PT98399A

PT98399A - Metodo para a transformacao integrativa de leveduras utilizando elementos repetitivos dispersos

Info

Publication number: PT98399A
Application number: PT98399A
Authority: PT
Inventors: Jeffery R Shuster
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1990-07-20
Filing date: 1991-07-19
Publication date: 1992-05-29
Also published as: US5629203A; WO1992001800A1; IE912551A1

Description

«SSSSa

Titular: CHIRON CORPORATION

Epiqrafe: "MÉTODO PARA TRANSFORMAÇÃO INTEGRATIVA DE LEVEDURAS USANDO ELEMENTOS REPETITIVOS DISPERSOS"

MEMÓRIA D ESC R I T I V A

Campo do invento

Este invento diz respeito à biologia molecular de leveduras e fungos, assim como a métodos de transformação de leveduras usando plasmideos integrativos.

Antecedentes do invento A expressão de proteínas recombinantes é correntemente posta em prática através do uso de diversos sistemas de expressão e células hospedeiras, cada qual possuindo as suas próprias vantagens e desvantagens. As células procariotas, tais como a E. coli, são geralmente empregues porque as estirpes de E. coli estão bem caracterizadas, estão disponíveis diversos promotores fortes, as células hospedeiras comportam um grande número de plasmideos convenientes para transformação e expressão, e as células hospedeiras podem ser cultivadas, até se obterem densidades elevadas, com relativa facilidade. No entanto, as células procarióticas hospedeiras são incapazes de expressar correctamente os produtos de um DNA que contenha introns, e não 1

proporcionam, de forma geral, a glicosilação de proteínas, que poderá ser necessária para garantir a actividade e/ou estabilidade de muitas proteínas eucarióticas.

As células de mamifero, tais como as células CHO e COS, são por vezes usadas para a expressão de proteinas. As células de mamifero podem expressar produtos de um DNA contendo introns, e são geralmente capazes de expressar proteinas com os adequados grau de glicosilação, ligações dissulfureto, etc. No entanto, as células de mamifero são frequentemente de cultura muito dificil, e são susceptiveis a infecções. Elas são também substancialmente mais complexas, e podem requerer que o DNA heterólogo seja integrado no genoma da célula hospedeira, obtendo-se por vezes resultados imprevisíveis.

As estirpes de leveduras têm-se evidenciado como sendo particularmente adequadas à expressão de proteinas heterólogas. Ao contrário das células de E.coli e de mamifero, muitas leveduras não são susceptiveis a infecções virais. Existem diversos géneros de leveduras adequados, tais como o Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluveromyces, Pichia, Hansenula, e semelhantes, assim como diversos plasmideos de expressão com utilidade. As técnicas de cultura de leveduras são bem conhecidas da técnica. No entanto, tem-se verificado que os plasmideos de replicaçâo autónoma em leveduras são frequentemente sujeitos a instabilidade, resultando em perda do plasmideo após diversas gerações. Veja-se, e.g., A.B. Fuchter et al., J. Bacteriol. (1984) 157:283-90. Alternativamente, a levedura pode ser transformada com um vector concebido para se integrar no genoma da levedura. No entanto, este vector deve revelar-se 2

homólogo de um local particular, no interior do genoma da levedura, para que seja possivel uma integração a frequência útil. 0 requisito de homologia representa uma grande restrição, uma vez que limita a utilidade de um vector integrativo à integração num único local (ou, no máximo, geralmente a 2-3), e ao uso com uma só variedade de levedura (possuindo um DNA genómico homólogo à sequência de direccionamento). Assim, a introdução de um elevado número de cópias de um gene heterólogo requer ou um elevado número de vectores individualmente direccionados, ou o direccionamento para uma sequência altamente repetitiva, tal como a região ribossómica de DNA repetida em "tandem". T.L. Orr-Weaver et al♦, Meth. Enzymol. (1983) 101:228-45, referiu-se à construção de plasmideos integrativos possuindo um DNA homólogo a um gene de levedura. Ao efectuar um corte na dupla cadeia da região do plasmideo homóloga à levedura, Orr-Weaver pôde aumentar a frequência da transformação até 3000 vezes, dependendo do gene homólogo seleccionado. R.A. Smith et al., Science (1985) 229:1219-24, comparou a expressão da proquimosina de vitelo em leveduras, realizada por intermédio de vectores plasmidicos e de vectores integrados. Smith verificou que a expressão a partir de DNA integrado produzia uma quantidade de enzima activo cerca de 4 vezes superior à obtida através da expressão plasmidica, mesmo quando o número de cópias do plasmideo era de cerca de 100/célula. A integração em quatro locais do genoma da levedura resultou numa secreção de enzima activo 3 vezes superior. T.S. Lopes et al., Gene (1989) 79^:199-206, descreveu 3 -p— vectores de integração em levedura direccionados para o DNA ribossómico (RDNA), que se encontra presente no genoma em cerca de 140 cópias, repetidas em tandem. Lopes et al. construíram vectores de integração possuindo diversas Kb de RDNA de levedura, Leu2-d (para selecção), e fosfoglicerato quinase (PGK) ou superóxido dismutase Mn-dependente (Mn-SOD). O direccionamento para o local genómico do RDNA foi conseguido através de uma clivagem ao nivel da região de RDNA do vector. No entanto, se bem que os vectores tenham sido integrados no local de RDNA em número de 100+ cópias, proporcionando uma expressão aumentada da PGK e da Mn-SOD, os autores foram incapazes de obter uma integração com elevado número de cópias usando outros genes marcadores para além do Leu2-d.

