　Ｎ　Ａを調製する
には以下に述べる様にオリゴ（ｄＴ）セルロースを用い
たアフィニティーク口マトグラフィーを行った．オリゴ
（ｄＴ）セルロース５０＋ｎｇをＩＯＩｎＭトリスーＨ
ＣＩ（ｐｌｌ７．５）、０．５Ｍ　ＮａＣｌ，　１ｍＭ
　Ｅ　ＤＴＡ，　０．１％Ｓ　Ｏ　Ｓ溶液で平衡化し、
これに同緩衝液に溶解したトタルＲＮＡ３９０μｇを吸
着させた。非吸着ＲＮＡを同上緩衝液で洗い、次に、吸
着したＲＮＡを１０１トリスーＨＣＩ（ｐｌ１　７．５
）、１ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ，　０．０５％ＳＤＳで溶出さ
せた。この？容出液に１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム
（ｐＨ　５．５）と２．５倍容量のエタノールを加えて
混合したのちに＝７０℃に２時間以上放置した。遠心分
離によって沈澱を集め、７０％エタノルで洗ったのちに
滅菌蒸留水に溶解してポリ（Ａ）ＲＮＡとした。

■ｃＤＮＡの合成 ｃＤＮＡの合成はファルマシア社製のｃＤＮＡ合成キッ
トを用いて行った。

２．５１ｇ　１７）ボ’Ｊ（Ａ）ＲＮＡと０．４ｐｇＯ
）ランダムプライマー（ｄｐ（Ｎ）い宝酒造〕を第一鎖
合成反応液に加エ、以後はファルマシア社のプロトコー
ルにしたがって反応を行った。二本鎖ｃＤＮＡの両末端
にプロトコールにしたがって、ＥｃｏＲＩアダプターを
連結した。２．５μｇのポリ（Ａ）　Ｒ　Ｎ　Ａがら二
本鎖ＤＮＡ２．３μｇが得られた。

■組換えＤＮＡの作製と組換え体ファージの作製組換え
ＤＮＡの作製は、プロメガ社製のプロトクローンλｇｔ
ｌｌシステムを用い、プロトコールにしたがって行った
。得られた組換えＤＮＡは、プロメガ社製のパフヵージ
ーンバッヶージングシステムを用いて組換え体ファージ
としポスト大腸菌Ｙ１０９０　（ｒ−）に導入した。こ
の組換え体ファジをアガロースプレート上で増殖させ、
λｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーを作製した。このライ
ブラリのｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙは６　Ｘ　１０’であっ
た。

ｃＤＮＡの作製とλｇｔｌｌ発現ベクター作製の工程は
第３図に示した。

■スクリーニング 上記λｇｔｌｌｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
はすでに発表されでいる方法に従って行った（Ｃｅｌ１
．５２，　４１５　（１９８８））　．スクリーニング
用のブローブはヒトα−フエトプロテイン遺伝子の５′
側上流に位置するエンハンサー領域（Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　　８．
　５１７９　（１９８８））のＤＮＡを材料として作製
した（第４図参照）。エンハンサーを含む領域より、制
限酵素ＨｇｉＡＩ　とＢｓｔＮ　１によってエンハンサ
ー活性をもつＤＮＡフラグメントを切り出し、この末端
をＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏ−フラグメント用いて
補填した。一方、ｐＵＣ１８ブラスミドをＢａｍＨＩに
よって切断し、この末端も同様に補填した。この両者を
７４ＤＮＡＩＪガーゼ（宝酒造）によって接続し、組換
え体プラスミドＩ）Ａ　Ｆ　Ｅ　（ＨｇｉＡ　Ｉ　／　
ＢｓｔＮ　Ｉ）１を作製した。

ｐＡ　Ｆ　Ｅ（ＨｇｉＡ　Ｉ　／　ＢｓｔＮ　ＩＮを制
限酵素ＸｂａｌとＰｓｔｌによって加水，分解し、エク
ソヌクレアーゼ■とマングビーンヌクレアーゼ（宝酒造
）を用いて削除反応を行ったのち、末端をＤＮＡポリメ
ラーゼＫｌｅｎｏ−フラグメントを用いて補填し、この
末端にＸｈｏｌリンカーを挿入して閉環した。

