JPH067168A - ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いる蛋白質の製造方法 - Google Patents
ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いる蛋白質の製造方法Info
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- JPH067168A JPH067168A JP5060394A JP6039493A JPH067168A JP H067168 A JPH067168 A JP H067168A JP 5060394 A JP5060394 A JP 5060394A JP 6039493 A JP6039493 A JP 6039493A JP H067168 A JPH067168 A JP H067168A
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- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターに接
続された特定の蛋白質をコードするDNA で形質転換され
た細胞を培養することによる、該特定の蛋白質を製造す
る方法。 【効果】 本発明の製造方法により、種々の蛋白質を効
率よく発現させることができる。
続された特定の蛋白質をコードするDNA で形質転換され
た細胞を培養することによる、該特定の蛋白質を製造す
る方法。 【効果】 本発明の製造方法により、種々の蛋白質を効
率よく発現させることができる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトβ−アクチン遺伝
子のプロモーターを用いる蛋白質の製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、組換えDNA 技術の向上により動物細胞を宿主とする
物質生産の技術が開発され、種々の物質の動物細胞によ
る生産が報告されている。そのような生産に用いられる
プロモーターはSimian virus 40 （以下、SV40という）
のプロモーターあるいはチミジンキナーゼのプロモータ
ーなどがあるが、これらのプロモーター活性のみでは発
現の程度は弱く、エンハンサーとの結合、増幅遺伝子と
の結合などで生産性をあげる工夫がなされていた。 【０００３】本発明者らは、さらに高い活性を有するプ
ロモーターを検討した結果、ヒトβ−アクチン遺伝子の
プロモーターがSV40のプロモーターよりも高い活性があ
ることを見出し本発明を完成した。 【０００４】 【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、ヒ
トβ−アクチン遺伝子のプロモーターに接続された特定
の蛋白質をコードするDNA で形質転換された細胞を培養
することによる、該特定の蛋白質を製造する方法を提供
する。 【０００５】アクチンは細胞骨格を形成する主要蛋白で
あり細胞の全蛋白質中で最も含量が多く、その遺伝子は
正常真核細胞由来の遺伝子としては非常に強いプロモー
ター活性を有すると考えられる。 【０００６】ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターの
DNA はヒトDNA からえられるが、ヒトDNA は、たとえば
ヒト由来の培養細胞を用いブリン(Blin)らの方法［Bli
n、Nら（1976年）のニュクレイック アシッズ リサー
チ(Nucleic Acids Res.)、３巻、2303頁参照］を用いて
調製される。 【０００７】ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターの
クローニングベクターとしては、charon 28 に代表され
るλファージベクター、pBR 322 に代表されるプラスミ
ドベクターなどが利用できるが、一般的には高率で長鎖
のDNA 断片をクローニングできるλファージベクターを
用いる方法が用いられる。 【０００８】前記でえられたヒトDNA を適切な制限酵素
で切断後、λファージベクターの置換可能領域の代りに
挿入し組換えファージDNA を作成する。つぎにインビト
ロパッケージングの手法を用いてファージ粒子を作成
し、宿主大腸菌とともにプレートにまき、組換え型ファ
ージプラークを形成させる［エンキストら（1979年）の
メソッズ イン エンザイモロジー(Methods in Enzymo
lozy) 、68巻、 281頁参照］。ヒトβ−アクチン遺伝子
断片を有する組換えファージのプラーク検出は、cDNAや
合成DNA をプローブとするプラークハイブリダイゼーシ
ョン［ウーら（1979年）のメソッズ イン エンザイモ
ロジー、68巻、 389頁、およびゾスタックら（1979年）