Exposição do invento 0 presente invento compreende a integração de vectores plasmidicos susceptiveis de inserção, com obtenção de um elevado número de cópias, em sequências heterólogas de DNA dispersas ao longo do genoma de uma levedura, e métodos para proporcionar a integração heteróloga em locais dispersos. Os vectores e métodos utilizados empregam elementos repetitivos dispersos (DRE's) localizados no genoma da levedura, tais como as sequências DELTA de levedura, como sequências-alvo da integração.

Breve descrição dos esquemas A Figura 1 representa um mapa do plasmideo pJS161. A Figura 2 representa um mapa do plasmideo pJS168. A Figura 3 representa uma comparação dos niveis de 4 produção da IGF-1 por transformantes do pJS168, resistentes ao cobre, quando direccionados para sequências Leu2 ou para sequências DELTA. A Figura 4 é uma fotocópia de um gel representando uma análise, por PAGE, da expressão da β-galactosidase de E. coli em leveduras transformadas com pJS176 direccionado para as sequências DELTA. A Figura 5 representa um mapa do plasmideo pJS176.

Formas de Realização do Invento A. Definições 0 termo "elemento repetitivo disperso" refere-se a uma sequência de DNA encontrada em locais múltiplos no interior do genoma de uma levedura (i.e., no interior dos cromossomas), sendo que cada ocorrência do elemento é substancialmente homóloga aos outros elementos. Os elementos repetitivos dispersos, no âmbito deste invento, ocorrem em pelo menos duas cópias no interior do genoma, preferencialmente pelo menos 5 cópias, e mais preferencialmente cerca de 20-300 cópias. As cópias não são necessariamente idênticas, mas devem ser homólogas em grau suficiente para permitir a integração ao nivel de cada cópia. Estes elementos repetitivos devem igualmente ser dispersos, i.e., não ocorrerão geralmente em tandem ou em sequências repetitivas adjacentes, mas encontrar-se-ão usualmente separadas por, pelo menos, cerca de 300-500 bases. Elementos repetitivos dispersos representativos incluem as sequências DELTA, as sequências Ty, e as sequências de DNA tRNA. 0 termo "sequência alvo" refere-se a um local, no 5

interior do genoma de uma célula hospedeira de levedura, ao nivel do qual se pretende que a integração ocorra. No presente invento, as sequências alvo são elementos repetitivos dispersos. 0 termo "sequência de direccionamento" refere-se a uma sequência de DNA, homóloga aos elementos repetitivos dispersos seleccionados no genoma da levedura hospedeira, capaz de dirigir a integração para os elementos repetitivos dispersos. As sequências de direccionamento terão, pelo menos, o comprimento minimo necessário para permitir tuna integração eficiente, geralmente pelo menos cerca de 50 pb, mais preferencialmente cerca de 100 pb, e ainda mais preferencialmente 100-200 pb. As sequências de direccionamento devem igualmente ser suficientemente homólogas dos elementos repetitivos dispersos seleccionados para garantir a integração em locais múltiplos: as sequências de direccionamento não serão necessariamente idênticas a nenhum local individual particular, mas preferencialmente assemelhar-se-ão a uma "sequência de consenso" dos locais alvo. 0 termo "DNA heterólogo", tal como aqui usado, refere-se a qualquer DNA que é inserido num estado não-nativo. Por exemplo, um DNA codificando para proteinas de mamifero ou procarióticas (e.g., factor de crescimento da epiderme, factores de crescimento semelhantes à insulina, glucose oxidase, e semelhantes) é considerado como "heterólogo" no âmbito desta definição. Adicionalmente, as proteinas normalmente encontradas em leveduras poderão ser consideradas como heterólogas, no âmbito deste invento, se o gene estrutural se encontrar associado a uma sequência promotora, ou de terminação, diferente, se a sequência codificante da proteina estiver alterada (estando a sequência 6

