JP2002534074A - メチロトローフ酵母発現系を使用する組換えモネリンの産生 - Google Patents
メチロトローフ酵母発現系を使用する組換えモネリンの産生Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、単鎖モネリン様タンパク質に関する。この単鎖モネリン様タンパク質は安定であり、そして重量に基づいてスクロースと比較した場合に少なくとも１００倍甘い。本発明はまた、このモネリン様タンパク質をコードする核酸に関する。好ましくは、この核酸はさらに、メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおいて、コードされるモネリン様タンパク質の発現および分泌を指向するためのプロモーターおよびシグナル配列を含む。本発明はさらに、このモネリン様タンパク質をコードする核酸を含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞、この組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからモネリン様タンパク質を産生するためのプロセス、およびこのプロセスの産物に関する。
Description
【０００１】 本願は、１９９８年１２月３１日に出願され、そしてＰＲＯＤＵＣＴＩＯＮ
ＯＦ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＭＯＮＥＬＬＩＮ ＵＳＩＮＧ ＭＥＴＨＹＬ
ＯＴＲＯＰＨＩＣ ＹＥＡＳＴ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭと表題付
けられた、Ｌｉｎｇｘｕｎ Ｄｕａｎに対する米国仮特許出願番号第６０／１１
４，５２９号に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）の下での優先権の利益を主
張する。
ＯＦ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＭＯＮＥＬＬＩＮ ＵＳＩＮＧ ＭＥＴＨＹＬ
ＯＴＲＯＰＨＩＣ ＹＥＡＳＴ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＳＹＳＴＥＭと表題付
けられた、Ｌｉｎｇｘｕｎ Ｄｕａｎに対する米国仮特許出願番号第６０／１１
４，５２９号に対して、米国特許法第１１９条（ｅ）の下での優先権の利益を主
張する。
【０００２】 （１．発明の分野） 本発明は、単鎖モネリン様タンパク質に関する。この単鎖モネリン様タンパク
質は安定であり、そして重量に基づいてスクロースと比較した場合に少なくとも
１００倍甘い。本発明はまた、このモネリン様タンパク質をコードする核酸に関
する。好ましくは、この核酸はさらに、メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａ
ｓｔｏｒｉｓにおいて、コードされるモネリン様タンパク質の発現および分泌を
指向するためのプロモーターおよびシグナル配列を含む。本発明はさらに、この
モネリン様タンパク質をコードする核酸を含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ細胞、この組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからモネリン様タンパ
ク質を産生するためのプロセス、およびこのプロセスの産物に関する。
質は安定であり、そして重量に基づいてスクロースと比較した場合に少なくとも
１００倍甘い。本発明はまた、このモネリン様タンパク質をコードする核酸に関
する。好ましくは、この核酸はさらに、メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａ
ｓｔｏｒｉｓにおいて、コードされるモネリン様タンパク質の発現および分泌を
指向するためのプロモーターおよびシグナル配列を含む。本発明はさらに、この
モネリン様タンパク質をコードする核酸を含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ細胞、この組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからモネリン様タンパ
ク質を産生するためのプロセス、およびこのプロセスの産物に関する。
【０００３】 （２．背景技術） （２．１．モネリン） モネリンは、熱帯植物由来の強烈な甘味タンパク質のファミリーに属する（Ｄ
ａｎｓｂｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９７、１５：４
１９−４２０）。モネリンは、スクロースと比較した場合に、約３，０００倍甘
い。他の類似のタンパク質としては、タウマチン、ミラクリン、マビンリン（ｍ
ａｂｉｎｌｉｎ）、ペンタジン（ｐｅｎｔａｄｉｎ）、およびアスパルテーム（
同書）が挙げられる。モネリンは、西アフリカの植物Ｄｉｏｓｃｏｒｅｐｈｙｌ
ｌｕｍ ｃｏｍｍｉｎｉｓｉｉから最初に単離された（米国特許第３，８７８，
１８４号および同第３，９９８，７９８号；ＭｏｒｒｉｓおよびＣａｇａｎ、Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９７２、２６１：１１４−１２２
）。モネリンのアミノ酸配列、三次元構造、ならびに種々の物理的特性および化
学的特性が、特徴付けられた（Ｏｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８７、３２８
：７３９−７４２；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７３、２４
８：５３４−５３９；Ｃａｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７３、１８１：３２−
３５；ＢｏｈａｋおよびＬｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１
９７６、４２７：１５３−１７０；ＨｕｄｓｏｎおよびＢｅｅｍａｎ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９７６、７１：２１２−２２
０；Ｖａｎ ｄｅｒ ＷｅｌおよびＬｏｅｖｅ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９７
３、２９：１８１−１８３；ならびに、ＦｒａｎｋおよびＺｕｂｅｒ、Ｈｏｐｐ
ｅＳｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９７６、３５７：５
８５−５９２）。
ａｎｓｂｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９７、１５：４
１９−４２０）。モネリンは、スクロースと比較した場合に、約３，０００倍甘
い。他の類似のタンパク質としては、タウマチン、ミラクリン、マビンリン（ｍ
ａｂｉｎｌｉｎ）、ペンタジン（ｐｅｎｔａｄｉｎ）、およびアスパルテーム（
同書）が挙げられる。モネリンは、西アフリカの植物Ｄｉｏｓｃｏｒｅｐｈｙｌ
ｌｕｍ ｃｏｍｍｉｎｉｓｉｉから最初に単離された（米国特許第３，８７８，
１８４号および同第３，９９８，７９８号；ＭｏｒｒｉｓおよびＣａｇａｎ、Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９７２、２６１：１１４−１２２
）。モネリンのアミノ酸配列、三次元構造、ならびに種々の物理的特性および化
学的特性が、特徴付けられた（Ｏｇａｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、１９８７、３２８
：７３９−７４２；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７３、２４
８：５３４−５３９；Ｃａｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９７３、１８１：３２−
３５；ＢｏｈａｋおよびＬｉ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１
９７６、４２７：１５３−１７０；ＨｕｄｓｏｎおよびＢｅｅｍａｎ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９７６、７１：２１２−２２
０；Ｖａｎ ｄｅｒ ＷｅｌおよびＬｏｅｖｅ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９７
３、２９：１８１−１８３；ならびに、ＦｒａｎｋおよびＺｕｂｅｒ、Ｈｏｐｐ
ｅＳｅｙｌｅｒ’ｓ Ｚ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９７６、３５７：５
８５−５９２）。
【０００４】 米国特許第４，３００，５７６号は、タウマチンまたはモネリンを含む喫煙品
（ｓｍｏｋｉｎｇ ａｒｔｉｃｌｅ）を開示する。米国特許第４，５６２，０７
６号は、タウマチンまたはモネリンのコーティングを有するチューインガムを開
示する。米国特許第４，４１２，９８４号は、タウマチンまたはモネリンを含む
香味を増強した経口組成物を開示する。しかし、低カロリー甘味料としてのその
可能性にも関わらず、モネリンの広範な商業的適用は、その熱およびｐＨに対す
る安定性の貧弱さ、植物供給の供給源に対する入手機会の欠如、および調節され
る気候における食品添加物についての不確定性に関する懸念によって妨害される
（Ｄａｎｓｂｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９７：１５
：４１９−４２０）。
（ｓｍｏｋｉｎｇ ａｒｔｉｃｌｅ）を開示する。米国特許第４，５６２，０７
６号は、タウマチンまたはモネリンのコーティングを有するチューインガムを開
示する。米国特許第４，４１２，９８４号は、タウマチンまたはモネリンを含む
香味を増強した経口組成物を開示する。しかし、低カロリー甘味料としてのその
可能性にも関わらず、モネリンの広範な商業的適用は、その熱およびｐＨに対す
る安定性の貧弱さ、植物供給の供給源に対する入手機会の欠如、および調節され
る気候における食品添加物についての不確定性に関する懸念によって妨害される
（Ｄａｎｓｂｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９７：１５
：４１９−４２０）。
【０００５】 １９８９年に、Ｓｕｎｇ−Ｈｏｕ Ｋｉｍのグループが、遺伝子操作すること
による、Ｅ．ｃｏｌｉにおける単鎖モネリンの産生を報告した（Ｋｉｍら、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９８９、２：５７１−５７５）。この精製された単鎖モ
ネリンは、甘味強度を保持していたが、より熱安定性であり、そして広範なｐＨ
範囲に対して耐性であることが見出された。本発明のいくつかの局面は、いくつ
かの米国特許の主題であった。例えば、米国特許第５，２３４，８３４号は、植
物細胞における単鎖モネリンの発現のための構築物を開示する。米国特許第５，
４８７，９２３号は、式Ｂ−Ｃ−Ａの甘味タンパク質様化合物を開示する。ここ
で、Ｂは、ネイティブなモネリンのＢ鎖の残基１〜４６に対して少なくとも９０
％相同であり、かつ保存的置換によってのみ改変されたペプチド部分を表し；Ｃ
は、共有結合であるか、または分子の外部に存在するようにか、もしくはネイテ
ィブなコンフォメーションを妨害しないように選択された１〜１０個のアミノ酸
のペプチドと等価な間隔長を提供し得る、親水性の生理的に受容可能な共有結合
性のリンカーであり；そしてＡは、ネイティブなモネリンのＡ鎖の残基６〜４５
に対して少なくとも９０％相同であり、かつ保存的置換によってのみ改変された
ペプチドを表す。米国特許第５，４８７，９８３号は、米国特許第５，４８７，
９２３号に開示された単鎖モネリンを作製するための発現系を開示する。米国特
許第５，６７０，３３９号は、米国特許第５，４８７，９２３号に開示された単
鎖モネリンをコードするＤＮＡを開示する。米国特許第５，６７２，３７２号は
、米国特許第５，４８７，９２３号に開示された単鎖モネリンを用いて、食品組
成物を甘くするための方法を開示する。米国特許第５，２６４，５５８号は、標
準的な食味試験において、重量に基づいて、スクロースの少なくとも５０倍であ
る単鎖モネリンタンパク質を開示する。
による、Ｅ．ｃｏｌｉにおける単鎖モネリンの産生を報告した（Ｋｉｍら、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９８９、２：５７１−５７５）。この精製された単鎖モ
ネリンは、甘味強度を保持していたが、より熱安定性であり、そして広範なｐＨ
範囲に対して耐性であることが見出された。本発明のいくつかの局面は、いくつ
かの米国特許の主題であった。例えば、米国特許第５，２３４，８３４号は、植
物細胞における単鎖モネリンの発現のための構築物を開示する。米国特許第５，
４８７，９２３号は、式Ｂ−Ｃ−Ａの甘味タンパク質様化合物を開示する。ここ
で、Ｂは、ネイティブなモネリンのＢ鎖の残基１〜４６に対して少なくとも９０
％相同であり、かつ保存的置換によってのみ改変されたペプチド部分を表し；Ｃ
は、共有結合であるか、または分子の外部に存在するようにか、もしくはネイテ
ィブなコンフォメーションを妨害しないように選択された１〜１０個のアミノ酸
のペプチドと等価な間隔長を提供し得る、親水性の生理的に受容可能な共有結合
性のリンカーであり；そしてＡは、ネイティブなモネリンのＡ鎖の残基６〜４５
に対して少なくとも９０％相同であり、かつ保存的置換によってのみ改変された
ペプチドを表す。米国特許第５，４８７，９８３号は、米国特許第５，４８７，
９２３号に開示された単鎖モネリンを作製するための発現系を開示する。米国特
許第５，６７０，３３９号は、米国特許第５，４８７，９２３号に開示された単
鎖モネリンをコードするＤＮＡを開示する。米国特許第５，６７２，３７２号は
、米国特許第５，４８７，９２３号に開示された単鎖モネリンを用いて、食品組
成物を甘くするための方法を開示する。米国特許第５，２６４，５５８号は、標
準的な食味試験において、重量に基づいて、スクロースの少なくとも５０倍であ
る単鎖モネリンタンパク質を開示する。
【０００６】 近年では、Ｋｏｎｄｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９
９７、１５：４５３−４５７が、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓにおける、
細胞内での単鎖モネリンタンパク質の異種発現を開示している。これは、モネリ
ンが、可溶性タンパク質の５０％より多くを説明する高レベルで産生されたこと
を報告する。
９７、１５：４５３−４５７が、酵母Ｃａｎｄｉｄａ ｕｔｉｌｉｓにおける、
細胞内での単鎖モネリンタンパク質の異種発現を開示している。これは、モネリ
ンが、可溶性タンパク質の５０％より多くを説明する高レベルで産生されたこと
を報告する。
【０００７】 （２．２．Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおける異種タンパク質の発現） メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓを、タンパク質発現系と
して使用した。この発現系のいくつかの局面は、いくつかの米国特許の主題であ
った。例えば、米国特許第４，８３７，１４８号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓの自律複製配列を開示する。米国特許第４，８５５，２３１号は、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞における異種遺伝子発現のための調節領域を開示
する。米国特許第４，８８２，２７９号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの
部位選択的ゲノム改変を開示する。米国特許第４，９２９，５５５号は、形質転
換能のあるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの全細胞を作製するための方法を開
示する。米国特許第５，１２２，４６５号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
の株において選択可能な表現型を生成するためのプロセスを開示する。米国特許
第５，３２４，６３９号は、メチロトローフ細胞（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ細胞を含む）におけるインスリン様増殖因子−１の産生を開示する。
して使用した。この発現系のいくつかの局面は、いくつかの米国特許の主題であ
