JPS62262995A - ヒトβ―アクチン遺伝子のプロモーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野コ 本発明はヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターおよび
それを用いる蛋白質の製造方法に関する。

［従来の技術および発明が解決しようとする問題点］ 近年、組換ＤＮＡ技術の向上により動物細胞を宿主とす
る物質生産の技術が開発され、種々の物質の動物細胞に
よる生産が報告されている。

そのような生産に用いられるプロモーターは５１ａｉａ
ｎ　ｖｉｒｕｓ　４０　　（以下、ＳＶ４０という）の
プロモーターあるいはチミジンキナーゼのプロモーター
などがあるが、これらのプロモーター活性のみでは発現
の程度は弱く、エンハンサ−との結合、増幅遺伝子との
結合などで生産性をあげる工夫がなされていた。

［問題点を解決するための手段］ 本発明者らは、さらに高い活性を有するプロモーターを
検討した結果、ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター
がＳＶ４０のプロモーターよりも高い活性があることを
見出し本発明を完成した。

アクチンは細胞骨格を形成する主要蛋白であり細胞の全
蛋白質中で最も含量が多く、その遺伝子は正常真核細胞
由来の遺伝子としては非常に強いプロモーター活性を有
すると考えられる。

ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターのＤＮＡはヒト
ＤＮＡからえられるが、ヒトＤＮＡは、たとえばヒト由
来の培養細胞を用いプリン（Ｂ１１ｎ）らの方法［Ｂ１
１ｎ、Ｎら（１９７６年）のユニクレイック　アシッズ
　リサーチ（ＮｕｅｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｃｓ、）３
巻、２３０３頁参照］を用いて調製される。

ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターのクローニング
ベクターとしては、ｃｈａｒｏｎ　２８に代表されるλ
フアージベクター、ｐＢＲ３２２に代表されるプラスミ
ドベクターなどが利用できるが、一般的には高率で長鎖
のＤＮＡ断片をクローニングできるλフアージベクター
を用いる方法が用いられる。

上記でえられたヒトＤＮＡを適切な制限酵素で切断後、
λフアージベクターの置換可能領域の代りに挿入し組換
えファージＤＮＡを作成する。

つぎにインビトロパッケージングの手法を用いてファー
ジ粒子を作成し、宿主大腸菌とともにプレートにまき、
組換え型ファージプラークを形成させる［エンキストら
（１９７９年）のメソッズ　イン　エンザイモロジ−（
ＭｅｔｈＯｄＳ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｚｙ）　、８８
巻、　２８１頁参照］。ヒトβ−アクチン遺伝子断片を
有する組換えファージのプラーク検出は、ｃＤＮＡや合
成りＮＡをプローブとするプラークハイブリダイゼーシ
ョン［ウーら（１９７９年）のメソッズ　イン　エンザ
イモロジー、６８巻、３８９頁、およびシスタックら（
１９７９年）の同４１７頁参照］が利用できる。

検出された組換えファージは回収後、宿主大腸菌ととも
に培養することにより大量に調製できる。また組換え型
ファージのＤＮＡはフェノール法などにより調製できる
。調製されたＤＮＡはマキサム・ギルバート法、Ｍ−１
３法などによって配列を決定することができ、それによ
ってプロモーター配列を有するか否かが決定できる。

またプロモーターの活性は、ヒトβ−アクチン遺伝子の
５”側頭域と原核細胞由来のクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼ（以下、ＣＡＴという）遺伝子
との融合遺伝子を作成し、Ｌｔｋ−細胞に形質転換し、
生産されるＣＡＴの活性を調べることにより測定するこ
とができる〔ゴーマン（Ｇｏｒａ＋ａｎ）ら（１９８２
年）のモレキュラー　アンド　セルラー　バイオロジー
（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　２巻、１０４４〜
１０５１頁参照］。

