FI87799C - Foerfarande foer framstaellning av humaninsulinlik tillvaextfaktor (igf) - Google Patents

Description

87799

MENETELMÄ IHMISEN INSULIININ KALTAISEN KASVUTEKIJÄN (IGF) TUOTTAMISEKSI

Keksinnön tausta

Pidetään mahdollisena, että somaattinen kasvu, joka seuraa kasvuhormonin antamista in vivo, välittyy mitogeenisten, insuliininkaltaisten peptidien ryhmän välityksellä, joiden seerumikonsentraatiot riippuvat kasvuhormonista. Näihin poly-peptideihin sisältyvät somatomediini-C, somatomediini-A sekä insuliinin kaltaiset kasvutekijät I ja II (IGF I sekä IGF II). IGF I ja II voidaan eristää ihmisen seerumista, ja niiden aminohapposekvenssit ovat suurin piirtein homologiset insuliinin aminohapposekvenssien kanssa. Nykyisin voidaan saada ainoastaan rajoitettuja määriä näitä kasvutekijöitä ihmisen seerumista eristämällä. Täten olisi sekä kliinisesti että tieteellisesti merkittävää pystyä valmistamaan suhteellisen suuria määriä kasvutekijöitä yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla.

Ihmisen insuliinin kaltaisten kasvutekijöiden I ja II (IGF I ja II) aminohapposekvenssit määrittivät ensiksi Rinderknecht ja Humbel (1978) J. Biol. Chem. 253:2769-2776 sekä FEBS Letters 89:283-286. IGF-reseptoreiden luonnetta ovat kuvan-··· neet Massague ja Czech (1982), julkaisussa J. Biol. Chem.

257:5038-5045. Kurjan ja Herskowitz, Cell (1982) 30:933-934, : kuvaavat oletettua oc-tekijän prekursoria, joka sisältää ____; neljä peräkkäistä kypsän <1-tekijän kopiota, ja he kuvaavat sekvenssiä ja oletettua valmistusmekanismia. Kurjan ja Herskowitz kuvaavat tiivistelmässä, Abstract of Papers, joka on esitetty 1981 Cold Opring Harbor Meeting on The Molecular Biology of Yeast, sivulla 242, otsikolla "A Putative Alpha-. : Factor Precursor Containing Four Tandem Repeats of Mature : Alpha-Factor", sekvenssiä, joka koodittaa oC-tekijää, sekä kahden tällaisen sekvenssin välialueita.

2 87799

Keksinnön yhteenveto

Keksintö koskee menetelmiä Ja koostumuksia kypsän, ihmisen insuliinin kaltaisen kasvutekijän (IGF) tehokkaaksi valmistamiseksi. Erityisesti hiivaisännässä tapahtuva "pre"-IGF Is n ja "pre"-IGF II:n ekspressio helpottaa polypeptidin erittymistä elatusaineeseen. DNA-rakenteet saadaan aikaan liittämällä yhteen eri lähteistä peräisin olevia DNA-sekvenssejä, luonnon sekä synteettisistä lähteistä saadut DNA-sekvenssit mukaanluettuina. Syntyvät DNA-rakentee't replikoituvat hiivassa jatkuvasti sekä antavat käyttöön valmistettujen "pre"-polypeptidien, jotka saatetaan eristää suurena saantona elatusaineesta, tehokkaan, korkeatasoisen tuotannon. Keksinnölle on tunnusomaista se, mitä on esitetty patenttivaatimusten tunnusmerkkiosissa.

Keksintö koskee DNA-sekvenssejä, jotka voivat ekspressoida ihmisen insuliinin kaltaisia kasvutekijöitä (IGF I ja II). Näitä DNA-sekvenssejä voidaan sisällyttää vektoreihin, ja syntyviä plasmideja käytetään herkkiä isäntiä transformoitaessa. Sellaisilla yhdistelmäplasmideilla suoritetun, herkän isännän transformoinnin tuloksena on insuliinin kaltaisen • . kasvutekijägeenin ekspressio sekä polypeptidituotteen ‘ valmistuminen.

Erityisesti keksintö koskee uusia DNA-rakenteita prekursori-polypeptidien ("pre"-IGF I sekä "preM-IGF II) valmistamiseksi hiivaisännässä, joka pystyy valmistamaan mainittuja prekursoripolypeptidejä sekä erittämään kypsän poiypeptidi-tuotteen elatusaineeseen. DNA-rakenteisiin sisältyy repli-• kointijärjestelmä, joka voi säilyä pysyvästi hiivaisännässä, :'· tehokas promoottori., rakennegeeni, johon sisältyvät joh- . . danto- ja prosessointisignaalit lukuvaiheistuksessa mainitun rakennegeenin kanssa, sekä transskription lopetussignaali rakennegeenin alapuolella.

3 87799

Valinnaisesti voidaan antaa käyttöön muita sekvenssejä trans-skription säätelyä, geenin monistumista, transskription ekso-geenistä säätelyä yms. varten. "Pre"-IGP:llä sekä "pre"-IGFrllu tarkoitetaan, että kypsää polypeptidiä koodaava DNA-sekvenssi on liitetty lukuvaiheistukseen ja lukuraamissa joh-dantojakson kanssa, joka sisältää hiivaisännän tehokkaasti tunnistamat prosessointisignaalit. Täten "pre" merkitsee hiivaisäntään kytkeytyvien eritys- ja prosessointisignaalien sisältymistä eikä mitään kyseistä polypeptidiä koodittavaan geeniin liittyneitä prosessointisignaaleja.