の同 417頁参照］が利用できる。 【０００９】検出された組換えファージは回収後、宿主
大腸菌とともに培養することにより大量に調製できる。
また組換え型ファージのDNA はフェノール法などにより
調製できる。調製されたDNA はマキサム・ギルバート
法、M-13法などによって配列を決定することができ、そ
れによってプロモーター配列を有するか否かが決定でき
る。 【００１０】またプロモーターの活性は、ヒトβ−アク
チン遺伝子の５´側領域と原核細胞由来のクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（以下、CAT とい
う）遺伝子との融合遺伝子を作成し、 Ltk- 細胞に形質
転換し、生産されるCAT の活性を調べることにより測定
することができる［ゴーマン(Gorman)ら(1982 年）のモ
レキュラー アンド セルラー バイオロジー(Mol.Cel
l.Biol.)、２巻、1044〜1051頁参照］。 【００１１】このようにしてえられたヒトβ−アクチン
遺伝子のプロモーターは配列番号１で示される下記の配
列を有していた。 【００１２】 【化１】【００１３】 【化２】【００１４】本プロモーターの特徴として、前記配列１
番目付近のポリオーマウィルスのエンハンサー様配列を
含めた３カ所のエンハンサー様の塩基配列、前記配列22
0 番目付近のTATAボックス以下に存在するZ-DNA 構造を
とりうる塩基配列があることがあげられ、これらの配列
がβ−アクチンプロモーターの活性に大きな影響を与え
ているものと考えられる。また該プロモーターは従来よ
り使用されているSV40のプロモーターよりも 1.7倍高い
活性を有し、真核細胞由来のプロモーターとして種々の
蛋白質の生産に応用され有用性が高いものである。 【００１５】 【実施例】以下に実施例を示すが、本発明における諸実
験は内閣総理大臣の定める「組換えDNA 実験指針」にし
たがって行なった。 【００１６】実施例１ ［Ｉ］ヒトβ−アクチン遺伝子のクローニング （１）ヒトゲノムライブラリーの作製 ヒトセルラインHUT-14(Kakunaga 、T.78 P.N.A.S. 75、
1334頁）を10％ウシ胎児血清（以下、FCS という）を含
む、イーグル最小必須培地（イーグルMEM)で培養後、遠
心にて集め、イーグルMEM で洗浄した。1010個のHUT-14
を50mlの 0.5MEDTA、 0.5％ザルコシル、 100μｇ／ml
プロテアーゼＫの溶液に懸濁し、３時間振盪して溶解し
た。フェノール抽出を３回行ない、水層を20mMトリス−
ＨＣｌ(pH 8.0)、10mM EDTA 、 10mM ＮａＣｌに対し透
析した。透析物を37℃で 3.5時間リボヌクレアーゼ 100
μｇ／mlで処理し、フェノール抽出後、20mMトリス−Ｈ
Ｃｌ(pH 8.0)、１mM EDTA 、 10mM ＮａＣｌに対して透
析し、高分子のヒトDNAをえた。ヒトDNA を制限酵素Eco
RI で部分分解し、ショ糖密度勾配遠心により約15kbの
大きさのEcoRI 部分分解断片を調製した。 【００１７】ラムダファージベクターcharon 4A DNA を
EcoRI で切断後、ショ糖密度勾配遠心により左端断片、
右端断片を含む画分をそれぞれ集め、エタノール沈澱に
より回収した。ヒト15kb DNA EcoRI断片と、charon 4A
の両端断片をＴ4 DNA リガーゼで結合後インビトロパッ
ケージングを行ない、大腸菌LE 392を宿主として組換え
ファージのプラークを形成させた。 【００１８】 （２）β−アクチン遺伝子のプロモーターの検出 プラークハイブリダイゼーション法［ベンソンド(Benth
ond)およびデービス(Davis)(1977年）のサイエンス、 1
96巻、 180頁参照］により検出した。コーティング領域
のプローブとしてβ−アクチン偽遺伝子［モント(Mont
e) ら（1983年）のモレキュラー アンド セルラー
バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)、３巻、1783〜1791頁］
のHinfI 0.3kb 断片（プローブＩ）、非翻訳領域のプロ
ーブとしてβ−アクチン偽遺伝子のHinfI 0.2kb 断片
（プローブII）をそれぞれ32Ｐラベルしたものおよびβ
−アクチン遺伝子の最初の６個のアミノ酸をコードする
DNA配列CTCACCATGGATGATGATATCGCCを合成し32Ｐラベル
したもの（プローブIII ）を用いた。 【００１９】プローブＩおよびプローブIIの両方のプロ
ーブとハイブリダイズするクローンが25株えられ、さら
にプローブIII を用いたばあい65℃でフィルターを洗浄
してもハイブリダイズするクローンλHa160 株１株がえ
られた。 【００２０】（３）DNA 配列の決定 λHa160 のファージクローンを単離し、宿主大腸菌LE39
2 とともに培養し、ファージ溶菌液をえた。遠心後上清
をSDS 処理し、酢酸カリウムを添加し、エタノール沈澱
