NO174302B - Fremgangsmaate for produksjon av en human-insulin-lignende vekstfaktor - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av

en human-insulin-lignende vekstfaktor-I (IGF-I), som beskrevet i krav 1.

Det antas at den somatiske vekst som etterfølger administre-ringen av veksthormon in vivo tilveiebringes gjennom en gruppe mitogene, insulin-lignende peptider hvis serum-konsentrasjoner er veksthormon-avhengig. Disse polypeptidene omfatter somatomedin-C, somatomedin-A og insulin-lignende vekstfaktorer I og II (IGF I og IGF II). IGF I og II kan isoleres fra menneske-serum og har aminosyresekvenser som stort sett er homologe med sekvensene til insulin. For tiden kan bare begrensede mengder av disse vekstfaktorer fås ved separasjon fra menneskeserum. Det vil derfor være av stor vitenskapelig og klinisk interesse å bli i stand til å produsere forholdvis store mengder av vekstfaktorene ved hjelp av rekombinante DNA-teknikker.

Aminosyresekvensen til human-insulin-lignende vekstfaktorer I og II (IGF I og II) ble først bestemt av henholdvis Rinderknecht - og Humbel (1978) J. Biol. Chem. 253:2769-2776 og Rinderknecht og Humbel (1978) FEBS Letters 89:283-286. Egenskapene til IGF-mot-takerne er diskutert i Massague og Czech (1982) J. Biol. Chem. 257:5038-5045. Kurjan og Herskowitz, Cell(1982) 30:933-934 beskriver en antatt a-faktor-forløper som inneholder fire etter hverandre liggende kopier av fullt utviklet a-faktor, idet sekvensen beskrives og en fremstillingsmekanisme postuleres. Kurjan og Hertskowitz, Abstracts of Papers presented at the 1981 Cold Spring Harbor Meeting on the Molecular Biology of Yeast,

s. 242, beskriver i et sammendrag med tittelen "A Putative Alpha-Factor Precursor Containing Four Tandem Repeats of Mature Alpha-Factor" sekvensen som koder for a-faktoren og deler som ligger mellom to slike sekvenser.

Det tilveiebringes fremgangsmåter for effektiv fremstilling av fullt utviklet human-insulin-lignende vekstfaktor (IGF). Spesielt letter ekspresjon av en "pre"-IGF I i en gjærvert utskil-lelsen av polypeptidene i næringsmediet. Det frembringes DNA-oppbygninger ved å knytte sammen DNA-sekvenser fra forskjellige kilder, både naturlige og syntetiske kilder. De resulterende DNA-oppbygninger replikeres stabilt i gjæren og gir effektiv produksjon på et høyt nivå av fremstilte "pre"-polypeptider som kan isoleres i høyt utbytte fra næringsmediet.

DNA-sekvenser som er i stand til å uttrykke human-insulin-lignende vekstfaktorer (IGF-I) tilveiebringes. Disse DNA-sekvensene kan innlemmes i vektorer og de resulterende plasmider brukes til å transformere mottagelige verter. Transformasjon av en mottagelig vert med slike rekombinante plasmider resulterer i ekspresjon av det insulin-lignende vekstfaktorgenet og produksjon av polypeptid-produktet.

Nærmere bestemt tilveiebringes nye DNA-oppbygninger for fremstilling av forløper-polypeptidene ("pre"-IGF I) i en gjærvert som er i stand til å fremstille forløper-polypeptidene og utskille det fullt utviklede polypeptidproduktet i næringsmediet. DNA-oppbyg-ningene omfatter et replikasjonssystem som er i stand til å opprettholdes stabilt i en gjærvert, en effektiv promoter, et struk-turelt gen som omfatter leder- og fremstillingssignaler i avled-ningsramme med det strukturelle genet, og en transkripsjonen avslutningssekvens som ligger etter det strukturelle genet. Eventuelt kan det tilveiebringes andre sekvenser for transkripsjonen regulering, forsterkning av genet, eksogen regulering av transkripsjon og lignende. Med "pre"-IGF-I menes at DNA-sekvensen som koder for det fullt utviklede polypeptidet er knyttet til og foreligger i avlesningsramme med en ledersekvens som omfatter fremstillingssignaler som effektivt gjenkjennes av gjærverten. Følgelig betegner "pre" innlemmingen av utskillelse- og fremstillingssignaler forbundet med en gjærvert og ikke noen fremstillingssignaler forbundet med genet som koder for polypeptidet av interesse.