DNA-konstruktiota valmistettaessa on välttämätöntä liittää yhteen yksityiset sekvenssit, jotka sulkevat piiriinsä repli-kaatiojärjestelmän, promoottorin, rakennegeenin, johon sisältyvät johdanto- ja prosessointisignaalit, sekä 1 opetussignaalin, edeltä määrätyssä järjestyksessä, jotta varmistutaan siitä, että ne voivat toimia sopivasti syntyvässä plasmidis-sa. Kuten tässä yhteydessä myöhemmin kuvataan, saatetaan käyttää liittäjämolekyylejä varmistamaan sekvenssien sopiva suuntaus sekä järjestys.

IGF I- ja IGF II-geenit, joita käytetään, saattavat olla kromosomaalista DNA:a, cDNA:a, synteettistä DNA:a tai niiden yhdistelmä. Johdanto- ja prosessointisignaalit ovat normaalisti peräisin luonnostaan hiivassa esiintyvistä DNA-sekvens-seistä, jotka ylläpitävät polypeptidin erittymistä. Sellaisiin polypeptideihin, joita hiiva luonnostaan erittää, sisältyvät o(-tekija, a-tekijä, hapan fosfataasi ym.. Jäljelle jää- ..... vät sekvenssit »jotka käsittävät rakenteen johon sisältyvät replikaatiojärjestelmä, promoottori sekä lopetussignaali, ovat hyvin tunnettuja sekä kirjallisuudessa kuvattuja.

- ; Koska erilaiset DNA-sekvenssit, jotka liitetään yhteen kyseessä olevan keksinnön mukaisen DNA-rakenteen muodostami seksi, ovat peräisin erilaisista lähteistä, on tarkoituksen- 4 37799 raukaista liittää sekvenssit yhdistäjä- tai liittäjämolekyyli-en avulla. Erityisesti voidaan käyttää liittäjiä yhdistämään johdanto- ja prosessointisignaalisekveri;'.:;ia koodaavan säikeen 3 ’ -pää IGF:a koodaavan säikeen 51-päähän yhdessä niiden vastaavien komplementaaristen DNA-säikeiden kanssa. Johdanto- ja prosessointisignaalisekvenssi saatetaan pilkkoa restriktioentsyymin avulla sisäisesti läheltä sen 3'-päätettä niin että siitä puuttuu koodittavan alueen emäsparien ennalta määrätty lukumäärä. Liittäjä voidaan sitten konstruoida siten, että kun johdanto- ja prosessointisekvenssi yhdistetään IGF:a koodittavaan säikeeseen, puuttuvat emäspa-rit annetaan käyttöön ja IGF:a koodittava säie on sopivassa lukuvaiheistuksessa johdantojakson suhteen. Synteettinen IGF:a koodittava alue ja/tai liittäjä sen ^'-päässä antaa käyttöön translationaaliset pysäytyskodonit sen seikan varmistamiseksi, että polypeptidin C-pääte on sama kuin luonnossa esiintyvä C-pääte.

Liittäjillä tulee olemaan 5-40 emästä, useammin noin 8-35 emästä, koodittavassa sekvenssissä, ja niillä voi olla joko liimautuvat tai tasapäät, liimautuvien päiden ollessa edullisia. On toivottavaa, että adaptorin päätteellä tulee olemaan liimautuvat päät, jotka liittyvät erilaisiin restriktioent-syymeihin, niin että liittäjä selektiivisesti kytkee kaksi erilaista DNA-sekvenssiä, joilla on sopivat, komlementaari-.!:* set, liimautuvat päät.

: Kyseessä olevaa keksintöä valaistaan synteettisten fragment- .-··· tien avulla, jotka koodittavat IGF I:a sekä IGF II:a, jotka liittyvät hiivan <?c-tekijän johdanto- ja prosessointisignaa-leihin. Hiivan σθ-tekijä saatetaan katkaista HindiII:11a sekä Salli:11a. Hindlll pilkkoo c<-tekijän prekursorin pro-sessointisignaalissa pilkkoen Glu-kodonin koodaussäikeessä 3'-kohdan toiseen emäkseen saakka, samalla kun HindiII:n tunnistussekvenssi täydentää Glu-kodonia, koodittaa alaninia sekä antaa käyttöön kypsän -tekijän aminoterminaalisen 5 877S9 trp-kodonin ensimmäisen 5'-emäksen. & -tekijän geenin transkription suunnan johdosta Sali-kohta on paikannettu transkriptionaalisen lopetussignaalin yläpuolelle.

IGF:a koodittavi11a synteettisillä geeneillä on nukleotidi-sekvenssit, jotka perustuvat IGF I sekä IGF II polypeptidien tunnettuihin aminohapposekvensseihin. Synteettiset sekvenssit käyttävät mieluummin kodoneja, joita hiivaisäntä ensisijaisesti käyttää hyväksi, esim. hiivan glykolyyttisiä entsyymejä koodittavissa geeneissä esiintyvien kodonien taajuuden perusteella. Synteettinen sekvenssi sisältää sopivasti liimautuvia päitä pikemmin kuin tasapäitä kloonaavassa siirtäjässä sijaitsevaan restriktiokohtaan tapahtuvaa insertiota varten. Lisäksi, restriktiokohdat laaditaan synteettisiin sekvensseihin mykkiä mutaatioita käyttämällä, fragmenttien tuottamiseksi, joita saatetaan lämpökäsitellä sekvensseiksi, jotka voivat valmistaa IGF I/IGF II-hybridipeptidiraole-kyylejä.