った。例えば、米国特許第４，８３７，１４８号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓの自律複製配列を開示する。米国特許第４，８５５，２３１号は、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞における異種遺伝子発現のための調節領域を開示
する。米国特許第４，８８２，２７９号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの
部位選択的ゲノム改変を開示する。米国特許第４，９２９，５５５号は、形質転
換能のあるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの全細胞を作製するための方法を開
示する。米国特許第５，１２２，４６５号は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
の株において選択可能な表現型を生成するためのプロセスを開示する。米国特許
第５，３２４，６３９号は、メチロトローフ細胞（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ細胞を含む）におけるインスリン様増殖因子−１の産生を開示する。
【０００８】 多くのシグナル配列が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞において発現さ
れる異種タンパク質の分泌を指向するために使用されている。このようなシグナ
ル配列の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓの酸性ホスファターゼのシグナル配列、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓのα−Ｓａｒｃｉｎのシグナル配列（Ｍａｒｔｉｎ
ｅｚ−Ｒｕｉｚら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、１９９８、１２
（３）：３１５−２２；Ａｂｄｕｌａｅｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕ
ｒｉｆ．、１９９７、１０（１）：６１−９；Ｋｏｔａｋｅら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ
Ｒｅｓ．、１９９６、３７（３）：５９９−６０５）、α−Ｎ−アセチルガラ
クトサミニダーゼ（αＮＡＧＡＬ、ＥＣ ３．２．１．４９）のシグナル配列（
Ｚｈｕら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９８、３５２（
１）：１−８）、ＯｍｐＡタンパク質のシグナルペプチド（Ｈｅｉｍら、Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１９９８、１３９６（３）：３０６−
１９）、マウスのα因子シグナル（ｃＣｅｌｌ）のシグナル配列またはコショウ
のエンド−β−１，４−グルカナーゼのネイティブなシグナル配列（Ｆｅｒｒａ
ｒｅｓｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９８、４２２（１）：２３−６）、リ
グニン溶解性（ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ）真菌Ｔｒａｍｅｔｅｓから単離され
たラッカーゼのシグナルペプチド（Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．
、１９９７、３２（６）：４２５−３０）、マウスのリソソーム酸性α−マンノ
シダーゼのシグナルペプチド（Ｍｅｒｋｌｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ．、１９９７、１３３６（２）：１３２−４６）、ブタのカルボニ
ックアンヒドラーゼのインヒビターのシグナルペプチド（Ｗｕｅｂｂｅｎｓら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７、３６（１４）：４３２７−３６）、Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉのグルコアミラーゼのシグナル配列（Ｆｉ
ｅｒｏｂｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、１９９７、９（２）
：１５９−７０）、マウスの主要尿タンパク質（ｍａｊｏｒ ｕｒｉｎａｒｙ
ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナル配列（Ｆｅｒｒａｒｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、
１９９７、４０１（１）：７３−７）、ｐｈｏ１のシグナル配列（Ｓｋｏｒｙら
、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９６、３０（５）：４１７−２２）、ウサギの
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）のシグナル配列（Ｓａｄｈｕｋｈａｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１（３１）：１８３１０−３）、Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのアスパラギン酸プロテイナーゼのプレペプチド
配列（Ｔｓｕｊｉｋａｗａら、Ｙｅａｓｔ、１９９６、１２（６）：５４１−５
３）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＲＣ１のシグナル配列（Ｏｈｉら、
Ｙｅａｓｔ、１９９６、１２（１）：３１−４０）、細菌の熱安定性αアミラー
ゼのシグナル配列およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由
来のＳＵＣ２遺伝子シグナル配列（Ｐａｉｆｅｒら、Ｙｅａｓｔ、１９９４、１
０（１１）：１４１５−９）、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ接合フェロモンα因子のシグナル配列（Ｆｉｄｌｅｒら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１９９８、２１（３）：３２７−３３６）。
れる異種タンパク質の分泌を指向するために使用されている。このようなシグナ
ル配列の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓの酸性ホスファターゼのシグナル配列、Ａｓｐｅｒｇｉｌ
ｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓのα−Ｓａｒｃｉｎのシグナル配列（Ｍａｒｔｉｎ
ｅｚ−Ｒｕｉｚら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、１９９８、１２
（３）：３１５−２２；Ａｂｄｕｌａｅｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕ
ｒｉｆ．、１９９７、１０（１）：６１−９；Ｋｏｔａｋｅら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ
Ｒｅｓ．、１９９６、３７（３）：５９９−６０５）、α−Ｎ−アセチルガラ
クトサミニダーゼ（αＮＡＧＡＬ、ＥＣ ３．２．１．４９）のシグナル配列（
Ｚｈｕら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９９８、３５２（
１）：１−８）、ＯｍｐＡタンパク質のシグナルペプチド（Ｈｅｉｍら、Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１９９８、１３９６（３）：３０６−
１９）、マウスのα因子シグナル（ｃＣｅｌｌ）のシグナル配列またはコショウ
のエンド−β−１，４−グルカナーゼのネイティブなシグナル配列（Ｆｅｒｒａ
ｒｅｓｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１９９８、４２２（１）：２３−６）、リ
グニン溶解性（ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ）真菌Ｔｒａｍｅｔｅｓから単離され
たラッカーゼのシグナルペプチド（Ｊｏｎｓｓｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．
、１９９７、３２（６）：４２５−３０）、マウスのリソソーム酸性α−マンノ
シダーゼのシグナルペプチド（Ｍｅｒｋｌｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ａｃｔａ．、１９９７、１３３６（２）：１３２−４６）、ブタのカルボニ
ックアンヒドラーゼのインヒビターのシグナルペプチド（Ｗｕｅｂｂｅｎｓら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７、３６（１４）：４３２７−３６）、Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉのグルコアミラーゼのシグナル配列（Ｆｉ
ｅｒｏｂｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、１９９７、９（２）
：１５９−７０）、マウスの主要尿タンパク質（ｍａｊｏｒ ｕｒｉｎａｒｙ
ｐｒｏｔｅｉｎ）のシグナル配列（Ｆｅｒｒａｒｉら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、
１９９７、４０１（１）：７３−７）、ｐｈｏ１のシグナル配列（Ｓｋｏｒｙら
、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９９６、３０（５）：４１７−２２）、ウサギの
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）のシグナル配列（Ｓａｄｈｕｋｈａｎら、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１（３１）：１８３１０−３）、Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓのアスパラギン酸プロテイナーゼのプレペプチド
配列（Ｔｓｕｊｉｋａｗａら、Ｙｅａｓｔ、１９９６、１２（６）：５４１−５
３）、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＲＣ１のシグナル配列（Ｏｈｉら、
Ｙｅａｓｔ、１９９６、１２（１）：３１−４０）、細菌の熱安定性αアミラー
ゼのシグナル配列およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由
来のＳＵＣ２遺伝子シグナル配列（Ｐａｉｆｅｒら、Ｙｅａｓｔ、１９９４、１
０（１１）：１４１５−９）、ならびにＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ接合フェロモンα因子のシグナル配列（Ｆｉｄｌｅｒら、Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１９９８、２１（３）：３２７−３３６）。
【０００９】 メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓは、種々の異種タンパク
質の産生のために首尾よく使用されており、米国特許第５，３２４，６３９号は
、現在のレベルのメチロトローフ酵母発現系の理解を開示しているが、所定の遺
伝子がこのような酵母において明らかなレベルまで発現され得るか否か、または
この酵母宿主がその細胞において組換え遺伝子産物の存在を許容するか否かは、
予測不可能である。米国特許第５，３２４，６３９号は、さらに、特定のタンパ
ク質がメチロトローフ酵母宿主によって分泌される場合（そうであれば、いくら
の効力においてか）を予見することが特に困難であることを開示する。例えば、
Ｖｏｌｌｍｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９６、１９９（
１）：４７〜５４は、ヒトｓＩＬ−６Ｒの３２３個のアミノ酸残基がメチロトロ
ーフ酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに適切な発現／分泌ベクターに挿入さ
れる場合、組換えタンパク質の検出可能な発現および分泌は得られないことを報
告する。現在まで、モネリンは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系を使用
して発現および分泌されていない。
質の産生のために首尾よく使用されており、米国特許第５，３２４，６３９号は
、現在のレベルのメチロトローフ酵母発現系の理解を開示しているが、所定の遺
伝子がこのような酵母において明らかなレベルまで発現され得るか否か、または
この酵母宿主がその細胞において組換え遺伝子産物の存在を許容するか否かは、
予測不可能である。米国特許第５，３２４，６３９号は、さらに、特定のタンパ
ク質がメチロトローフ酵母宿主によって分泌される場合（そうであれば、いくら
の効力においてか）を予見することが特に困難であることを開示する。例えば、
Ｖｏｌｌｍｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９６、１９９（
１）：４７〜５４は、ヒトｓＩＬ−６Ｒの３２３個のアミノ酸残基がメチロトロ
ーフ酵母Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓに適切な発現／分泌ベクターに挿入さ
れる場合、組換えタンパク質の検出可能な発現および分泌は得られないことを報
告する。現在まで、モネリンは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系を使用
して発現および分泌されていない。
【００１０】 モネリンの商業的適用において最も興味深いものを仮定すると、モネリンのネ
イティブの甘味強度（ｓｗｅｅｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をなお保持しかつ下流
の精製手順を単純化する、安定なモネリンを産生するためのより効率的な方法に
ついての重要な必要性が存在する。本発明は、当該分野におけるこれら必要性お
よび他の必要性を検討する。本明細書中上記の参考文献の引用は、このような参
考文献が本発明の先行分野であることを承認すると解釈されない。
イティブの甘味強度（ｓｗｅｅｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をなお保持しかつ下流
の精製手順を単純化する、安定なモネリンを産生するためのより効率的な方法に
ついての重要な必要性が存在する。本発明は、当該分野におけるこれら必要性お
よび他の必要性を検討する。本明細書中上記の参考文献の引用は、このような参
考文献が本発明の先行分野であることを承認すると解釈されない。
【００１１】 （３．発明の要旨） 本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離され
た核酸に関し、このキメラタンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端に、以下：ａ）ネイテ
ィブモネリンのＢ鎖の残基１〜５０に対して少なくとも４０％の同一性を有する
アミノ酸配列からなる第１のペプチジルフラグメント（ここで、同一性の割合は
、ネイティブモネリンのＢ鎖に対して同一のサイズのアミノ酸配列にわたって決
定される）；ｂ）ペプチジル結合、または１〜１２のアミノ酸からなる第２のペ
プチジルフラグメント；およびｃ）ネイティブモネリンのＡ鎖の残基１〜４５に
対して少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる第３のペプチジ
ルフラグメント（ここで、同一性の割合は、ネイティブモネリンのＡ鎖に対して
同一のサイズのアミノ酸配列にわたって決定される）を含み、ここで、このキメ
ラタンパク質は安定であり、そして所定の量のこのキメラタンパク質は、同じ量
のスクロースと比較して少なくとも１００倍甘く、そしてこの核酸において、好
ましくは酵母細胞によって使用されるコドンが、使用される。好ましくは、単離
された核酸は、さらに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタンパク質発
現を指向し得るプロモーターおよび／またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由
来のコードされたキメラタンパク質の分泌を指向し得るアミノ酸配列をコードす
る。
た核酸に関し、このキメラタンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端に、以下：ａ）ネイテ