Ved fremstilling av DNA-oppbyggingen er det nødvendig å bringe de enkelte sekvensene som utformer replikasjonssystemet, promoteren, det strukturelle genet inkludert leder- og fremstillingssignaler, og terminatoren sammen i en på forhånd fastlagt rekkefølge for å sikre at de er i stand til å virke korrekt i det resulterende plasmid. Som beskrevet nedenunder, kan det anvendes tilpasningsmolekyler for å sikre den korrekte orientering av og rekkefølge for sekvensene.

IGF-I-genene som anvendes kan være kromosomal DNA, cDNA, syntetisk DNA eller kombinasjoner derav. Leder- og fremstillingssignaler vil normalt være avledet fra naturlig forekommende DNA-sekvenser i gjær som sørger for utskillelse av et polypeptid. Slike polypeptider som utskilles naturlig av gjær omfatter a-faktor, a-faktor, syrefosfatase og lignende. De gjenværende sekvensene som utgjør oppbygningen omfattende replikasjonssystemet, promoteren og terminatoren, er velkjente og beskrevet

i 1itteraturen.

Ettersom de forskjellige DNA-sekvensene som knyttes sammen for å danne DNA-oppbyggingen ifølge foreliggende oppfinnelse, avledes fra forskjellige kilder, vil det være bekvemt å knytte sekvensene sammen ved hjelp av koplings- eller tilpasnings-molekyler. Spesielt kan tilpasningsmolekyler anvendes med

fordel for å kople 3'-enden i den kodende kjeden hos leder-

og fremstillings(prosesserings-)signalsekvensen til 5<1->enden

i den IGF-kodende kjede, sammen med deres respektive komplementære DNA-kjeder. Leder- og fremstillingssignalsekvensen kan spaltes internt nær sin 3<1->ende slik at den mangler et på forhånd bestemt antall basepar av det kodende område. Et tilpasningsmolekyl kan så konstrueres slik at, når man knytter leder- og fremstillingssekvensen til den IGF-kodende kjede, tilveiebringes de manglende basepar og den IGF-kodende kjede

er i den korrekte leseramme i forhold til ledersekvensen.

Det syntetiske IGF-kodende område og/eller tilpasnings-molekyler vil ved sin 3'-ende tilveiebringe translasjonene stoppsignaler for å sikre at C-enden av polypeptidet er den samme som den naturlig forekommende C-ende.

Tilpasningsmolekylene har fra ca. 5 til 40 baser, vanligvis fra ca. 8 til 3 5 baser, i den kodende sekvensen og kan ha enten kohesive eller butte ender, idet kohesive ender er foretrukket. Det er ønskelig at endene til tilpasningsmolkekylet har kohesive ender med tilknytning til forskjellige restriksjonsenzymer slik at tilpasningsmolekylet selektivt vil knytte sammen to forskjellige DNA-sekvenser som har de passende komplementære kohesive endene.

Foreliggende oppfinnelse illustreres med syntetiske fragmenter som koder for IGF-I knyttet til leder- og fremstillingssignalene for gjær-a-faktor. Gjær-a-faktoren kan spaltes med Hindlll og Sali. Hindlll spalter i fremstillingssignalet for a-faktor-forløperen, idet den spalter 3' hos den andre basen i den kodende kjede for glu-kodonet, mens Hindlll gjenkjenningssekvensen kompletterer glu-kodonet, idet det koder for ala og tilveiebringer den første 5<1->basen i aminoende-trp-kodonet til fullt utviklet a-faktor. Når det gjelder transkripsjonsretningen for a-faktor-genet, er Sall-setet lokalisert foran den transkripsjonene terminatoren.

De syntetiske genene som koder for IGF har nukleotidsekvenser basert på de kjente aminosyresekvensene til IGF-I-polypeptidene. De syntetiske sekvensene benytter seg helst av kodoner som fortrinnsvis utnyttes av gjærverten, f.eks. basert på kodonenes hyppighet i genene som koder for de glykolytiske gjærenzymene. Vanligvis omfatter den syntetiske sekvensen heller kohesive ender enn butte ender for innføring i et restriksjonssete i et klonings-hjelpemiddel. Videre utformes restriksjonsseter i de syntetiske sekvensene ved å bruke "hvilende" mutasjoner for å frembringe fragmenter som kan bli ført inn i sekvenser som er i stand til å produsere IGF I-hybridpeptidmolekyler.