Esimerkeissä annetaan käyttöön synteettisiä fragmentteja, joissa on EcoRI:a varten liimautuvat päät ja jotka on inser-toitu pBR328:ssa sijaitsevaan EcoRI-kohtaan. Tavallisesti synteettinen sekvenssi sisältää muita restriktiokohtia, jotka sijaitsevat proksimaalisesti polypeptidiä koodittavan alueen kunkin pään suhteen. Valitaan sellaiset sisäiset restriktiokohdat, että saadaan koodausalue tarkasti leikat-: tua kloonaavasta siirtäjästä ja liittäjiin yhdistämistä varten, niin että lopullinen DNA-rakenne, joka sisältää johdanto- ja prosessointisignaalit sekä koodittavan alueen, ovat sopivassa lukuvaiheistuksessa sekä sopivassa rinnakkals-asemassa transkription lopetussignaaliin nähden. Mieluummin . , restriktiokohdi11a tulee olla tunnistussekvenssihaara pilk- ' koutumiskohdasta, jossa pilkkoutuminen on suunnattu proksimaalisesti koodausalueeseen nähden ja tunnistuskohta on : . hävinnyt. Tämä tekee mahdolliseksi pilkkoutumisen tarkasti koodausalueen kussakin päässä nukleotidisekvenssistä huoli- 6 37799 matta. Hgal-kohdat on annettu käyttöön esimerkeissä.

Synteettistä geeniä valmistettaessa, tavanomaisin tekniikoin valmistetaan päällekkkäin menevät yksisäikeiset DNA (ssDNA)-fragmentit. Sellaiset ssDNA-fragmentit tulevat tavallisesti olemaan pituudeltaan 10-40 emästä. Vaikka saatetaan käyttää huomattavasti pitempiä fragmentteja, synteesin saanto vähenee ja tulee vaikeammaksi varmistaa, ettei sopiva sekvenssi ole tuotamuksellisesti huonontunut tai muuttunut. Sen jälkeen kun ssDNA-fragmentit on syntetisoitu, ne yhdistetään lämpökäsittelyolosuhteissa komplementaarisen eraäsparin kanssa sopivan järjestyksen varmistamiseksi. Sitten fragmenttien päät sidotaan, ja syntyvä synteettinen fragmentti kloonataan sekä suoritetaan geenin monistuminen, tavallisesti bakteeri-isännässä, kuten esim E.colissa. Kuten aiemmin on ilmaistu, synteettinen rakennegeeni saattaa olla varustettu liimautuvin päin, jotka ovat komplementaariset sopivalle restriktiokohdalle kyseessä olevassa kloonaavassa siirtäjässä (vektorissa) sekä sisäisissä tunnistuskohdissa, jotka sallivat koodaavan alueen tarkan poistamisen. Synteettisten sekvenssien kloonauksen sekä monistumisen jälkeen saatetaan poistaa sekvenssien käyttökelpoisia määriä, tavallisesti IGF:a koodaavan alueen kummassakin päässä sijaitsevissa sisäisissä restriktiokohdissa.

• · ·

Promoottori, jota käytetään, saattaa olla liitetty johdanto-\ jaksoon ja prosessontisekvenssiin. Tällä tavalla saatetaan antaa käyttöön 5'-siirrettävä tekijä, joka sisältää sekä promoottorin että johdanto jakson sopivassa avaruussuhteessa *·1·. tehokkaan transkription suhteen. Sisällyttämällä lisäksi transkriptionaalinen lopetussignaali, luodaan "kasetti", joka sisältää promoottorin/johdanto-restriktiokohdan (-koh-’· dat)-lopetussignaalin, jossa IGF:a koodaava alue saattaa • ‘ ' olla insertoitu Uittajien avulla. Tavallisesti sellaisia "kasetteja" saatetaan saada eristämällä DNA-fragmentti, joka sisältää hiivaisännästä peräisin olevan intaktin geenin sekä · * · · 7 37799 geenin ylä- että alapuolisen transkription säätelysekvens-sit, joissa geeni ekspressoi polypeptidin, jonka isäntä erittää.

Vaihtoehtoisesti voidaan korvata luonnossa esiintyvä hiiva-promoottori muilla promoottoreilla, jotka ottavat huomioon transkription säätelyn. Tämä edellyttää alueen sekvenssi-ja/tai restriktiokartoitusta säätelysekvenssin yläpuolella, erilaisen promoottorin liittämiseksi. Joissakin tapauksissa saattaa olla toivottavaa säilyttää luonnossa esiintyvä hiiva-promoottori ja antaa käyttöön toinen promoottori, joka sijaitsee peräkkäin, joko ylä- tai alapuolella luonnossa esiintyvästä hiivan promoottorista.