このようにしてえられたヒトβ−アクチン遺伝子のプロ
モーターは下記の配列を有していた。

ＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡ　ＧＣＡＣＣＣＣＡＡＧ　ＧＣＧ
ＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ　ＣＣＣＴＣＣＴ
ＣＣＴ　ＣＴＴＣＣＴＣＡＡＴＣＴＣＧＣＴＣＴＣＧ　
ＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴＣＧＣＡＡＡＡＣＧＡ
ＧＧＧＧＡＧ　ＡＣＧＣＧＧＴＡＡＡ　ＡＡＡＡＴＧＣ
ＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣＧＧＣＧＡＡＧＣＣＧＧＴＧ　Ａ
ＧＴＧＡＧＣＧＧＣＧＣＧＧＧＧＣＣＡＡ　ＴＣＡＧＣ
ＧＴＧＣＧ　ＣＣＧＴＴＣＣＧＡＡＡＧＴＴＧＣＣＴＴ
Ｔ　ＴＡＴＧＧＣＴＣＧＡ　ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＣＧ
ＧＣＧＣＣＣＴＡ　ＴＡＡＡＡＣＣＣＡＧ　ＣＧＧＣＧ
ＣＧＡＣＧＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＡＣＣＧ
　ＣＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＧＡＧＣＡＣＡＧ　ＡＧＣ
ＣＴＣＧＣＣＴ　ＴＴＧＣＣＧＡＴＣＣＧＣＣＧＣＣＣ
ＧＴＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＧＴＡＡＧＣＣ
ＣＧＧＣＣＡＧＣＣＧＡＣＣにＧＧＧＣＡＴＧＣＧＧＣ
ＣＧＣＧＧＣＣＣＣＴＴＣＧ　ＣＣＣＧＴＩＩ；ＣＡＧ
Ａ　ＧＣＣＧＣＣＧＴＣＴＧＧＧＣＣＧＣＡＣＣＧＧＧ
ＧＧＧＣＧＣＡ　ＴＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＣＣＧＧＡＣ
ＣＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＡＡＧＣＣ
ＣＣＴＧＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＧＡＴＧ　ＧＧＧＧＡＣ
ＡＣＣＣ９℃ ＣＡＣＧＣＣＡＧＴＴ　　ＣＧＧＡＧＧＣＧＣＧ　　Ａ
ＧＧＣＣＧＣＧＣＴＧ２ａ　　　　　　　　　　　　ｃ
Ｒｒ　　　　　　　　　　　　Ｃ４゜ＣＧＧＧＡＧＧＣ
ＧＣＧＣＴＣＣＧＧＧにＧ　　ＴＧＣＣＧＣＴＣＴＣｃ
ｂｏ　　　　　　　　　　　Ｇ’Ｍ ＧＧＧＧＣＧＧＧＧＧ　　ＣＡＡＣＣＧＧＣＧＧ　　Ｇ
ＧＴＣＴＴＴＧＴＣｃａｎ　　　　　　　　　　　ｔｊ
ｌａ　　　　　　　　　　　６ｔｍＴＧＡＧＣＣＧＧＧ
ＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＴ　　ＧＧＧＧＡＴＣＧＣＡ６１
０　　　　　　　　　　６２Ｄ　　　　　　　　　　　
６ＭＧＧＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＣＣＴＡＧＣＣＣＣＣＧ
ＣＣＡＧＧＣＣθψ　　　　　　　　　　　１６０　　
　　　　　　　　　　々ＣＣＧＧＴＧＧＧＧＧＣＴＧＧ
ＧＧＣＧＣＣＡ　　ＴＴＧＣＣＧＧＴＧＣ６７０Ｕｏ　
　　　　　　　　　　ｂ９ａＣＣＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴ
ＴＧＧＧＣＧＣＴ　　ＡＡＣＴＧＣＧＴＧＣ７ｍ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７２
０にＣＧＣＴＧＧＧＡＡ　　ＴＴＧＧＣＧＣＴＡＡ　　
ＴＴＧＣＧＣＧＴＧＣ７３０７ＣＯ ＧＣＧＣＴＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＴ　　ＡＡＴ
ＴＧＣＧＣＣＴ７６０　　　　　　　　　　　ｎｏ　　
　　　　　　　　　７ａ。

ＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧ　　ＧＣＣＣＧＧＧＧＴＧ　　Ｃ
ＣＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＴＣＧＣＧＣＧ　　ＡＡＧＣ
ＣＣＧＣＣＴ　　ＣＧＧＣＣＧＧＡＡＣ８２０ａｍ　　
　　　　　　　　ａ４゜ＧＧＧＴＧＧＧＧＴＣＧＣＣＣ
ＣＧＧＣＴＣＣＣＧＧＧＣＧＣＴＴＧＣＣＣＧＣＡＣＴ
￥’　ｃｃｔｃｃｃｃｃＡ’ｆｆ’　ｃｃｃｃｒｃｃｃ
ｃｃ’Ｂｅｅｒ　　　　　　　　　　　　８９１１　　
　　　　　　　　　９ｏＯＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧ　　Ｔ
ＧＧＣＣＧＣＴＧＣＧＴＣＣＧＣＧＣＧＣ９ｔｏ　　　
　　　　　　　　９２６　　　　　　　　　　９？０Ｇ
ＣＣＧＡＣＣＣＧＧ　　ＣＧＣＴＧＴＴＴＣＡ　　ＡＣ
ＣＧＧＧＣＧＧＡ９４０　　　　　　　　　　９’５Ｄ
　　　　　　　　　　　９６０ＧＧＣＧＧＧＧＣＴＧ　
　ＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴ　　ＧＧＧＡＧＧＧＧＧＴ９７
０　　　　　　　　　　９８ｏ　　　　　　　　　　　
＃ＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧ　　ＣＴＴＣＣＴＣＣＣＧ　　
ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＧＡＣＧＣＣＴＣＣＧＡＣＣＡ
ＧＴＧＴＴ　　ＴＧＣＣＴＴＴＴＡＴ１１１Ｊ１７　　
　　　　　　　　　１ζ随　　　　　　　　　　　ｔｏ
ｃ。

ＣＧＴＡＡＴＡＡＣＧ　　ＣＧＧＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣ
ＴＴＣＣＴＴＴ１６６１１１＋７フｏｒｏａ。

ＧＴＣＣＣＣＡＡＴＣＴＧＧＧＣＧＣＧＣＧ　　ＣＣＧ
ＧＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣ ＣＧＧＣＣＣＧＣＣＴ　　ＡＡＧＧＡＣＴＣＧＧ　　Ｃ
ＧＣＧＣＣＧＧＡＡＧＴＧＧＣＣＡＣＧＧ　　ＣＧＧＧ
ＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＴＣＡＣＡＧＣＣＣＣＣＣＣ
Ｇ　　ＧＣＴＡＴＴＣＴＣＧ　　ＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡ
ＧＧＡＴＧ 本プロモーターの特徴として、上記配列１番目付近のポ
リオーマウィルスのエンハンサ一様配列を含めた３カ所
のエンハンサ一様の塩基配列、上記配列２２０番目付近
のＴＡＴＡボックス以下に存在するＺ−ＤＮＡ構造をと
りうる塩基配列があることがあげられ、これらの配列が
゛β−アクチンプロモーターの活性に大きな影響を与え
ているものと考えられる。また該プロモーターは従来よ
り使用されている５Ｖ４Ｇのプロモーターよりも１．７
倍高い活性を有し、真核細胞由来のプロモーターとして
種々の蛋白質の生産に応用され有用性が高いものである
。

［実施例］ 以下に実施例を示すが、本発明における諸実験は内閣総
理大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」にしたがって
行なった。

実施例１ ヒトβ−アクチン遺伝子のクローニング（１）ヒトゲノ
ムライブラリーの作製 ヒトセルラインＯＵＴ−１４（Ｋａｋｕｎａｇａ　、　
Ｔ、７８Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　７５．１３３４頁）を１０
％ウシ胎児血清（以下、Ｆｅ２という）を含む、イーグ
ル最小必　・須培地（イーグルＭＥＮ）で培養後、遠心
にて集め、イーグルＭＥＮで洗浄した。１０１０個のＨ
ＵＴ−１４を５０ｍ１の　０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、　　０
．５％ザルコシル、　１００μｇ／ｍｌプロテアーゼに
の溶液に懸濁し、３時間振盪して溶解した。フェノール
抽出を３回行ない、水層を２０ｍＭ　）リス−１１ＣＩ
（ｐｉｔ　ａ、ｏ＞、ｌＯａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ。