I eksemplene er de syntetiske fragmentene forsynt med kohesive ender for EcoRI og innført i EcoRI-setet i pBR328. Den syntetiske sekvensen omfatter vanligvis ytterligere restriksjonsseter nær hver ende i det polypeptidkodende område. Slike indre restriksjonsseter velges for å gi nøyaktig fjerning av det kodende område fra kloningshjelpemidlet og for tilknytning til tilpasnings-molekyler slik at den endelige DNA-oppbygningen, inkludert leder-og fremstillingssignalene og det kodende område, er i korrekt leseramme, og i korrekt sammenstilling med en transkripsjons-terminator. Restriksjonssetene har helst gjenkjenningssekvensen forskjøvet fra spaltningssetet, hvor spalting styres nært opp til det kodende område og gjenkjenningssetet tapes. Dette tillater spalting nøyaktig ved hver ende av det kodende område uansett nukleotid-sekvens. Hqal-seter tilveiebringes i eksemplene.

Ved fremstilling av det syntetiske genet fremstilles det overlappende fragmenter med énkjedet DNA (ssDNA) ved hjelp av vanlig kjente teknikker. Slike ssDNA-fragmenter vil vanligvis ha en lengde fra ca. 10 til 4 0 baser. Selv om det kan anvendes betydelig lengre fragmenter, avtar syntese-utbyttet, og det blir mer vanskelig å forsikre seg mot at den korrekte sekvensen ikke er blitt utilsiktet brutt ned eller endret. Etter at ssDNA-fragmentene er blitt syntetisert, knyttes de sammen under sammenføyningsbetingelser med komplementær base-parring som sikrer den korrekte rekkefølge. Endene av fragmentene bindes så sammen og det resulterende syntetiske DNA-fragment klones og forøkes i antall, vanligvis i en bakteriell vert slik som E. coli. Som tidligere angitt, kan det syntetiske strukturelle genet være forsynt med kohesive ender komplementært til et egnet restriksjonssete i kloningshjelpemidlet av interesse og indre gjenkjenningsseter som tillater nøyaktig fjerning av det kodende område. Etter kloning og forøkelse av de syntetiske sekvensene, kan anvendelige mengder av sekvensene tas ut, vanligvis ved de indre restriksjonssetene ved hvilken som helst ende av det IGF-kodende område.

Vanligvis kan promoteren som anvendes være promoteren som er forbundet med leder- og fremstillingssekvensen. På denne måten kan det tilveiebringes et 5<1->transportabelt element som inneholder både promoteren og ledersekvensen i korrekt rommelig forhold for effektiv transkripsjon. Ved videre å innlemme en transkripsjonen terminator, fremstilles det en "kasett" som består av promoter/ leder-restriksjonssete(r)-terminator hvor det IGF-kodende område kan innføres ved hjelp av tilpasningsmolekyler. Slike "kasetter" kan vanligvis tilveiebringes ved å isolere et DNA-fragment som omfatter et intakt gen fra en gjærvert og de foranliggende og etterfølgende transkripsjonene regulatorsekvensene til genet, idet genet uttrykker et polypeptid som utskilles av verten.

Eventuelt kan man erstatte den naturlig forekommende gjærpromoteren med andre promotere.; som tillater transkripsjonen regulering. Dette vil kreve sekvensering og/eller restriksjons-kartlegging av området foran ledersekvensen for å sørge for innføringen av en ulik promoter. I noen tilfeller kan det være ønskelig å beholde den naturlig forekommende gjærpromoteren og tilveiebringe en andre promoter slik at de blir liggende etter hverandre, den andre promoteren enten foran eller etter den naturlig forekommende gjærpromoteren.

En lang rekke promotere er tilgjengelige eller kan oppnås fra gjærgener. Promoterer av spesiell interesse omfatter de promoterene som er forbundet med enzymer i glykolysesporet, slik som promoterer for alkoholdehydrogenase, glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, pyruviat-kinase, triose-fosfat-isomerase, fosfo-glukoisomerase, fosfofruktokinase, etc. Ved å anvende disse promoterne sammen med reguler ingssekvenser, slik som f remittere, operatorer, etc., og ved å bruke en vert med et intakt regule-ringssystem, kan man regulere ekspresjonen av den fremstilte "pre"-IGF. Således kan forskjellige små organiske molekyler, f.eks. glukose, anvendes til reguleringen av fremstilling av det ønskede polypeptidet.

