MX2009001691A

MX2009001691A - Metodo para produccion del factor de crecimiento i tipo insulina.

Info

Publication number: MX2009001691A
Application number: MX2009001691A
Authority: MX
Inventors: Kurt Lang; Friederike Hesse; Stephan Fischer; Christian Schantz; Andreas Schaubmar; Hendrik Knoetgen; Joerg Thomas Regula
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 2006-08-31
Filing date: 2007-08-29
Publication date: 2009-02-25
Also published as: US8552158B2; WO2008025527A8; BRPI0715754A2; EP2059530A1; CA2658736A1; KR20090046874A; CA2658736C; CN101484469B; AU2007291501B2; EP2059530B1; JP4958975B2; IL195664A0; JP2010501606A; ES2393373T3; US20100121036A1; WO2008025527A1; AU2007291501A1; CN101484469A; IL195664A; KR101106795B1

Abstract

Se describe el método para la producción de IGF-I, caracterizado por el cultivo de una célula hospedadora procariótica que comprende un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende el IGF-I unido por la terminal N a la terminal C de un propéptido, por lo cual el propéptido finaliza en la terminal C con los aminoácidos -Y-Pro, en donde Y se selecciona del grupo que consiste de Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro, la recuperación y separación de la proteína de fusión con la proteasa IgA, y la recuperación de IGF-I. El IGF-I es útil para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos tal como la enfermedad de Alzheimer.

Description

METODO PARA PRODUCCION DEL FACTOR DE CRECIMIENTO I TIPO INSULINA Campo da la invención Esta invención se refiere a un método para la producción factor de crecimiento I tipo insulina (IGF-I, por sus siglas en inglés), composiciones farmacéuticas, y métodos de uso. Antecedentes de la invención El factor de crecimiento I tipo insulina ( IGF-I ) humano es una hormona circulante relacionada de manera estructural a la insulina. El IGF-I tradicionalmente se considera como el mediador principal de las acciones de la hormona de crecimiento en tejidos periféricos. El IGF-I está compuesto por 70 aminoácidos y también es llamado somatomedina C y es definido por SwissProt No. P01343. Se mencionan el uso, actividad y producción, por ejemplo, le Bouc, Y., y col., FEBS Lett. 196 (1986) 108-112; Pagter-Holthuizen, P., y col., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist, A.C., y col., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenbergh, P.H., y col., Biochem. Biophys . Res. Commun . 175 (1991) 507-514; Tanner, J.M., y col., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84 (1977) 681-696; Uthne, K . , y col., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP 0 123 228; EP 0 128 733; US 5,861,373; REF. :198777 US 5,714,460; EP 0 597 033; WO 02/32449; WO 93/02695. La regulación de la función de IGF-I es muy compleja. En la circulación, solamente el 0.2% del IGF-I existe en forma libre mientras que la mayoría está unido a las proteínas de unión de IGF (IGFBP, por sus siglas en inglés), que tienen afinidades muy altas a IGF y modulan la función de IGF-I. El factor se puede liberar localmente por los mecanismos que liberan el IGF-I, tal como la proteólisis de IGFBPs por proteasas. El IGF-I desempeña una función paracrina en el desarrollo y maduración del cerebro (Werther, G.A., y col., Mol. Endocrinol. 4 (1990) 773-778). Los estudios in vitro indican que el IGF-I es un agente trófico no selectivo potente para varios tipos de neuronas en el CNS ( nusel, B., y col., J. Neurosci. 10 (1990) 558-570; Svrzic, D., y Schubert, D., Biochem.. Biophys . Res. Commun . 172 (1990) 54-60), incluyendo las neuronas dopaminérgicas (Knusel, B. , y col., J. Neurosci. 