Monia erilaisia promoottoreita on käytettävissä tai voidaan saada hiivan geeneistä. Erityisen mielenkiintoisiin promoot-toreihin sisältyvät promoottorit, jotka kytkeytyvät glyko-lyyttisen metuboliatien entsyymeihin, kuten esimerkiksi promoottorit alkoholidehydrogenaasia, glyseraldehydi-ö-fos-faattidehydrogenaasia, pyruvaattikinaasia, trioosifosfatti-isomeraasia, fosfoglukoisoraeraasia, fosfofruktoosikinaasia, jne. varten. Käyttämällä näitä promoottoreita säätelysekvens-sien, kuten esimerkiksi lisääjien operaatoreiden jne. kanssa sekä käyttämällä isäntää, jolla on koskematon säätelysekvens-si, voidaan säädellä prosessoidun "pre"-IGP:n ekspressiota. 7'·'; Täten saatetaan käyttää erilaisia, pieniä, orgaanisia : molekyylejä, esim. glukoosia, halutun polypeptidin valmistuk- -··: sen säätelyyn.

Saatetaan käyttää myös lämpötilalle herkkiä säätelymutantte-ja, jotka tekevät mahdolliseksi transkription moduloinnin - . lämpötilaa vaihtelemalla. Täten kasvattamalla solut ei-salli- vassa lämpötilassa, ne voidaan kasvattaa suureen tiheyteen, ennen kuin lämpötilaa muutetaan, jotta saadaan "pre"-polypep-: : tidien ekspressio IGF I:a ja IGF II:a varten.

8 8 7 7 9 9

Muita mahdollisuuksia voidaan myös sisällyttää rakenteeseen. Esimekiksi jotkut geenit huolehtivat monistumisesta, jolloin stressin kohdistuessa isäntään, ei ainoastaan geeni, joka vastaa stressiin, monistu, vaan myös reunustavat alueet. Sijoittamalla sellainen geeni promoottorin koodausalueen sekä muiden säätelysignaaleiden yläpuolelle, jotka antavat käyttöön "pre"-polypeptidin transkription kontrollin, saatetaan saada plasmideja, joissa on suuri määrä toistuvia sekvenssejä, joihin sisältyy "pre"-polypeptidigeeni säätelysek-vensseineen. Valaiseviin geeneihin kuuluvat metallotioniee-nit sekä dihydrofolaattireduktaasi.

Säätelysekvenssi-fragmentin lisäksi rakenne saattaa sisältää muuta, isännän perintöainekselle homologista DNA:a. Jos halutaan IGF-geenin integraatiota kromosomiin (kromosomeihin), voidaan integraatiota lisätä hankkimalla IGF-geenikonstrukti-oita reunustavia sekvenssejä, jotka ovat homologisia isännän kromosomaalisen DNA:n kanssa.

Hiivaisännän tulee tunnistaa replikaatiojärjestelmä, jota käytetään. Sen tähden on toivottavaa, että replikaatiojärjes-telmä kuuluu luonnostaan hiivaisäntään. Botstein ert a2L. , ne (1979) 8:17-24, ovat tehneet selkoa monista hiivavektoreis-ta. Erityisen mielenkiintoisia ovat YEp-plasmidit, jotka sisältävät 2 ^m-plasmidin replikaatiojärjestelmän. Näitä plasmideja säilytetään pysyvästi moninkertaisina kopioina.

• Vaihtoehtoisesti tai. lisäksi saatetaan käyttää ARS1 :n sekä ....: CEN4:n yhdistelmää pysyvää säilyttämistä varten.

Kunkin käsittelyn jälkeen rakenne saatetaan kloonata, niin että haluttu rakenne, saadaan puhtaana ja riittävässä määrin . . jatkokäsittelyä varten. Haluttaessa saatetaan käyttää sukku-lavektoria (se on vektoria, joka käsittää sekä hiiva- että ' bakteerialkuperää olevan replikation), niin että kloonaus voidaan suorittaa prokaryooteissa, erityisesti E^_ colilla.

• » 9 87799

Plasraidit saatetaan viedä hi ivaisäntään millä taliansa tavallisella keinolla, käyttämällä isäntäsoluja tai sferoplasteja sekä käyttämällä kalsiumilla saostettua DNA:ta transformaatioon tai liposomeja tai muita tavanomaisia menetelmiä. Modifioidut isännät saatetaan valita geneettisten markkerei-den mukaisesti, joita tavallisesti on vektorissa, jota käytetään ekspressioplasmidin konstruktioon. Saatetaan käyttää auksotrofista isäntää, jossa plasmidilla on geeni, joka täydentää isäntää ja saa aikaan prototrofiän. Vaihtoehtoisesti voidaan plasmidiin sisällyttää markkerina resistenssi sopivalle biosidille, esim. antibiootille, raskasmetallille, myrkylle tms. Valinta saatetaan sitten suorittaa käyttämällä elatusainetta, joka kuormittaa kantasoluja niin, että voidaan valita solut, jotka sisältävät plasmidin. Plasmidin sisältävät solut saatetaan sitten kasvattaa sopivassa elatus-aineessa, ja haluttu, eritetty polypeptidi eristetään tavanomaisin menetelmin. Polypeptidi saatetaan puhdistaa kromato-grafian, suodatuksen, uuttamisen jne. avulla. Koska polypeptidi tulee olemaan elatusaineessa kypsässä muodossa, elatus-ainetta voidaan kierrättää jatkuvasti poistamalla haluttu polypeptidi.

Seuraavien esimerkkien tarkoituksena on valaista eikä rajoittaa keksintöä.