codificante dos aminoácidos alterada ou não), se a proteína não é habitualmente encontrada na levedura hospedeira seleccionada, se o gene é introduzido a niveis amplificados superiores aos niveis normalmente encontrados na levedura de tipo selvagem, e assim por diante. Um gene estrutural está em "associação operável" com um promotor e/ou terminador se o promotor e/ou o terminador funcionam, na construção integrada, para o controlo ou modulação da expressão do gene estrutural. 0 termo "local único de reconhecimento da endonuclease de restrição" refere-se a uma sequência de DNA que é reconhecida e clivada por uma endonuclease de restrição seleccionada, e que ocorre apenas uma vez no interior da molécula de DNA. Se desejado, podem ser utilizados vectores que possuam roais do que uma cópia do local de reconhecimento da endonuclease de restrição se os outros locais se encontrarem protegidos, e.g., por metilação. Assim, os vectores do invento requerem que as sequências de direccionamento flanqueiem um local de reconhecimento da endonuclease de restrição que é especialmente susceptivel à clivagem, quer a mesma sequência ocorra em outro local da molécula quer não. Alternativamente, é possivel fazer com que mais do que uma cópia do local de reconhecimento da endonuclease de restrição num plasmideo seja clivada e gere moléculas lineares por digestão parcial do plasmideo com a enzima apropriada. 0 temo "marcador seleccionável" refere-se a uma sequência de DNA que permite a identificação e/ou segregação de transformantes possuindo essa sequência. E geralmente preferido o uso de marcadores seleccionáveis que confiram uma sobrevivência 7

melhorada à célula hospedeira, por exemplo conferindo resistência a antibióticos, resistência a iOes metálicos, fototrofismo para um determinado nutriente, e semelhantes. As células hospedeiras eficazmente transformadas podem então ser separadas das células nao-transformantes através da cultura da levedura sob condiçOes selectivas, por exemplo cultivando a levedura na presença de antibióticos ou iOes metálicos, ou cultivando a levedura num meio defeciente num nutriente essencial. Outros marcadores incluem genes codificando para proteínas luminescentes, antigénios bem definidos, e sequências únicas de DNA detectáveis por sonda. B. Método geral

No genoma das leveduras encontra-se um certo número de elementos repetitivos dispersos. Os principais exemplos sao os elementos DELTA, os transposões Ty, centrómeros, telómeros, e DNA do tRNA. Os elementos repetitivos dispersos presentemente preferidos sao os elementos DELTA. Veja-se, e.g., J.R.Cameron et al., Cell (1979) 16:739-51; e J.R.Warmington et al., Nucl.Acids Res. (1985) 13:6679-93. Como as sequências de nucleótidos se encontram descritas na literatura, é possivel construir facilmente vectores recombinantes direccionados para locais múltiplos, com base nestas sequências.

Os vectores deste invento serão, em geral, moléculas de DNA de cadeia dupla (dsDNA) linear, possuindo uma cassete de expressão e sequências de direccionamento nas extremidades 3' e 5' da molécula. Alternativamente, os vectores podem ser proporcionados na forma de plasmideos circulares possuindo uma única sequência de reconhecimento da endonuclease de restrição, 8

posicionada de modo a que se obtenha, após digestão, um vector linear dsDNA de acordo com o invento. Os vectores podem incluir adicionalmente marcadores seleccionáveis, de preferência situados entre as sequências de direccionamento e a cassete de expressão. A cassete de expressão incluirá, em geral, um promotor, um gene estrutural, e uma sequência de terminação, ligados de modo a proporcionar a expressão do gene estrutural. 0 promotor é, de preferência, indutivel. Adicionalmente, podem incluir-se sequências de sinalização, como o factor-α de levedura, para possibilitar a secreção da proteina expressa. A cassete de expressão pode incluir mais do que um gene estrutural, e o vector pode incluir mais do que uma cassete de expressão. 0 gene estrutural pode codificar para qualquer proteina, polipéptido, ou produto RNA, de origem eucariótica, ou procariótica, e pode, ou não, conter introns. Por razões de eficiência de integração, é preferivel limitar o tamanho do gene estrutural a não mais de cerca de 50 Kb, preferencialmente a menos de 10 Kb, e mais preferencialmente < 1 Kb. 0 produto do gene deve também ser relativamente não-tóxico para o hospedeiro seleccionado na forma em que é expresso (i.e., uma proteina tóxica pode ser expressa numa forma não-activada, ou numa forma que não seja suficientemente tóxica para prejudicar o crescimento da levedura). Genes estruturais exemplificativos codificam para factores polipeptidicos de crescimento, como o factor de crescimento epidérmico (EGF), factores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs), hormona de crescimento humano (hGH), factor libertador de hormona do crescimento (GRF) interleuquina-ΐα (IL-la), IL-Ιβ, IL-2, factor de transformação do crescimento (TGF-a), 9 TGF-Ps, factor de crescimento do fibroblasto (FGF), péptidos activadores de tecido conjuntivo (CTAP-I, CTAP-II, CTAP-III), e semelhantes; para receptores como o receptor CD4 humano, o receptor EGF, o receptor TGF-β, o receptor GH, o receptor do estrogénio, e semelhantes; para antigênios, como o gpl20 do virus da Imunodeficiência Humana (HIV), o gB e gD do virus do herpes simplex (HSV, tipo I e/ou II), a proteína principal da membrana exterior (MOMP) da Chlamydia trachomatis, o antigénio de superfície (HBsAg) ou antigénio do core do virus da hepatite B (HBV), antigênios do virus da hepatite C (HCV), antigênios do virus da hepatite Delta (HDV), antigênios do Citomegalovirus (CMVj, tais como gp55, gB, e gH, antigênios do virus da hepatite A (HAV), antigênios do circumsporozoito da malária, e semelhantes; e para outras proteínas incluindo proteínas estruturais, proteínas de ligação, e péptidos (por exemplo, proteínas do MHC), e enzimas, como a β-galactosidase, fosfatase alcalina, e semelhantes. No caso de antigênios, o gene estrutural pode alternativamente codificar para um ou mais fragmentos do antigénio que possui epitopos específicos do patogénio do qual são derivados. De forma semelhante, proteínas ligadas a membrana (incluindo antigênios, enzimas, e proteínas estruturais) podem ser expressas na forma truncada e/ou solúvel, através da remoção da porção do gene estrutural que codifica para a região membranar de ancoragem da proteina.