生じたプラスミドを大腸菌ＤＨ５に導入して得゜られた
デリション・ミュータントの中から望ましい塩基配列を
持つクローンを選択し、これをｐＡＦＥ　（ＨｇｉＡ　
Ｉ／Ｘｈｏｌ）１と名づけだ。ｐＡＦ　Ｅ（ＨｇｉＡ　
Ｉ　／　Ｘｈｏ　Ｉ）１を制限酵素Ｎ１ａｒＶとＸｈｏ
ｌによって加水分解し、エンハンサーを含むフラグメン
トをアガロース電気泳動によって分離した。

このＮｌａｒＶ／Ｘｈｏｌフラグメントの末端をＤＮＡ
ポリメラーゼκｌｅｎｏｗフラグメントによって補填し
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結したのち、ｌｌｉｎ
ｅ■で加水分解したｐＵＣｌ８ブラスミドとＴ４リガゼ
を用いて連結した。生じた組換えプラスミドを大腸菌Ｄ
Ｈ５α（ＢＲＬ社）に導入し、組換え体の中から望まし
いクローンを選択した。このクローンに含まれる組換え
プラスミドには上記ＮｌａＩＶ／Ｘｈｏｌフラグメント
が６個連結されて旧ｎｅｌ１サイトに挿入されていた。

このプラスミドをρＡＦ　Ｅ　（Ｎ１ａｌＶ／　Ｘｈｏ
　Ｉ　）６と名づけた。ｐＡＦ　Ｅ（Ｎ１ａｒＶ／Ｘｈ
ｏｌ）６を制限酵素Ｓｍａ　Ｔと旧ｎｃＵ（宝酒造）に
よって切断し、エンハンサーを含むＳｎ＋ａ　Ｉ　／　
Ｉｌｉｎｃ　ＩＩフラグメントを分離したのち、Ｔ４ボ
リヌクレチオドキナーゼと５′〔γ・”Ｐ）　ＡＴＰを
用いて標識し、これをスクリーニング用ブローブとして
使用した。３ＸＩＯ’個のプラークをスクリーニングし
てプローブと特異的に結合するクローンを単離し、これ
をλ２と名づけだ。λ２のブラークを含むアガロースを
プレートから切り出し、５０ｍＭ　｝リスーＨＣＩ（ｐ
ｌｌ　７．５）、０．ＩＭ　ＮａＣｌ　、８．ｂ＋Ｍ　
ＭｇＳＯ４、０．１％ゼラチンに懸濁してファージを溶
出したのち、クロロホルムを一滴加えて４℃に保存した
． ■溶原菌抽出液の作製 上記保存ファージをすでに発表されている方法（ＤＮＡ
クローニング、ｖｏｔ．，１　、Ｄ，Ｍ．グローバー編
集Ｉ　Ｒ　ＬＰｒｅｓｓ出版、１９８５年、ｐ４９）に
従ってＹ１０８９大腸菌に感染させ熔原菌を作製した。

次に溶原苗より　Ｓｉｎｇｈらの方法（Ｃｅｌｌ．５２
．　４１５　１９８８）に従って抽出液を作製した。コ
ントロールとしてｃＤＮＡを含まないλｇｔｌｌファー
ジをＹ　１０８９に惑゜染させ、この溶原菌からも同様
に抽出液を作製した。

■ゲルシフトアッセイ ゲルシフトアッセイは、上記熔原菌抽出液と■で述べた
ｐＡ　Ｆ　Ｅ　（ＨｇｉＡ　ｒ　／　ＢｓｔＮ　ＩＮか
らＳｍａ　Ｉと旧ｎｃＩＩによって切り出したエンハン
サーＤＮＡフラグメントの５′末端を３２Ｐ標識して作
製したプローブとを用いて既存の方法（Ｎａｔｕｒｅ　
３１９１５４，　１９８８）に従って行った。