• · · : ·.* Kokeellinen osa ____: Nukleotidisekvenssit ihmisen insuliinin kaltaisia kasvuteki- joitä I ja II (IGF I ja II) varten, sisältäen edullisia hii-van kodoneita, suunniteltiin aminohapposekvenssien perusteella, joista raportoidaan Rinderknechtin ja Humbelin julkaisussa (1978), J. Biol. Ghem. 253:2769-2776 sekä Rinderknechtin - ja Humbelin julkaisussa (1978), FEBS Letters 89:283-286. 3ek- *· ' venssit (koodittavat säikeet, jotka on esitetty 5*:sta 3':iin) ovat seuraavat: 37799

IGF I

* Hood i t ta va a. J uu

AsnSc rTh rl.ruMc t GlyProGluThrLeuCy sGlyAlaGl uLcuVa lAspAl aLeuGl o 5'-AATTCGÄCGCTTATCGGTCCAGAAACCTTGTGTGGTGCTGAATTGGTCGATGCTTTGCAA GCTGCGAATACCCAG^rCTTTGGAACACACCACCACTTAACCAGCTACGAAACGTT EcoRI Hgal

PhcValCysGlyAspArgGlyPbeTyrPheAsnLysProThrGlyTyrGlySerSerSer

TTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCAACAAGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTCT

AAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGTTGTTCGGTTGGCCAATGCCAAGAAGAAGA

ArgArgAlaProGlnThrGIylleValAspGluCysCysPheArgSerCysAspLeuArg AGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTTGACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGAGA TCTTCTCGAGGTGTTTGGCCATAGCAACTGCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACTCT

HgaI EcoRI

ArgLeuGlufletTryCysAlaProLeuLysProAlaLysSerAlaOP MetArgArg AGATTGGAAATGTACTGTGCTCCATTGAAGCCAGCTAAGT CTGCTTGAATGCGTCG-3’ TCTAACCTTTACATGACACCAGGTAACTTCGGTCGATTCAGACCAACTTACGCAGCTTAA

Koodittava alue «j

IGF II

* Koodittava alue

AsnSerThrLeuMet AlaTyrArgProSerGluThrLeuCysGlyGlyGluLeuValAsp 5'-AATTCGACGCTTATCGCTTACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGTGGTGAATTGGTCGAC

|gctgcgaataccgaat]gtctggtaggctttggaacacaccaccacttaaccagctg

EcoRI Hgal * t* ThrLeuGloPheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheSerArgProAlaSerArgVal

- -.I ACCTTGCAATTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCTCCAGACCAGCTTCCAGAGTT

: TGGAACGTTAAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGAGGTCTGGTCGAAGGTCTCAA

SerArgArgSerArgGlylleValGluGluCysCysPheArgSerCysAspLeuAlaLeu TCTAGAAGATCCAGAGGTATCGTTGAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGGCTTTG :Vt AGATCTTCTAGGTCTCCATAGCAACTTCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACCGAAAC

Hgal EcoRI

’· ** LeuGluThrTyrCysAlaThrProAlaLysSerGluOP MetArgArg ' TTGGAAACCTACTGTGCTACCCCAGCTAAGT CTGAATGAATGCGTCG-3’

- AAr.CTTTGGATGArACGATGGGGTCGATTCAGACTI ACTTACGCAGCTTAA

·’ ’ _______nr

Koodittava alue ♦! 11 87799 S e k v e n g n c issn on EcoRI liimautuvat päät kummassakin päässä . IGF I:n koodaus alkaa koodi ttavan säikeen emäksestä: 16 ja päättyy emäkseen 225· Hgal restriktiokohdat sijaitsevat IGF I:a koodittavan alueen kummassakin päässä. Hgal:n tunnistus-kohdat (5'-GACGC-3') sijaitsevat IGF I:a koodittavan alueen ulkopuolella, so. synteettisen sekvenssin pään ja Hgal pilk-komiskohdan välissä. IGF II synteettinen sekvsnssi on konstruoitu samalla tavalla siten, että koodittava säie alkaa emäksestä 16 ja päättyy emäksen 219 kohdalla.

Synteettinen DNA-fragmentti IGF J:a varten, jolla on sekvenssi, jota on juuri kuvattu IGF I:n suhteen, valmistettiin syntetisoimalla 20 limittäistä DNA-segmenttiä käy ttr-imäl ] ä fosforamidiittimenetelmaä (katso käsittelyn alaisena olevaa hakemusta, sarja no. 457,412, jätetty tammikuun 12 päivänä, -85)· ssDNA-sekvenssit olivat seuraavat:

Nimitys Sekvenssi

A AATTCGACGCTTATGG

B-I-l GTCCAGAAACCTTGTGTGGT

C-I-2b GCTGAATTGGTC

C-I-2a GATGCTTTGCAATTCGT

D TTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTC

i-3 aacaagccXaccggttacggttcttcttc

E-I-4 TAGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTT

F-I-5 GACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTG

.;]* G-1-6 AGAAGATTGGAAATGTACTGTGCT

1-7 CCATTGAAGCCAGCTAAGTCT

: H-1-8 GCTTGAATGCGTCG

...: J-I-9 GTTTCTGGACCCATAAGCGTCG

K-I-10 AAAGCATCGACCAATTCAGCACCACACAAG

77 L CTCTGTCACCACAAACGAATTGC

M-I-ll AACCGGTTGGCTTGTTGAAGTAGAAAC

1-12 TGGAGCTCTTCTAGAAGAAGAACCGT

1-13 GAAACAACATTCGTCAACGATACCGGTTTG

::: N-1-14 CCAATCTTCTCAAGTCACAAGATCT

Γ: 1-15 GGCTTCAATGGAGCACAGTACATTT

·*; 1-16 AATTCGACGCATTCAAGCAGACTTAGCT

12 87 799 ssDNA-segmentit yhdistettiin seuraavasti: 50 pikomoolia kutakin segmenttiä, paitsi A:a sekä 1-16:a ‘5 '-fosfo ryloi t i i n T4-polynukleotidikinaasilla. Sitten 50 pikomoolia kaikkia segmenttejä lämpokäsiteitiin yksinkertaisessa vaiheessa 18 ^ul:n yhteispanoksena jäähdyttämällä 95°C:sta 25°C:een 1,5 tunnin kuluessa. Sidonta saatiin aikaan 50pl:n reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 1mM ATP:tä, 1OmM DTT:tä, 1OOmM tris-HCl:ää, pH 7,8, 1 OmM MgCl2:a, 1ug/ml spermidiiniä sekä T4-ligaasia. Tarkoituksenmukainen, kaksi-säikeinen fragmentti, joka syntyy kuvassa 1 esitettyjen fragmenttien ryhmityksestä ja pariutumisesta, puhdistettiin 7 ^ puhdasta polyakryyliamidia sisältävällä elektroforeesi-geelillä.

Kuva 1 IGF Iin lämpökäsittely ja sidontakaavio 5. A B-II-1 C-1 - 2b C-!-2a D 1-3 . E-1-4 · F-I-5 G-I-6 1-7 · H-I_-8 + 3·---- - ---' - - J-I-9 K-I-10 L 1-11 1-12 1-13 H-I-14 1-15 1-16 IGF II:a varten DNA-sekvenssi syntetisoitiin samalla tavalla. Valmistettiin seuraavat ssDNA-lisäfragmentit. Nimitys Sekvenssi

B-II-1 CTTACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGT

C-II-2 GGTGAATTGGTCGACACCTTGCAATTCGT

11-3 TCCAGACCAGCTTCCAGAGTTTCT

E-II-4 AGAAGATCCAGAGGTATCGTT

F-II-5 GAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTG

G-II-6 GCTTTGTTGGAAACCTACTGTGCT

H-II-7 ACCCCAGCTAAGTCTGAATGAATGCGTCG

v.: J-II-8 GTTTCGGATGGTCTGTAAGCCATAAGCGTCG

K-II-9 AAGGTGTCGACCAATTCACCACCACACAAG

M-II-10 AAGCTGGTCTGGAGAAGTAGAAAC

:- ’ 11-11 CTGGATCTTCTAGAAACTCTGG

11-12 GAAACAACATTCTTCAACGATAC CT

7' ' N-11-13 TTCCAACAAAGCCAAGTCACAAGATCT

: · · ·: 11-14 AGACTTAGCTGGGGTAGCACAGTAGGT

I'-'; 11-15 AATTCGACGCATTCATTC

13 37799 200 pikomoolia näitä ssDNA-fragmentteja sekä fragmentteja A, D sekä L yhdistettiin samalla tavalla kuin edellä on esitetty, jolloin A ja 11-15 eivät olleet fosforyloituja ja tuloksena oli seuraava segmentt,ien järjestys ja pariutuminen.

Kuva 2 IGF II;n lämpökäsittely ja sidontakaavio c, A 8-1I-1 C-I1-2 D I1-3 E-II-4 F-II-5 G-II-6 H-II-7 i> - - - - - ---- 3 + 3’ -- ------ - - 5' J-II-8 K-Il-9 L Μ-Π-10 11-11 11-12 N-II-13 11-14 11-15

Synteettiset DNA-sekvenssit liitettiin pBR328:n EcoRI-koh-taan plasmidien p328IGF I:n ja p328IGF II:n valmistamiseksi. Kloonauksen jälkeen IGF:a koodittavat säikeet leikattiin käyttäen Hgal:a

Synteettiset oligonukleotidiliittäjät sidottiin Hgal-restrik-tiofragmentteihin. IGF I:ä varten liittäjillä oli seuraavat sekvenssit: a) 5'-AGCTGAAGCT-3' 3'-CTTCGACCAGG-5' b) 5’-CTGCTTGATAAG-3' 3 ' -ACTATTCAGCT-5 ' : Mitä tulee koodittavan säikeen suuntaukseen, ensimmäisen ____: liittäjän a) 3'-pää on komplementaarinen 5' Hgal-pilkkoutu- miskohdalle IGF I:n synteettisessä sekvenssissä, samalla kun "ä ensimmäisen liittäjän 5'-pää saa Hindlll liimautuvan pään.

‘ Toinen liittäjä b) on komplementaarinen 5'-päästään IGF I

sekvenssin 5'-päässä sijaitsevalle Hgal pilkkoraiskohdalle, '· samalla kun liittäjän 3' -pää antaa käyttöön Pali tarttuvan ·.· ' pään.