ィブモネリンのＢ鎖の残基１〜５０に対して少なくとも４０％の同一性を有する
アミノ酸配列からなる第１のペプチジルフラグメント（ここで、同一性の割合は
、ネイティブモネリンのＢ鎖に対して同一のサイズのアミノ酸配列にわたって決
定される）；ｂ）ペプチジル結合、または１〜１２のアミノ酸からなる第２のペ
プチジルフラグメント；およびｃ）ネイティブモネリンのＡ鎖の残基１〜４５に
対して少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる第３のペプチジ
ルフラグメント（ここで、同一性の割合は、ネイティブモネリンのＡ鎖に対して
同一のサイズのアミノ酸配列にわたって決定される）を含み、ここで、このキメ
ラタンパク質は安定であり、そして所定の量のこのキメラタンパク質は、同じ量
のスクロースと比較して少なくとも１００倍甘く、そしてこの核酸において、好
ましくは酵母細胞によって使用されるコドンが、使用される。好ましくは、単離
された核酸は、さらに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタンパク質発
現を指向し得るプロモーターおよび／またはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由
来のコードされたキメラタンパク質の分泌を指向し得るアミノ酸配列をコードす
る。
【００１２】 本発明はまた、上記の核酸を含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞
に関する。本発明は、さらに、キメラタンパク質を産生するためのプロセスに関
し、このプロセスは、上記の核酸を含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
細胞を増殖して、その結果、コードされたキメラタンパク質がこの細胞によって
発現および分泌される工程、ならびにこの発現および分泌されたキメラタンパク
質を回収する工程を包含する。最後に、本発明は、上記のプロセスの産物に関す
る。
に関する。本発明は、さらに、キメラタンパク質を産生するためのプロセスに関
し、このプロセスは、上記の核酸を含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
細胞を増殖して、その結果、コードされたキメラタンパク質がこの細胞によって
発現および分泌される工程、ならびにこの発現および分泌されたキメラタンパク
質を回収する工程を包含する。最後に、本発明は、上記のプロセスの産物に関す
る。
【００１３】 （４．発明の詳細な説明） 本発明は、一本鎖モネリン様タンパク質をコードする核酸を提供する。このタ
ンパク質は安定であり、そして重量基準で、スクロースと比較して少なくとも１
００倍甘い。好ましくは、この核酸は、さらに、メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉ
ａ Ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるコードされたモネリン様タンパク質の発現および
分泌を指向するための、プロモーターおよびシグナル配列を含む。本発明はまた
、モネリン様タンパク質をコードする核酸を含む組換えＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ細胞、この組換えＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓからモネリン様タン
パク質を産生するためのプロセス、およびこのプロセスの産物を提供する。
ンパク質は安定であり、そして重量基準で、スクロースと比較して少なくとも１
００倍甘い。好ましくは、この核酸は、さらに、メチロトローフ酵母Ｐｉｃｈｉ
ａ Ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるコードされたモネリン様タンパク質の発現および
分泌を指向するための、プロモーターおよびシグナル配列を含む。本発明はまた
、モネリン様タンパク質をコードする核酸を含む組換えＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔ
ｏｒｉｓ細胞、この組換えＰｉｃｈｉａ Ｐａｓｔｏｒｉｓからモネリン様タン
パク質を産生するためのプロセス、およびこのプロセスの産物を提供する。
【００１４】 制限の目的ではなく開示の明確さのために、本発明の詳細な説明は、続く小節
に分けられる。
に分けられる。
【００１５】 （４．１．一本鎖モネリンタンパク質をコードする核酸） 本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離され
た核酸を提供し、このキメラタンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端に、以下：ａ）ネイ
ティブモネリンのＢ鎖の残基１〜５０に対して少なくとも４０％の同一性を有す
るアミノ酸配列からなる第１のペプチジルフラグメント（ここで、同一性の割合
は、ネイティブモネリンのＢ鎖に対して同一のサイズのアミノ酸配列にわたって
決定される）；ｂ）ペプチジル結合、または１〜１２のアミノ酸からなる第２の
ペプチジルフラグメント；およびｃ）ネイティブモネリンのＡ鎖の残基１〜４５
に対して少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる第３のペプチ
ジルフラグメント（ここで、同一性の割合は、ネイティブモネリンのＡ鎖に対し
て同一のサイズのアミノ酸配列にわたって決定される）を含み、ここで、このキ
メラタンパク質は安定であり、そして所定の量のこのキメラタンパク質は、同じ
量のスクロースと比較して少なくとも１００倍甘く、そしてこの核酸において、
好ましくは酵母細胞によって使用されるコドンが、使用される。
た核酸を提供し、このキメラタンパク質は、Ｎ末端〜Ｃ末端に、以下：ａ）ネイ
ティブモネリンのＢ鎖の残基１〜５０に対して少なくとも４０％の同一性を有す
るアミノ酸配列からなる第１のペプチジルフラグメント（ここで、同一性の割合
は、ネイティブモネリンのＢ鎖に対して同一のサイズのアミノ酸配列にわたって
決定される）；ｂ）ペプチジル結合、または１〜１２のアミノ酸からなる第２の
ペプチジルフラグメント；およびｃ）ネイティブモネリンのＡ鎖の残基１〜４５
に対して少なくとも４５％の同一性を有するアミノ酸配列からなる第３のペプチ
ジルフラグメント（ここで、同一性の割合は、ネイティブモネリンのＡ鎖に対し
て同一のサイズのアミノ酸配列にわたって決定される）を含み、ここで、このキ
メラタンパク質は安定であり、そして所定の量のこのキメラタンパク質は、同じ
量のスクロースと比較して少なくとも１００倍甘く、そしてこの核酸において、
好ましくは酵母細胞によって使用されるコドンが、使用される。
【００１６】 特定の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、第１のペプチジルフラグメ
ントは、ネイティブモネリンのＢ鎖に対して少なくとも６０％の同一性を有する
アミノ酸配列からなる。好ましくは、第１のペプチジルフラグメントは、ネイテ
ィブモネリンのＢ鎖に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列か
らなる。より好ましくは、第１のペプチジルフラグメントは、ネイティブモネリ
ンのＢ鎖のアミノ酸残基１〜５０からなる。
チド配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、第１のペプチジルフラグメ
ントは、ネイティブモネリンのＢ鎖に対して少なくとも６０％の同一性を有する
アミノ酸配列からなる。好ましくは、第１のペプチジルフラグメントは、ネイテ
ィブモネリンのＢ鎖に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列か
らなる。より好ましくは、第１のペプチジルフラグメントは、ネイティブモネリ
ンのＢ鎖のアミノ酸残基１〜５０からなる。
【００１７】 別の特定の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、第２のペプチジルフラ
グメントは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１）からなる。好
ましくは、第２のペプチジルフラグメントは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２）からなる。より好ましくは、第２のペプチジルフラ
グメントは、アミノ酸Ｇｌｙからなる。
レオチド配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、第２のペプチジルフラ
グメントは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１）からなる。好
ましくは、第２のペプチジルフラグメントは、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２）からなる。より好ましくは、第２のペプチジルフラ
グメントは、アミノ酸Ｇｌｙからなる。
【００１８】 なお別の特定の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードする
ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、第３のペプチジル
フラグメントは、ネイティブモネリンのＡ鎖に対して少なくとも６０％の同一性
を有するアミノ酸配列からなる。好ましくは、第３のペプチジルフラグメントは
、ネイティブモネリンのＡ鎖に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ
酸配列からなる。より好ましくは、第３のペプチジルフラグメントは、ネイティ
ブモネリンのＡ鎖のアミノ酸残基１〜４５からなる。
ヌクレオチド配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、第３のペプチジル
フラグメントは、ネイティブモネリンのＡ鎖に対して少なくとも６０％の同一性
を有するアミノ酸配列からなる。好ましくは、第３のペプチジルフラグメントは
、ネイティブモネリンのＡ鎖に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ
酸配列からなる。より好ましくは、第３のペプチジルフラグメントは、ネイティ
ブモネリンのＡ鎖のアミノ酸残基１〜４５からなる。
【００１９】 好ましい実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、第１のペプチジルフラグ
メントは、ネイティブモネリンのＢ鎖のアミノ酸残基１〜５０からなり、第２の
ペプチジルフラグメントは、アミノ酸残基Ｇｌｙからなり、そして第３のペプチ
ジルフラグメントは、ネイティブモネリンのＡ鎖のアミノ酸残基１〜４５からな
る。
オチド配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、第１のペプチジルフラグ
メントは、ネイティブモネリンのＢ鎖のアミノ酸残基１〜５０からなり、第２の
ペプチジルフラグメントは、アミノ酸残基Ｇｌｙからなり、そして第３のペプチ
ジルフラグメントは、ネイティブモネリンのＡ鎖のアミノ酸残基１〜４５からな
る。
【００２０】 特定の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を含む、単離された核酸を提供し、このキメラタンパク質は、抗モネリ
ン抗体または抗タウマチン抗体によって免疫反応的に結合され得る。
チド配列を含む、単離された核酸を提供し、このキメラタンパク質は、抗モネリ
ン抗体または抗タウマチン抗体によって免疫反応的に結合され得る。
【００２１】 別の特定の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、このキメラタンパク質
は、さらに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからのこのキメラタンパク質の分
泌を指向し得るアミノ酸配列を含む。好ましくは、分泌指向配列は、Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓの内因性シグナル配列である。より好ましくは、この内因
性シグナル配列は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＲＣ１によってコード
される、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酸ホスファターゼ、Ｐｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓカルボキシペプチダーゼＹのシグナル配列からなる群より選択される。あ
るいは、分泌指向配列は酵母シグナル配列であり、ここで、この酵母は、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓではない。好ましくは、この酵母シグナル配列は、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のシグナル配列である。
より好ましくは、このＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシグ
ナル配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ ２
およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合フェロモンα因
子（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍａｔｉｎｇ ｐｈ
ｅｒｏｍｏｎｅ α−ｆａｃｔｏｒ）のシグナル配列からなる群より選択される
。より好ましくは、このＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシ
グナル配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合フェロ
モンα因子のシグナル配列である。本発明において使用され得る他の分泌指向配
列の例としては、以下が挙げられるが，これらに限定されない：Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ α−Ｓａｒｃｉｎ、α−Ｎ−アセチルガラクト
サミニダーゼ、ＯｍｐＡタンパク質、マウスα因子（ｃＣｅｌｌ）、コショウエ
ンド−β−１，４−グルカナーゼ、リグニン溶解性（ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ
）真菌Ｔｒａｍｅｔｅｓから単離されたラッカーゼ、マウスリソソーム酸α−マ
ンノシダーゼ、炭酸脱水素酵素のブタインヒビター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ、マウス主要尿タンパク質、ｐｈｏ１、ウサギ
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）および細菌性熱安定αアミラーゼの、シグ
ナル配列。
レオチド配列を含む、単離された核酸を提供し、ここで、このキメラタンパク質
は、さらに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからのこのキメラタンパク質の分
泌を指向し得るアミノ酸配列を含む。好ましくは、分泌指向配列は、Ｐｉｃｈｉ
ａ ｐａｓｔｏｒｉｓの内因性シグナル配列である。より好ましくは、この内因
性シグナル配列は、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＲＣ１によってコード
される、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ酸ホスファターゼ、Ｐｉｃｈｉａ ｐ
ａｓｔｏｒｉｓアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓカルボキシペプチダーゼＹのシグナル配列からなる群より選択される。あ
るいは、分泌指向配列は酵母シグナル配列であり、ここで、この酵母は、Ｐｉｃ
ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓではない。好ましくは、この酵母シグナル配列は、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のシグナル配列である。
より好ましくは、このＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシグ
ナル配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ ２
およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合フェロモンα因
子（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｍａｔｉｎｇ ｐｈ
ｅｒｏｍｏｎｅ α−ｆａｃｔｏｒ）のシグナル配列からなる群より選択される
。より好ましくは、このＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシ
グナル配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合フェロ
モンα因子のシグナル配列である。本発明において使用され得る他の分泌指向配
列の例としては、以下が挙げられるが，これらに限定されない：Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓ α−Ｓａｒｃｉｎ、α−Ｎ−アセチルガラクト
サミニダーゼ、ＯｍｐＡタンパク質、マウスα因子（ｃＣｅｌｌ）、コショウエ
ンド−β−１，４−グルカナーゼ、リグニン溶解性（ｌｉｇｎｉｎｏｌｙｔｉｃ
）真菌Ｔｒａｍｅｔｅｓから単離されたラッカーゼ、マウスリソソーム酸α−マ
ンノシダーゼ、炭酸脱水素酵素のブタインヒビター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ、マウス主要尿タンパク質、ｐｈｏ１、ウサギ
アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）および細菌性熱安定αアミラーゼの、シグ
ナル配列。
【００２２】 特定の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオ
チド配列を含む、単離された核酸を提供し、この核酸は、ＤＮＡである。別の実
施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列にハイブ
リダイズ可能である、単離された核酸を提供する。なお別の特定の実施形態にお
いて、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
チド配列を含む、単離された核酸を提供し、この核酸は、ＤＮＡである。別の実
施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列にハイブ
リダイズ可能である、単離された核酸を提供する。なお別の特定の実施形態にお
いて、本発明は、キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的なヌ
クレオチド配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【００２３】 特定の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするＤＮＡを
提供し、このＤＮＡは、さらに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタン
パク質発現を指向し得るプロモーターを含む。好ましくは、このプロモーターは
、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの内因性プロモーターである。より好ましく
は、この内因性プロモーターは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓグリセルアル
デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）のプロモーターである。
あるいは，好ましくはないが、メチロトローフ酵母中のメタノール応答性遺伝子
のプロモーターもまた、使用され得る。このようなメタノール応答性プロモータ
ーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ１由来の第一級アルコールオキシダーゼ遺伝子のため
のプロモーター、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ２由来の第二級アル
コールオキシダーゼ遺伝子のためのプロモーター、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ（ＤＡＳ）由来のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のためのプロモー
ター、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＰ４０遺伝子のためのプロモータ
ー、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のカタラーゼ遺伝子のためのプロモー
ターなど（米国特許第５，３２４，６３９号を参照のこと）。
提供し、このＤＮＡは、さらに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタン
パク質発現を指向し得るプロモーターを含む。好ましくは、このプロモーターは
、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの内因性プロモーターである。より好ましく
は、この内因性プロモーターは、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓグリセルアル
デヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）のプロモーターである。
あるいは，好ましくはないが、メチロトローフ酵母中のメタノール応答性遺伝子
のプロモーターもまた、使用され得る。このようなメタノール応答性プロモータ
ーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ１由来の第一級アルコールオキシダーゼ遺伝子のため
のプロモーター、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ２由来の第二級アル
コールオキシダーゼ遺伝子のためのプロモーター、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ（ＤＡＳ）由来のジヒドロキシアセトンシンターゼ遺伝子のためのプロモー
ター、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＰ４０遺伝子のためのプロモータ
ー、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のカタラーゼ遺伝子のためのプロモー
ターなど（米国特許第５，３２４，６３９号を参照のこと）。
【００２４】 別の特定の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするＤＮ
Ａを提供し、このＤＮＡは、さらに、細菌中でその複製および選択を可能にする
配列を含む。この方法において、大量のＤＮＡフラグメントは、細菌中での複製
によって産生され得る。
Ａを提供し、このＤＮＡは、さらに、細菌中でその複製および選択を可能にする
配列を含む。この方法において、大量のＤＮＡフラグメントは、細菌中での複製
によって産生され得る。
【００２５】 好ましい実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするＤＮＡ
を提供し、ここで、このコードされたキメラタンパク質において、第１のペプチ
ジルフラグメントは、ネイティブモネリンのＢ鎖のアミノ酸残基１〜５０からな
り、第２のペプチジルフラグメントは、アミノ酸残基Ｇｌｙからなり、そして第
３のペプチジルフラグメントは、ネイティブモネリンのＡ鎖のアミノ酸残基１〜
４５からなり、そしてこのＤＮＡは、さらに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
ＧＡＰのプロモーターおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ接合フェロモンα因子のシグナル配列を含む。
を提供し、ここで、このコードされたキメラタンパク質において、第１のペプチ
ジルフラグメントは、ネイティブモネリンのＢ鎖のアミノ酸残基１〜５０からな
り、第２のペプチジルフラグメントは、アミノ酸残基Ｇｌｙからなり、そして第
３のペプチジルフラグメントは、ネイティブモネリンのＡ鎖のアミノ酸残基１〜
４５からなり、そしてこのＤＮＡは、さらに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
ＧＡＰのプロモーターおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ接合フェロモンα因子のシグナル配列を含む。
【００２６】 別の好ましい実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするＤ
ＮＡを提供し、ここで、好ましくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓによって使
用されるコドンが、使用される。
ＮＡを提供し、ここで、好ましくはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓによって使
用されるコドンが、使用される。
【００２７】 最も好ましい実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードするＤ
ＮＡを提供し、ここで、このＤＮＡ分子は、図１に示されるようなヌクレオチド
配列または図４に示されるようなＤＮＡベクターを含む。
ＮＡを提供し、ここで、このＤＮＡ分子は、図１に示されるようなヌクレオチド
配列または図４に示されるようなＤＮＡベクターを含む。
【００２８】 本明細書中に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含
む核酸、またはその任意のフラグメント、アナログもしくは誘導体は、当該分野
で公知の任意の方法によって得られ得る。この核酸は、全体的に化学的に合成さ
れ得る。あるいは、このキメラタンパク質の各フラグメント（すなわち、第１の
ペプチジルフラグメント、第２のペプチジルフラグメントもしくは第３のペプチ
ジルフラグメント）をコードする核酸は、分子クローニングによって得られ得る
か、または所望の細胞から精製され得る。次いで、このキメラタンパク質の各フ
ラグメントをコードする核酸は、ともに化学的または酵素的に連結されて、本明
細書中に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそ
の任意のフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸を形成し得る。
む核酸、またはその任意のフラグメント、アナログもしくは誘導体は、当該分野
で公知の任意の方法によって得られ得る。この核酸は、全体的に化学的に合成さ
れ得る。あるいは、このキメラタンパク質の各フラグメント（すなわち、第１の
ペプチジルフラグメント、第２のペプチジルフラグメントもしくは第３のペプチ
ジルフラグメント）をコードする核酸は、分子クローニングによって得られ得る
か、または所望の細胞から精製され得る。次いで、このキメラタンパク質の各フ
ラグメントをコードする核酸は、ともに化学的または酵素的に連結されて、本明
細書中に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列、またはそ
の任意のフラグメント、アナログもしくは誘導体を含む核酸を形成し得る。
【００２９】 任意のＤｉｏｓｃｏｒｅｏｐｈｙｌｌｕｍ ｃｏｍｍｉｎｉｓｉｉ細胞は潜在
的に、モネリンをコードする核酸の単離のための核酸供給源として役立ち得る。
あるいは、モネリンをコードする核酸は、図１に示されるネイティブモネリンの
アミノ酸配列に従って設計および合成され得る（米国特許第５，４７８，９２３
号もまた、参照のこと）。
的に、モネリンをコードする核酸の単離のための核酸供給源として役立ち得る。
あるいは、モネリンをコードする核酸は、図１に示されるネイティブモネリンの
アミノ酸配列に従って設計および合成され得る（米国特許第５，４７８，９２３
号もまた、参照のこと）。
【００３０】 ＤＮＡは、クローニングされたＤＮＡ（例えば、ＤＮＡライブラリー）から当
該分野において公知の標準的手順によって、化学合成によって、ｃＤＮＡクロー
ニングによって、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡもしくはそのフ
ラグメントのクローニングによって、得られ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編）、１９８５、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ；
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，
Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，第Ｉ巻、第ＩＩ巻を参照のこと）。ゲノムＤＮＡ由来のク
ローンは、コード領域に加えて、調節領域およびイントロンＤＮＡ領域を含み得
；ｃＤＮＡ由来のクローンは、エキソン配列のみを含む。供給源が何であれ、こ
の遺伝子は、この遺伝子の増殖のために適切なベクター中に分子的にクローニン
グされるべきである。
該分野において公知の標準的手順によって、化学合成によって、ｃＤＮＡクロー
ニングによって、または所望の細胞から精製されたゲノムＤＮＡもしくはそのフ
ラグメントのクローニングによって、得られ得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら
、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ；Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（編）、１９８５、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ；
Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，
Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ，第Ｉ巻、第ＩＩ巻を参照のこと）。ゲノムＤＮＡ由来のク
ローンは、コード領域に加えて、調節領域およびイントロンＤＮＡ領域を含み得
；ｃＤＮＡ由来のクローンは、エキソン配列のみを含む。供給源が何であれ、こ
の遺伝子は、この遺伝子の増殖のために適切なベクター中に分子的にクローニン
グされるべきである。
【００３１】 ｃＤＮＡ由来の遺伝子の分子クローニングにおいて、ｃＤＮＡは、当該分野で
周知の方法によって、全体的に細胞性ＲＮＡまたはｍＲＮＡから生成される。こ
の遺伝子はまた、ＤＮＡフラグメントが（例えば、制限酵素を使用してか、また
は機械的剪断によって）生成される場合に、ゲノムＤＮＡから得られ得、これら
のうちのいくつかは、所望の遺伝子をコードする。次いで、線状ＤＮＡフラグメ
ントは、標準的な技術（アガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル
電気泳動ならびにカラムクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定され
ない）によって、サイズに従って分離され得る。
周知の方法によって、全体的に細胞性ＲＮＡまたはｍＲＮＡから生成される。こ
の遺伝子はまた、ＤＮＡフラグメントが（例えば、制限酵素を使用してか、また
は機械的剪断によって）生成される場合に、ゲノムＤＮＡから得られ得、これら
のうちのいくつかは、所望の遺伝子をコードする。次いで、線状ＤＮＡフラグメ
ントは、標準的な技術（アガロースゲル電気泳動およびポリアクリルアミドゲル
電気泳動ならびにカラムクロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定され
ない）によって、サイズに従って分離され得る。
【００３２】 一旦、本明細書中に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配
列を含む核酸、またはその任意のフラグメント、アナログもしくは誘導体が得ら
れると、その同一性は、核酸配列決定（当該分野で周知の任意の方法による）お
よび公知の配列との比較によって確認され得る。ＤＮＡ配列分析は、当該分野で
公知の任意の技術（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍａｘａｍおよび
Ｇｉｌｂｅｒｔ、１９８０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５：４９９〜５６
０）、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ方法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５４６３）、Ｔ７ ＤＮＡポ