によりDNA を回収した。DNA は制限酵素EcoRI で切断
し、 0.7％アガロースゲルにかけ、サザーン法で確認、
回収した。DNA を精製後、マキサム・ギルバート法によ
ってプロモーター部分のDNA 配列を決定した（配列番号
１参照）。その結果、塩基配列はつぎのとおりであっ
た。 【００２１】 【化３】【００２２】 【化４】【００２３】［II］ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモー
ターによるクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子（CAT 遺伝子）の発現 CAT 遺伝子のβ−アクチン遺伝子のプロモーターへの結
合は以下のようにして行なった。 【００２４】［Ｉ］で単離したDNA を図１に示すように
制限酵素 SmaI 、Sal Ｉで切断し、Sal Ｉの制限酵素切
断部位をSIヌクレアーゼを用いてHind IIIリンカーで置
換し、約1200bpのヒトβ−アクチン遺伝子のプロモータ
ー断片をえた。CAT 遺伝子を有する発現ベクターpSV2-S
H を制限酵素Sal Ｉ、Hind IIIで切断し、これにヒトβ
−アクチン遺伝子のプロモーター断片を混合し、 T4 DN
A リガーゼで結合し、これを pβ1097-CATとした。これ
らをカルシウムフォスフェート法［ウィスラー(Wisler)
らのプロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカ
デミー オブサイエンスイズ オブ ザ ユナイテッド
ステイツ オブ アメリカ(Proc.Natl. Acad.Sci.US
A)(1979) 76、３、1373〜1376頁参照］を用いて、マウ
ス Ltk-株に導入し、５％FCS を含むイーグルMEM で48
時間培養した。以下ゴールマンらのCAT アッセイ法［Mo
l.Cell. Biol. ２巻、1044〜1051頁、ウィスラーらのプ
ロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー
オブ サイエンスイズオブ ザ ユナイテッド ステ
イツ オブ アメリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、79、
6777〜6581］にしたがってCATase活性を測定した。 【００２５】すなわち、14Ｃでラベルされたクロラムフ
ェニコール（ 0.02mmole、１μCi）細胞抽出液20μｌに
４mMアセチルコエンザイムA 20μｌを加えて37℃で反応
させ、薄層クロマトグラフィー［メルク社製 F２５４、
展開溶媒：クロロホルム−メタノール（19：１）］にか
け、アセチル化されたクロラムフェニコールの放射能活
性をβ−スキャナーで測定した。 【００２６】比較例としてヒトβ−アクチン遺伝子のプ
ロモーターのかわりにSV40のプロモーターを同様の方法
で導入したプラスミド pSV2-CAT を用いてCAT アッセイ
を行なった。pSV2-CATを用いたばあい、比活性は 0.47c
pm／μｇ蛋白質／分、 pβ1097-CATを用いたばあいは
0.81cpm／μｇ蛋白質／分の比活性を示し、β−アクチ
ン遺伝子のプロモーターが約 1.7倍高かった。すなわち
1.7倍のCAT 蛋白質が生産されていることがわかる。 【００２７】 【発明の効果】本発明によれば、真核細胞由来のプロモ
ーターを用いることにより種々の蛋白質を効率よく発現
させることが可能となる。 【００２８】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：1176 配列の型：核酸 配列の種類：Genomic DNA 起 源 生物名：ホモ サピエンス（Homo sapiens） 株名：ＨＵＴ−１４ 配 列 CCCGGGCCCA GCACCCCAAG GCGGCCAACG CCAAAACTCT CCCTCCTCCT CTTCCTCAAT 60 CTCGCTCTCG CTCTTTTTTT TTTTCGCAAA AGGAGGGGAG AGGGGGTAAA AAAATGCTGC 120 ACTGTGCGGC GAAGCCGGTG AGTGAGCGGC GCGGGGCCAA TCAGCGTGCG CCGTTCCGAA 180 AGTTGCCTTT TATGGCTCGA GCGGCCGCGG CGGCGCCCTA TAAAACCCAG CGGCGCGACG 240 CGCCACCACC GCCGAGACCG CGTCCGCCCC GCGAGCACAG AGCCTCGCCT TTGCCGATCC 300 GCCGCCCGTC CACACCCGCC GCCAGGTAAG CCCGGCCAGC CGACCGGGGC ATGCGGCCGC 360 GGCCCCTTCG CCCGTGCAGA GCCGCCGTCT GGGCCGCAGC GGGGGGCGCA