10 (1990) 558-570) y los oligodendrocitos (McMorris, F.A., y Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21 (1988) 199-209; McMorris, F.A., y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83 (1986) 822-826; Mozell, R.L., y McMorris, F.A., J. Neurosci. Res. 30 (1991) 382-390)). US 5,093,317 menciona que la supervivencia de las células neuronale-s colinérgicas es mejorada por la administración de IGF-I. Además se conoce que IGF-I estimula la regeneración nerviosa periférica ( anje, M., y col., Brain Res. 486 (1989) 396-398) y mejora la actividad de la ornitina decarboxilasa (US -5, 093, 317) . US 5, 861, 373 y WO 93/02695 mencionan un método para tratar las lesiones o enfermedades del sistema nervioso central que afectan predominantemente las células neuronales gliales y/o no colinérgicas aumentando las concentraciones activas de IGF-I y/o análogos del mismo en el sistema nervioso central del paciente. WO 02/32449 se dirige a los métodos para reducir o prevenir el daño isquémico en el sistema nervioso central de un mamífero administrando en la cavidad nasal del mamífero una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva o biológicamente activa de IGF-I . El IGF-I se absorbe a través de la cavidad nasal y se transporta en el sistema nervioso central del mamífero en una cantidad efectiva para reducir o prevenir el daño isquémico asociado a un acontecimiento isquémico. EP 0874641 reivindica el uso de un IGF-I o IGF-I I para la fabricación de un medicamento para tratar o prevenir el daño neuronal en el sistema nervioso central, debido a la demencia relacionada al SIDA, enfermedad de Alzheimer (AD, por sus siglas en inglés), enfermedad de Parkinson, enfermedad de Pick, enfermedad de Huntington, encefalopatía hepática, síndromes gangliónicos básicos corticales, demencia progresiva, demencia familiar con paraparesia espástica, parálisis supranuclear progresiva, esclerosis múltiple, esclerosis cerebral de Schilder o encefalomielitis hemorrágica necrosante aguda, en donde el medicamento está en una forma para la administración parenteral de una cantidad efectiva de IGF fuera de la barrera cerebral sanguínea o barrera de la médula espinal sanguínea. La reducción de los niveles en cerebro y suero de IGF-I libre se ha relacionado a la patogénesis de las formas esporádicas y familiares de AD . Además, el IGF-I protege las neuronas contra la neurotoxicidad inducida por ?ß (Niikura, T. , y col., J. Neurosci. 21 (2001) 1902-1910; Dore, S., y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94 (1997) 4772-4777; Dore, S., y col., Ann NY Acad. Sci. 890 (1999) 356-364) . Recientemente, fue demostrado que el IGF-I administrado de manera periférica es capaz de reducir loe niveles en cerebro de ?ß en las ratas y ratones (Carro, E., y col., Nati. Med. 8 (2002) 1390-1397). Además, el estudio demostró que en un modelo de ratón transgénico con AD, el tratamiento prolongado de IGF-I redujo significativamente la carga de la placa amiloidea del cerebro. Estos datos apoyan fuertemente la idea que IGF-I puede reducir los niveles en cerebro de ?ß y la demencia cerebral asociada a la placa eliminando ?ß del cerebro. El sitio de reconocimiento de la proteasa IgA se describe como Yaa-Pro . ! . Xaa-Pro . Yaa significa Pro (o raramente Pro en combinación con Ala, Gly o Thr : Pro-Ala, Pro-Gly, o Pro-Thr. Xaa . representa Thr, Ser o Ala (Pohlner, J. y col., Bio/Technology 10 (1992) 799-804; Pohlner, J. y col., Nature 325 (1987) 458-462 y US 5,427,927). Los sitios de separación han sido identificados naturalmente por Wood, S.G. y Burton, J. , Infect Immun. 