リメラーゼの使用（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、米国特許第４，７
９５，６９９号）、自動化ＤＮＡ配列決定装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の使用またはＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９７／１５６９０に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない
）によって実施され得る。
列を含む核酸、またはその任意のフラグメント、アナログもしくは誘導体が得ら
れると、その同一性は、核酸配列決定（当該分野で周知の任意の方法による）お
よび公知の配列との比較によって確認され得る。ＤＮＡ配列分析は、当該分野で
公知の任意の技術（ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍａｘａｍおよび
Ｇｉｌｂｅｒｔ、１９８０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５：４９９〜５６
０）、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ方法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、７４：５４６３）、Ｔ７ ＤＮＡポ
リメラーゼの使用（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、米国特許第４，７
９５，６９９号）、自動化ＤＮＡ配列決定装置（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）の使用またはＰＣＴ公開Ｗ
Ｏ ９７／１５６９０に記載される方法が挙げられるが、これらに限定されない
）によって実施され得る。
【００３３】 本明細書中に開示されるキメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含
む核酸にハイブリダイズ可能である核酸、またはその任意のフラグメント、アナ
ログもしくは誘導体は、低いストリンジェンシー、高いストリンジェンシーまた
は中程度のストリンジェンシーの条件下での核酸ハイブリダイゼーションによっ
て単離され得る（ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：６７８９〜６７９２もまた参照のこ
と）。
む核酸にハイブリダイズ可能である核酸、またはその任意のフラグメント、アナ
ログもしくは誘導体は、低いストリンジェンシー、高いストリンジェンシーまた
は中程度のストリンジェンシーの条件下での核酸ハイブリダイゼーションによっ
て単離され得る（ＳｈｉｌｏおよびＷｅｉｎｂｅｒｇ、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：６７８９〜６７９２もまた参照のこ
と）。
【００３４】 本明細書中で使用される場合、「安定な」は、本願の一本鎖モネリンキメラタ
ンパク質が、このタンパク質が約４℃で少なくとも６ヶ月間、または約６０℃で
少なくとも２．５時間、あるいは約１００℃で少なくとも５分間置かれた後に、
その甘味強度の少なくとも７０％を保持することを意味する。さらに、「安定な
」は、本願の一本鎖モネリンキメラタンパク質が、このタンパク質が約２．０〜
約１１．０の範囲のｐＨで少なくとも６時間置かれた後に、その甘味強度の少な
くとも７０％を保持することを意味する。
ンパク質が、このタンパク質が約４℃で少なくとも６ヶ月間、または約６０℃で
少なくとも２．５時間、あるいは約１００℃で少なくとも５分間置かれた後に、
その甘味強度の少なくとも７０％を保持することを意味する。さらに、「安定な
」は、本願の一本鎖モネリンキメラタンパク質が、このタンパク質が約２．０〜
約１１．０の範囲のｐＨで少なくとも６時間置かれた後に、その甘味強度の少な
くとも７０％を保持することを意味する。
【００３５】 本願の一本鎖モネリンキメラタンパク質の甘味は、当該分野で公知の、通常の
味覚試験を使用して評価され得る。例えば、スクロースの甘味との比較は、重量
基準で、適切な希釈によってなされ得る（米国特許第５，４７８，９２３号もま
た参照のこと）。
味覚試験を使用して評価され得る。例えば、スクロースの甘味との比較は、重量
基準で、適切な希釈によってなされ得る（米国特許第５，４７８，９２３号もま
た参照のこと）。
【００３６】 酵母細胞による好ましいコドン使用頻度は、当該分野で公知の方法（例えば、
Ｓｈａｒｐら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８６、１４（１３）
：５１２５〜４３、ならびにＬｉおよびＬｕｏ、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１
９９６、１８１（２）：１１１〜２４に開示される方法）によって決定され得る
。Ｓｈａｒｐに従うと、酵母における好ましいコドンの重要な特徴としては、以
下が挙げられる：ｔＲＮＡの豊富さとの高い相関、３番目の塩基がピリジミンで
ある偏りの大きさ、およびＡ＋Ｔ塩基対になる傾向の小ささ。ＬｉおよびＬｕｏ
は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞および酵母細胞中での遺伝子発現レベルを分類および予測
する方法を開示し、この方法は、自己整合性情報クラスタリング（Ｓｅｌｆ−Ｃ
ｏｎｓｉｓｔｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ（ＳＣＩ
Ｃ））を呼ばれる。改変したコドン適合指標（ＣＡＩ）値を使用して、Ｌｉおよ
びＬｕｏは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよび酵母における、塩基組成
、塩基の相関および遺伝子発現レベルとの間の関連に関する、線形回帰分析を達
成した。ＬｉおよびＬｕｏはまた、発現増強ネットワーク部位（ＥＥＮＳ）とい
う仮定を提案した。この存在は、遺伝子発現と、コドン、隣接コドンおよび非隣
接コドンにおける塩基相関との間の一次方程式によって示され得る。さらに、Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞において異種タンパク質を発現するために首
尾良く使用されているコドンが、使用され得る。このようなコドンの例は、以下
において見出され得る：米国特許第４，８３７，１４８号；同第４，８５５，２
３１号；同第４，８８２，２７９号；同第４，９２９，５５５号；同第５，１２
２，４６５号；同第５，３２４，６３９号；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｒｕｉｚら、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．１９９８、１２（３）：３１５〜２２；Ａ
ｂｄｕｌａｅｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１９９７、１０（
１）：６１〜９；Ｋｏｔａｋｅら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９６、３７（
３）：５９９〜６０５；Ｚｈｕら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．１９９８、３５２（１）：１〜８；Ｈｅｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ．１９９８、１３９６（３）３０６〜１９；Ｆｅｒｒａｒｅｓｅ
ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８、４２２（１）２３〜６；Ｊｏｎｓｓｏｎら
、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７、３２（６）：４２５〜３０；Ｍｅｒｋｌｅ
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９７、１３３６（２）：
１３２〜４６；Ｗｕｂｂｅｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７、３６
（１４）：４３２７〜３６；Ｆｉｅｒｏｂｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕ
ｒｉｆ．１９９７、９（２）：１５９〜７０；Ｆｅｒｒａｒｉら、ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ．１９９７、４０１（１）：７３〜７；Ｓｋｏｒｙら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ
ｅｔ．１９９６、３０（５）：４１７〜２２；Ｓａｄｈｕｋｈａｎら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６、２７１（３１）：１８３１０〜３；Ｔｓｕｊｉｋａ
ｗａら、Ｙｅａｓｔ、１９９６、１２（６）：５４１〜５３；Ｏｈｉら、Ｙｅａ
ｓｔ、１９９６、１２（１）３１〜４０；Ｐａｉｆｅｒら、Ｙｅａｓｔ、１９９
４、１０（１１）：１４１５〜９；Ｆｉｄｌｅｒら、Ｊ．Ｎｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．１９９８、２１（３）３２７〜３３６；およびＢｒｏｃｃａら、Ｐｒ
ｉｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９８、７（６）：１４１５〜２２． キメラタンパク質が、抗モネリン抗体または抗タウマチン抗体によって免疫反
応結合され得るか否かは、当該分野で公知の方法によって決定され得る。本発明
において使用され得る抗モネリン抗体または抗タウマチン抗体の例としては、以
下において開示される抗体が挙げられるがこれらに限定されない：Ｓｌｏｏｔｓ
ｔｒａら、Ｃｈｅｍ．Ｓｅｎｓｅｓ、１９９５、２０（５）：５３５〜４３；Ａ
ｎｔｏｎｅｋｏおよびＺａｎｅｔｔｉ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９４、５５（１
５）：１１８７〜９２；Ｂｏｄａｎｉら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９３、１２
（２）：１７７〜８３；Ｍａｎｄａｌら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９１、１０
（４）：４５９〜６６およびＨａｉｍｏｖｉｃｈ、Ｉｓｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ
．１９７５、１１（１１）：１１８３。
Ｓｈａｒｐら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８６、１４（１３）
：５１２５〜４３、ならびにＬｉおよびＬｕｏ、Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１
９９６、１８１（２）：１１１〜２４に開示される方法）によって決定され得る
。Ｓｈａｒｐに従うと、酵母における好ましいコドンの重要な特徴としては、以
下が挙げられる：ｔＲＮＡの豊富さとの高い相関、３番目の塩基がピリジミンで
ある偏りの大きさ、およびＡ＋Ｔ塩基対になる傾向の小ささ。ＬｉおよびＬｕｏ
は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞および酵母細胞中での遺伝子発現レベルを分類および予測
する方法を開示し、この方法は、自己整合性情報クラスタリング（Ｓｅｌｆ−Ｃ
ｏｎｓｉｓｔｅｎｔ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ（ＳＣＩ
Ｃ））を呼ばれる。改変したコドン適合指標（ＣＡＩ）値を使用して、Ｌｉおよ
びＬｕｏは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよび酵母における、塩基組成
、塩基の相関および遺伝子発現レベルとの間の関連に関する、線形回帰分析を達
成した。ＬｉおよびＬｕｏはまた、発現増強ネットワーク部位（ＥＥＮＳ）とい
う仮定を提案した。この存在は、遺伝子発現と、コドン、隣接コドンおよび非隣
接コドンにおける塩基相関との間の一次方程式によって示され得る。さらに、Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞において異種タンパク質を発現するために首
尾良く使用されているコドンが、使用され得る。このようなコドンの例は、以下
において見出され得る：米国特許第４，８３７，１４８号；同第４，８５５，２
３１号；同第４，８８２，２７９号；同第４，９２９，５５５号；同第５，１２
２，４６５号；同第５，３２４，６３９号；Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｒｕｉｚら、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．１９９８、１２（３）：３１５〜２２；Ａ
ｂｄｕｌａｅｖら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１９９７、１０（
１）：６１〜９；Ｋｏｔａｋｅら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．１９９６、３７（
３）：５９９〜６０５；Ｚｈｕら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ
．１９９８、３５２（１）：１〜８；Ｈｅｉｍら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ａｃｔａ．１９９８、１３９６（３）３０６〜１９；Ｆｅｒｒａｒｅｓｅ
ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１９９８、４２２（１）２３〜６；Ｊｏｎｓｓｏｎら
、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７、３２（６）：４２５〜３０；Ｍｅｒｋｌｅ
ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１９９７、１３３６（２）：
１３２〜４６；Ｗｕｂｂｅｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７、３６
（１４）：４３２７〜３６；Ｆｉｅｒｏｂｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐ．Ｐｕ
ｒｉｆ．１９９７、９（２）：１５９〜７０；Ｆｅｒｒａｒｉら、ＦＥＢＳ Ｌ
ｅｔｔ．１９９７、４０１（１）：７３〜７；Ｓｋｏｒｙら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎ
ｅｔ．１９９６、３０（５）：４１７〜２２；Ｓａｄｈｕｋｈａｎら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６、２７１（３１）：１８３１０〜３；Ｔｓｕｊｉｋａ
ｗａら、Ｙｅａｓｔ、１９９６、１２（６）：５４１〜５３；Ｏｈｉら、Ｙｅａ
ｓｔ、１９９６、１２（１）３１〜４０；Ｐａｉｆｅｒら、Ｙｅａｓｔ、１９９
４、１０（１１）：１４１５〜９；Ｆｉｄｌｅｒら、Ｊ．Ｎｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎｏｌ．１９９８、２１（３）３２７〜３３６；およびＢｒｏｃｃａら、Ｐｒ
ｉｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１９９８、７（６）：１４１５〜２２． キメラタンパク質が、抗モネリン抗体または抗タウマチン抗体によって免疫反
応結合され得るか否かは、当該分野で公知の方法によって決定され得る。本発明
において使用され得る抗モネリン抗体または抗タウマチン抗体の例としては、以
下において開示される抗体が挙げられるがこれらに限定されない：Ｓｌｏｏｔｓ
ｔｒａら、Ｃｈｅｍ．Ｓｅｎｓｅｓ、１９９５、２０（５）：５３５〜４３；Ａ
ｎｔｏｎｅｋｏおよびＺａｎｅｔｔｉ、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１９９４、５５（１
５）：１１８７〜９２；Ｂｏｄａｎｉら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９３、１２
（２）：１７７〜８３；Ｍａｎｄａｌら、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、１９９１、１０