Sistemas de expressão úteis no âmbito do invento compreendem promotores derivados dos genes eucarióticos apropriados. Promotores particularmente preferidos são os encontrados nas leveduras para sintese de enzimas glicoliticos, 10

incluindo aqueles para a 3-fosfogliceratoquinase (Hitzeman et al., J.Biol.Chem. (1980) 255:2073), e especialmente para a gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) (Travis et al., J.Biol.Chem. (1985) 260:4384-89). Outros promotores incluem os do gene da enolase (M.J.Holland et al♦, J.Biol.Chem. (1981) 256:1385), o gene LEU2 obtido a partir do YEpl3 (J.Broach et al., Gene (1978) 8:121), e promotores reguláveis e hibridos (J.Shuster (1990), em "Yeast Genetic Engineering" (Eds. P.J.Barr, A.J.Brake, e P.Valenzuela), Butterworths, Stoneham, MA, págs 83-108). E presentemente preferido exprimir proteinas fundidas com uma sequência "leader" de secreção adequada, como a sequência leader do factor-α de levedura, a sequência leader da lisozima de galinha, a sequência leader de secreção de tPA humano, e semelhantes. E particularmente preferida a sequência leader do factor-α. Métodos de Clonaqem A clivagem, especifica de local, de DMA é feita por tratamento com um enzima (ou enzimas) de restrição adequado(s), sob condições conhecidas da técnica, geralmente seguindo instruções do fabricante. Veja-se, e.g., o catálogo de produtos da New England Biolabs. Em geral, cerca de 1 pg de plasmideo ou sequência de DNA é clivado por uma unidade de enzima em cerca de 20 μΐ de solução tampão; nos exemplos aqui dados, é tipicamente usado um excesso de enzima de restrição, de modo a assegurar a digestão completa do substrato de DNA. São utilizados tempos de incubação de cerca de 1 a 2 hr, a cerca de 37°C, sendo toleradas variações. Após cada incubação, a proteina é removida por 11 extracçâo com fenol/clorofórmio, podendo seguir-se extracçâo com éter dietilico, e o ácido nucleico recuperado das fracçOes aquosas por precipitação com etanol. Se desejado, pode ser realizada uma separação por tamanho dos fragmentos clivados por electroforese com gel de agarose ou gel de poliacrilamida, usando técnicas padronizadas. Uma descrição geral de separaçOes de tamanho encontra-se em Meth.Enzymol. (1980) 65:499-560.

Os fragmentos clivados por restrição podem ser transformados em fragmentos de extremidades cegas através de tratamento com o grande fragmento da DNA-polimerase I de E. coli (Klenow) na presença dos quatro desoxiribonucleótidos trifosfatos (dNTPs) usando tempos de incubação de cerca de 15 a 25 min a 20 a 25°C, em Tris 50 mM, pH 7,6, NaCl 50 mM, MgCl2 6 mM, DTT 6 mM, e dNTPs 5-10 μΜ. 0 fragmento de Klenow sintetisa ao nivel das extremidades 5', mas digere as extremidades protuberantes 3' das cadeias simples, apesar de estarem presentes os quatro dNTPs. Se desejado, pode ser efectuada uma reparação selectiva, fornecendo apenas 1 a 3 dos dNTPs, dentro das limitações impostas pela natureza das extremidades coesivas. Após tratamento com o fragmento de Klenow, a mistura é extraida com fenol/clorofórmio e precipitada com etanol. Tratamento sob condiçOes apropriadas com a nuclease SI resulta em hidrólise de qualquer porção de cadeia simples.

Podem ser preparados oligonucleótidos sintéticos usando sintetisadores automáticos de oligonucleótidos, disponíveis comercialmente. 0 tratamento das cadeias simples por quinases antes do emparelhamento, ou para marcação, pode ser conseguido usando um excesso, i.e., aproximadamente 10 unidades de quinase 12 polinucleotidica para 0,1 nmole de substrato na presença de Tris 50 mM, pH 7,6, MgCÍ2 10 mM, DTT 5 mM, ATP 1-2 mM, 1,7 pmoles de qo P-ATP (2,9 mCi/mmole), espermidina 0,1 mM, e EDTA 0,1 mM.

