HU204565B

HU204565B - Process for the synthesis of hybride dns of ripe insuline-like growth factor

Info

Publication number: HU204565B
Application number: HU841572A
Authority: HU
Inventors: Philip J Barr; James P Merryweather; Guy Mullenbach; Mickey S Urdea
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1983-04-25
Filing date: 1984-04-24
Publication date: 1992-01-28
Also published as: FI841524A; IE60228B1; ES8505412A1; DE3486491D1; IL71634A; DE3486491T2; PT78484B; EP0123228B1; ATE220101T1; FI87799B; IE840975L; EP0123228A2; AU2723384A; ATE95236T1; DE3486216T2; NO174302B; ZA842982B; NO174302C; AU576757B2; JP2548105B2

Description

A találmány tárgya eljárás érett inzulínszerir növekedési hormonokat meghatározó hibrid DNS szintézisére.

Felteszik, hogy a növekedési hormon in vivő adagolását követő szomatikus (testi) növekedés olyan mitogén, inzulinszeru peptidcsalád szabályozása révén jön létre, amelyek szérumkoncentrációja növekedési hormon függő. Ezek a polipeptidek például a szomatomedin-C, szomatomedin-A és az I és H inzulinszeru növekedési faktorok (IGF I és IGF Π). Az IGF I és IGF H a humán szérűmből izolálható, aminosavszekvenciájuk nagymértékben homológ az inzulinéval. Jelenleg csak korlátozott mennyiségben nyerhetők a humán szérumból ezek a növekedési faktorok. Ezért nagy tudományos és klinikai érdek fűződik ahhoz, hogy rekombináns DNS-technikákkal viszonylag nagy mennyiségűnövekedési faktorokat állíthassunk elő.

Az I és H humán inzulinszerű növekedési faktorok (IGF I és H) aminosavszekvenciáját elsőként Rinderknecht és Humbel határozta meg [J. Bioi. Chem., 253, 2Ί69-2Τ16. (1978)]; továbbá Rinderknecht és Humbel, 1 FEBS Letters, 89,283-286. (1978). AzIGF-receptorok tulajdonságait Massague és Czech tárgyalják [J. Bioi. Chem., 257, 5038-5045. (1982)]. Kurjan és Herskowitz [Cell, 30,933-934. (1982)] egy olyan feltételezett α-faktoiprekurzort írnak le, amely az érett α-faktor (az í élesztő által természetes úton kiválasztott fehérje) négy tandem másolatát tartalmazza, leírják a szekvenciát is, és feltehető keletkezési mechanizmusát. Kurjan és Herskowitz (Abstracts of Papers, Cold Spring Harbor Meeting on The Molecular Biology of Yeast, 242. 2 oldal, „A Putative AIpha-Factor Precursor Containing Four Tandem Repeats of Mature Alpha-Factor”) leírják az α-faktort meghatározó és két ilyen szakasz között elhelyezkedő nukleotid szekvenciáját.

A találmány olyan módszerekre és készítményekre 3 vonatkozik, amelyekkel hatékonyan állíthatjuk elő az érett humán inzulinszerű növekedési faktort (IGF). Részletesebben, a pre-IGF I és a pre-IGF H kifejezés éleszőgazdasejtben a polipeptidek tápközegbe való szekretálődásával jár együtt. Az eljárás során különbő- 4i ző forrásból származó, természetes és szintetikus eredetű DNS-szekvenciákat összekapcsolva DNS-moIekulákat hozunk létre. Az előállított DNS-molekulák élsztosejtekben stabilan replikáidnak, és hatékonyan, nagy koncentrációban termelik a prepolípeptídeket, 4í amelyek a tápközegből jó kitermeléssel Izolálhatok.

A találmány olyan DNS-szekvenciák előállítására vonatkozik, amelyek humán, inzulinszerű növekedési faktorok (IGF I és H) kifejezésére képesek. Ezeket a dezoxiribonukleinsav-szekvencíákat vektorokba épít- 5C hetjűk be, és a kapott plazmidokkal a megfelelő gazdasejteket transzformáljuk. A megfelelő gazdasejtek ilyen rekombináns plazmidokkal történő transzformációja az inzulinszerű növekedési faktor génjének kifejeződését eredményezi, és a polipeptidtermék termelését. Részle- 55 tezve, a találmány tárgya eljárás prekurzor polipeptidek (pre-IGF lés pre-IGF Π) termelését meghatározó új DNS-szekvenciák kifejezésére olyan élesztőgazdasejtben, amely képes szintetizálni a fenti prekurzor polipeptideket, és az érett polipeptidterméket a tápkő- 60 zegbe szekretálja. A DNS-molekula hordoz egy replikációs rendszert, amely a DNS-t képes stabilan fenntartani élesztőgazdasejtben, tartalmaz továbbá egy hatékony promotort, egy struktúrgént, ideértve az ezzel azonos leolvasási fázisban lévő vezér- és processzorszignálokat, tartalmaz továbbá a struktúrgéntől 3’ irányban egy transzkripciós terminátorszekvenciáL Adott esetben a transzkripció szabályozására, a gén sokszorosítására, és a transzkripció exogén szabályozására más szekvenciákat is beépíthetünk.