（４）：４５９〜６６およびＨａｉｍｏｖｉｃｈ、Ｉｓｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ
．１９７５、１１（１１）：１１８３。
【００３７】 （４．２．組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞由来のモネリンタンパ
ク質の産生） 特定の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードする核酸を含
む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を提供する。このキメラタンパク
質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下を含む：ａ）ネイティブのモネリンの
Ｂ鎖の残基１〜５０と少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる
、第１のペプチジルフラグメント（この同一性のパーセンテージは、ネイティブ
のモネリンのＢ鎖と同一なサイズのアミノ酸配列にわたって決定される）；ｂ）
ペプチジル結合か、または１〜１２アミノ酸からなる第２のペプチジルフラグメ
ント；およびｃ）ネイティブのモネリンのＡ鎖の残基１〜４５と少なくとも４０
％同一性を有するアミノ酸配列からなる、第３のペプチジルフラグメント（この
同一性のパーセンテージは、ネイティブのモネリンのＡ鎖と同一なサイズのアミ
ノ酸配列にわたって決定される）。この細胞において、このキメラタンパク質は
安定であり、そして所定量のこのキメラタンパク質は、同一量のショ糖と比較し
て少なくとも１００倍甘く、そしてその核酸中では、酵母細胞によって好ましく
使用されるコドンが、使用される。好ましくは、この組換えＰｉｃｈｉａ Ｐａ
ｓｔｒｉｓ細胞は、図１に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子または図
４に示されるＤＮＡベクターを含む。第４．１節に開示される核酸を含むＰｉｃ
ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞もまた、提供される。
ク質の産生） 特定の実施形態において、本発明は、キメラタンパク質をコードする核酸を含
む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を提供する。このキメラタンパク
質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下を含む：ａ）ネイティブのモネリンの
Ｂ鎖の残基１〜５０と少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる
、第１のペプチジルフラグメント（この同一性のパーセンテージは、ネイティブ
のモネリンのＢ鎖と同一なサイズのアミノ酸配列にわたって決定される）；ｂ）
ペプチジル結合か、または１〜１２アミノ酸からなる第２のペプチジルフラグメ
ント；およびｃ）ネイティブのモネリンのＡ鎖の残基１〜４５と少なくとも４０
％同一性を有するアミノ酸配列からなる、第３のペプチジルフラグメント（この
同一性のパーセンテージは、ネイティブのモネリンのＡ鎖と同一なサイズのアミ
ノ酸配列にわたって決定される）。この細胞において、このキメラタンパク質は
安定であり、そして所定量のこのキメラタンパク質は、同一量のショ糖と比較し
て少なくとも１００倍甘く、そしてその核酸中では、酵母細胞によって好ましく
使用されるコドンが、使用される。好ましくは、この組換えＰｉｃｈｉａ Ｐａ
ｓｔｒｉｓ細胞は、図１に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子または図
４に示されるＤＮＡベクターを含む。第４．１節に開示される核酸を含むＰｉｃ
ｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞もまた、提供される。
【００３８】 メチロトローフ酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を形質転換
するための方法、および異種タンパク質をコードする遺伝子をそのゲノム中に含
むメチロトローフ酵母細胞を培養するために適用可能な方法は、当該分野で一般
的に公知である。好ましくは、米国特許第４，８３７，１４８号；同第４，８５
５，２３１号；同第４，８８２，２７９号；同第４，９２９，５５５号；同第５
，１２２，４６５号；同第５，３２４，６３９号に開示される、形質転換、形質
転換体ポジティブ選択および培養方法が、本発明において使用され得る。
するための方法、および異種タンパク質をコードする遺伝子をそのゲノム中に含
むメチロトローフ酵母細胞を培養するために適用可能な方法は、当該分野で一般
的に公知である。好ましくは、米国特許第４，８３７，１４８号；同第４，８５
５，２３１号；同第４，８８２，２７９号；同第４，９２９，５５５号；同第５
，１２２，４６５号；同第５，３２４，６３９号に開示される、形質転換、形質
転換体ポジティブ選択および培養方法が、本発明において使用され得る。
【００３９】 別の特定の実施形態において、本発明は、モネリンキメラタンパク質を産生す
るためのプロセスを提供し、このプロセスは、図面に開示される核酸を含む組換
えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を、コードされるキメラタンパク質が細
胞によって発現されそして分泌されるように増殖させる工程、ならびにその発現
されそして分泌されたキメラタンパク質を回収する工程を包含する。好ましくは
、図１に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子または図４に示されるＤＮ
Ａベクターを含むを含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞が、使用さ
れる。
るためのプロセスを提供し、このプロセスは、図面に開示される核酸を含む組換
えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞を、コードされるキメラタンパク質が細
胞によって発現されそして分泌されるように増殖させる工程、ならびにその発現
されそして分泌されたキメラタンパク質を回収する工程を包含する。好ましくは
、図１に示されるヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子または図４に示されるＤＮ
Ａベクターを含むを含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞が、使用さ
れる。
【００４０】 当該分野において適切な任意の発酵プロセスが、本発明のプロセスにおいて使
用され得る。メチロトローフ酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）
においてＧＡＰプロモーターにより駆動される組換えＤＮＡベースの産物の大規
模産生のために、３段階の高細胞密度フェドバッチ発酵系が、好ましくは使用さ
れる。この発酵系の第１段階すなわち増殖段階において、発現宿主Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞が、過剰の非誘導性炭素源（例えば、グリセロール）を
含む、規定の最小培地（例えば、ＢＭＧＹ（緩衝化最小グリセロール複合培地）
中で培養される。この発現宿主Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞がこのよう
な炭素原上で増殖される場合、異種遺伝子発現が抑制され、これにより、異種タ
ンパク質発現の不在下での細胞塊の生成が可能になる。この増殖段階の間に、そ
の培地のｐＨが約５に維持されることがまた、好ましい。次に、この発現宿主Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、限定された非誘導性炭素源上で短い期間
増殖されて、この細胞塊がさらに増大し、そしてグルコース応答性プロモーター
が抑制される。この限定された増殖期間の間の培地のｐＨは、４未満、好ましく
は約２．０〜約３．５の範囲内に維持される。この最終段階は、「グルコース過
剰フェドバッチモード」または「混合供給フェドバッチモード」のいずれかが使
用され得る、産生段階である。この「グルコース過剰フェドバッチモード」にお
いて、２％グルコースのみが、添加される。この「混合供給フェドバッチモード
」において、限定量の非誘導性炭素源およびグルコースが発酵槽に添加されて、
ＧＡＰプロモーターにより駆動されるモネリン遺伝子の発現が誘導される。
用され得る。メチロトローフ酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）
においてＧＡＰプロモーターにより駆動される組換えＤＮＡベースの産物の大規
模産生のために、３段階の高細胞密度フェドバッチ発酵系が、好ましくは使用さ
れる。この発酵系の第１段階すなわち増殖段階において、発現宿主Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞が、過剰の非誘導性炭素源（例えば、グリセロール）を
含む、規定の最小培地（例えば、ＢＭＧＹ（緩衝化最小グリセロール複合培地）
中で培養される。この発現宿主Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞がこのよう
な炭素原上で増殖される場合、異種遺伝子発現が抑制され、これにより、異種タ
ンパク質発現の不在下での細胞塊の生成が可能になる。この増殖段階の間に、そ
の培地のｐＨが約５に維持されることがまた、好ましい。次に、この発現宿主Ｐ
ｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞は、限定された非誘導性炭素源上で短い期間
増殖されて、この細胞塊がさらに増大し、そしてグルコース応答性プロモーター
が抑制される。この限定された増殖期間の間の培地のｐＨは、４未満、好ましく
は約２．０〜約３．５の範囲内に維持される。この最終段階は、「グルコース過
剰フェドバッチモード」または「混合供給フェドバッチモード」のいずれかが使
用され得る、産生段階である。この「グルコース過剰フェドバッチモード」にお
いて、２％グルコースのみが、添加される。この「混合供給フェドバッチモード
」において、限定量の非誘導性炭素源およびグルコースが発酵槽に添加されて、
ＧＡＰプロモーターにより駆動されるモネリン遺伝子の発現が誘導される。
【００４１】 この分泌されたモネリンキメラタンパク質は、当該分野で公知の任意の方法に
よって、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養培地から回収され得る。例えば、
米国特許第３，８７８，１８４号および３，９９８，７９８号；Ｍｏｒｒｉｓお
よびＣａｇａｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９７２、２６
１：１１２〜１２２；Ｋｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９８９、２：５７
１〜５７５；そして最近では、Ｋｏｎｄｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、１９９７、１５：４５３〜４５７に開示される方法が、この分泌さ
れたモネリンキメラタンパク質を回収および単離するために使用され得る。好ま
しくは、この発現されそして分泌されたキメラタンパク質は、イオン交換クロマ
トグラフィーを含む手段によって、回収される。より好ましくは、この発現され
そして分泌されたキメラタンパク質は、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムクロマト
グラフィーまたはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィーを含む
手段によって、回収される。
よって、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ培養培地から回収され得る。例えば、
米国特許第３，８７８，１８４号および３，９９８，７９８号；Ｍｏｒｒｉｓお
よびＣａｇａｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９７２、２６
１：１１２〜１２２；Ｋｉｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９８９、２：５７
１〜５７５；そして最近では、Ｋｏｎｄｏら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ、１９９７、１５：４５３〜４５７に開示される方法が、この分泌さ
れたモネリンキメラタンパク質を回収および単離するために使用され得る。好ま
しくは、この発現されそして分泌されたキメラタンパク質は、イオン交換クロマ
トグラフィーを含む手段によって、回収される。より好ましくは、この発現され
そして分泌されたキメラタンパク質は、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムクロマト
グラフィーまたはＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィーを含む
手段によって、回収される。
【００４２】 別の特定の実施形態において、本発明は、上記のプロセスの産物を提供する。
【００４３】 （５．実施例） （５．１．合成組換えモネリンＤＮＡの調製） 組換えモネリンタンパク質のアミノ酸配列およびこの組換えモネリンタンパク
質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列が、図１に示される。図１に示される
ように、ヌクレオチド１〜１５０は、ネイティブのモネリンタンパク質のＢ鎖の
残基１〜５０をコードし；ヌクレオチド１５０〜１５２は、結合「Ｌ」部分とし
てグリシンをコードし；そしてヌクレオチド１５３〜２８７は、ネイティブモネ
リンタンパク質のＡ鎖の残基１〜４５をコードする。この組換えモネリンタンパ
ク質の後には、以下のアミノ酸配列が続く：Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（配列番号
３）。これは、Ｍｅｔ残基およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ接合フェロモンα因子のシグナル配列に対応する。
質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列が、図１に示される。図１に示される
ように、ヌクレオチド１〜１５０は、ネイティブのモネリンタンパク質のＢ鎖の
残基１〜５０をコードし；ヌクレオチド１５０〜１５２は、結合「Ｌ」部分とし
てグリシンをコードし；そしてヌクレオチド１５３〜２８７は、ネイティブモネ
リンタンパク質のＡ鎖の残基１〜４５をコードする。この組換えモネリンタンパ
ク質の後には、以下のアミノ酸配列が続く：Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−
Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−
Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−
Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ（配列番号
３）。これは、Ｍｅｔ残基およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ接合フェロモンα因子のシグナル配列に対応する。
【００４４】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合フェロモンα因子の
シグナル配列および組換えモネリンタンパク質をコードするこの合成ＤＮＡを、
オリゴＭ１〜Ｍ４およびＮ１〜Ｎ４から調製した。これらのオリゴは、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを
使用して、ＡＣＴＧカンパニーによって合成された（図２〜３および５）。この
オリゴを、尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離し、そしてＳｅ
ｐ−ｐａｋ Ｃ１８カラム（Ｗｈａｔｍａｎ）を通すことによって精製し、そし
て図３に示されるようにアニールおよび連結して、ＥｃｏＲＩ部位によって挟ま
れた、合成ＤＮＡを得た。
シグナル配列および組換えモネリンタンパク質をコードするこの合成ＤＮＡを、
オリゴＭ１〜Ｍ４およびＮ１〜Ｎ４から調製した。これらのオリゴは、Ａｐｐｌ
ｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを
使用して、ＡＣＴＧカンパニーによって合成された（図２〜３および５）。この