TGGGGGGGGA 420 ACCGGACCGC CGTGGGGGGC GCGGGAGAAG CCCCTGGGCC TCCGGAGATG GGGGACACCC 480 CACGCCAGTT CGGAGGCGCG AGGCCGCGCT CGGGAGGCGC GCTCCGGGGG TGCCGCTCTC 540 GGGGCGGGGG CAACCGGCGG GGTCTTTGTC TGAGCCGGGC TCTTGCCAAT GGGGATCGCA 600 GGGTGGGCGC GGCGTAGCCC CCGCCAGGCC CGGTGGGGGC TGGGGCGCCA TTGCCGGTGC 660 GCGCTGGTCC TTTGGGCGCT AACTGCGTGC GCGCTGGGAA TTGGCGCTAA TTGCGCGTGC 720 GCGCTGGGAC TCAAGGCGCT AATTGCGCGT GCGTTCTGGG GCCCGGGGTG CCGCGGCCTG 780 GGCTGGGGCG AAGGCGGGCT CGGCCGGAAG GGGTGGGGTC GCCGCGGCTC CCGGGCGCTT 840 GCGCGCACTT CCTGCCCGAG CCGCTGGCCG CCCGAGGGTG TGGCCGCTGC GTGCGCGCGC 900 GCCGACCCGG CGCTGTTTGA ACCGGGCGGA GGCGGGGCTG GCGCCCGGTT GGGAGGGGGT 960 TGGGGCCTGG CTTCCTGCCG CGCGCCGCGG GGACGCCTCC GACCAGTGTT TGCCTTTTAT 1020 GGTAATAACG CGGCCGGCCC GGCTTCCTTT GTCCCCAATC TGGGCGCGCG CCGGCGCCCC 1080 CTGGCGGCCT AAGGACTCGG CGCGCCGGAA GTGGCCAGGG CGGGGGCGAC TTCGGCTCAC 1140 AGCGCGCCCG GCTATTCTCG CAGCTCACCA TGGATG 1176
子のプロモーターを用いる蛋白質の製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、組換えDNA 技術の向上により動物細胞を宿主とする
物質生産の技術が開発され、種々の物質の動物細胞によ
る生産が報告されている。そのような生産に用いられる
プロモーターはSimian virus 40 （以下、SV40という）
のプロモーターあるいはチミジンキナーゼのプロモータ
ーなどがあるが、これらのプロモーター活性のみでは発
現の程度は弱く、エンハンサーとの結合、増幅遺伝子と
の結合などで生産性をあげる工夫がなされていた。 【０００３】本発明者らは、さらに高い活性を有するプ
ロモーターを検討した結果、ヒトβ−アクチン遺伝子の
プロモーターがSV40のプロモーターよりも高い活性があ
ることを見出し本発明を完成した。 【０００４】 【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、ヒ
トβ−アクチン遺伝子のプロモーターに接続された特定
の蛋白質をコードするDNA で形質転換された細胞を培養
することによる、該特定の蛋白質を製造する方法を提供
する。 【０００５】アクチンは細胞骨格を形成する主要蛋白で
あり細胞の全蛋白質中で最も含量が多く、その遺伝子は
正常真核細胞由来の遺伝子としては非常に強いプロモー
ター活性を有すると考えられる。 【０００６】ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターの
DNA はヒトDNA からえられるが、ヒトDNA は、たとえば
ヒト由来の培養細胞を用いブリン(Blin)らの方法［Bli
n、Nら（1976年）のニュクレイック アシッズ リサー
チ(Nucleic Acids Res.)、３巻、2303頁参照］を用いて
調製される。 【０００７】ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターの
クローニングベクターとしては、charon 28 に代表され
るλファージベクター、pBR 322 に代表されるプラスミ
ドベクターなどが利用できるが、一般的には高率で長鎖
のDNA 断片をクローニングできるλファージベクターを
用いる方法が用いられる。 【０００８】前記でえられたヒトDNA を適切な制限酵素
で切断後、λファージベクターの置換可能領域の代りに
挿入し組換えファージDNA を作成する。つぎにインビト
ロパッケージングの手法を用いてファージ粒子を作成
し、宿主大腸菌とともにプレートにまき、組換え型ファ
ージプラークを形成させる［エンキストら（1979年）の
メソッズ イン エンザイモロジー(Methods in Enzymo
lozy) 、68巻、 281頁参照］。ヒトβ−アクチン遺伝子
断片を有する組換えファージのプラーク検出は、cDNAや