Man kan også anvende temperaturfølsomme regulatormutanter som tillater modulering av transkripsjon ved å variere temperaturen. Ved å dyrke cellene ved den ikke-tillatelige temperaturen kan må således dyrke opp cellene til høy tetthet før man endrer temperaturen for å tilveiebringe ekspresjon av "pre"-polypeptidene for

IGF-I.

Andre egenskaper kan også innføres i oppbyggingen. For eksempel sørger noen gener for forøkelse hvor, etter påvirkning av verten, ikke bare genet som svarer på påvirkningen forøkes, men også tilgrensende områder. Ved å plassere et slikt gen foran promoteren, det kodende område og de øvrige reguleringssignaler som tilveiebringer transkripsjonen kontroll av "pre"-polypeptidet, og påvirke gjærverten, kan det fås plasmider som har en rekke gjentatte sekvenser, som omfatter "pre"-polypeptidgenet med sine reguleringssekvenser. Illustrerende gener omfatter metallo-tioneiner og dihydrofolat-reduktase.

I tillegg til ledersekvensfragmentet kan oppbyggingen omfatte annen DNA som er homolog til vertgenomet. Dersom det er ønskelig at IGF-genet skal integreres i kromosomet eller kromosomene, kan integrering fremmes ved å tilveiebringe sekvensene som ligger opp til IGF-gjenoppbyggingen og som er homologe med kromosomal DNA fra verten.

Det anvendte replikasjonssystemet vil bli gjenkjent av gjærverten. Det er derfor ønskelig at replikasjonssystemet er naturlig for gjærverten. Et antall gjærvektorer er rapporter av Botstein et al.. Gene (1979) 8:17-24. Av spesiell interesse er YEp-plasmidene som inneholder 2 jum plasmidreplikasjonssystemet. Disse plasmidene opprettholdes stabilt i et stort antall kopier. Istedet eller i tillegg kan man bruke en kombinasjon av ARS1 og CEN4 for å tilveiebringe stabil bevaring.

Etter hver manipulering kan, når det er formålstjenlig, oppbyggingen klones slik at den ønskede oppbygging fås i ren tilstand og i tilstrekkelig mengde for videre manipulering. Fortrinnsvis kan det anvendes en skyttel-vektor (dvs. som inneholder både et opphav for replikasjon fra gjær og et fra bakterie) slik at kloning kan utføres i prokaryoter, særlig E. coli.

Plasmidene kan innføres i gjærverten på en hvilken som helst vanlig måte, idet det anvendes gjærvertceller eller sferoplastere og brukes kalsium-utfelt DNA for transformasjon eller liposomer eller andre vanlig kjente teknikker. De modifiserte vertene kan velges i overensstemmelse med de genetiske markørene som vanligvis tilveiebringes i en vektor som brukes til å konstruere ekspresjons-plasmidet. Det kan anvendes en auksotrof vert hvor plasmidet har et gen som fullstendiggjør verten og gir prototrofi. Eventuelt kan resistens mot et passende biocid, f.eks. antibiotikum, tung-metall, toksin eller lignende, innføres som en markør i plasmidet. Seleksjon kan så oppnås ved å anvende et næringsmedium som påvirker foreldrecellene på en slik måte at det selekteres for cellene som inneholder plasmidet. Cellene som inneholder plasmidet kan så dyrkes i et passende næringsmedium og det ønskede utskilte polypeptidet isoleres i henhold til vanlig kjente teknikker. Polypeptidet kan renses ved hjelp av kromatografering, filtrering, ekstraksjon, etc. Etter som polypeptidet vil være til stede i fullstendig utviklet form i næringsmediet, kan man sende næringsmediet i et kretsløp, idet man kontinuerlig fjerner det ønskede polypeptidet.