A pre-IGF I és a pre-IGF H kifejezés azt jelenti, hogy az érett polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát leolvasási fázisban kapcsoltuk hozzá a vezérszekvenciához és a processzorszignálokhoz, amelyeket hatéko15 nyan felismer az élesztőgazdasejt. így a pre szócska azt jelzi, hogy az élesztősejt szekréciós és processzorszignáljai jelen vannak, de nem jelenti azt, hogy a szóban forgó polipeptidet kódoló gén bármely processzorszignálja jelen van.

A DNS-készítmény előállításakor lényeges, hogy a replikáciős rendszert, promotort, a vezér- és proceszszorszignálokat hordozó struktúrgént és a terminátort előre meghatározott sorrendben kapcsoljuk, azért, hogy a kapott plazmidban megfelelően funkcionálja25 nak. Ahogy azt a későbbiekben megadjuk, a szekvenciák megfelelő orientációját és sorrendjét adaptormolekulák használatával alakíthatjuk ki. A felhasznált IGF I és IGF H gének lehetnek kromoszomális DNS-ek, cDNS-molekulák, szintetikus DNS-ek vagy ezek komΌ binációi. A vezér- és proeesszorszignálokat az élesztőben levő természetesen előforduló DNS-szekvenciákból izoláljuk, ezek biztosítják egy polipeptid szekretálódását. Az élesztő által természetesen szekretált polipeptidek közül megemlítjük az α-faktort, a-faktort, savas foszfatázt stb.

A konstrukciót felépítő további szekvenciák a replikációs rendszer, promotor és tenninátor jól ismertek, az irodalomban megadottak.

Mivel a találmány szerinti DNS-molekula összeál0 Iításakor különböző DNS-szekvenciákat használunk, amelyek különböző forrásból származnak, kényelmi okokból összekötő vagy adaptermolekulákat használunk. Részletesebben szólva, az adaptermolekulákat előnyösen használhatjuk a vezér és processzor szígi nálszekvenciákat hordozó kódolószál 3’-végének kapcsolására az IGF-kódoIószál 5’-végéhez, a kapcsolást a megfe-lelő kiegészítő DNS-szálakkal együtt végezzük. A vezér- és processzorszignálokat hordozó szekvenciát közel, ennek 3'-végéhez hasíthatjuk úgy, ) hogy kódolórégiőjából előre meghatározott számú bázispár kiessen. Ezután adaptermolekula állítható elő úgy, hogy ha a vezér és processzor szignálszekvenciát áz IGF-kődolószekvenciához kapcsoljuk, a hiányzó bázispárok beépülnek, és a vezérszekvenciái hoz képest az IGF-kódolőszál megfelelő leolvasási fázisban, helyezkedik el, A szintetikus IGF-kődolószekvencia és/vagy az adaptermolekula 3’-végén transzlációs stopkodonokat hordoz, ily módon elérjük, hogy a polipeptid C-terminális vége azonos legyen a természetes polipeptid C-terminálisával.

HU 204565 Β

Az adaptermolekula 5-40 bázisból állhat, általában 8-35 bázisból, a kódolószekvenciában helyezkedik el, és kohéziv vagy tompa végű lehet. Előnyös, ha az adaptermolekula végei tapadós (kohéziv) végűek, mivel így az adapter szelektíve kapcsolódik a különböző restrikciós enzimekkel kapott két különböző DNSszekvenciához, amelyek a megfelelő komplementer kohéziv végekkel rendelkeznek.

A találmányt az élesztő α-faktorának vezér- és processzorszignáljaihoz kapcsolt IGF I és IGF H polipeptideket kódoló szintetikus fragmenssel szemléltetjük. Az élesztő α-faktora Hindin és Sáli restrikciós endonukleázokkal hasítható ki. A HindlH hasítja az a-faktor prekurzorának processzorszignálját, hasítja a 3’-véget a kódolószál Glu-kodonjának második bázisáig, ugyanakkor a HindlH felismerő szekvencia teljessé teszi a Glu-kodont, kódolja az alanint, és létrehozza az első 5’-bázist az érett α-faktor aminoterminális trp-kodonjában. Az α-faktor génjének átírási irányához képest a Sáli hely a transzkripciós terminátortól 5’ irányban helyezkedik el.

Az IGF-polipeptidet kódoló szintetikus gén nukleotidszekvenciáját az IGF I és IGF Π polipeptidek ismert aminosavszekvenciája határozza meg. A szintetikus szekvenciát előnyösen úgy tervezzük, hogy abban az élesztőgazdasejt által szívesen használt kodonok legyenek, például az élesztő glikolitikus enzimjeinek kodonfelhasználási frekvenciájára alapozunk. A szintetikus szekvencia előnyösen nem tompa, hanem kohéziv végeket tartalmaz abból a célból, hogy egy klónozó vektor megfelelő restrikciós helyébe beépíthessük. Ezenkívül a szintetikus szekvenciákba restrikciós helyeket építhetünk be néma mutációkat használva, így olyan fragmensek keletkezhetnek, amelyeket beépítve hibrid IGF I vagy IGF II peptidmolekulák keletkezhetnek.