オリゴを、尿素−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単離し、そしてＳｅ
ｐ−ｐａｋ Ｃ１８カラム（Ｗｈａｔｍａｎ）を通すことによって精製し、そし
て図３に示されるようにアニールおよび連結して、ＥｃｏＲＩ部位によって挟ま
れた、合成ＤＮＡを得た。
【００４５】 Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合フェロモンα因子の
シグナル配列および組換えモネリンタンパク質をコードするこのＤＮＡを合成す
るために、１００μｌ ＰＣＲ反応容器中で、オリゴＭ２〜Ｎ３各々２ｐＭを、
１０ｐＭのＭ１およびＮ４と混合し、９４℃まで５分間Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ不在下で加熱した。次いで、この反応混合物を、３７℃までゆっくり冷却し
た。Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
，Ｉｎｃ．）１単位を添加した後、ＰＣＲ反応を標準的プロトコルに従って実施
した。１００μｌ ＰＣＲ反応混合物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８
．０）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、およ
び１単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを含む。ＰＣＲ反応を、以下のように
実施した：各サイクル９４℃にて１分、５３℃にて１．５分、７２℃を２分を、
計３０サイクル。最後に、この反応混合物を、７２℃で１０分間インキュベート
した。この反応混合物を、フェノール／クロロホルムにより抽出し、エタノール
を用いて沈殿し、そして１．２％低融点アガロースゲル中でゲル精製した。この
精製したＤＮＡフラグメントを、ｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ，Ｉｎｃ）中に挿入して、ｐＴ７ｙＭプラスミドを作製した（図５を参照のこ
と）。２０μｌのＤＮＡライゲーション反応において、２μｌの１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ、４０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ，Ｉｎｃ．）を添加し、そして１μｇの精製モネリンＤＮＡフラグメントおよ
び５０ｎｇのｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクターと混合した。この反応混合物を、１
６℃にて１６時間維持した。２００μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＮｏｖａＢｌｕｅコン
ピテント細胞（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、１９８３、１０１：２０〜７８）にこのライゲーション混合物５μｌを添加す
ることによって、このライゲーション混合物を宿主細胞中に形質転換し、そして
所望の配列を、Ｔ７プライマーおよびＵ１９プライマーを使用するジデオキシ配
列決定法によって確認した（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．１９８５、７４：５４６３〜５４６７） （ｌ）。
シグナル配列および組換えモネリンタンパク質をコードするこのＤＮＡを合成す
るために、１００μｌ ＰＣＲ反応容器中で、オリゴＭ２〜Ｎ３各々２ｐＭを、
１０ｐＭのＭ１およびＮ４と混合し、９４℃まで５分間Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ不在下で加熱した。次いで、この反応混合物を、３７℃までゆっくり冷却し
た。Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ
，Ｉｎｃ．）１単位を添加した後、ＰＣＲ反応を標準的プロトコルに従って実施
した。１００μｌ ＰＣＲ反応混合物は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８
．０）、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ｄＮＴＰ、およ
び１単位のＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを含む。ＰＣＲ反応を、以下のように
実施した：各サイクル９４℃にて１分、５３℃にて１．５分、７２℃を２分を、
計３０サイクル。最後に、この反応混合物を、７２℃で１０分間インキュベート
した。この反応混合物を、フェノール／クロロホルムにより抽出し、エタノール
を用いて沈殿し、そして１．２％低融点アガロースゲル中でゲル精製した。この
精製したＤＮＡフラグメントを、ｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクター（Ｎｏｖａｇｅ
ｎ，Ｉｎｃ）中に挿入して、ｐＴ７ｙＭプラスミドを作製した（図５を参照のこ
と）。２０μｌのＤＮＡライゲーション反応において、２μｌの１０ｍＭ ＡＴ
Ｐ、４０単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ，Ｉｎｃ．）を添加し、そして１μｇの精製モネリンＤＮＡフラグメントおよ
び５０ｎｇのｐＴ７ｂｌｕｅ（Ｒ）ベクターと混合した。この反応混合物を、１
６℃にて１６時間維持した。２００μｌのＥ．ｃｏｌｉ ＮｏｖａＢｌｕｅコン
ピテント細胞（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、１９８３、１０１：２０〜７８）にこのライゲーション混合物５μｌを添加す
ることによって、このライゲーション混合物を宿主細胞中に形質転換し、そして
所望の配列を、Ｔ７プライマーおよびＵ１９プライマーを使用するジデオキシ配
列決定法によって確認した（Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．１９８５、７４：５４６３〜５４６７） （ｌ）。
【００４６】 （５．２．発現ベクターｐＧＷＹＳ−１の調製） ｐＧＡＰＺａ発現ベクターを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から購入した
。合成モネリンＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩを用いてｐＴ７ｙＭｅｎａｌ
ｌｉｎから取り出し、そしてこのｐＧＡＰＺａベクターのＥｃｏＲＩ部位中に挿
入して、ｐＧＷＹＳを得た。手短には、５μｇの精製ｐＴ７ｙＭｅｎａｌｌｉｎ
プラスミドを、５単位のＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を３７℃で２
時間使用して、２０μｌの反応容量にて消化した。この反応混合物を、１％低融
点アガロースゲル電気泳動により分離した後、合成モネリンＤＮＡフラグメント
を、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｉｎｃ．）を使用して精製した。１００ｎｇの精製モネリンＤＮＡフラグメント
を、発現ｐＧＡＰＺａベクター中へのライゲーションに使用した。１０μｌのラ
イゲーション反応において、Ｅ．ｃｏｌｉで消化した５０ｎｇのｐＧＡＰＺａベ
クターを、１００ｎｇのモネリンＤＮＡフラグメントと混合した。ライゲーショ
ン反応を、１０μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴおよび２００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の存在下で、１６℃にて一晩
実施して、ｐＧＷＹＳを得た。このライゲーション混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔ
ＯＰ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中に形質転換した。２０
個のＺｅｏｃｉｎ耐性クローンを拾い、そしてそのインサートの方向を、α因子
（５’ＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣ３’）（配列番号４）およびＮ
４オリゴを使用するＰＣＲ反応によって、スクリーニングした。選択した各クロ
ーンを、２００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含む３ｍｌのＬＢ培養培地中に移し
、そして振盪しつつ３７℃にて一晩インキュベートした。この組換えプラスミド
ｐＧＷＹＳを、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｐ ２０キットシステム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．）を使用して、１．５ｍｌの培養細菌細胞から調製した。５０ｎｇの精製
ｐＧＷＹＳプラスミドをＰＣＲテンプレートとして使用して、そのインサートの
方向を決定した。２５μｌのＰＣＲ反応において、５０ｎｇのｐＧＷＹＳプラス
ミドを、１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）の
存在下で、２．５ｐＭのα因子およびＮ４オリゴと混合した。ＰＣＲ反応を、以
下の条件下で実施した：各サイクル９４℃にて１分、５５℃にて１分、７２℃に
て２分を、合計４０サイクル。最後に、この反応混合物を、７２℃で１０分間イ
ンキュベートした。このＰＣＲ反応混合物を、１．２％アガロースゲル上で分離
した後、所望の方向でインサートを含むクローンのうちの１つを、ｐＧＷＹＳ−
１と名付けた。このインサートの配列を、ＤＮＡ配列決定法によってさらに確認
した。
。合成モネリンＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩを用いてｐＴ７ｙＭｅｎａｌ
ｌｉｎから取り出し、そしてこのｐＧＡＰＺａベクターのＥｃｏＲＩ部位中に挿
入して、ｐＧＷＹＳを得た。手短には、５μｇの精製ｐＴ７ｙＭｅｎａｌｌｉｎ
プラスミドを、５単位のＥｃｏＲＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．）を３７℃で２
時間使用して、２０μｌの反応容量にて消化した。この反応混合物を、１％低融
点アガロースゲル電気泳動により分離した後、合成モネリンＤＮＡフラグメント
を、Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，
Ｉｎｃ．）を使用して精製した。１００ｎｇの精製モネリンＤＮＡフラグメント
を、発現ｐＧＡＰＺａベクター中へのライゲーションに使用した。１０μｌのラ
イゲーション反応において、Ｅ．ｃｏｌｉで消化した５０ｎｇのｐＧＡＰＺａベ
クターを、１００ｎｇのモネリンＤＮＡフラグメントと混合した。ライゲーショ
ン反応を、１０μｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ
ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴおよび２００単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅ
ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の存在下で、１６℃にて一晩
実施して、ｐＧＷＹＳを得た。このライゲーション混合物を、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔ
ＯＰ１０Ｆ’細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）中に形質転換した。２０
個のＺｅｏｃｉｎ耐性クローンを拾い、そしてそのインサートの方向を、α因子
（５’ＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣ３’）（配列番号４）およびＮ
４オリゴを使用するＰＣＲ反応によって、スクリーニングした。選択した各クロ
ーンを、２００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含む３ｍｌのＬＢ培養培地中に移し
、そして振盪しつつ３７℃にて一晩インキュベートした。この組換えプラスミド
ｐＧＷＹＳを、Ｑｉａｇｅｎ Ｔｉｐ ２０キットシステム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉ
ｎｃ．）を使用して、１．５ｍｌの培養細菌細胞から調製した。５０ｎｇの精製
ｐＧＷＹＳプラスミドをＰＣＲテンプレートとして使用して、そのインサートの
方向を決定した。２５μｌのＰＣＲ反応において、５０ｎｇのｐＧＷＹＳプラス
ミドを、１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）の
存在下で、２．５ｐＭのα因子およびＮ４オリゴと混合した。ＰＣＲ反応を、以
下の条件下で実施した：各サイクル９４℃にて１分、５５℃にて１分、７２℃に
て２分を、合計４０サイクル。最後に、この反応混合物を、７２℃で１０分間イ
ンキュベートした。このＰＣＲ反応混合物を、１．２％アガロースゲル上で分離
した後、所望の方向でインサートを含むクローンのうちの１つを、ｐＧＷＹＳ−
１と名付けた。このインサートの配列を、ＤＮＡ配列決定法によってさらに確認
した。
【００４７】 （５．３．ｐＧＷＹＳ−１によるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞の形質
転換） Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるモネリンの高レベルかつ安定な発現
を生じるために、精製ｐＧＷＹＳ−１プラスミドを、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌに記載のエレクトロポレ
ーション技術によって、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ａｐｐａｒａｔｕｓ
ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）を使用して、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ細胞中に形質転換した。簡潔には、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
ＧＳ１１５細胞５００ｍｌを、３０℃のＹＰＤ培地にて、ＯＤ600＝１．３ま
で増殖させた。細胞を、１，５００ｇ、４℃で５分の遠心分離によって、ペレッ
トにした。ペレットになった細胞を、氷冷滅菌水５００ｍｌで洗浄した。この洗
浄工程を、それぞれ氷冷滅菌水２５０ｍｌおよび２０ｍｌで繰り返した。次いで
、この細胞を氷冷１Ｍソルビトール２０ｍｌで洗浄し、そして氷冷ソルビトール
１ｍｌ中に再懸濁した。１Ｍソルビトール中の酵母ＧＳ１１５細胞４０μｌを、
精製ｐＧＷＹＳ−１プラスミド１０μｇと混合して総容量５０μｌにし、そして
この混合物を氷冷キュベット中に移した。この混合物を含むキュベットを、氷上
で５分間インキュベートした。エレクトロポレーションを、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ
ｒａｔｉｏｎ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＩＩマニュアルのパラメーター（Ｉｎｖｉ
ｔｏｒｇｅｎ Ｉｎｃ．製造）に従って実施した。電気パルスの後、氷冷１Ｍソ
ルビトール１ｍｌをこのキュベット中に添加し、そしてこのキュベットの内容物
を微小遠心管中に移した。形質転換細胞２００μｌを、４００μｇ／ｍｌのＺｅ
ｏｃｉｎを含む５ ＲＤＢプレート１枚上にプレーティングした。このプレート
を、３０℃にて、コロニーが出現するまでインキュベートした。陽性の形質転換
体を、種々の濃度（例えば、４００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、８００μｇ
／ｍｌおよび１０００μｇ／ｍｌ）のＺｅｏｃｉｎの存在下での増殖によって、
特徴付けた。
転換） Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるモネリンの高レベルかつ安定な発現
を生じるために、精製ｐＧＷＹＳ−１プラスミドを、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏ
ｒｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ Ｍａｎｕａｌに記載のエレクトロポレ