第５図に結果を示すように、λ２の感染した溶原菌の抽
出液を用いた場合にシフトした二本のハンド（ａ，ｂ）
が検出され、このバンドはｃＤＮＡを持たないλｇｔｌ
ｌの溶原菌抽出物では検出されなかったことがらλ２に
クローンされたＣＤＮＡにコードされる蛋白質がプロー
ブに結合する性質を持つことが示された。

■　フットプリント法によるＤＮＡ塩基配列上の蛍白質
結合部位の同定 １０ｍＭ　トリスーＨＣＩ（ｐＨ　７．５）、５０ｍＭ
　ＮａＣ１　，　ｌｍＭ　ＤＴＴ，　０．５ａ＋Ｍ　Ｅ
　ＤＴＡ，　２．５ｍＭ　ＭｇＣＩｚ　、３ｔｌｇ　！
１０ｌｙ（ｄｌ−ｄＣ）ｐｏｌｙ（ｄｉ−ｄＣ）　、５
％グリセロールを含む７５μｌの反応液中で１６μｇの
蛋白質を含むλ２溶原菌抽出液と■で述べたｐＡ　Ｆ　
Ｅ　（ＨｇｉＡ　Ｉ／ＢｓｔＮ　ＩＮから作製したＳｍ
ａ　Ｉ　／Ｉｌｉｎｃ■プローブを混合し、室温に３０
分放置した。このブローブは片方の５′末端のみが２２
ｐによって標識されている。この反応液に４０ｎｇ／　
ｐ　ｌ！の［）Ｎａｓｅｌを１μ／加え、室温で１分間
反応させたのち、０．５ＭＥＤＴＡを２．３μｌ加えて
反応を止めた。この反応液をゲルシフトアッセイ用の５
％ポリアクリルアミドゲルに供与し、ｌｌｖ／ｃＩＩ１
でプロモフェノールブルが下端近くへ移動するまで電気
泳動を行った。

片方のガラス板を除き、ゲルをサランランプで包んだの
ちＸ線フイルムを密着させオートラジオグラフィーを作
製した。

蛋白質と結合したＤＮＡのバンドと結合していないＤＮ
Ａのバンドに相当する位置のゲルを切り゜出し、０．５
−の０．５Ｍ酢酸アンモニウム、０．１％ＳＤＳ、１ｍ
ＭＥＤＴＡで室温において一夜抽出した。

遠心して上清を取り、ゲル片は同溶出液０．５−で２回
洗い、洗液と上清を合わせた。これに５μｇのトランス
ファーＲＮＡを加えたのち等量のフェノール：クロロホ
ルム（１　：　１）で抽出し、水層に２倍量のエタノー
ルを加えて−７０℃に３０分以上保存した．ＤＮＡを遠
心分離によって集め、７０％エタノールで１回洗ったの
ち、減圧乾固した。このＤＮＡをｌＯμｌの８０％ホル
ムアミド、ｌＯｍＭ　ＮａＯＨ、１ｓＭ　ＥＤＴＡ，０
．１％キシレンシアノール、０．１％プロモフェノール
ブルーに溶解し、９０℃で３分加熱したのち３〜４μｌ
を塩基配列決定用の７Ｈ尿素を含む８％ポリアクリルア
ミドゲルに供与した。

サイズマーカーとしてプローブＤＮＡをマキサムギルバ
ート法によってアデニンとグアニンの位置で化学的に切
断したもの（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙｖｏｌ．６５，　４９９．　１９８０）を供に泳動
した。

電気泳動終了後オートラジオグラフイーを行った結果を
第６図に示す。図のように蛋白質と結合していないＤＮ
Ａと比べ、蛋白質と結合していたＤＮＡではＴＴＡＡＴ
ＡＡＴＴＡを中心とする１５塩基対がＤ　Ｎａｓｅ　Ｉ
の分解から保護されていることが示された。