A példákban megadott eljárás során a szintetikus fragmenseket EcoRI kohéziv végekkel látjuk el, és a pBR328 plazmid EcoRI helyére építjük be. A szintetikus szekvencia általában a polipeptidet meghatározó régió mindkét végének közelében további restrikciós helyeket is tartalmaz. Ezeket a belső restrikciós helyeket úgy választjuk meg, hogy a klónozó vektorból pontosan kihasíthassuk a kódolószekvenciát, és úgy köthessük be az adaptermolekulát, hogy a végső DNSmolekula tartalmazza a vezér- és processzorszignálokat, és a kódolórégiót egymáshoz képest megfelelő leolvasási fázisban és megfelelő távolságra egy transzkripciós terminátortól. Előnyös, ha a restrikciós hely felismerőszekvenciája távolabbra esik a hasítási helytől, ebben az esetben a hasítás a kódolórégiótól 3’ irányba esik, és a felismerési hely eltűnik. Ez lehetővé teszi a kódolószál mindkét végén a pontos hasítást, a nukleotidszekvenciától függetlenül. A példákban Hgal helyeket ismertetünk.

A szintetikus gén előállítására ismert technikákkal átfedő egyszálú dezoxiribonukleinsav (ssDNS) fragmenseket állítunk elő. Ezek az ssDNS-fragmensek általában 10-40 bázis hosszúak. Bár jelentősen hosszabb fragmenseket is használhatunk, a szintézis hozama ekkor csökken, és nehéz megjósolni, hogy a megfelelő szekvencia degradálódik-e vagy megváltozik. Miután előállítottuk az ssDNS-fragmenseket, összekapcsoljuk azokat olyan kapcsolási reakciókörülmények között, ahol a komplementer bázisok párosodása megfelelő sorrendben következik be. A fragmensek végeit ezután ligáljuk, és a kapott szintetikus DNS-fragmenst klónozzuk és sokszorosítjuk, általában E.coli baktériumgazdasejtben. Ahogy előzőleg jeleztük, a szintetikus struktúrgént az adott klónozó vektor megfelelő restrikciós helyével komplementer kohéziv végekkel látjuk el, és egy olyan belső felismerési hellyel, amely a kódolószakasz pontos kimetszését lehetővé teszi. A szintetikus szekvenciák klónozása és sokszorosítása után megfelelő mennyiségű terméket kihasítunk, általában az IGF-kódolórégió egyik végénél elhelyezkedő belső restrikciós helyet használva.

A használt promotor kényelmi okokból a vezér- és processzorszekvenciákhoz kötött promotor lehet. Ilyen módon előállíthatunk egy olyan 5’ eredetű szekvenciát, amely tartalmazza a promotort is és a vezérszekvenciát, mégpedig egymáshoz képest olyan kapcsolatban, hogy hatékony transzkripció legyen várható. Transzkripciós terminátor beépítésével ezután egy olyan „kazettát” állítunk elő, amely hordozza a promotor/vezérszekvencia restrikciós hely (helyek), terminátorszekvenciákat, és ahová adaptermolekulák segítségével beépíthetjük az IGF-polipeptidet meghatározó kódolószakaszt. Uyen kazettákat általában úgy állíthatunk elő, hogy izolálunk egy érintetlen élesztőgént és 3’, illetve 5’ irányban a gén transzkripciós szabályozószekvenciáit hordozó dezoxiribonukleinsav-fragmenst, ez a gén kifejezi és szekretálja az adott polipeptidet.

Eljárhatunk oly módon is, hogy a természetesen előforduló élesztőpromotort transzkripciós szabályozást megengedő más promotorokkal helyettesítjük. Ebben az esetben a vezérszekvenciától 5’ irányban eső régiót szekvenálnunk kell és/vagy meg kell állapítanunk restrikciós térképét. Némely esetben kívánatos lehet az, hogy megtartva a természetes élesztőpromotort, amellé 3’ vagy 5’ irányban egy másik promotort építsünk be.

Élesztőgénekből több különböző promotort izolálhatunk. Különösen előnyösek azok a promotorok, amelyek a glükolízis folyamatának enzimeivel kapcsolatosak, ilyen promotorok az alkohol- dehidrogenáz, a glicerin-aldehid-3-foszfát-dehidrogenáz, piruvát-kináz, trióz-foszfát-izomeráz, foszfoglüko-izomeráz, foszfofrukto-kináz stb. promotor. Ezeket a promotorokat regulálószekvenciákkal, például erősítőkkel, operátorokkal stb. együtt használva, ép regulálórendszerrel rendelkező gazdasejttel szabályozhatjuk a pre-IGF expresszióját. így különböző kisméretű, szerves molekulákat, például glükózt használhatunk az adott polipeptid termelésének szabályozására.

Használhatunk hőmérsékletérzékeny regulációs mutánsokat, így a hőmérséklet változtatásával befolyásolhatjuk a transzkripciót. Ha a sejteket kedvezőtlen hőmérsékleten növesztjük, igen sűrű tenyészetet kaphatunk, mielőtt megváltoztatjuk a hőmérsékletet abból a célból, hogy az IGF I és IGF II prepolipeptideket kifejezzük. A találmány szerinti molekulába más ké3

HU 204565 Β pességeket is bevihetünk. Például egyes gének felelősek a sokszoroződásért, a gazdasejtet ért stressz hatására nem. csupán a stresszre válaszoló gén sokszoroződik, de a határos régiók is. Ha a promotor, a kódolörégiő és más, a prepolipeptid transzkripciós szabályozásáért felelős regulációs szignálok elé egy ilyen gént helyezünk, és az élesztő gazdasejtet stresszállapotba hozzuk, úgy olyan plazmidokat kaphatunk, amelyekben több ismétlődő szekvencia van, ezek a szekvenciák pedig tartalmazzák a prepolipeptidgént a regulációs szekvenciákkal együtt A jelen leírásban a metallo-tíonein és a dihidrofolát reduktázgéneket használjuk.