合成DNA をプローブとするプラークハイブリダイゼーシ
ョン［ウーら（1979年）のメソッズ イン エンザイモ
ロジー、68巻、 389頁、およびゾスタックら（1979年）
の同 417頁参照］が利用できる。 【０００９】検出された組換えファージは回収後、宿主
大腸菌とともに培養することにより大量に調製できる。
また組換え型ファージのDNA はフェノール法などにより
調製できる。調製されたDNA はマキサム・ギルバート
法、M-13法などによって配列を決定することができ、そ
れによってプロモーター配列を有するか否かが決定でき
る。 【００１０】またプロモーターの活性は、ヒトβ−アク
チン遺伝子の５´側領域と原核細胞由来のクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（以下、CAT とい
う）遺伝子との融合遺伝子を作成し、 Ltk- 細胞に形質
転換し、生産されるCAT の活性を調べることにより測定
することができる［ゴーマン(Gorman)ら(1982 年）のモ
レキュラー アンド セルラー バイオロジー(Mol.Cel
l.Biol.)、２巻、1044〜1051頁参照］。 【００１１】このようにしてえられたヒトβ−アクチン
遺伝子のプロモーターは配列番号１で示される下記の配
列を有していた。 【００１２】 【化１】【００１３】 【化２】【００１４】本プロモーターの特徴として、前記配列１
番目付近のポリオーマウィルスのエンハンサー様配列を
含めた３カ所のエンハンサー様の塩基配列、前記配列22
0 番目付近のTATAボックス以下に存在するZ-DNA 構造を
とりうる塩基配列があることがあげられ、これらの配列
がβ−アクチンプロモーターの活性に大きな影響を与え
ているものと考えられる。また該プロモーターは従来よ
り使用されているSV40のプロモーターよりも 1.7倍高い
活性を有し、真核細胞由来のプロモーターとして種々の
蛋白質の生産に応用され有用性が高いものである。 【００１５】 【実施例】以下に実施例を示すが、本発明における諸実
験は内閣総理大臣の定める「組換えDNA 実験指針」にし
たがって行なった。 【００１６】実施例１ ［Ｉ］ヒトβ−アクチン遺伝子のクローニング （１）ヒトゲノムライブラリーの作製 ヒトセルラインHUT-14(Kakunaga 、T.78 P.N.A.S. 75、
1334頁）を10％ウシ胎児血清（以下、FCS という）を含
む、イーグル最小必須培地（イーグルMEM)で培養後、遠
心にて集め、イーグルMEM で洗浄した。1010個のHUT-14
を50mlの 0.5MEDTA、 0.5％ザルコシル、 100μｇ／ml
プロテアーゼＫの溶液に懸濁し、３時間振盪して溶解し
た。フェノール抽出を３回行ない、水層を20mMトリス−
ＨＣｌ(pH 8.0)、10mM EDTA 、 10mM ＮａＣｌに対し透
析した。透析物を37℃で 3.5時間リボヌクレアーゼ 100
μｇ／mlで処理し、フェノール抽出後、20mMトリス−Ｈ
Ｃｌ(pH 8.0)、１mM EDTA 、 10mM ＮａＣｌに対して透
析し、高分子のヒトDNAをえた。ヒトDNA を制限酵素Eco
RI で部分分解し、ショ糖密度勾配遠心により約15kbの
大きさのEcoRI 部分分解断片を調製した。 【００１７】ラムダファージベクターcharon 4A DNA を
EcoRI で切断後、ショ糖密度勾配遠心により左端断片、
右端断片を含む画分をそれぞれ集め、エタノール沈澱に
より回収した。ヒト15kb DNA EcoRI断片と、charon 4A
の両端断片をＴ4 DNA リガーゼで結合後インビトロパッ
ケージングを行ない、大腸菌LE 392を宿主として組換え
ファージのプラークを形成させた。 【００１８】 （２）β−アクチン遺伝子のプロモーターの検出 プラークハイブリダイゼーション法［ベンソンド(Benth
ond)およびデービス(Davis)(1977年）のサイエンス、 1
96巻、 180頁参照］により検出した。コーティング領域
のプローブとしてβ−アクチン偽遺伝子［モント(Mont
e) ら（1983年）のモレキュラー アンド セルラー
バイオロジー(Mol.Cell.Biol.)、３巻、1783〜1791頁］
のHinfI 0.3kb 断片（プローブＩ）、非翻訳領域のプロ
ーブとしてβ−アクチン偽遺伝子のHinfI 0.2kb 断片
（プローブII）をそれぞれ32Ｐラベルしたものおよびβ
−アクチン遺伝子の最初の６個のアミノ酸をコードする
DNA配列CTCACCATGGATGATGATATCGCCを合成し32Ｐラベル
したもの（プローブIII ）を用いた。 【００１９】プローブＩおよびプローブIIの両方のプロ
ーブとハイブリダイズするクローンが25株えられ、さら
にプローブIII を用いたばあい65℃でフィルターを洗浄
してもハイブリダイズするクローンλHa160 株１株がえ