As ligações podem ser realizadas em volumes de 15-30 μΐ nas seguintes condições padrão e temperaturas: Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, 33μg/ml BSA, NaCl 10 mM-50 mM, e ou ATP 40 μΜ, 0,01-0,02 unidades (Weiss) de DNA-ligase T4 a 0°C (para ligação "de extremidades coesivas") ou ATP 1 mM, 0,3-0,6 unidades (Weiss) de DNA-ligase T4 a 14°C (para ligaçSo "de extremidades cegas"). Ligações intermoleculares de extremidades coesivas sao habitualmente realizadas a uma concentração de 33-100 μg/ml de concentração total de DNA (concentração total final 5-100 nM). Ligações intermoleculares de extremidades cegas (habitualmente empregando um excesso molar de linkers de 10-30x) podem ser realizadas a uma concentração total final de 1 μΜ.

Na construção de vectores empregando "fragmentos de vector", o fragmento de vector é habitualmente tratado com fosfatase alcalina bacteriana (BAP) de modo a remover o fosfato na extremidade 5' e evitar a religaçâo do vector. As digestões com BAP sao conduzidas a pH 8-9, em Tris aproximadamente 10-150 mM, usando cerca de 1-10 unidades de BAP por μg de vector, a cerca de 60°C, durante cerca de 1 hr. De modo a recuperar os fragmentos de ácido nucleico, a preparação é extraida com fenol/clorofórmio e precipitada com etanol. Alternativamente, a religaçâo pode ser evitada em vectores que tenham sido duplamente digeridos por uma digestão adicional com um enzima de restrição dos fragmentos indesejados.

Para porções de vectores derivados de cDNA ou DNA 13

genómico, que requerem modificações de sequência, pode ser usada uma mutagénese dirigida, especifica de local, mediada por primer. Tal pode ser efectuado usando um primer oligonucleotidico sintético complementar a um fago de DNA de cadeia simples a ser mutagenisado, excepto numa porção limitada não complementar, representando a mutação desejada. Resumidamente, um oligonucleótido sintético é usado como um primer para dirigir a sintese de uma cadeia complementar ao fago, e o DNA de cadeia dupla resultante é transfectado para a bactéria hospedeira que aloja o fago. Culturas das bactérias transfectadas são cultivadas em placas de agar, permitindo a formação de placas a partir de células isoladas que alojam o fago.

Teoricamente, 50% das novas placas conterão o fago com a forma mutada na forma de cadeia simples, e 50% conterão a sequência original. Os DNAs das placas resultantes são hibridizados com primer sintético tratado por quinases. Em geral, pode-se variar a temperatura, força iónica, e concentração do(s) agente(s) caotrópico(s) na solução de hibridizaçâo, de modo a obter condições sob as quais não serão substancialmente hibridizadas sondas na ausência de um elemento exactamente correspondente. Para hibridizaçâo das sondas com DNA ligado, a fórmula empirica para calcular a temperatura óptima em condições padrão (NaCl 0,9 M) é T(°C) = 4(Ng+Nc) + 2 (Na+Nt) - 5 °C em que Nq, Nc, Na, e NT são o número de bases G, C, A, e T, na sonda (J.Meinkoth et al., Anal.Biochem. (1984) 138:267- 84). Placas correspondendo a DNA que se hibridiza especificamente 14 com a sonda sâo então recolhidas, cultivadas, e o DNA é recuperado.

Transformações em leveduras podem ser levadas a cabo de acordo com o método de A.Hinnen et al., Proc.Nat♦Acad.Sci.USA (1978) 75:1929-33, ou de H.Ito et al, J.Bacteriol, (1983) 153:163-68. Após o DNA ter sido introduzido na célula hospedeira, o vector integra-se no genoma da levedura em um ou mais sitios homólogos da sua sequência de direccionamento. E presentemente preferido linearizar o vector clivando-o ao nivel da sequência de direccionamento por intermédio de uma endonuclease de restrição, dado que este procedimento aumenta a eficiência de integração. 0 número de sequências integradas, após transformações com sucesso, pode ser aumentado por técnicas clássicas de manipulação genética. Como os clones de células individuais podem transportar vectores integrados em diferentes locais, um cruzamento genético entre duas estirpes apropriadas, seguido de esporulaçâo e recuperação de segregantes, pode resultar numa nova estirpe de leveduras possuindo as sequências integradas de ambas as estirpes progenitoras originais. Podem ser usados ciclos continuados deste método com outras estirpes integrativamente transformadas, para aumentar ainda mais as cópias dos plasmideos integrados numa estirpe de levedura hospedeira. As sequências integradas podem também ser amplificadas usando técnicas padrSo, por exemplo, tratando as células com concentrações crescentes de iões de cobre (tendo sido incluido no vector integrante um gene conferindo resistência ao cobre). 15