A találmány szerinti molekula a vezérszekvenciát hordozó fiagmensen kívül a gazdasejt genomjával homológ más dezoxiribonukleinsav-fragmenseket is tartalmazhat. Szükség esetén integrálhatjuk az IGF-gént a kromoszómába, ezt úgy érhetjük el, hogy az IGF-gént a gazdasejt kromoszomális dezoxiribonukleinsavával homológ szekvenciák határolják.

A használt replikációs rendszert az élesztőgazdasejt felismeri. így előnyös, ha a replikációs rendszer természetes az élesztőgazdasejt számára. Botstein és munkatársai [Gene, 8, 17-24. (1979)] több élesztővektort ismertetnek. Különösen érdekesek az YEp-plazmidok, amelyek tartalmazzák az élesztő két mikronos plazmidjának replikációs rendszerét. Ezek a plazmidok stabilan fennmaradnak, sejtenként több másolatban. Használhatjuk az ARS1 és CEN4 kombinációkat a stabil fenntartáshoz (ARS: autonóm replikálódő szekvencia; CEN: kromoszóma centomer szakasz). Amolekulák manipulációját követően, szükség szerint, klónozzuk azt, úgy, hogy tisztán és megfelelő mennyiségben kapjuk meg a további kísérletekhez. Előnyösen használhatunk úgynevezett ingázó vektort (élesztő és bakteriális eredetűreplikáciős origót is tartalmaz), úgy, I hogy a klónozást prokariőtasejtekben, különösen E.coliban is elvégezhetjük.

A plazmidokat bármely megfelelő módszerrel bejuttathatjuk az élesztősejtbe, használhatunk élesztősejteket vagy szferoplasztokat, és kalciumionokkal kicsapott dezoxiribonukleinsavat vagy liposzómákat, vagy [lásd például Hitzemann és munkatársa: Natúré 293: 717-720 (1981), Beggs: Natúré 275: 104-109 (1978) és Hinen és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929-1933 (1978)] más, ismert technikákat. A módosított gazdasejteket az expressziós plazmid előállítására használt vektorban általában jelen lévő genetikai markerek segítségével szelektáljuk. Használhatunk auxotróf gazdasejtet, ebben az esetben a plazmid egy olyan gént hordoz, amely kiegészíti a gazdasejt kromoszomális hiányát és prototrófiát okoz. Egy megfelelő biológiailag aktív anyaggal, például antibiotikummal, nehézfémmel, toxinnal vagy más, hasonlóval szembeni rezisztenciát biztosító, és a plazmidban jelen lévő markért is használhatunk. A szelekciót ekkor úgy végezzük, hogy a szülői sejtek növekedését meg nem engedő táptalajon tenyésztünk, így szelektáljuk a plazmidot hordozó sejteket A plazmidot tartalmazó sejtek megfe0 Ielőén kiegészített táptalajon növekednek, és az adott, szekretált polipeptid ismert technikákkal, például kromatográfiával, szűréssel, extrahálással stb. izolálható. Mivel a polipeptid a tápközegben érett alakban van jelen, az adott polipeptid folyamatos eltávolítása után a tápközeg recirkuláltatható.

Az alábbi példákban szemléltetjük a találmányt, a példák szemléltető jellegűek, a leírás oltalmi körét nem szűkítik.

) Példa

A humán inzulinszerű növekedési faktorokat (IGF I és IGF Π) meghatározó nukleotidszekvenciákat Rindefknecht és Humbel [J. Bioi. Chem., 253,27692776. (1978)] és Rinderknecht és Humbel [FEBS » Letters, 89, 283-286. (1978)] által közölt aminosavszekvenciák alapján terveztük úgy, hogy az élesztő szempontjából előnyös kodonok legyének jelen. Az 5-3’ irányú (a kódolőszálak iránya) szekvencia a következő:

A s n S erThrLeuMet

IGFI kódolószakasz

GlyProGluThrLeuCysGlyAlaGluLeuValAspAlaLeuGln

5’-|AArTCGACGCTTATGj3GTCCAGAAACCTrGTGTGGTGCTGAArTGGTCGATGCTTrGCAA jGCTGCGAATACCCAG^rClíTTGGAACACACCACGACrTAACCAGCTACGAAACGTT

EcoRI

Hgal

PheValCysGlyAspArgGlyPheTyrP he AsnLysProThrGlyTyrGly SerSer Ser TTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCAACAAGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTCT AAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGTTGTrCGGITGGCCAATGCCAAGAAGAAGA

ArgArgAlaProGInThrGlylleValAspGluCysCysPheArgSerCysAspLeuArg

AGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTrGACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGAGA

TCTTCTCGAGGTGTTTGGCCATAGCAÁCrGCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACTCT

Hgal EcoRI

ArgLeuGluMetTryCysAlaProLeuLysProAlaLysSlerAlaOP MetArgAi AGATTGGAAATGTACTGTGCTCCATTGAAGCCAGCTAAG'IICTGCTTGAATGCGTCC

Yrlg :g£3L

TCTAACCTTTACATGACACGAGGTAACTTCGGTCGATTCAGACGA\CTTACGCAQCTTAA kódolószakasz *

HU 204 565 Β

IGF II kódolószakasz

5’AsnSerThrLeuMet AlaTyrArgProSerGluThrLeuCy sGlyGlyGluLeu Val Asp AATTCGÁCGCTTATGbcTrACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGTGGTGAATrGGTCGAC iGCTGCGAATACCGAAltaTCTGGTAGGCTTTGGAACACACCACCACITAACCAGCTG EcoRI Hgal

ThrLeuGlnPheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheSerArgProAlaSerArgVal

ACCTTGCAATTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCTCCAGACCAGCTTCCAGAGTT

TGGAACGTTAAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGAGGTCTGGTCGAAGGTCTCAA

SerArgArgSerArgGlylleValGluGluCysCysPheArgSerCysAspLeuAlaLeu

TCTAGAAGATCCAGAGGTATCGTTGAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGGCTTTG

AGATCTTCTAGGTCTCCATAGCAACITCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACCGAAAC

Hgal EcoRI

LeuGluThrTyrCysAlaThrProAlaLysSsrGluOP Met Arg Árig TTGGAAACCTACTGTGCTACCCCAGCTAAG1CTGAATGAATGCGTCCÍ3’ aacctttggatgacacgatggggtcgattcagactiacttacgcagcttaai kódolószakasz

A szekvencia mindkét végén EcoRI kohéziv végeket tartalmaz. Az IGF I kódja a kódolószál 16. nukleotidjánál kezdődik, és a 225-nél fejeződik be. Az IGF I szekvenciát kódoló régió mindkét végén Hgal restrik- 25 ciós helyek vannak. A Hgal felismerőhelyek (5*GACGC-3’) az IGF I kódolórégióján kívül helyezkednek el, azaz a szintetikus szekvencia vége és a Hgal hasítási hely között. Az IGF Π szintetikus szekvenciát hasonlóképpen szerkesztettük, a kódolőszál a 16. bázisnál kezdődik, és a 219-nél fejeződik be.

Az előzőekben megadott IGF I szekvenciát meghatározó szintetikus DNS-fragmenst úgy állítjuk elő, hogy a foszfor-amitid-módszerrel [lásd Urdea és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 7461-7465. (1983)] húsz, egymást átfedő ssDNS-szegmenst szintetizálunk.

Az alábbiakban megadjuk az ssDNS-szekvenciákat:

Jelzés

Szekvencia

A

B-I-l

C-I-2b

C-I-2a

D

1-3

E-I-4

F-I-5

G-I-6

1-7

H-I-8

J-I-9

K-I-10

L

M-I-ll

1-12

1-13

N-I-14

1-15

1-16

AATTCGACGCTTATGG

GTCCAGAAACCTTGTGTGGT

GCTGAATTGGTC

GATGCTTTGCAATTCGT

TTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTC

AACAAGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTC

TAGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTT

GACGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTG

AGAAGATTGGAAATGTACTGTGCT

CCATTGAAGCCAGCTAAGTCT

GCTTGAATGCGTCG

GTTTCTGGACCCATAAGCGTCG

AAAGCATCGACCAATTCAGCACCACACAAG

CTCTGTCACCACAAACGAATTGC

AACCGGTTGGCTTGTTGAAGTAGAAAC

TGGAGCTCTTCTAGAAGAAGAACCGT

GAAACAACATTCGTCAACGATACCGGTTTG

CCAATCTTCTCAAGTCACAAGATCT

GGCTTCAATGGAGCACAGTACATTT

AATTCGACGCATTCAAGCAGACTTAGCT

Az ssDNS-szegmenseket az alábbiak szerint eljárva kapcsoljuk össze:

T4 polinukleotid-kinázzal 5 ’-foszforilezünk 50 pmól- 55 nyi mennyiségi szegmenst, mindegyiket, kivéve az A és 1-16 jelűt. Ezután 18 pl reakcióelegyben 50-50 pmólnyi szegmenseket egyetlen lépésben összekapcsolunk úgy, hogy 1,5 óra alatt 95 °C hőmérsékletről 25 °C-ra hűtjük a reakcióelegyet. A ligálást 30 pl reakcióelegyben végezzük, amely az alábbi összetételű:

mmól adenozin-trifoszfát, mmól ditiotreitol,

100 mmól triszhidrogén-klorid, pH-7,8, mmól magnézium-diklorid, pg/ml spermidin és T4 ligáz.

HU 204565 Β

Az 1. ábrán, mutatjuk be a megfelelő sorrendben párosodott fragmensekből előállított kétszálű fragmenst, amit 7% natív poliakrilamidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk.

1. ábra

Az IGF I összekapcsolásának és ligálásának reak ciósémája

5’ A B-H-l C-I-2b C-I-2a D 1-3 E-l-4 F-I-5 G-I-6 Γ-7 HU-8 +

3’ OT ίΟϊΰσ L~ ΐ4ΐ IÜ2 FII N-I-14 ÜJ M6

Hasonlóképpen szintetizáljuk az IGF H DNS-szek- 10 vencíáját. Ehhez az alábbi, további ssDNS-fragmen-

seket állítjuk elő:
Jelzés	Szekvencia
B-H-l	C1TACAGACCATCCGAAACCTTGTGTGGT
C-H-2	GGTGAATTGGTCGACACCTTGCAATTCGT
Π-3	TCCAGACCAGCTTCCAGAGTTTCT
E-H-4	AGAAGATCCAGAGGTATCGTT
F-H-5	GAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTG
G-H-6	GCITTGTTGGAAACCTACTGTGCT
Η-Π-7	ACCCCAGCTAAGTCTGAATGAATGCGTCG
J-H-8	GTTTCGGÁIGGTCTGTAAGCCATAAGCGTCG
Κ-Π-9	AAGGTGTCGACCAATTCACCACCACACAAG
Μ-Π-10	AAGCTGGTCTGGAGAAGTAGAAAC
H-ll	CTGGATCTTCTAGAAACTCTGG
Π-12	GAÁACAACATTCTTCAACGATACCT
Ν-Π-Ι3	TfCCAACAAAGCCAAGTCACAAGATCT
H-14	AGACTl'AGCTGGGGTAGCACAGTAGGT
H-15	AÁTTCGACGCATTCATTC