59 (1991) 1818-1822. Los sustratos peptidicos sintéticos para la proteasa Al de inmunoglobulina de la gonorrea Neisseria (tipo 2) son los sitios autoproteoliticos Lys-Pro-Ala-Pro .!. Ser-Pro, Val-Ala-Pro-Pro .!. Ser-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro .! .Ala-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro .!. Ser-Pro, Pro-Arg-Pro-Pro .!. Thr-Pro y los sitios de separación de IgAl Pro-Pro-Thr-Pro .!. Ser-Pro y Ser-Thr-Pro-Pro .!. hr-Pro . WO 2006/066891 describe los conjugados que consisten del factor de crecimiento I tipo insulina (IGF-I) y uno o dos (grupos poli ( etilenglicol ) , caracterizados porgue el IGF-I tiene una alteración de aminoácido en hasta tres posiciones de aminoácido 27, 37, 65, 68 de la secuencia de aminoácido de IGF-I de tipo silvestre a modo que uno o dos de los aminoácidos sea lisina y el aminoácido 27 sea un aminoácido polar pero no lisina, que se conjuga via los grupos amina primaria de lisina y los grupos poli (etilenglicol) tienen un peso molecular total de 20 a 100 Da . Tales conjugados son útiles para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos tal como la enfermedad de Alzheimer. WO2006/074390 se refiere a las variantes de IGF-I y a las proteínas de fusión que comprenden las variantes de IGF-I y ciertos componentes de fusión. WO 2006/074390 se refiere a ciertas variantes de IGF-I. Se conocen los métodos para la producción recombinante de IGF-I vía una proteína de fusión, por ejemplo, en EP0155655 y US 5,158,875. Sin embargo se encuentra frecuentemente la microheterogeneidad de IGGF-I producida de manera recombinante se encuentra ( Forsberg, G. y col., Biochem. J. 271 (1990) 357-363). Breve descripción de la invención La invención proporciona un método para la producción recombinante de IGF-I sin metionina unida a la terminal N en los procariotas con pureza y producción elevada. La invención comprende un método para la producción de IGF-I, caracterizada por a) cultivo de una célula hospedadora procariótica que comprende un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión que comprende el IGF-I unido por la terminal N a la terminal C de un propéptido, b) por lo cual el propéptido finaliza la terminal C con los aminoácidos - Y-Pro, en donde Y se selecciona del grupo que consiste de Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro, c) recuperación y separación de la proteina de fusión con la proteasa IgA, y d) recuperación del IGF-I . El IGF-I recuperado no comprende ningún residuo de metionina unido en la terminal N. Una modalidad preferida de la invención es un propéptido seleccionado del grupo que consiste de los péptidos mostrados en la SEC ID NO: 2-5. Una modalidad adicional de la invención es una proteina de fusión que comprende el IGF-I unido por la terminal N a la terminal C de un propéptido, caracterizado porque finaliza la terminal C de tal propéptido con los aminoácidos -Y-Pros, en donde Y se selecciona del grupo que consiste de Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro. Debido a la secuencia -Y-Pro, el propéptido se puede separar por el tratamiento de proteasa IgA del IGF-I. Preferiblemente la proteina de fusión de acuerdo a la invención es caracterizada por la fórmula et-Xi-Hisn- X2-Y-Pro- [IGF-I] , en donde · Met denota metionina, • Xi es un enlace, serina o asparragina, • His es histidina, • n es un número de 0 a 6, • X2 es un péptido enlace, seleccionado del grupo de péptidos SEC ID NO: 6-10, • Pro es prolina, e • Y se selecciona del grupo que consiste de Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pr -Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro . Preferiblemente el propéptido es mostrado por la fórmula Met-Xi-HiSn-X2-Y-Pro-, en donde • Met denota metionina, • Xi es un enlace, serina o asparragina, • His es histidina, · n es un número de 0 a 6, • X2 es un péptido enlace, seleccionado del grupo de péptidos SEC ID NO: 6-10, • Pro es prolina, e • Y se selecciona del grupo que consiste de Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro. El propéptido es unido por la terminal C a la terminal N (glicina) de IGF-I . El propéptido tiene preferiblemente una longitud de hasta 30 aminoácidos. Preferiblemente Xi es un enlace. Preferiblemente N es 0 ó 6. Preferiblemente X2 es el péptido SEC ID NO : 7. Preferiblemente Y es Pro-Arg-Pro. .La invención adicionalmente comprende las composiciones farmacéuticas