14 87799 TGF ΤΙ :11ο 1 i i ttäj 1.11 ä ori rpu rrmvat sek vonssi 1..

c) 5'-AGCTGAGAAGCT-3' 3 '-CTTCGACGAAT-5' d) 5'-CTGAATGATAAG-3' 3 '-ACTATTCAGCT-5'

Suuntauksen ollesso kuten edellä, ensimmäinen liittäjä c) on komplementaarinen 3'-päästään IGF II synteettisessä sekvenssissä sijaitsevalle 5'-Hgal pilkkoutumiskohdalle, kun taas 5'-pää antaa käyttöön Hindi11 liimautuvan pään. Toinen liit— täjä d) on ^'-päästään komplementaarinen IGF TI synteettisessä sekvenssi ssä sijaitsevalle toiselle H f,ai pi I kkoutuin i .'-.kohdalle ja antaa 3'-päässään käyttöön SalI liimautuvan pään.

Synteettiset fragmentit ja niihin yhdistetyt liittäjät puhdistettiin preparatiivisella geelielektroforeesilla sekä sidottiin 100 ng:aan pAB113:a, joka aiemmin oli uutettu täydellisesti endonukleaaseilla Hindlll sekä Sali:llä. pAB113 saatiin pAB112:sta poistamalla kolme 63 pb HindiII fragmenttia. pAB112 on plasmidi, joka sisältää 1,8 kb EcoRI-fragmen-tin hi ivan Λ-tekijägeenin kanssa, joka on kloonattu pBR322:n EcoRI kohdassa, josta HindiII sekä Sali kohdat on poistettu. pAB112 johdettiin plasmidi pAB101:stä, joka sisältää hiivan •(.-tekijän geenin osittnisenn SauöA fragmenttina, joka on kloonattu plasmidi YEp24:n Burn Hl-kohdassa. pAB1 01 saatiin ‘I". seulomalla YEp24:ssä kloonattu hiivan genomikokoelma käyttä- / .* mällä entsymaattisesti P32;na radiomerkattua, synteettistä ·** | oligonukleotidimallia, joka oli homologinen julkaistulle o(-tekijää koodittavalle alueelle (Kurjan ja Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Spring Harbor Meeting on the Molecular Biology of Yeast, sivu 242).

Syntyviä seoksia käytettiin transformoimaan E^ coli HB 101 soluja, ja saatiin plasmidit pAB113-IGF-I sekä pAB113-IGF-II vastaavasti IGF I:a sekä IGF II:a varten.

» · * * · » · » * * • · · 15 87 799

Plasmidit pAB113-IGF-I sekä pAB113-IGF-II (5 pg kumpaakin), joissa oli vastaavasti rakonnegeenit IGF I ja IGF Tl, pilkottiin täydellisesti EcoRI: i 1 ä , ja syntyvät fragmentit, yhdistettiin ylimäärään EcoRI-BamHI liittäjiä ja uuta'tti i n BamHI:n kanssa. Syntyvät 1,8 kb BamHI fragmentit eristettiin preparatiivisen geelielektroforeesin avulla, ja noin 100 ng kutakin fragmenttia sidottiin 100 ngraan pCl/l:a, joka aiemmin oli pilkottu täydellisesti BamHI:1lä sekä käsitelty alkalisella fosfataasilla.

Plasmidi pCl/l on pJDB219:n johdannainen, Beg,gs, Nature (1978) 275:104, jossa pJDB219:ssä sijaitsevaa bakteeriperäistä plasmidia pMB9 vastaava alue on syrjäytetty pCl/l:ssä sijaitsevalla pBR322:lla. Kutakin sidontaseosta käytettiin transformoimaan coli HB 101:n soluja. Transformantit valittiin ampisilliiniresistenssin perusteella, niiden plasmidit analysoitiin restriktioendonuklsaasiuuton avulla. Valmistettiin DNA, joka oli peräisin kutakin rakennegeeniä IGF I tai IGF 11 (pYIGF-I-10/1) varten vastaavasti valitusta kloonista, ja sitä käytettiin transformoimaan hiivan AB103 soluja. Transformaatit valittiin niiden Leu+-fenotyypin perusteella.

Kaksi hiivakannan AB103 («,pep 4-3, 2-3, leu 2-112, ura . 3-52, his 4-580), jotka oli transformoitu plasmidilla • * · ——— ··· ( pYIGF-I-1 0/1 ) , viljelmää (5 ja 9 litraa) kasvatettiin " 30°C:ssa, -leu-väliaineessa, kyllästykseen asti (optinen : tiheys 650 nm:ssä 5) ja jätettiin ravistellen 30°C:een vielä 12 tunnin mittaiseksi ajaksi. Solusupernatantit koottiin *:* kustakin viljelmästä sentrifugoiden, ja IGF konsentroitiin absorboimalla ioninvaihtohartsiin (Biorex-70 on saatavissa Bio-Rad Laboratories, Inc.rltä Richmond, Kalifornia). Gon : jälkeen kun oli eluoitu 80 öiseen etanoliin valmistetulla 10 mMrlla HClrlla, IGF I-jakeet (0,4 ml ja 3 ml vastaavasti) määritettiin kokonaisproteiinikonsentraation ja IGF I ‘ konsentraati on suhteen. Protei inimääri tys suoritettiin 16 87799

Coomassie Blue:lla, jota on saatavissa Bio-Rad Laboratories, Inc.:Itä Richmond, Kalifornia. TGF I-määritys oli tavanomainen kompetitiivinen radioimmunologinen määritys, jossa käytettiin radiomerkattua TGF T:a. Tulokset olivat seuraavat:

Tilavuus konsent- Kokonais-

Tutkimus no Tilavuus roinnin jälkeen proteiini IGF I.