200 pmól fenti ssDNS-fragmenseket és az A-, D- és L-fragmenseket az előzőekben megadott módon összekapcsolunk, azzal a különbséggel, hogy az A és H-15 fragmenseket T4 polinukleotid-kinázzal nem foszforiIezzük. Ekkor a 2. ábrán megadott sorrendű és pároso- 35 dásű szegmenseket kapjuk.

2. ábra

Áz IGF H összekapcsolásának és ligálásának reakci· ósémája

G-H-7 3’

5’ A B-H-l C-H-2 D H3 E-H-4 F-H-5 G-H-6 +

3^r ÜÜ? KÜÜ9 “L^- M-II-10 ΗΪΓ HÜ2 NÜÜÍ3 HÜ4 ΪΗ5 5’

A szintetikus DNS-szekvenciákat a pBR328 plazmid EcoRI restrikciós helyére építjük be, miután megkapjuk a p328IGFI és p328IGF II plazmidokat. Klónozás után az IGF-kődolószálakat Hgal endonuklezázzal 45 kihasítjuk. A fenti általános módszert részletesen ismertetik Urdea és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 80:7461-7465 (1983).

A Hgal restrikciós fragmensekhez ezután szintetikus oligonukleotid adaptermolekulákat ligálunk, ugyan- 50 csak Urdea szerinti Az IGF I esetén az alábbi adapterszekvenciákat használjuk:

a) 5’-AGCTGAAGCT-3’

3’-CTTCGACCAGG-5’ 55

b) 5’-CTGCTTGATAAG-3’

3^r-ACTATTCAGCT-5’. .

A kődolőszál irányultságához képest az a)-val jelölt első adaptermolekula 3’-vége komplementer az IGF I szintetikus szekvencia 5’-végén elhelyezkedő Hgal hasítási hellyel, míg az első adapter 5’-vége Hindin kohéziv véget eredményez.

A b) jellel jelzett második adaptermolekula 5’-végén komplementer az IGF I szekvencia 3’-végén elhelyezkedő Hgal hasítási hellyel, míg az adapter 3 ’-vége Sáli kohéziv véget eredményez.

Az IGF H klónozásakor az alábbi adapterszekvenciákat használjuk:

c) 5’-AGCTGAÁGCT-3’

3’-CTTCGACGAAT-5’

d) 5’-CTGAATGAIAAG-3’

3’-ACTATTCAGCT-5’.

Az orientációt tekintve, az első adaptermolekula c) 3’-végén komplementer az IGF II szintetikus szekvencián levő 5’-végen elhelyezkedő Hgal hasítási hellyel, 60 míg az adapter 5’-vége HíndHI kohéziv véget eredmé6

HU 204 565 Β nyez. A d) betűvel jelzett második adaptermolekula 5’-végén komplementer az IGF II szintetikus szekvencia második Hgal hasítási helyével, és Sáli kohéziv véget alakít ki annak 3’-végén.

A szintetikus fragmenseket és a hozzájuk kapcsolt adaptermolekulákat preparatív gélelektroforézissel tisztítjuk, és HindíII és Sáli endonukleázokkal előzőleg teljesen emésztett 100 ng mennyiségű pAB113 plazmidhoz ligáljuk. ApAB113 a pAB112 plazmidból származik a három 63 bázispár nagyságú HindíII fragmens deléciójával. A pAB112 egy 1,8 kb nagyságú EcoRl fragmenst tartalmaz az élesztő a-faktor génjével, amit a pBR322 plazmid EcoRl helyére klónoztunk, amely pBR322-ből a HindíII és Sáli helyeket kivágtuk. A pAB112 a pABlOl plazmidból származik, amely utóbbi részleges Sau3A fragmensen hordozza az élesztő α-faktor génjét; a fragmenst az YEp24 plazmid BamHl helyére kiónoztuk. A pABlOl plazmidot úgy kaptuk, hogy YEp24 plazmiddal élesztő genomiális könyvtárat (génbankot) állítottunk elő, majd enzimatikusan ³²P radioaktívan jelzett szintetikus oligonukleotid-próbával szkríneltünk. A próba homológ a publikált α-faktor kódolórégióval [Kurjan és Herskowitz, Abstracts (1981), Cold Spring Harbor meeting on the Molecular Biology of Yeasts, 242. oldal]. A fenti műveleteket ugyancsak Urdea ismertetett módszerével végezzük.

A kapott keverékkel E.coli HB101 sejteket transzformálunk, és izoláljuk az IGF I és IGF H szekvenciát hordozó pAB113-IGF-I pAB113-IGF-II plazmidokat. Az IGF I és IGF Π struktúrgéneket hordozó pAB113-IGF-I és pAB 113-IGF-II plazmidokat EcoRl enzimmel teljesen emésztjük, és a kapott fragmenseket fölös mennyiségben jelen levő EcoRI-BamHI adapteimolekulákkal ligáljuk, végül BamHl restrikciós endonukleázzal emésztjük.