EKSPERIMENTELT

Nukleotidsekvenser for human-insulin-lignende vekstfaktor I (IGF I) som omfatter foretrukkede gjær-kodoner ble konstruert baserte på aminosyresekvensen rapportert i henholdsvis Rinderknecht og Humbel (1978), J. Biol. Chem. 253:2769-2776 og Rinderknecht og Humbel (1978) FEBS Letters 89:283-286. Sekvensene (med de kodende kjeder vist fra 5' til 3') er som følger:

Sekvensene tilveiebringes med kohesive EcoRI-ender i begge endene. Koding for IGF I begynner ved base 16 i den kodende kjede og ender ved base 225. Hgal-restriksjonsseter er lokalisert til hver ende av det kodende område for IGF I. Hgal-gjenkjennings-setene (5'-GACGC-3<1>) ligger utenfor det kodende område for IGF I, dvs. mellom enden av den syntetiske sekvensen og H<g>al-spaltningssetet. Den syntetiske IGF II-sekvensen konstrueres på lignende måte med oppstarting for den kodende kjede ved base 16 og avslut-ning ved base 219.

Et syntetisk DNA-fragment for IGF I som har den nylig beskrevne sekvensen for IGF I, ble fremstilt ved å syntetisere 20 overlappende ssDNA-segmenter ved å bruke fosforamidit-fremgangs-måten (se US-patentsøknad nr. 457.412, innlevert 12. januar 1983).

ssDNA-sekvensene var som følger:

ssDNA-segmentene ble knyttet sammen på følgende måte:

50 pmol av hvert segment med unntak av A og 1-16 ble 5'-fosforylert med T4 polynukleotidkinase. 50 pmol av alle segmentene ble så ført sammen i et enkelt trinn som en 18 /txl blanding ved avkjøling fra 95°C til 25°C i løpet av 1,5 timer. Binding ble oppnådd i et reaksjonsvolum på 3 0 /xl som inneholdt ImM ATP, lOmM DTT, lOOmM tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 1 jug/ml spermidin og T4 ligase. Det passende dobbeltkjedete fragmentet som oppsto fra rekkefølgen og pardannelse av fragmenter vist i figur 1, ble renset på en 7% elektroforesegel av naturlig forekommende polyakrylamid.

Figur 1

Skjema for sammenføring og binding av IGF I

De følgende ytterligere ssDNA-fragmenter ble fremstilt.

200 pmol av disse ssDNA-fragmentene og fragmentene A, D og L ble knyttet sammen på en lignende måte som ovenfor, hvor A og II-15 ikke ble fosforylert, noe som resulterte i den følgende rekke-følge og pardannelse av segmenter.

De syntetiske DNA-sekvensene ble innført i EcoRI-setet i pBR328 hvorved plasmidene p328IGF I og p328IGF II ble fremstilt. Etter kloning ble de IGF-kodende kjeder fjernet ved å bruke Hgal.

Syntetiske oligonukleotid-tilpasningsmolekyler ble så bundet til Hgal-restriksj onsfragmentene.

For IGF I hadde tilpasnings-molekylene de følgende sekvenser:

Med orientering med hensyn til den kodende kjede, er 3'-enden av det første tilpasningsmolekylet a) komplementært til 5<1> Hera I - spaltingssetet på den syntetiske IGF I-sekvensen, mens 5<1->enden til det første tilpasningsmolekylet gir en kohesiv Hindlll-ende. Det andre tilpasningsmolekylet, b), er i sin 5<1->ende komplementært til H<g>al-spaltingssetet i 3'-enden av IGF I-sekvensen, mens 3'-enden i tilpasningsmolekylet tilveiebringer en kohesiv Sall-ende.

Med orientering som ovenfor, er det første tilpasningsmolekylet, c), komplementært i sin 3<1->ende til 5•-Hgal-spaltings-setet i den syntetiske IGF II-sekvensen, mens 5'-enden tilveiebringer en kohesiv Hindlll-ende. Det andre tilpasningsmolekylet,

d), er komplementært i sin 5<1->ende til det andre Hgal-spaltings-setet i den syntetiske IGF II-sekvensen og tilveiebringer en

kohesiv Sall-ende i sin 3'-ende.

De syntetiske fragmentene og tilpasningsmolekylene som er bundet til disse, ble renset ved preparativ gel-elektroforese og bundet til lOOng pAB113 som tidligere var blitt utsatt for fullført spalting med endonukleasene Hindlll og Sali. pAB113

var avledet fra pAB112 ved fjerning av de tre 63 bp Hindlll-fragmentene. pAB112 er et plasmid som inneholder et l,8kb EcoRI-fragment med gjær-a-faktor-genet klonet i EcoRI-setet til pBR322 hvor Hindlll- og Sall-setene er blitt fjernet. pAB112 ble avledet fra plasmid pABlOl som inneholder gjær-a-faktor-genet som et partielt Sau3A-fragment klonet i BamHI-setet til plasmid YEp24. pABlOl ble erholdt ved å gjennomsøke en gjær-genomsamling klonet i YEp24 under anvendelse av en enzymatisk p<32->radioaktivt merket,

syntetisk oligonukleotid-probe som er homolog med det publiserte a-faktor-kodende område (Kurjan og Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Spring Harbor Meeting on the Molecular Biology of Yeasts, s. 242).