Verificação da Construção

Ligações correctas para construção do plasmideo podem ser confirmadas transformando primeiro a estirpe MM294 de E. coli obtida do E.coli Genetic Stock Center (CGSC), #6135/ ou outro hospedeiro adequado com a mistura de ligaçao. Transformantes com sucesso sao seleccionados com base na resistência a ampicilina, tetraciclina/ ou outro antibiótico/ ou usando outros marcadores dependendo da construção do plasmideo/ tal como é conhecido dos especialistas. Os plasmideos dos transformantes sao então preparados de acordo com o método de D.B.Clewell et al., Proc.Nat.Acad.Sci.USA (1969) 62:1159, seguindo-se, opcionalmente, a amplificação com cloranfenicol (D.B.Clewell, J.Bacteriol. (1972) 110:667). 0 DNA isolado é analisado por mapeamento de restrição e/ou sequenciado pelo método didesoxi de F.Sanger et al., Proc♦Nat.Acad♦Sci.USA (1977) 74:5463 tal como descrito por Messing et al., Nucl.Acids Res. (1981) £:309, ou através do método de Maxam e Gilbert, Meth.Enzymol. (1980) 65:499. C. Exemplos

Os exemplos que se seguem sâo proporcionados como um guia adicional para o técnico de pericia comum, e nao devem ser tomados como limitativos do invento em qualquer forma.

Exemplo 1 (Integração do sCD4) 0 plasmideo pJS161 foi construido começando pelo local de origem LEU2, com 2 μπι, de levedura, e pelo pBR322 do plasmideo 16

I yEP13 (J.R.Broach et al., Gene (1979) £:121), CUP1 (M.Karin et al., Proc.Nat.Acad.Sei.USA (1984) £1:337), e um gene estrutural codificando para o sinal de secreção do lisozima de galinha fundido a uma sequência codificando para o receptor CD4 solúvel humano, sob controlo transcricional do promotor hibrido ADH2/GAPDH de levedura (Cousens et al., Gene (1987) 63.:265) e um sinal de terminação de mRNA do factor-α de levedura. Na Figura 1 é mostrado vim mapa da construção. 0 plasmideo pJS162 contém os mesmos componentes, mas possui o CUP1 em orientação oposta. 0 local de restrição da Xhol no plasmideo encontra-se ao nivel do elemento DELTA, e divide eficazmente a região em sequências de direccionamento 5' e 3'.

Os plasmideos pJS161 e pJS162 foram digeridos com Xhol e usados para transformar a estirpe de levedura hospedeira ΆΒ110 (uma mutante leu2), fazendo-se a selecção em placas deficientes em leucina.

As placas de transformantes Leu+ (integrativas) foram cultivadas, para obtenção de réplicas, em placas compostas de YEPD + CUSO4 10 mM, de forma a seleccionar os transformantes

Ί* R possuindo cópias múltiplas do plasmideo. As colónias Leu Cu foram purificadas por repicagem para placas não selectivas de YEPD e testadas quanto à expressão do CD4. Os resultados mostraram que as estirpes isoladas desta forma produziam tanto ou mais CD4 do que estirpes similares de levedura hospedeira, contendo a mesma cassete de expressão de CD4 num plasmideo de replicação autónoma (dados não apresentados). 17

Exemplo 2 (Expressão do Factor de Crescimento I, Semelhante à Insulina

Humana) (A) 0 plasmideo pJS168 foi construido usando o local de origem LEU2, com 2 μιη, de levedura, o pBR322, CUP1, e um gene estrutural codificando para a sequência leader de secreção do factor-α de levedura, fundido com uma sequência codificando para o factor de crescimento I semelhante à insulina humana (IGF-I), sob controlo transcricional do promotor hibrido ADH2/GAPDH de levedura e de um sinal de terminação de mRNA do factor-α de levedura. Na Figura 2 é apresentado um mapa da construção. 0 plasmideo pJS168 foi digerido com Xhol e usado para transformar a estirpe DLM300 (um mutante leu2) seleccionada em placas de meio deficiente em leucina. Como controlo, o mesmo plasmideo foi cortado com BstE2, que lineariza o plasmideo ao nivel da sequência LEO2 (mas não na região do elemento DELTA), e usado para transformar a estirpe DLM300 relativamente ao fototrofismo para a leucina. Assim, a transformação de controlo deverá dirigir a integração para o local leu2 da levedura.

Os transformantes Leu+ foram recolhidos e o DNA analisado pela técnica de imunotransferência de Southern quanto à posição de integração do plasmideo no genoma. Em 5 de 7 transformantes de direccionamento DELTA, o plasmideo foi integrado num outro local do genoma que não o local leu2; noutro transformante o plasmideo foi integrado no local leu2; e noutro parece ter ocorrido uma conversão do gene de leu2 para LEU2, sem que tenha ocorrido qualquer integração plasmidica. Para os plasmideos de controlo cortados por BstE2, foram integrados 18 plasmideos no local leu2 em 3 de 7 transformantes; 3 outros transformantes parecem ter sofrido uma conversão de genes sem integração; e um outro sofreu a integração de um plasmideo em outro local que não o leu2. Assim, os vectores clivados ao nivel da sequência DELTA foram direccionados para diferentes áreas do genoma. (B) As placas de colónias de leveduras obtidas na parte A, acima descrita, foram então cultivadas, para obtenção de réplicas, em placas YEPD contendo CUSO4 10 mM. Foi ensaiado,

Ί* R quanto à produção de IGF-I, um total de 23 colónias Leu Cu dos

Ί* R transformantes de direccionamento DELTA, e 20 colónias Leu Cu dos transformantes de direccionamento LEU2. Os resultados demonstraram que os transformantes de direccionamento DELTA proporcionavam niveis superiores de expressão de IGF-I do que os controlos de transformantes de direccionamento LEU2 (Figura 3). Assim, permitindo a integração ao nivel de sequências repetitivas dispersas, resulta na obtenção de transformantes que exibem niveis superiores de expressão do gene heterólogo do que a observada em transformantes criados por direccionamento para o gene LEU2.