られた。 【００２０】（３）DNA 配列の決定 λHa160 のファージクローンを単離し、宿主大腸菌LE39
2 とともに培養し、ファージ溶菌液をえた。遠心後上清
をSDS 処理し、酢酸カリウムを添加し、エタノール沈澱
によりDNA を回収した。DNA は制限酵素EcoRI で切断
し、 0.7％アガロースゲルにかけ、サザーン法で確認、
回収した。DNA を精製後、マキサム・ギルバート法によ
ってプロモーター部分のDNA 配列を決定した（配列番号
１参照）。その結果、塩基配列はつぎのとおりであっ
た。 【００２１】 【化３】【００２２】 【化４】【００２３】［II］ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモー
ターによるクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ遺伝子（CAT 遺伝子）の発現 CAT 遺伝子のβ−アクチン遺伝子のプロモーターへの結
合は以下のようにして行なった。 【００２４】［Ｉ］で単離したDNA を図１に示すように
制限酵素 SmaI 、Sal Ｉで切断し、Sal Ｉの制限酵素切
断部位をSIヌクレアーゼを用いてHind IIIリンカーで置
換し、約1200bpのヒトβ−アクチン遺伝子のプロモータ
ー断片をえた。CAT 遺伝子を有する発現ベクターpSV2-S
H を制限酵素Sal Ｉ、Hind IIIで切断し、これにヒトβ
−アクチン遺伝子のプロモーター断片を混合し、 T4 DN
A リガーゼで結合し、これを pβ1097-CATとした。これ
らをカルシウムフォスフェート法［ウィスラー(Wisler)
らのプロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカ
デミー オブサイエンスイズ オブ ザ ユナイテッド
ステイツ オブ アメリカ(Proc.Natl. Acad.Sci.US
A)(1979) 76、３、1373〜1376頁参照］を用いて、マウ
ス Ltk-株に導入し、５％FCS を含むイーグルMEM で48
時間培養した。以下ゴールマンらのCAT アッセイ法［Mo
l.Cell. Biol. ２巻、1044〜1051頁、ウィスラーらのプ
ロシーディングズ オブ ザ ナショナル アカデミー
オブ サイエンスイズオブ ザ ユナイテッド ステ
イツ オブ アメリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)、79、
6777〜6581］にしたがってCATase活性を測定した。 【００２５】すなわち、14Ｃでラベルされたクロラムフ
ェニコール（ 0.02mmole、１μCi）細胞抽出液20μｌに
４mMアセチルコエンザイムA 20μｌを加えて37℃で反応
させ、薄層クロマトグラフィー［メルク社製 F２５４、
展開溶媒：クロロホルム−メタノール（19：１）］にか
け、アセチル化されたクロラムフェニコールの放射能活
性をβ−スキャナーで測定した。 【００２６】比較例としてヒトβ−アクチン遺伝子のプ
ロモーターのかわりにSV40のプロモーターを同様の方法
で導入したプラスミド pSV2-CAT を用いてCAT アッセイ
を行なった。pSV2-CATを用いたばあい、比活性は 0.47c
pm／μｇ蛋白質／分、 pβ1097-CATを用いたばあいは
0.81cpm／μｇ蛋白質／分の比活性を示し、β−アクチ
ン遺伝子のプロモーターが約 1.7倍高かった。すなわち
1.7倍のCAT 蛋白質が生産されていることがわかる。 【００２７】 【発明の効果】本発明によれば、真核細胞由来のプロモ
ーターを用いることにより種々の蛋白質を効率よく発現
させることが可能となる。 【００２８】 【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：1176 配列の型：核酸 配列の種類：Genomic DNA 起 源 生物名：ホモ サピエンス（Homo sapiens） 株名：ＨＵＴ−１４ 配 列 CCCGGGCCCA GCACCCCAAG GCGGCCAACG CCAAAACTCT CCCTCCTCCT CTTCCTCAAT 60 CTCGCTCTCG CTCTTTTTTT TTTTCGCAAA AGGAGGGGAG AGGGGGTAAA AAAATGCTGC 120 ACTGTGCGGC GAAGCCGGTG AGTGAGCGGC GCGGGGCCAA TCAGCGTGCG CCGTTCCGAA 180 AGTTGCCTTT TATGGCTCGA GCGGCCGCGG CGGCGCCCTA TAAAACCCAG CGGCGCGACG 240 CGCCACCACC GCCGAGACCG CGTCCGCCCC GCGAGCACAG AGCCTCGCCT TTGCCGATCC 300 GCCGCCCGTC CACACCCGCC GCCAGGTAAG CCCGGCCAGC CGACCGGGGC ATGCGGCCGC 360 