De resulterende blandinger ble brukt til å transformere

E. coli HBlOl-celler, og plasmidet pAB113-IGF-I ble oppnådd for

IGF I.

Plasmid pAB113-IGF-I (5 /Lig) med de strukturelle genene for IGF I ble utsatt for fullført spalting med EcoRI og de resulterende fragmenter ble bundet til et overskudd av EcoRI- BamHI-tilpasningsmolekyler og spaltet med BamHI. De resulterende l,8kb BamHI-fragmentene ble isolert ved preparativ gelelektroforese og omtrent 100 ng av hvert fragment ble bundet til lOOng pCl/1, som tidligere var blitt utsatt for fullført spalting med BamHI og behandlet med alkalisk fosfatase.

Plasmid pCl/1 er et derivat av pJDB 219, Beggs, Nature

(1978) 275:104, hvor området som svarer til bakterielt plasmid pMB9 i pJDB219 er blitt erstattet av pBR32 2 i pCl/1. Hver lige-ringsblanding ble brukt til å transformere E. coli HBlOl-celler. Transformanter ble valgt ut ved hjelp av ampicillinresistens og deres plasmider analysert ved hjelp av restriksjonsendonuklease-spalting. Det ble fremstilt DNA fra én utvalgt klon for det strukturelle gen, (pYIGF-I-10/1) for IGF I og brukt til å transformere gjær AB103-celler. Transformanter ble valgt ut etter sin Leu<+->fenotype.

To kulturer (5 og 9 liter) av gjærstamme AB103 (a, pe<p> 4- 3, leu 2- 3, leu 2- 112, ura 3- 52, his 4- 580) som var transformert med plasmid (pYIGF-I-10/1), ble dyrket ved 30°C i -leu-medium til metning (optisk tetthet ved 650nm på 5) og hensatt under rysting ved 30°C i en periode på ytterligere 12 timer. Cellesupernatenter ble samlet opp fra hver kultur ved sentrifugering og IGF I konsen-trert ved absorbsjon på en ionebytteharpiks, "Biorex-70®11. Etter eluering med lOmM HC1 i 80% etanole, ble IGF I-fraksjonene (henholdsvis 0,4 ml og 3 ml) analysert med hensyn på total protein-konsentrasjon og konsentrasjon av IGF I. Proteinanalysen var "Coomassie Blue"-analysen. Analysen av IGF I var en vanlig kjent, konkurrerende radioimmunoanalyse hvor det anvendes radioaktivt merket IGF I.

Resultatene var som følger:

En bioanalyse av IGF I basert på den synergistiske virkningen hvorved peptidet fremmer responsen på prolaktin i mavesekken til duer (Anderson et al., (1983) i Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors, Spencer, E.M., ed., Walter deGruter, Berlin) avslører at IGF I-produktet i disse fremstillinger har en virkning som svarer til autentisk IGF I isolert fra menneskeserum.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det tilveie-bragt nye konstruksjoner som kan innføres i vektorer og gi ekspresjon av human-insulin-lignende vekstfaktor I som sørger for fremstilling og utskillelse. Man kan således få et polypeptid som har en sekvens som er identisk med den som naturlig forekommer i human-insulin-lignende vekstfaktor I. Ved det at det sørges for utskillelse, kan det oppnås svært økte utbytter basert på celle-populasjon, og derpå følgende preparative operasjoner og rensing forenkles.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en human-insulin-lignende vekstfaktor-I (IGF-I), karakterisert ved å transformere Saccharomyces cerevisiåe med en gjærekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens som koder for insulinlignende vekstfaktor I (IGF-I) med følgende aminosyresekvens: i riktig leseramme med a-faktor-sekretoriske leder- og prosess-seringssekvens som effektivt gjenkjennes i Saccharomyces cerevisiåe.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA-sekvensen som koder for insulinlignende vekstfaktor I (IGF-I) er som følger:

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at gjærekspresjonsvektoren er pYIGF-I-10/1 (ATCC adgangsnummer 20673).