que contienen un IGF-I de acuerdo a la invención, preferiblemente junto con un portador farmacéuticamente aceptable. La invención adicionalmente comprende los métodos para la producción de composiciones farmacéuticas que contienen un IGF-I de acuerdo a la invención. La invención adicionalmente comprende el uso de un IGF-I de acuerdo a la invención para la preparación de un medicamento para el tratamiento de AD. La invención adicionalmente comprende los métodos para el tratamiento de AD, caracterizado porque una cantidad farmacéuticamente efectiva de IGF-I amino-reactivo se administra a un paciente en necesidad de tal tratamiento, preferiblemente en una a dos aplicaciones por semana. Descripción detallada de la invención Se encontró asombrosamente que la proteasa IgA, preferiblemente proteasa IgA de Neisseria gonorrhoae, es capaz de separar la secuencia de aminoácido Y-Pro . ! . Gly-Pro . Y se selecciona del grupo que consiste de Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro. Es preferiblemente útil como sitio de hendidura Pro-Pro .!. Gly-Pro o Pro-Arg-Pro-Pro . ! . Gly-Pro (SEC ID NO: 11) (.!.: posición de separación). El sitio de separación de proteasa IgA para el proceso de acuerdo a la presente invención tiene la secuencia de consenso de aminoácido Y-Pro .!. Gly-Pro, por lo cual Gly-Pro son los primeros dos aminoácidos del IGF-I . Y representa preferiblemente una secuencia de aminoácido que termina con los aminoácidos Pro, Pro-Ala, Arg-Pro o Pro-Arg-Pro . Tales secuencias de aminoácido de Y, especialmente Pro-Arg-Pro se pueden prolongar por un grupo adicional Ala o Pro-Ala, tal como por ejemplo en Ala-Pro-Arg-Pro (SEC ID NO: 12) o Pro-Ala-Pro Arg-Pro (SEC ID NO: 13) . Son particularmente preferidas las secuencias de aminoácido de la separación Pro-Arg-Pro-Pros .!. Gly-Pro (SEC ID NO: 11), Pro-Ala-Pro. ! .Gly-Pro (SEC ID NO: 14), Pro-Pro .!. Gly-Pro (SEC ID NO: 15), Ala-Pro-Arg-Pro-Pro .!. Gly-Pro (SEC ID NO: 16) o Pro-Ala-Pro-Arg-Pro-Pro. ! .Gly-Pro (SEC ID NO: 17). De acuerdo con la presente invención el término "proteasa IgA" incluye las proteasas que separan específicamente IgA y que se describen, por ejemplo, en ornfeld, SJ. y Plaut, A.G., Rev. Infekt. Dis . 3 (1981) 521-534, tal como por ejemplo la proteasa IgAl de Neisseria gonorrhoea (tipo 2). Las proteasas IgA recombinantes tales como las descritas en DE-A 36 22 221; Koomey, J.M., y col. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79 (1982) 7881-7885; Bricker, J. , y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80 (1983) 2681-2685; Pohlner, J., Nature 325 (1987) 458-462; y Halter, R . , y col., EMBO J. 3 (1984) 1595-1601, también de igual manera son convenientes. Preferiblemente la proteasa IgA es la proteasa IgA de Neisseria gonorrhoae. Preferiblemente la proteasa IgAl de la Neisseria gonorrhoea (tipo 2) tiene la secuencia SEC ID NO: 21. El IGF-I de acuerdo a la invención se refiere a una proteína humana que consiste de 70 aminoácidos que también es llamada somatomedina C y es definida por SwissProt No. P01343. El uso, actividad y producción se mencionan en, por ejemplo, le Bouc, Y., y col., FEBS Lett . 196 (1986) 108-112; Pagter-Holthuizen, P., y col., FEBS Lett. 195 (1986) 179-184; Sandberg Nordqvist, A.C., y col., Brain Res. Mol. Brain Res. 12 (1992) 275-277; Steenbergh, P.H., y col., Biochem. Biophys . Res. Commun. 175 (1991) 507-514; Tanner, J.M., y col., Acta Endocrinol . (Copenh.) 84 (1977) 681-696; üthne, K. , y col., J. Clin. Endocrinol. Metab. 