１０ｍＭＮａｃｆに対し透析した。透析物を３７℃で３
．５時間リボヌクレアーゼ１００μｇ　／　ｍｌで処理
し、フェノール抽出後、２０ｍＭトリス−１１ｃ１（ｐ
ｔｌ　ｓ、口）、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ　５１０ｄ　Ｎａ
Ｃｌに対して透析し、高分子のヒトＤＮＡをえた。ヒト
ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲｌで部分分解し、ショ糖密度
勾配遠心により約１５ｋｂの大きさのＥｃｏＲ１部分分
解断片を調製した。

ラムダファージベクターｃｈａｒｏｎ　４Ａ　ＤＮＡを
ＥｃｏＲＩで切断後、ショ糖密度勾配遠心により左端断
片、右端断片を含む両分をそれぞれ集め、エタノール沈
澱により回収した。ヒトＬ５ｋｂ　ＤＮＡＥｃｏＲＩ断
片と、ｃｈａｒｏｎ　４Ａの両端断片をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合後インビトロパッケージングを行ない、大腸
菌ＬＥ　３９２を宿主として組換えファージのプラーク
を形成させた。

（２）β−アクチン遺伝子のプロモーターの検出プラー
クハイブリダイゼーション法［ベンソンド（Ｂｅｎｔｈ
ｏｎｄ）およびデービス（Ｄａｖｉｓ）　（１９７７年
）のサイエンス、１９６巻、　１８０頁参照］により検
出した。コーティング領域のプローブとしてβ−アクチ
ン偽遺伝子［モント（Ｍｏｎｔｅ）ら（１９８３年）の
モレキュラー　アンド　セルラー　バイオロジー（Ｍｏ
１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）、３巻、１７８３〜１７９
１頁］のｌ１ｉｎｆ’ｌ　０Ｊｋｂ断片（プローブＩ）
、非翻訳領域のプローブとしてβ−アクチン偽遺伝子の
ｌ１ｉｎｆ’Ｉ　Ｏ，２ｋｂ断片（プローブ■）をそれ
ぞれ″Ｐラベルしたものおよびβ−アクチン遺伝子の最
初の６個のアミノ酸をコードするＤＮＡ配列ＣＴＣＡＣ
ＣＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧＡＴＡＴＣＧＣＣを合成し　Ｐ
ラベルしたもの（プローブ■）を用いた。

プローブＩおよびプローブ■の両方のプローブとハイブ
リダイズするクローンが２５株えられ、さらにプローブ
■を用いたばあい６５℃でフィルターを洗浄してもハイ
ブリダイズするクローンλＨａ１６０株１株かえられた
。

（３）ＤＮＡ配列の決定 λＨａ１６０のファージクローンを単離し、宿主大腸菌
ＬＥ−３９２とともに培養し、ファージ溶菌液をえた。

遠心後上清をＳＤＳ処理し、酢酸カリウムを添加し、エ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収した。ＤＮＡは制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断し、０．７％アガロースゲルにかけ
、サザーン法で確認、回収した。ＤＮＡを精製後、マキ
サム・ギルバート法によってプロモータ一部分のＤＮＡ
配列を決定　１した。その結果、塩基配列はつぎのとお
りであった。

４０　　　　　　　　　　　　　　Ｇ（ｌ　　　　　　
　　　　　　　　ｂ。

ＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴ　　ＣＣＣＴＣＣＴＣＣＴ　　Ｃ
ＴＴＣＣＴＣＡＡＴ１６１＋　　　　　　　　　　　　
１７１１　　　　　　　　　　　　ｌ８０ＧＣＧＧＧＧ
ＣＣＡＡ　　ＴＣＡＧＣＧＴＧＣＧ　　ＣＣＧＴＴＣＣ
ＧＡＡＬｉＬ＋Ｌ＋１１ｊＬｉｌｊＬ；ＬｉＬ；　　Ｌ
ｉＬｉＵしｌ八しししし　ししししし八−しししｌ４ｏ
　　　　　　　　　　　ｂｏｏ　　　　　　　　　　　
ｂｂ。

ＣＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＧＧＣＧＣＧＣＣＡ　　ＴＴＧ
ＣＣＧＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＧＴＣＣＴＴＴＧＧＣＣＣ
ＣＴ　　ＡＡＣＴＧＣＧＴＧＣＧＣＧＣＴＧＧＧＡＡ　
　ＴＴＧＧＣＧＣＴＡＡ　　ＴＴＧＣＧＣＣＴＧＣ７３
１）　　　　　　　　　　　７４０　　　　　　　　　
　７り０ＧＣＧＣＴＧＧＧＡＣＴＣＡＡＧＧＣＧＣＴ　
　ＡＡＴＴＧＣＣＣＧＴ７６ｏ　　　　　　　　　　　
　　　　　　フ７０　　　　　　　　　　　　　　　　
７ＪＯＧＣＧＴＴＣＴＧＧＧ　　ＧＣＣＣＧＧＣＧＴＧ
　　ＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧ７９０　　　　　　　　８０
０　　　　　　　　　ａｔＯＧＧＣＴＧＧＧＧＣＧ　　
ＡＡＧＧＣＧＧＯＣＴ　　ＣＣＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧ
ＴＧＣ；ＧＧＴＣＧＣＣＧＣＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＧ
ＣＴＴａｇｏ　　　　　　　　　　　ａω　　　　　　
　　　　ｔｎａＧＣＧＣＧＣＡＣＴＴ　　ＣＣＴＧＣＣ
ＣＧＡＧ　　ＣＣＧＣＴＧＧＣＣＧ８８ｏ　　　　　　
　　　　　８９ｏ　　　　　　　　　　　９ｏ。

ＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧ　　ＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＧＴＧ
ＣＣＣＣＣＣＣ９／Ｉ）　　　　　　　　　　９２０　
　　　　　　　　　９３０ＧＣＣＧＡＣＣＣＧＧ　　Ｃ
ＧＣＴＣＴＴＴＣＡ　　ＡＣＣＧＧＧＣＧＣＡ９４０　
　　　　　　　　９．０　　　　　　　　　９ωＧＧＣ
ＧＣ；ＧＧＣＴＧ　　ＧＣＧＣＣＣＧＧＴＴ　　ＧＧＣ
ＡＩＣＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧ　　ＣＴＴＣＣ
ＴＧＣＩＪ　　ＣＧＣＧＣＣＧＣＣＧＧＣｉＡＣＧＣＣ
ＴＣＣＧＡＣＣＡＧＴＧＴＴ　　ＴＣＣＣＴＴＴＴＡＴ
ｒｏｚｏ　　　　　　　　　　　ｒｏ４ｏＩＯＧＯＧＧ
ＴＡＡＴＡＡＣＧ　　ＣＧＧＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＴＴ
ＣＣＴＴＴｒｏω　　　　　　　　　　１０１０　　　
　　　　　　　７０１３０ＧＴＣＣＣＣＡＡＴＣＴＧＧ
ＧＣＧＣＧＣＧ　　ＣＣＣＧＣＣＣＣＣＣｒｏｃｒ。

ＣＴＧＧＣＣＧＣＣＴ　　ＡＡＣｉＧＡＣＴＣＧＧ　　
Ｃｔｌ；ＣＧＣＣＧＧＡＡ１＋２０１１９０　　　　　
　　　　　　　ｌ１４０ＧＴＧＧＣＣＡＧＧＧ　　ＣＧ
ＧＧＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＴＣＡＣＩＩ６０１１７
０ ＡＧＣＧＣＧＣＣＣＧ　　ＧＣＴＡＴＴＣＴＣＧ　　Ｃ
ＡＧＣＴＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧ 実施例２ ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターによるクロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡ
Ｔ遺伝子）の発現 ＣＡＴ遺伝子のβ−アクチン遺伝子のプロモーターへの
結合は以下のようにして行なった。