1 5 1 0,4 ml 5,0 mg/ml 3,75 mg/ml 2 91 3,0 ml ?,9 mg/ml 3,00 mg/ml IGF I:n biologinen määritys, joka perustuu peptidin synergis-tiseen vaikutukseen kyyhkysenkupuvasteen lisäämiseksi prolaktiinille Anderson et ai. (1983), kirjassa Somatomedins/ Insu-lin-Like Growth Factors, Spencer, E.M., Toimittaja Walter deGruter, Berliini), ilmaisee, että näiden valmisteiden IGF I tuotteella, on aktiivisuutta, joka on samanarvoista autenttisen IGF I:n kanssa, joka on eristetty ihmisen seerumista.

AB103(pYIGF-II-10/1):n viljelmät, jotka oli kasvatettu edellä kuvatulla tavalla sekä määritetty käyttämällä ihmisen istukan membraanin radioreseptorimääritystä (Spencer et ai. (1979) Act. Endocrinol. 91:36-48) IGF II:n suhteen, osoittivat 3,9 yksikköä/ml, kun ihmisen normaali seerumissa on 1 yksikkö/ml.

• « » * · -• · . *: Kyseessä oleva keksintö antaa käyttöön uusia rakenteita, jot- ' ka saatetaan liittää vektoreihin ihmisen insuliinin kaltai- : "· non kasvutekijä I:n ekspressiota varten valmistuksen ja ori t- ·; tymisen aikaansaamiseksi. Täten voidaan saada polypoptid i , ;*; jolla mi identtinen sekvenssi luonnossa esiintyvän, ihmisen insuliinin kaltaisen kasvutekijä l:n kanssa. Käyttöön saadun .·. ; erittymisen johdosta voidaan saada lisääntyneitä saantoja *..) solupopulaatioon perustuen, ja seuraavat preparatiiviset toi minnot ja puhdistus ovat yksinkertaistettuja.

• · · - I* · « · · » ·» 17 87799

Vaikka edellä esitettyä keksintöä on kuvattu yksityiskohtaisesti valaisemalla sitä esimerkein, jolloin tarkoituksena on ollut selventää keksintöä, on ilmeistä, että käytännössä saatetaan toteuttaa tiettyjä muutoksia liitteenä olevien patenttivaatimusten puitteissa.

» »

Claims (2)

18 87799 1* Menetelmä ihmisen insuliinin kaltaisen kasvutekijän (IGF) tuottamiseksi, tunnettu siitä, että kasvatetaan hiivaa, joka sisältää toiminnallisen DNA-rakenteen, joka sisältää geenin, joka koodaa seuraavaa aminohapposekvenssiä: GlyProGluThrLeuCysGlyAlaGluLeuValAspAlaLeuGln PheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheAsaLysProThrGlyTycGlySerSerSer ArgArgAlaProGlnThrGlylleValAspGluCysCysPheArgSerCysAepLeuArg ArgLeuGluMetTyrCysAlaProLeuLysProAlaLysSerAla tai • · AlaTyrArgProSerGluThrLeuCysGlyGlyGluLeuValAsp ThrLeuGlnPheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheSerArgProAlaSerArgVal SerArgArgSerArgGlylleValGluGluCysCysPheArgSerCysAspLeuAlaLeu LeuGluThrTyrCysAlaThrProAlaLysSerGlu liitettynä sopivaan lukuvaiheistukseon hiivan tunnistamien DNA- 19 87799 sta koodaavien erityksen ohjaaja- ja prosessointisignaalisek-venssien kanssa rakennegeenin muodostamiseksi hiivan kanssa yhteensopivassa vektorissa sijaitsevan transkription aloitusalu-een alapuolelle ja transkription säätelyn alaiseksi, ja että eristetään hiivasta sen insuliinin kaltainen kasvutekijä.

2. Rekombinantti DNA, tunnettu siitä, että se koodaa insuliinin kaltaista kasvutekijää, edullisesti hiivassa, nukle-1 otidisekvenssin ollessa: 5' -GGTCCAGAAACCTTGTGTGGTGCT6AATTGGTCGATGCTTTGCAA CCAGGTCTTTGGAACACACCACGACTTAACCAGCTACGAAACGTT TTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCAACAAGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTCT AAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGTTGTTCGGTTGGCCAATGCCAAGAAGAAGA AGAAGAGCrCCACAAACCGGTATCGTTGACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGAGA TCTTCTCGAGGTGTTTGGCCATAGCAACTGCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACTCT AGATTGGAAATGTACTGTGCTCCATTGAAGCCAGCTAAGTCTGCT-3' TCTAACCTTTACATGACACGAGGTAACTTCGGTCGATTCAGACGA - -tai 5' -GCTTACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGTGGTGAATTGGTCGAC CGAATGTCTGGTAGGCTTTGGAACACACCACCACTTAACCAGCTG ACCTTGCAATTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCTCCAGACCAGCTTCCAGAGIT TGGAACGTTAAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGAGGTCTGGTCGAAGGTCTCAA TCTAGAAGATCCAGAGGTATCGTTGAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGGCTTTG ... - AGATCTTCTAGGTCTCCATAGCAACTTCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACCGAAAC TTGGAAACCTACTGTGCTACCCCAGCTAAGTCTGAA-3' AACCTTTGGATGACACGATGGGGTCGATTCAGACTT 20 87799 KRAV