39 (1974) 548-554; EP 0 123 228; EP 0 128 733; US 5, 861, 373; US 5, 714, 460; EP 0 597 033; WO 02/32449; WO 93/02695. El IGF-I de acuerdo a la invención comprende un IGF-I seleccionado del grupo que consiste de IGF-I, IGF-I truncado en la terminal C (supresión de 3-6 aminoácidos), R36A (sustitución de arginina en la posición 36 por alanina) , R37A. Preferiblemente el IGF-I es unido por la terminal a Fe humano de IgG, preferiblemente de IgGl o IgG4. El IGF-I truncado en la terminal C (supresión de 3-6 aminoácidos), un IGF-I de SEC ID NO: 1, en donde se suprimen en la terminal C los aminoácidos 3-6. R36A denota un IGF-I de la SEC ID NO: 1, en donde en la posición de aminoácido 36 es sustituida la arginina por la alanina. R37A denota un IGF-I de la SEC ID NO: 1, en donde en la posición de aminoácido 37 es sustituida la arginina ppr la alanina. La codificación genética para la proteina de fusión se coloca preferiblemente bajo el control de las señales de expresión convenientes (preferiblemente inducibles) para poder producir las proteínas de fusión de acuerdo a los" requisitos. Las células procarióticas o eucarióticas convenientes (vegetales así como animales) se pueden utilizar como células hospedadoras para la producción de la proteína de fusión; sin embargo también son posibles los sistemas sin células . Una modalidad preferida del proceso de acuerdo a la presente invención se caracteriza porque una célula hospedadora está transformada con un ADN recombinante o un vector recombinante , en donde el ADN o vector contiene por lo menos una copia de un gen que codifica una proteina de fusión de acuerdo a la invención y la célula transformada es cultivada en un medio conveniente, la codificación genética de la proteina de fusión se realiza para expresarse en la célula transformada, la proteina de fusión se separa con la proteasa IgA y se aisla el IGF-I . La expresión de la proteina de fusión de acuerdo a la invención se puede, por ejemplo, mejorar en el nivel del ADN por la fusión con los fragmentos del gen galactosidasa beta sin lisina, es decir, Y contiene una parte de una proteina galactosidasa beta sin lisina. Otras alternativas para aumentar la expresión de la proteina de fusión son conocidas por el experto. La purificación y separación del producto de expresión se pueden facilitar por la fusión con otros polipéptidos , particularmente, con los polipéptidos o proteínas que están altamente cargados (por ejemplo poli(Lys, Arg) ) o que se pueden unir a las sustancias particulares con alta afinidad (por ejemplo estreptavidina) (ver por ejemplo ??-? 0 089 626, EP-A 0 306 610) . Especialmente los péptidos enlace preferidos son los péptidos SEC ID NO: 6-10, preferiblemente precedidos en la terminal N por SHHHHHH (SEC ID NO: 18), NHHHHHH (SEC ID NO: 19) o HHHHHH (SEC ID NO: 20) . La presente invención también proporciona el ácido nucleico (recombinante) que codifica una proteina de fusión de acuerdo a la presente invención y en donde se incorpora un sitio de separación de proteasa IgA en la región de unión entre el propéptido y IGF-I . ün ADN recombinante de acuerdo a la presente invención se puede obtener de una forma conocida por un experto en el área de la biología molecular. Para esto un vector que contiene una secuencia de ADN que codifica la secuencia de aminoácido de IGF-I, se separa comúnmente con las endonucleasas de restricción en la región del extremo 5' de este gen y se une nuevamente con los oligonucleótidos que contienen la secuencia deseada. Además, la invención también proporciona un vector recombinante que contiene por lo menos una copia de un ADN recombinante de acuerdo a la presente invención. Los vectores que son convenientes como base para la expresión de la proteína en organismos procarióticos , son conocidos por el experto. Este vector es preferiblemente uno que permita una alta expresión del ADN recombinante de acuerdo a la presente invención. El ADN recombinante en el vector está preferiblemente bajo el control de una señal de expresión inducible (por ejemplo promotor lambda, tac, laca o trp) . El vector de acuerdo a la presente invención puede estar presente de manera extracromosómica (por ejemplo plásmido ) asi como integrado en el genoma del organismo