Exemplo 3 (Expressão de uma β-Galactosidase)

Foi demonstrada, através da utilização da β-galactosidase de E.coli, a expressão de uma proteina não secretada usando os vectores do invento. Uma cassete de expressão, consistindo num gene de β-galactosidase derivado de

E.coli, colocado entre um promotor ADH2/GAPDH e um terminador de mRNA GAPDH, foi clonada, ao nivel de restrição da BamHI, no plasmideo pJS168, substituindo a cassete de expressão do IGF-I. 0 plasmideo resultante foi linearizado com Xhol e usado para transformar a estirpe hospedeira de levedura AB110 relativamente ao fototrofismo para a leucina. Os transformantes foram cultivados, para a obtenção de réplicas, em placas de meio YEPD + CUSO4 10 mM, e foram obtidas colónias resistentes ao cobre. As células foram cultivadas em meio YEP + glicerol a 3%, lavadas com água, e as suas membranas destruídas com esferas de vidro. As proteinas solúveis extraidas foram analisadas, quanto ao teor em β-galactosidase, por gel de SDS-poliacrilamida. Foram observados niveis substanciais de β-galactosidase nos transformantes resistentes ao cobre. A Figura 4 mostra uma fotocópia do gel SDS- PAGEí trilha M=marcadores do peso molecular; trilha l=controlo _ + AB110 (Leu ); trilha 2=integrante em cópia única (Leu , sensivel ao Cu); trilhas 3-6=integrantes em cópias múltiplas (Leu+, resistentes ao Cu). As trilhas 3 a 6 exibiram bandas densas correspondentes à expressão da β-galactosidase, enquanto que a trilha 2 exibiu uma banda muito leve na posição correspondente, e a trilha 1 não exibiu uma banda detectável. Na Figura 5 foi representado um mapa do plasmideo integrativo, pJS176, contendo o gene da β-galactosidase. Este plasmideo proporciona um veiculo conveniente, uma vez que a cassete de BamHI pode ser removida com facilidade, e substituída por qualquer cassete de expressão desejável. 20

Claims

"·Ι Depósito 0 plasmideo pJS176, estirpe de E.coli DH5a foi depositado na American Type Culture Collection (12301 Parklawn Dr., Rockville, Maryland) em 18 de Julho de 1990, tendo o número de acesso ##. Este depósito será mantido ao abrigo do disposto no Tratado de Budapeste. Todas as restrições de acesso ao depósito serão removidas ao ser concessionada esta patente. Este depósito é proporcionado meramente como uma facilidade conferida aos peritos na técnica, nao estando implicito que seja necessário tal depósito ao abrigo do parágrafo 112 da USC 35. A sequência dos polinucleótidos contidos no material depositado, assim como a sequência de aminoácidos neles codificados, sao aqui incorporados para referência, e servem como controlo em caso de alguma inconsistência nas sequências aqui descritas. Pode ser necessária uma licença de fabricação, uso ou venda do material depositado, nao sendo aqui garantida a concessão de uma tal licença. REIVINDICAÇÕES 1- Um vector para introduzir o DNA heterólogo num genoma da célula hospedeira de levedura, tendo disperso, o referido genoma, na sua sequência, elementos repetitivos, caracterizado pelo facto de compreender: - uma molécula de dsDNA linear possuindo, nas suas extremidades 5' e 3', respectivamente, uma primeira e segunda seguências de direccionamento homólogas aos referidos elementos repetitivos dispersos na célula hospedeira no genoma da levedura; 21 V

e - um DNA heterólogo flanqueado pelas referidas primeira e segunda sequências de direccionamento.
2- Um vector, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto de as referidas primeira e segunda sequências de direccionamento serem, cada uma, homólogas a um elemento disperso no genoma de levedura, seleccionado do grupo consistindo em DNA Ty e DNA de sequência DELTA.
3- Um vector, conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto do referido DNA heterólogo compreender DNA estrutural em associação operável com uma sequência promotora e uma sequência terminadora funcional na referida célula hospedeira.
4- Um vector, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto do referido DNA heterólogo compreender, além disso, um marcador seleccionável.
5- Um vector, conforme reivindicado na reivindicação 4, caracterizado pelo facto do referido marcador seleccionável ser seleccionado do grupo consistindo em CUP1 e LEU2.
6- Um vector, conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto do referido DNA estrutural codificar para a CD4 humana activa truncada, o factor I de crescimento semelhante à insulina humana, ou β-galactosidase da E. coli.
7- Um vector circular para introduzir o DNA heterólogo num genoma da célula hospedeira de levedura, tendo disperso, o referido genoma, na sua sequência, elementos repetitivos, caracterizado pelo facto de compreender: - uma molécula de dsDNA circular possuindo uma primeira 22