実施例１で単離したＤＮＡを第１図に示すように制限酵
素５ａｌａｌ　５Ｓａｊ　Ｉで切断し、５ａｆｆ　Ｉの
制限酵素切断部位をＳｔヌクレアーゼを用いてＨ１ｎｄ
ｍリンカ−で置換し、約１２００ｂｐのヒトβ−アクチ
ン遺伝子のプロモーター断片をえた。

ＣＡＴ遺伝子を有する発現ベクターｐｓＶ２−８Ｈを制
限酵素ＳａＮ　Ｉ　、　Ｈｌｎｄｎ［で切断し、これに
ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーター断片を混合し、
Ｔａ　ＤＮＡリガーゼで結合し、これをｐβ１０９７−
ＣＡＴとした。これらをカルシウムフォスフェート法［
ライスラ−（Ｗｌｓｌｅｒ）らのプロシーディングズ　
オブ　ザ　ナショナル　アカデミーオブ　サイエンスイ
ズ　オブ　ザ　ユナイテッド　ステイツ　オブ　アメリ
カ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　。

ＡｃａｄｙＳｃｌ、ＵＳＡ）　（１９７９）７８．３．
１３７３〜１３７Ｂ頁参照コを用いて、マウスＬｔｋ−
株に導入し、５９１ＦＣ９を含むイーグルＨＥＭで４８
時間培養した。尼下ゴールマンらのＣＡＴアッセイ法［
Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、２巻、１０４４〜１０５１頁、ライスラーら
のフロシーディングズ　オブ　ザ　ナショナル　７カデ
ミー　オブ　サイエンスイズ　オブ　ザユナイテッド　
ステイツ　オブ　アメリカ（Ｐｒｏｅ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ｔｌＳＡ）、　１旦、　６７７７〜８５
８１コにしたがってＣＡＴａｓｅ活性を測定した。

すなわち、１４ｃでラベルされたクロラムフェニコール
（０，０２ｍａ＋ｏｌｅ、　１　μｃｉ）細胞抽出液２
μΩに４ａ＋ＭアセチルコエンザイムＡ　２０μｇを力
えて３７℃で反応させ、薄層クロマトグラフィー［メル
ク社製Ｔ’２５４、展開溶媒：クロロホノムーメタノー
ル（１９：１）］にかけ、アセチノ化されたクロラムフ
ェニコールの放射能活性シβ−スキャナーで測定した。

比較例としてヒトβ−アクチン遺伝子のブーモーターの
かわりに５Ｖ４Ｄのプロモーターを同）の方法で導入し
たプラスミドｐｓＶ２−ＣＡＴを用（てＣＡＴアッセイ
を行なった。ｐ’３Ｖ２−ＣＡＴを用いた！　　　ばあ
い、比活性は（１，４７ｃｐｍ／μｇ蛋白質／分、ｐβ
１０９７−ＣＡＴを用いたばあいはＱ、８１ｃｐｍ／　
ｕ　ｇ蛋白質／分の比活性を示し、β−アクチン遺伝子
のプロモーターが約１．７倍高かった。すなわち　１．
７倍のＣＡＴ蛋白質が生産されていることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２においてｐβ１０９７−ＣＡＴを０
　　　うる手順を示す模式図である。 ］ し 特許出願人　　蜜酒造株式会社　はか１名ゴ 支

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　下記のＤＮＡ配列を有するヒトβ−アクチン遺伝子
   のプロモーター。 【遺伝子配列があります】 ２　ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターに接続され
   た特定の蛋白質をコードするＤＮＡ。 ３　特定の蛋白質をコードするＤＮＡがクロラムフェニ
   コールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ
   である特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ。 ４　ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターに接続され
   た特定の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された細
   胞。 ５　特定の蛋白質をコードするＤＮＡがクロラムフェニ
   コールアセチルトランスフェラーゼをコードするＤＮＡ
   である特許請求の範囲第４項記載の細胞。 ６　ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターに接続され
   た特定の蛋白質をコードするＤＮＡで形質転換された細
   胞を培養することによる、該特定の蛋白質を製造する方
   法。 ７　特定の蛋白質がクロラムフェニコールアセチルトラ
   ンスフェラーゼである特許請求の範囲第６項記載の方法
   。