hospedador (por ejemplo bacteriófago lambda). El vector de acuerdo a la presente invención es preferiblemente un plásmido. Los vectores que son convenientes en cada caso para la expresión genética en un organismo hospedador particular son conocidos por un experto en el área de la biología molecular. Puede ser un vector eucariótico, pero preferiblemente un vector procariótico . Los ejemplos de los vectores convenientes para la expresión de ADN de acuerdo a la presente invención en procariotas son, vectores comercialmente disponibles por ejemplo, pUC y pUR. La invención también proporciona una célula, preferiblemente una célula procariótica, particularmente de preferencia una célula de Escherichía Coli, que se transforma con el ADN recombinante de acuerdo a la presente invención y/o con un vector recombinante de acuerdo a la presente invención. Cuando la proteína de fusión se expresa en las procariotas, se forman los agregados escasamente solubles (cuerpos refractivos, cuerpos de inclusión) , los cuales son inactivos. Por lo tanto la proteína de fusión se debe transformar en su forma activa. Usando los procedimientos que son familiares a los expertos en la técnica (ver por ejemplo EP-A 0 219 874, EP A 0 114 506, WO 84/03711) primero se realiza una solubilización por la adición de agentes desnaturalizantes seguido por la renaturalización y, si se desea, las etapas de purificación adicional. No son criticas las condiciones requeridas para el tratamiento de una proteina de fusión de IGF-I que se separará con las proteasas IgA. En este proceso, sin embargo, es preferido que la relación en peso de la proteina de fusión de IGF-I a la proteasa IgA sea de 1:1 a 100:1. La reacción ocurre preferiblemente en una solución acuosa amortiguada a pH 6.5 a 8.5. La concentración de amortiguador está preferiblemente en el intervalo de 50 y 500 mmol/1 si se desea, con la adición de 0-100 mmol/1 de cloruro de sodio. La separación se realiza preferiblemente a temperatura ambiente durante por lo menos 60 minutos hasta 5 dias, preferiblemente entre 24-72 H. Después de la solubilización, renaturalización y separación con la proteasa IgA, el producto de separación obtenido de esta manera es purificado preferiblemente por medio de la cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de intercambio iónico y/o fraccionamiento por tamaño. El IGF-I producido de esta manera está libre de metionina en la posición -1. Formulaciones farmacéuticas El IGF-I se puede administrar como una mezcla, o una diferente especie separada por cromatografía de interacción hidrofóbica mediante por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico o cromatografía de la exclusión de tamaño. Los compuestos de la presente invención se pueden formular de acuerdo a los métodos para la preparación de las composiciones farmacéuticas, los cuales son conocidos por el experto en la técnica. Para la producción de tales composiciones, un IGF-I de acuerdo a la invención es combinado en una mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable, preferiblemente por diálisis o diafiltración contra una solución acuosa que contiene los ingredientes deseados de las composiciones farmacéuticas. Se describen- tales portadores aceptables, por ejemplo, en Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18ava. edición, 1990, Mack Publishing Company, editada por Oslo y col. (por ejemplo las páginas 1435-1712) . Las composiciones comúnes contienen una cantidad efectiva de la sustancia de acuerdo a la invención, por ejemplo aproximadamente 0.1 a 100 mg/ml, junto con una cantidad conveniente de un portador. Las composiciones se pueden administrar de manera parenteral. El IGF-I de acuerdo a la invención se administra preferiblemente vía aplicación intraperitoneal , subcutánea, intravenosa, o intranasal. Las formulaciones farmacéuticas de acuerdo a la invención se