A reakcióelegyben 5-5 pg plazmid DNS-t használunk. A kapott 1,8 kb nagyságú BamHl fragmenseket preparatív gélelektroforézissel izoláljuk, és a közelítőleg 100 ng-nyi mennyiségű fragmenseket 100 ng pCl/1 plazmidhoz ligáljuk, amely plazmidot előzőleg BamHl endonukleázzal teljesen emésztünk, és alkalikus foszfatázzal kezelünk.

A pCl/1 plazmid a pJDB219 egy származéka [Beggs, Natúré, 275, 104. (1978)], a plazmidban a pMB9 (pJDB219) bakteriális plazmidnak megfelelő szakaszt a pBR322-vel helyettesítettük. Mindegyik ligációs eleggyel E.coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin-rezisztenciájuk alapján szelektáljuk, és a bennük levő plazmidokat restrikciós endonuklezázos kezeléssel analizáljuk. Az IGF I vagy IGF II struktúrgént hordozó egy-egy szelektált klónból (pYIGF-I-10/1 és pYIGF-II-10/1) DNS-t izolálunk, és ezzel AB 103 élesztősejteket transzformálunk. A transzformánsokat leucin pozitív fe'notípus alapján szelektáljuk. A fenti transzformációs lépéseket Beggs előző cikke, valamint Maniatis: Molecular Cloning, Larboratory Mamel, Cold Spring Harbor Press, (1982) szerint végezzük.

A pYIGF-I-10/1 plazmiddal transzformált AB103 (a,pép 4-3, leu 2-3, leu 2-112, ura 3-52, his 4-580) élesztőtörzset 5 és 9 literes tenyészetben 30 °C hőmérsékleten növesztjük -leu-táptalajban addig, míg a tenyészet optikai sűrűsége 650 nm-en 5 lesz, majd ezután további 12 órán át tenyésztünk 30 °C hőmérsékleten. Centrifugálással mindkét tenyészetből összegyűjtjük a sejtfelülúszót, és az IGF I polipeptidet ioncserélő oszlopon (Biorex-70, Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Califomia) abszorbeálva koncentráljuk. A terméket 10 mmól hidrogén-kloridot tartalmazó, 80%-os etanollal eluáljuk, a 0,4 ml és 3 ml térfogatú IGF I frakciókat teljes proteintartalomxa és IGF I koncentrációra vizsgáljuk. A proteintartalmat Coomassie Blue módszerrel határozzuk meg (Bio-Rad Laboratories, Inc., Richmond, Califomia).

Az IGF I koncentrációt az ismert kompetitív radioimmunassay-vel mérjük, radioaktívan jelzett IGF I-et használva. Az eredményeket az alábbiakban közöljük:

Vizsg.	Térfogat	Koncent- Ossz-	IGF-I
száma		rálás utáni protein
		térfogat
1.	5 liter	0,4 ml 5,0 mg/ml	3,75 mg/ml
2.	9 liter	3,0 ml 2,9 mg/ml	3,00 mg/ml

A mérést Zapf és munkatársai: J. Cím. Invest. 68: 1321-1330 (1981) szerint végezzük.

Az IGF I mérés azon alapszik, hogy a peptid szinergista hatású a galambbegy-prolaktinra adott válaszának erősítésében [Anderson és munkatársai, Somatomedins/Insulin-Like Growth Factors, Spencer szerkesztése, Walter deGruter, Berlin (1983)]. A biológiai mérés alátámasztja, hogy a készítményekben levő IGF I termék azonos hatású a humán szérumból izolált autentikus IGF I termékkel.

A fentiekhez hasonlóan tenyésztve az AB 103 (pYIGE-H-10/1) törzset, és humán placentamembrán radioreceptorassay-vel meghatározva az IGF II koncentrációt [Spencer és munkatársai, Act. Endocrinol., 91, 36-48. (1979)], úgy találtuk, hogy a tenyészetekben 3,9 egység/ml, míg a normál humán szérumban 1 egység/ml IGF II aktivitás van.

A találmány szerinti eljárással új DNS-molekulákat állítunk elő, ezek a humán inzulinszerű növekedési faktor (I) kifejezésére, termelésére és szekréciójára használhatók. Tehát olyan polipeptidet állíthatunk elő, amely azonos szekvenciájú a természetesen előforduló humán I inzulinszerű növekedési faktorral. A szekréció biztosításával adott sejtpopulációból nagymértékben megnövekedett hozamot biztosíthatunk, és az ezután következő izolálási és tisztítási lépések egyszerűsödnek.

Bár a találmányt annak szemléltetése során részletesen ismertettük, és példát adtunk meg a világos érthetőség kedvéért, nyilvánvaló, hogy a találmány oltalmi körének szőkítése nélkül bizonyos változtatásokat és módosításokat eszközölhetünk.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