GGCCCCTTCG CCCGTGCAGA GCCGCCGTCT GGGCCGCAGC GGGGGGCGCA TGGGGGGGGA 420 ACCGGACCGC CGTGGGGGGC GCGGGAGAAG CCCCTGGGCC TCCGGAGATG GGGGACACCC 480 CACGCCAGTT CGGAGGCGCG AGGCCGCGCT CGGGAGGCGC GCTCCGGGGG TGCCGCTCTC 540 GGGGCGGGGG CAACCGGCGG GGTCTTTGTC TGAGCCGGGC TCTTGCCAAT GGGGATCGCA 600 GGGTGGGCGC GGCGTAGCCC CCGCCAGGCC CGGTGGGGGC TGGGGCGCCA TTGCCGGTGC 660 GCGCTGGTCC TTTGGGCGCT AACTGCGTGC GCGCTGGGAA TTGGCGCTAA TTGCGCGTGC 720 GCGCTGGGAC TCAAGGCGCT AATTGCGCGT GCGTTCTGGG GCCCGGGGTG CCGCGGCCTG 780 GGCTGGGGCG AAGGCGGGCT CGGCCGGAAG GGGTGGGGTC GCCGCGGCTC CCGGGCGCTT 840 GCGCGCACTT CCTGCCCGAG CCGCTGGCCG CCCGAGGGTG TGGCCGCTGC GTGCGCGCGC 900 GCCGACCCGG CGCTGTTTGA ACCGGGCGGA GGCGGGGCTG GCGCCCGGTT GGGAGGGGGT 960 TGGGGCCTGG CTTCCTGCCG CGCGCCGCGG GGACGCCTCC GACCAGTGTT TGCCTTTTAT 1020 GGTAATAACG CGGCCGGCCC GGCTTCCTTT GTCCCCAATC TGGGCGCGCG CCGGCGCCCC 1080 CTGGCGGCCT AAGGACTCGG CGCGCCGGAA GTGGCCAGGG CGGGGGCGAC TTCGGCTCAC 1140 AGCGCGCCCG GCTATTCTCG CAGCTCACCA TGGATG 1176
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、実施例１において pβ1097-CATをうる
手順を示す模式図である。
手順を示す模式図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｎ 15/54
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターに接続され
た特定の蛋白質をコードするDNA で形質転換された細胞
を培養することによる、該特定の蛋白質を製造する方
法。 ２ 特定の蛋白質がクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼである特許請求の範囲第１項記載の方
法。
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|---|---|---|---|
| JP61107181A JPH07106152B2 (ja) | 1986-05-10 | 1986-05-10 | ヒトβ―アクチン遺伝子のプロモーター |
| JP5060394A JPH06102036B2 (ja) | 1986-05-10 | 1993-03-19 | ヒトβ−アクチン遺伝子のプロモーターを用いる蛋白質の製造方法 |
Applications Claiming Priority (2)
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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- 1986-05-10 JP JP61107181A patent/JPH07106152B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-03-19 JP JP5060394A patent/JPH06102036B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
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Also Published As
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|---|---|
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| JPH06102036B2 (ja) | 1994-12-14 |
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