pueden preparar de acuerdo a los métodos conocidos en la técnica. Generalmente, las soluciones de IGF-I se dializan o diafiltran contra el amortiguador previsto para utilizarse en la composición farmacéutica y la concentración final deseada de la proteina es ajustada por concentración o dilución. Los siguientes ejemplos y secuencias se proporcionan para ayudar a la comprensión de la presente invención, cuyo alcance verdadero se establece en las reivindicaciones anexas. Se entiende que se pueden hacer modificaciones a los procedimientos establecidos sin apartarse del espíritu de la invención. Los nombres de los aminoácidos se abrevian usando cualquiera de un código de una letra (por ejemplo R) o un código de tres letras (por ejemplo Arg) . R36A significa un mutante de IGF-I en el cual el aminoácido arginina 36 es sustituido por alanina. Listado de secuencias SEC ID NO: 1 secuencia de aminoácido de IGF-I humano (aminoácidos 49-118 de SwissProt P01343) . SEC ID NO: 2 secuencia de aminoácido de un propéptido preferido SEC ID NO: 3 secuencia de aminoácido de un propéptido preferido SEC ID NO: 4 secuencia de aminoácido de un propéptido preferido SEC ID NO: 5 secuencia de aminoácido de un propéptido preferido SEC ID NO: 6-10 enlace SEC ID NO: 11-17 secuencias de separación SEC ID NO: 18-20 otros SEC ID NO: 21 secuencia de aminoácido de una proteasa IgAl de Neisseria gonorrhoea (tipo 2) E emplos Ejemplo 1 El vector de expresión y la cepa Escherichia Coli útiles se describen en EP 0 972 838. A partir de un clon de Escherichia Coli, expresando la proteina de fusión se desarrollan en la placa de agar selectiva, un ciclo de inoculación se transfiere (100 mi) al medio selectivo y se cultiva durante 13 h a 37 °C a una densidad óptica (578 nanómetro) de 2-4. Este cultivo se almacena en hielo durante 6 horas adicionales antes de la inoculación automatizada del cultivo principal que se realiza a 37 °C. La expresión del mutante de IGF-I se inicia a una densidad óptica (578 nanómetro) de 50 con la adición de 1.0 mM IPTG. La fermentación total dura hasta 16 horas. La cantidad de proteina es determinada de manera densitométrica comparando la intensidad volumétrica de la banda de la proteina del producto con la banda de un estándar de IGF en un gel de SDS-PAGE. El caldo de cultivo es cosechado por centrifugación. Para obtener el material del cuerpo de inclusión (IB, por sus siglas en inglés) purificado, la biomasa cosechada fuera de la fermentación estándar se trata con el siguiente procedimiento: 0.3 de g/100 g lisozima de peso bio-seco y 5 U/1 g de benzonasa de peso bio-seco se incuba duante 20 minutos y se homogeneiza. 30 U/1 g de benzonasa de peso bio-seco se agrega e incuba durante 60 minutos a 37 °C. 0.5 1 amortiguador Brij /litro se agregan e incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación el gránulo se suspende nuevamente en 300 mi amortiguador Tris-EDTA/100 g peso bio-húmedo (peso húmedo de IB purificado) , se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente y se centrifuga. 1 g IB/litro es solubilizado a temperatura ambiente en 6.8 M guanidina-HCl, 0.1 M TrisHCl, 0.1 M DTT, pH 8.5 durante la noche. La solución turbia se dializa a 4°C contra 6.8 M guanidina-HCl, 0.1 M TrisHCl, pH 8.0. Después de la diálisis los componentes insolubles fueron eliminados por centrifugación. El plegamiento es realizado por dilución de 50 veces de la solución de Pro-IGF-I en arginina de 0.8 M, 0.1 M TrisHCl, 0.1 M guanidina-HCl, 1 mM GSH, 1 mM GSSH, pH 8.5 a temperatura ambiente. Después de dos horas la solución se complementa con 2 M cloruro de sodio, filtra y aplica a un caudal de 10 ml/min en una columna de HIC (Butyl Sepharose 4 Fast Flow; GE, Amersham Biosciences ) , que se equilibra a temperatura ambiente con el amortiguador que contiene 2 M NaCl, 0.8 M arginina, 0.1 M TrisHCl, 0.1 M guanidina-HCl , pH 8.5. La