I. Eljárás humán inzulinszení I vagy Π növekedési faktorok (IGF) hatékony előállítására megfelelő gazdamikrooiganizmusban, azzal jellemezve, hogy i) egy IGF I vagy IGF Π polipeptidet kódoló DNSszekvenciát állítunk elő, ezt az IGF I vagy IGF H polipeptidet kódoló DNS-szekvencíát megfelelő leolvasási fázisban összekapcsoljuk egy olyan DNS-szekvenciával, amely az adott gazdaszervezet által felismert szekréciós vezér és processzor szignálszekvencíákat határoz meg, ezek 3’ irányban helyezkednek el az őket transzkripciós szinten szabályozó, a gazdaszervezet által felismerhető transzkripciós régiótól; az így kapott DNS-molekulával gazdaszervezetet transzformálunk;

xi) a transzformált sejteket tenyésztjük; és 5 iii) a transzformált gazdasejtek tenyészetéből izoláljuk a szekretált humán IGF I vagy IGF H polipeptideket.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdaszervezet által előnyben részesített kodo10 nokat tartalmazó szintetikus IGF-gént alkalmazunk.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán IGF-génként egy alábbi nukleoíidszekvenciájú szintetikus IGFI gént alkalmazunk:

GlyProGluThrLeuCysGIyAlaGluLeuValAspAIaLeuGIn

5’-GGTCCAGAAACCTTGTGTGGTGCTGAATTGGTCGATGCTTTGCAA

CCAGGTCTTTGGAACACACCACGACTTAACCAGCTACGAAACGTT

PheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheÁsnLysProThrGlyTyrGlySerSerSer

TTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCAACAÁGCCAACCGGTTACGGTTCTTCTTCT

AAGCAAACACCACrGTCTCCAAAGATGAAGTTGTTCGGTTGGCCAATGCCAAGAAGAAGA

ArgArgAlaProGlnThrGlylleValAspGluCysCysPheArgSerCysAspLeuArg

AGAAGAGCTCCACAAACCGGTATCGTTGACGAATGTTGTTTCAGATCrTGTGACTTGAGA

TCTTCTCGAGGTGTTTGGCCÁTAGCÁACTGCTTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACTCT

ArgLeuGluMetTyrCysAlaProLeuLysProAlaLysSerAla

AGArTGGÁAATGTACTGTGCrCCATTGAAGCCAGCTAAGTCTGCT-3’

TCTAACCTTTACATGACACGAGGTAACTTCGGTCGATTCAGACGA
4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán IGF-génként egy alábbi nukleotidszekvenciájú szintetikus IGF H gént alkalmazunk:

AlaTyrArgProSerGluThrLeuCysGlyGlyGluLeu ValAsp 5’-GCTTACAGACCArCCGAAACCTTGTGTGGTGGTGAATTGGTCGAC

CGAATGTCTGGTAGGCTTTGGAACACACCACCACITAACCAGCTG

ThrLeuGInPheValCysGlyAspArgGlyPheTyrPheSerArgProAlaSerArgVal

ACCTTGCAATTCGTTTGTGGTGACAGAGGTTTCTACTTCTCCAGACCAGCTTCCAGAGTT

TGGAACGTTAAGCAAACACCACTGTCTCCAAAGATGAAGAGGTCTGGTCGAAGGTCTCAA

SerArgArgSerArgGIylIeValGIuGIuCysCysPheArgSerCysAspLeuAlaLeu

TCTAGAAGATCCAGAGGTATCGTTGAAGAATGTTGTTTCAGATCTTGTGACTTGGCTTTG

AGATCTTCrAGGTCrCCATAGCAACTTCrTACAACAAAGTCTAGAACACTGAACCGAAAC

LeuGluThrTyrCysAlaThrProAlaLysS erGlu TTGGAAACCTACTGTGCTACCCCAGCrAAGTCTGAA-3 ’ AACCTTTGGATGACACGATGGGGTCGATTCAGACrr
5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként élesztősejtet használunk.
6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdasejtként élesztősejtet, és hordozó DNS-ként az élesztőkét mikronos plazmidjának egy származékát használjuk.
7. Az 1. igénypont szerinti eljárás a humán inzulinszén! növekedési faktor (JGF) előállítására élesztőben, azzal jellemezve, hogy előállítunk egy olyan első DNS-fragmenst, amely tartalmaz egy IGF-poIipeptidet meghatározó elsőDNSszekvenciát, és ennek kódolószálának 5’-vége a nevezett DNS-szekvencia első bázisa mellett, vagy attól 3’ irányban helyezkedik el;

egy olyan második DNS-fragmenst állítunk elő, amely egy második, az élesztősejtek által felismerhető szekréciós és processzorszignálokat kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, és kódolószálának 3’-vége a nevezett

HU 204565 Β processzorszignál utolsó bázisa mellett, vagy ettől 5’ irányban található, és a nevezett első és második fragmens legalább egyikének vége a kódolószekvencián belül helyezkedik el, aminek eredményeképpen bázispárok esnek ki;

a nevezett első és második DNS-fragmenseket a nevezett első és második DNS-fragmensek hiányzó bázispárjait kódoló adaptermolekulával összekapcsoljuk, amikor a nevezett első és második DNS-fragmens azonos leolvasási fázisba kerül;

az első fragmenstől 3’ irányba és annak szomszédságába egy terminációs kodont építünk be, majd a kapott gént élesztő expressziós vektorba klónozzuk és kifejezzük.
8. A 7. igénypont szerinti eljárás IGF előállítására, azzal jellemezve, hogy IGF-ként IGF I-et fejezünk ki.
9. A 7. igénypont szerinti eljárás IGF előállítására, azzal jellemezve, hogy IGF-ként IGF H-t fejezünk ki.
10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktériumok által felismerhető replikációs rendszert tartalmazó expressziós vektort alkalmazunk.
11. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az élesztő 2 mikronos plazmidjából, vagy annak egy részéből álló élesztő replikációs rendszert tartalmazó expressziós vektort alkalmazunk.