e segunda sequências de direccionamento homólogas aos referidos elementos repetitivos dispersos no genoma da célula hospedeira de levedura; e - DNA heterólogo flanqueado no lado 5' pela dita primeira sequência de direccionamento, e no lado 3' pela dita segunda sequência de direccionamento; - em que a referida molécula de dsDNA circular possui um único local de reconhecimento da endonuclease de restrição, posicionado na extremidade 5' da referida primeira sequência de direccionamento, e na extremidade 3' da referida segunda região de direccionamento.
8- Um vector, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto das referidas primeira e segunda regiOes de direccionamento serem, cada uma, homólogas a um elemento disperso no genoma da levedura, seleccionado do grupo consistindo em DNA Ty e DNA de sequência DELTA.
9- Um vector, conforme reivindicado na reivindicação 7, caracterizado pelo facto de o referido DNA heterólogo compreender DNA estrutural em associação operável com uma sequência promotora e uma sequência terminadora funcional na referida célula hospedeira.
10- Um vector, conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o referido DNA heterólogo compreender, além disso, um marcador seleccionável.
11- Um vector, conforme reivindicado na reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o referido marcador seleccionável ser seleccionado do grupo consistindo em CUPl e LEU2.
12- Um vector, conforme reivindicado na reivindicação 9, 23

caracterizado pelo facto do referido DNA estrutural codificar a CD4 humana truncada activa, o factor I de crescimento semelhante à insulina humana, ou a β-galactosidase da E. coli.
13- Um método para introduzir DNA heterólogo num genoma de célula hospedeira de levedura, tendo o referido genoma de célula hospedeira de levedura , disperso na sua sequência, elementos repetitivos, caracterizado pelo facto de compreender: - fornecimento de uma molécula de dsDNA linear possuindo uma primeira e segunda sequências de direccionamento , nas suas extremidades 5' e 3', respectivamente, sendo estas sequências homólogas aos referidos elementos repetitivos dispersos no genoma da referida célula hospedeira de levedura, e sendo o DNA heterólogo flanqueado pelas referidas primeira e segunda sequências de direccionamento; e - transformação de uma célula hospedeira de levedura adequada com o referido dsDNA linear.
14- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 13, caracterizado pelo facto das referidas primeira e segunda sequências de direccionamento serem cada uma homólogas a um elemento disperso no genoma da levedura , seleccionado do grupo consistindo em DNA Ty e DNA de sequência DELTA.
15- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o referido DNA heterólogo compreender DNA estrutural em associação operável com uma sequência promotora e uma sequência terminadora funcional na referida célula hospedeira.
16- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto do referido DNA heterólogo compreender 24 Ή um marcador seleccionável.
17- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o referido marcador seleccionável ser seleccionado do grupo consistindo em CUP1 e LEU2.
18- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 15, caracterizado pelo facto de o DNA estrutural codificar a CD4 truncada activa humana, o factor-1 de crescimento semelhante à insulina humana, ou a β-galactosidase da E. coli.
19- Um método para introduzir o DNA heterólogo num genoma da célula hospedeira de levedura, possuindo o referido genoma, dispersos na sua sequência, elementos repetitivos, caracterizado pelo facto de compreender: - o fornecimento de uma molécula de dsDNA circular, possuindo uma primeira e segunda sequência de direccionamento homólogas aos referidos elementos repetitivos dispersos na célula hospedeira de levedura, e DNA heterólogo flanqueado no lado 5' pela referida primeira sequência de direccionamento, e, no lado 3' pela referida segunda sequência de direccionamento, possuindo a referida molécula de dsDNA circular um único sitio de reconhecimento da endonuclease de restrição, posicionado na extremidade 5' da referida primeira sequência de direccionamento, e na extremidade 3' da referida segunda sequência de direcc ionamento; - clivagem da referida molécula de dsDNA circular no referido único sitio de restrição; e - transformação de uma célula hospedeira de levedura adequada, com o referido dsDNA linear.
20- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 19, 25 caracterizado pelo facto das primeira e segunda sequências de direccionamento serem, cada uma, homóloga a um elemento disperso no genoma de levedura , seleccionado do grupo consistindo em DNA Ty e DNA de sequência DELTA.
21- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 19, l caracterizado pelo facto do referido DNA heterólogo compreender DNA estrutural em associação operável com uma sequência promotora e uma sequência terminadora, funcional na referida célula hospedeira.
22- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto do referido DNA heterólogo compreender, além disso, um marcador seleccionável.
23- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 22, caracterizado pelo facto do referido marcador seleccionável ser seleccionado do grupo consistindo em CUP1 e LEU2.
24- Um método, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto do referido DNA estrutural codificar a CD4 humana activa truncada, o factor-1 de crescimento da insulina humana, ou a β-galactosidase da E. coli. Lisboa, 19 de Julho de 1991 PELO agente oficial da propriedade industrial

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