columna se lava con amortiguador de equilibrio hasta que la línea base se alcanza y después se eluye con diez volúmenes de columna de un gradiente linear iniciando con el amortiguador de equilibrio y finalizando con el amortiguador que contiene 0.1 M TrisHCl, 5% etilenglicol , pH 8.5. Las fracciones eluídas son analizadas por cromatografía de alto rendimiento de fase inversa (rpHPLC) . Se recolectaron las fracciones que contienen la proteína con enlaces SS formados correctamente. La mezcla de reacción se complementa con proteasa IgAl de Neisseria gonorrhoea (tipo 2) (relación de p/p 1:50) e incuba durante noche a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se diluye 1:2 con 50 rtiM ácido acético pH 4.5 y entonces se aplica a una columna de IEC de catión (MacroCap SP support; GE, Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) , se equilibró con 50 mM ácido acético o aplicó a SEC Superdex™ 200 (General Electric) . La columna se lava hasta que se alcanza la línea base y entonces se eluye con 20 volúmenes de columna de un gradiente lineal iniciando con 50 mM de ácido acético y se finaliza con 50 mM de ácido acético complementado con 1 M cloruro de sodio. Las fracciones eluídas se analizan por SDS-PAGE.- Las fracciones que contienen una sola banda con tamaño molecular de IGF-I se recolectan como IGF-I. La identidad de IGF-I es verificada por cromatografía analítica de exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés) con detección de dispersión luminosa estática, análisis de EM de asimilaciones trípticas, análisis de EM de asimilaciones de Asp-N, e IEC o SEC de catión analíticas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. El método para la producción de IGF-I, caracterizado porque comprende a) cultivo de una célula hospedadora procariótica que comprende un vector de expresión que contiene un ácido nucleico que codifica una proteina de fusión que comprende el IGF-I unido por la terminal N a la terminal C de un propéptido, b) por lo cual el propéptido finaliza la terminal C con los aminoácidos - Y-Pro, en donde Y se selecciona del grupo que consiste de Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro, c) recuperación y separación de la proteina de fusión con la proteasa IgA, y d) recuperación del IGF-I . 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el IGF-I se selecciona del grupo de IGF-I (SEC ID N0:1), IGF-I truncado en la terminal C (3-6 aminoácidos) , R36A, R37A.
3. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque IGF-I está unido por la terminal C a Fe humano de IgG.
4. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el propéptido es mostrado por la fórmula en donde • Met denota metionina, • Xi es un enlace, serina o asparragina, · His es histidina, • n es un número de 0 a 6, • X2 es un péptido enlace, seleccionado del grupo de péptidos SEC ID NO: 6-10, • Pro es prolina, e · Y se selecciona del grupo que consiste de Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro.
5. La proteina de fusión, caracterizada porque comprende el IGF-I unido a la terminal C de un propéptido, en donde el propéptido finaliza en la terminal C con los aminoácidos -Y-Pro, en donde Y se selecciona del grupo que consiste de Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro.
6. La proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el propéptido tiene una longitud de hasta 30 aminoácidos.
7. Proteina de fusión de conformidad con la reivindicación 5 ó 6, caracterizada porque comprende la fórmula Met-X!-HiSn-X2-Y-PrO- [IGF-I] en donde • Met denota metionina, • Xi es un enlace, serina o asparragina, • His es histidina, • n es un número de 0 a 6, • X2 es un péptido enlace, seleccionado del grupo de péptidos SEC ID NO: 6-10, • Pro es prolina, e • Y se selecciona del grupo que consiste de Pro, Pro-Ala, Pro-Gly, Pro-Thr, Ala-Pro, Gly-Pro, Thr-Pro, Arg-Pro, o Pro-Arg-Pro.