■λ２ファージにクローンされたｃ　ＤＮＡの塩基配列 λ２フプージのＤＮＡを一般的な方法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒｃｌｏｎｉｎｇ　，　ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　
ｍａｎｕａｌ　．．ｐ７６　＊　１９８２）に従って調
製し、ＥｃｏＲＩによって加水分解したのちアガロース
電気泳動によってインサートＤＮＡを分離した。

このＤＮＡの塩基配列をジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５，　５６０．　１９
８０）及びＭａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法（Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６５，　４９９．
　１９８０）を用いて決定した結果を第７図に示す。

次に、上述のλ２ｃＤＮＡにコードされた蛋白質が結合
するＤ　Ｎ　Ａ　？ｉＪＴ域がエンハンサー活性を持つ
ことを下記に示すキャソトアソセイにより６１ｉ　ｉ２
した． ［相］キャットアフセイ 実施例において■で述べたｐＡＦＥ　（ＨｇｉＡＩ／Ｘ
ｈｏｌＨより分離したＮＩａｌＶ／Ｘｈｏｒフラグメン
トを、キャットアッセイ用ベクターｐＡＦ１．０ＣＡＴ
のＣｌａサイトに平滑末端ライゲーションによって挿入
し、ｐＡＦ１．ＯＥ２４ＣＡＴを作製した（第８図参照
）。

ｐＡＦ１．ＯｃＡＴにはα−フェトプロテイン遺伝子の
プロモーター領域のＤＮＡｌｋｂと大腸菌のクロラムフ
ェニコール・アセチルトランスフェラゼの構造遺伝子、
そしてＳＶ４０のポリ（Ａ）付加シグナルおよびｔ一抗
原遺伝子イントロンが含まれている．このベクターはエ
ンハンサー活性をもつＤＮＡフラグメントの検索に用い
られる（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｗ．　２６２，　４８１
２．１９８７）。キャットブラスミドのＨｕＨ−７細胞
への導入とキャノトアフセイは既存の方法（Ｍｏｌ．　
Ｃｅｌｌ．　Ｒｉｏｔ．　２，　１０４４．　１９８２
）を基本として次のように行った。

７５−の培養フラスコに８　Ｘ　１０’程度の細胞を培
養し、これに２０〜３０μｇのキャノトブラスミドＤＮ
Ａをリン酸カルシウム法によって導入した。３％ラクト
アルプミン加水分解物を含むＲ　ＰＭ　Ｉ　−１６４０
培地で２日間培養したのち細胞をＰＢＳで洗い、ポリス
マンを用いて細胞をはがした。細胞を低速遠心（８００
ｒｐｍ．５ａ＋ｉｎ）によって集め、４ｋＭ｝−リスー
ＨＣＩ（ｐＨ　７．５）、１ｓＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　，
　１５０ｍＭ　ＮａＣＩで一度洗ったのち１００μｌの
２５０ｌｌｌＭトリスー１）ＣＩ（ｐＨ　７．５）に懸
濁した．凍結融解を５回繰り返して細胞を破砕し、エッ
ベンドルフ遠心機で１２，ＯＯＯｒｐｍ＋，　５分間遠
心して上清を得た．これを６５℃、ｌＯ分間熱処理し、
エフペンドルフ遠心機で１２，　ＯＯＯｒｐｍ、５分間
遠心して得た上滑を細胞辿出液とした． 細胞抽出液中の蛋白質濃度をバイオランド社のプロテイ
ン・アソセイ・キットを用いて測定し、５０〜２００μ
ｇの蛋白質を次のキャフトアッセイに使用した。キャソ
ト　アッセイの典型的な反応液１８０μ／中には２５０
ｍＭ　　｝リス−１）ＣＩ（ｐｌ！　７．５）、０．１
゛μＣｉ　（”Ｃ）クロラムフェニコール（アマシャム
）、０．４ｍＭアセチルＣｏＡ、５０μｇ〜２００μｇ
細胞抽出蛋白質が含まれていた。この反応液を３７℃で
６０分〜１８０分間インキユベートし、酢酸エチルをｌ
＋＋＋ｆｆｉ加えてクロラムフエニコールとそのアセチ
ル化物を抽出した。酢酸エチル層を回収し、減圧乾固し
たのち、２０μｌの酢酸エチルに再溶解し、その一部ま
たは全部をシリカゲルプレート　（メルク社）に供与し
て、クロロホルム：メタノール（９６　：　４）を用い
て展開した。展開後シリカゲルプレートを室温で乾燥し
、サランラップに包んでオー１・ラジオグラフィーを行
った。　第９図に示すように、αフェトプロテイン遺伝
子上流のエンハンサー領域のＤＮＡを含むキャソトプラ
スミドｐＡ．Ｆ１．ＯＥ２４ＣＡＴを用いた場合にはｐ
ＡＦ１．ＯｃＡＴに比較して高い活性が認められ、Ｎｌ
ａｌＶ／Ｘｈｏｌフラグメントにエンハンサー活性の存
在することがわかった．

【図面の簡単な説明】

第１図は、上記ＤＮＡがコードする、α−フエトプロテ
イン遺伝子エンハンサーに結合する蛋白質のアミノ配列
を示し、第２図は、本発明によるＤＮＡの塩基配列を示
す． 第３図は、ｍＲＮＡよりｃＤＮＡを得て、λｇｔｌｌ発
現ベクターに組み込むための手順を示し、図中の→印は
ｃＤＮＡが組み込まれるｌａｃＺ遺伝子の挿入位置を示
す。 第４図はヒトα−フェトプロテイン遺伝子５′上流に存
在するエンハンサー領域の制限酵素地図を表したもので
、イニシエーションサイトの上流−３．３　ｋｂから−
３．７　ｋｂの領域は拡大して示されている． 旧とＨａはそれぞれ制限酵素旧ｎｄＤＩとＨａｅ　ＩＩ
Ｉの認識部位を示す。 第５図は、λ２とλｇｔｌｌの溶原菌抽出液を用いたゲ
ルシフトアノセイを示したものであり、コントロールは
抽出液を加えない場合のパターン、λ２溶原閑の抽出液
を用いた場合にのみ、二木のシフ゛トしたバンド（ａ，
ｂ）が見られる。 第６図は、λ２溶原菌抽出液を用いたＤ　Ｎａｓｅ　１
フットプリントを表わす．Ｇ＋ＡはＭａｙａｍ−Ｇｉｌ
ｂｅｒｔ法の化学的切断によって作製したサイズマーカ
レーン１はタンパク質と結合していないＤＮＡのバンド
から抽出されたＤＮＡ、２と３はそれぞれタンパク質と
結合してシフトしたバンドａとｂの位置から抽出したＤ
ＮＡをそれぞれ表わす。 ＡはＳｍａｌサイトの５′末端が標識された場合、Ｂ４
’！ＨｉｎｃＵサイトの５′末端が標識された場合ノパ
ターン、ＣはＡとＢの結果をまとめたものを示す。 第７図は、λ２にクローンされたｃＤＮＡの塩基配列と
それにコードされたタンパク質の“アミノ酸配列を示す
。 第８図は、キャソトブラスミドｐ　Ａ　Ｆ１．０Ｅ２４
ＣＡＴ（７）構築を表わし、ｐ　Ａ　Ｆｌ．ＯＥ２４Ｃ
　Ａ　ＴはｐＡＦ１．ＯｃＡＴのＣｌａ＋サイトにエン
ハンサー領域のＮｌａｒＶ／Ｘｈｏｌフラグメント（３
１ｂｐ）を挿入することによって構築したことを示す。 第９図は、ヒト肝癌細胞培養株Ｈ　ｕ　Ｈ〜７株を用い
たキャソトアソセイを示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）α−フェトプロティン遺伝子エンハンサーに特異
   的に結合する蛋白質であって、第１図に示されるアミノ
   酸配列をもった蛋白質をコードするＤＮＡ。
2. （２）ＤＮＡは添付の第２図に示した塩基配列で表わさ
   れる請求項（１）に記載のＤＮＡ。