ーション技術によって、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ａｐｐａｒａｔｕｓ
ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）を使用して、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓ
ｔｏｒｉｓ細胞中に形質転換した。簡潔には、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
ＧＳ１１５細胞５００ｍｌを、３０℃のＹＰＤ培地にて、ＯＤ600＝１．３ま
で増殖させた。細胞を、１，５００ｇ、４℃で５分の遠心分離によって、ペレッ
トにした。ペレットになった細胞を、氷冷滅菌水５００ｍｌで洗浄した。この洗
浄工程を、それぞれ氷冷滅菌水２５０ｍｌおよび２０ｍｌで繰り返した。次いで
、この細胞を氷冷１Ｍソルビトール２０ｍｌで洗浄し、そして氷冷ソルビトール
１ｍｌ中に再懸濁した。１Ｍソルビトール中の酵母ＧＳ１１５細胞４０μｌを、
精製ｐＧＷＹＳ−１プラスミド１０μｇと混合して総容量５０μｌにし、そして
この混合物を氷冷キュベット中に移した。この混合物を含むキュベットを、氷上
で５分間インキュベートした。エレクトロポレーションを、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏ
ｒａｔｉｏｎ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＩＩマニュアルのパラメーター（Ｉｎｖｉ
ｔｏｒｇｅｎ Ｉｎｃ．製造）に従って実施した。電気パルスの後、氷冷１Ｍソ
ルビトール１ｍｌをこのキュベット中に添加し、そしてこのキュベットの内容物
を微小遠心管中に移した。形質転換細胞２００μｌを、４００μｇ／ｍｌのＺｅ
ｏｃｉｎを含む５ ＲＤＢプレート１枚上にプレーティングした。このプレート
を、３０℃にて、コロニーが出現するまでインキュベートした。陽性の形質転換
体を、種々の濃度（例えば、４００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、８００μｇ
／ｍｌおよび１０００μｇ／ｍｌ）のＺｅｏｃｉｎの存在下での増殖によって、
特徴付けた。
【００４８】 （５．４．陽性形質転換体の安定性試験） ３つの陽性形質転換体を選択して、８００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎ存在下で
の増殖、および２％グルコース誘導による組換えモネリンの発現に基づいてさら
に特徴付けた。以下の実験を行って、それらの遺伝子の安定性を試験した。これ
ら３つの形質転換体各々を、滅菌爪楊枝を使用して拾い、そしてコロニーが出現
するまで、いかなる選択も行わずに３０℃にてＹＰＤプレート上でインキュベー
トした。これらのコロニーを拾い、そして新しいコロニーが出現するまで、新た
なＹＰＤ培地上にプレートした。このような非選択増殖を５０回反復した後、継
代コロニー各々を、８００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含む選択プレート上でイ
ンキュベートした。２％グルコース誘導によるタンパク質発現を、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分析した。これらの３つすべての陽性形質転換体は、ＹＰＤプレー
ト上での５０回の継代の後に、もとのコロニーと同じ表現型を示した。
の増殖、および２％グルコース誘導による組換えモネリンの発現に基づいてさら
に特徴付けた。以下の実験を行って、それらの遺伝子の安定性を試験した。これ
ら３つの形質転換体各々を、滅菌爪楊枝を使用して拾い、そしてコロニーが出現
するまで、いかなる選択も行わずに３０℃にてＹＰＤプレート上でインキュベー
トした。これらのコロニーを拾い、そして新しいコロニーが出現するまで、新た
なＹＰＤ培地上にプレートした。このような非選択増殖を５０回反復した後、継
代コロニー各々を、８００μｇ／ｍｌのＺｅｏｃｉｎを含む選択プレート上でイ
ンキュベートした。２％グルコース誘導によるタンパク質発現を、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによって分析した。これらの３つすべての陽性形質転換体は、ＹＰＤプレー
ト上での５０回の継代の後に、もとのコロニーと同じ表現型を示した。
【００４９】 （５．５．組換えモネリンタンパク質の産生） ５．４において選択した３つの陽性形質転換体各々を、５リットルフラスコ中
にある１リットルのＹＰＤ培地にて、激しく振盪しつつ（２５０ｒｐｍ）３０℃
にて増殖させた。それぞれ２４時間後、４８時間後、そして７２時間後に、２ｍ
ｌの上清を培養物から得た。各時点で収集したサンプルのうちの５μｌを、１５
〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲルを使用して分析した。分泌された組換えモ
ネリンタンパク質が、１２ｋＤのタンパク質バンドとして観察された。Ｄｅｎｓ
ｉｔｏｍｅｔｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用し
てのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の定量により、陽性株のうちの１つが、ほぼ１０グラ
ム／リットルの分泌された組換え単鎖モネリンタンパク質を産生したことが示さ
れる。この株を、ＧＷｙＳ１と名付けた。
にある１リットルのＹＰＤ培地にて、激しく振盪しつつ（２５０ｒｐｍ）３０℃
にて増殖させた。それぞれ２４時間後、４８時間後、そして７２時間後に、２ｍ
ｌの上清を培養物から得た。各時点で収集したサンプルのうちの５μｌを、１５
〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲルを使用して分析した。分泌された組換えモ
ネリンタンパク質が、１２ｋＤのタンパク質バンドとして観察された。Ｄｅｎｓ
ｉｔｏｍｅｔｒｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃ，Ｉｎｃ．）を使用し
てのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の定量により、陽性株のうちの１つが、ほぼ１０グラ
ム／リットルの分泌された組換え単鎖モネリンタンパク質を産生したことが示さ
れる。この株を、ＧＷｙＳ１と名付けた。
【００５０】 （５．６．分泌された組換えモネリンタンパク質の精製） タンパク質法を使用して、ＧｗｙＳ−１酵母株から分泌された組換えモネリン
タンパク質を精製した。第１の方法に従って、７２時間培養の後に、上清を、１
２，０００ｒｐｍ（１７，０００ｇ）での遠心分離によって収集した。収集後、
上清のｐＨを、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液を使用して、約６．８に調整した。１Ｍ
のＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．８）を１：１００（ｖ／ｖ）になるま
でこの上清に添加し、そして十分混合した。次いで、この上清を、０．０１Ｍ
ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．８）溶液で事前に平衡化した、ＣＭ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）上にロードした。この
カラムを、５カラム容量の０．１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．８
）溶液で洗浄した後、０．３Ｍ ＮａＣｌ−０．０１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2
ＨＰＯ4（ｐＨ６．８）溶液で組換えモネリンタンパク質を溶出した。水に対す
る透析の後、このタンパク質の純度をゲル電気泳動によって決定すると、約９８
％であった。
タンパク質を精製した。第１の方法に従って、７２時間培養の後に、上清を、１
２，０００ｒｐｍ（１７，０００ｇ）での遠心分離によって収集した。収集後、
上清のｐＨを、０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液を使用して、約６．８に調整した。１Ｍ
のＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．８）を１：１００（ｖ／ｖ）になるま
でこの上清に添加し、そして十分混合した。次いで、この上清を、０．０１Ｍ
ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．８）溶液で事前に平衡化した、ＣＭ−Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）上にロードした。この
カラムを、５カラム容量の０．１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ６．８
）溶液で洗浄した後、０．３Ｍ ＮａＣｌ−０．０１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2
ＨＰＯ4（ｐＨ６．８）溶液で組換えモネリンタンパク質を溶出した。水に対す
る透析の後、このタンパク質の純度をゲル電気泳動によって決定すると、約９８
％であった。
【００５１】 第２の方法に従って、７２時間培養の後、上清を、１２，０００ｒｐｍ（１７
，０００ｇ）での遠心分離によって収集した。収集後、上清のｐＨを、０．１Ｎ
ＮａＯＨ溶液を使用して、約７．２に調整した。１Ｍ ＮａＣｌ−１Ｍ Ｎａ
Ｈ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．２）を１：１００（ｖ／ｖ）になるまでこの
上清に添加し、そして十分混合した。次いで、この上清を、１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4 −Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．２）−１Ｍ溶液で事前に平衡化した、ＤＥＡＥ−Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）上にロードした。そのフ
ロースルー画分を収集し、そして水に対して透析した。このタンパク質の純度を
ゲル電気泳動によって決定すると、約９８％であった。
，０００ｇ）での遠心分離によって収集した。収集後、上清のｐＨを、０．１Ｎ
ＮａＯＨ溶液を使用して、約７．２に調整した。１Ｍ ＮａＣｌ−１Ｍ Ｎａ
Ｈ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．２）を１：１００（ｖ／ｖ）になるまでこの
上清に添加し、そして十分混合した。次いで、この上清を、１Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4 −Ｎａ2ＨＰＯ4（ｐＨ７．２）−１Ｍ溶液で事前に平衡化した、ＤＥＡＥ−Ｓｅ
ｐｈａｄｅｘカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．）上にロードした。そのフ
ロースルー画分を収集し、そして水に対して透析した。このタンパク質の純度を
ゲル電気泳動によって決定すると、約９８％であった。
【００５２】 いずれの方法に従って精製した組換えモネリンタンパク質も、さらに凍結乾燥
して、その甘味を試験するための乾燥粉末にした。
して、その甘味を試験するための乾燥粉末にした。
【００５３】 （５．７．甘味および安定性の試験） この精製組換えモネリンタンパク質の甘味を、通常の食味試験を使用して評価
した。ショ糖の甘味との比較を、重量ベースでの適切な希釈によって行った。代
表的試験において、１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌおよび５０
ｍｇ／ｍｌのショ糖水溶液を、標準溶液として使用した。甘味を生じ得た精製組
換えモネリンタンパク質の最小重量を、ショ糖の最小重量と比較した。本発明の
モネリンは、ショ糖の量の約１０００分の１である量の添加を要する。例えば、
５０ｎｇ／ｍｌの組換えモネリンタンパク質溶液は、５０ｍｇ／ｍｌのショ糖（
Ｌｕｃｋｙ ＳｕｐｅｒｍａｒｋｅｔのＬａｄｙ Ｌｅｅブランドの砂糖）と同
じ程度に甘かった。
した。ショ糖の甘味との比較を、重量ベースでの適切な希釈によって行った。代
表的試験において、１ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２５ｍｇ／ｍｌおよび５０
ｍｇ／ｍｌのショ糖水溶液を、標準溶液として使用した。甘味を生じ得た精製組
換えモネリンタンパク質の最小重量を、ショ糖の最小重量と比較した。本発明の
モネリンは、ショ糖の量の約１０００分の１である量の添加を要する。例えば、
５０ｎｇ／ｍｌの組換えモネリンタンパク質溶液は、５０ｍｇ／ｍｌのショ糖（
Ｌｕｃｋｙ ＳｕｐｅｒｍａｒｋｅｔのＬａｄｙ Ｌｅｅブランドの砂糖）と同
じ程度に甘かった。
【００５４】 安定性を、１００μｇ／ｍｌの濃度の天然のモネリン（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．
）および精製組換えモネリンタンパク質を、ｐＨ２．０、ｐＨ４．０、ｐＨ６．
３およびｐＨ７．５にて溶解することによって測定した。各サンプルを、３７℃
、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃および１００℃まで１５分間加熱し
、そして試験する前に室温まで冷ました。最も劇的な差異は、天然モネリンが、
ｐＨ２．０にて５０℃まで加熱した場合に、その甘味を失ったが、精製組換えモ
ネリンタンパク質は、１００℃にて５分間加熱した後でさえ、その甘味を保持し
たことであった。
）および精製組換えモネリンタンパク質を、ｐＨ２．０、ｐＨ４．０、ｐＨ６．
３およびｐＨ７．５にて溶解することによって測定した。各サンプルを、３７℃
、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃および１００℃まで１５分間加熱し
、そして試験する前に室温まで冷ました。最も劇的な差異は、天然モネリンが、
ｐＨ２．０にて５０℃まで加熱した場合に、その甘味を失ったが、精製組換えモ
ネリンタンパク質は、１００℃にて５分間加熱した後でさえ、その甘味を保持し
たことであった。
【００５５】 本発明は、寄託された微生物または本明細書中に記載される特定の実施形態に
よって、範囲は限定されない。実際には、本明細書中に記載の改変形に加えて本
発明の種々の改変形が、上記の記載および添付の図面から、当業者に明らかにな
る。このような改変形は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図され
る。
よって、範囲は限定されない。実際には、本明細書中に記載の改変形に加えて本
発明の種々の改変形が、上記の記載および添付の図面から、当業者に明らかにな
る。このような改変形は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることが意図され
る。
【００５６】 種々の参考文献が本明細書中で引用されている。これらの開示は、その全体が
、参考として援用される。
、参考として援用される。
【図１】 図１は、組換え一本鎖モネリンタンパク質のアミノ酸配列およびこの組換え一
本鎖モネリンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。アミノ酸残基１〜５０
は、ネイティブモネリンのＢ鎖のアミノ酸残基１〜５０に対応し；アミノ酸残基
５１は、リンカーとしてのグリシンであり；そしてアミノ酸残基５２〜９６は、
ネイティブモネリンのＡ鎖のアミノ酸残基１〜４５に対応する。
本鎖モネリンタンパク質をコードするＤＮＡ配列を示す。アミノ酸残基１〜５０
は、ネイティブモネリンのＢ鎖のアミノ酸残基１〜５０に対応し；アミノ酸残基
５１は、リンカーとしてのグリシンであり；そしてアミノ酸残基５２〜９６は、
ネイティブモネリンのＡ鎖のアミノ酸残基１〜４５に対応する。
【図２】 図２は、組換え一本鎖モネリンタンパク質の合成のために使用されたオリゴの
ＤＮＡ配列を示す。
ＤＮＡ配列を示す。
【図３】 図３は、合成されたモネリンＤＮＡにおける各ＤＮＡオリゴおよびその酵素的
消化部位の位置を示す。
消化部位の位置を示す。
【図４】 図４は、組換えモネリンタンパク質発現ベクターｐＧＷＹＳ１の制限マップを
示す。
示す。
【図５】 図５は、ｐＧＷＹＳ１の構築を示す。
【図６】 図６は、培養培地から単離された、分泌された組換えモネリンタンパク質のＳ
ＧＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
ＧＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図７Ａ】 図７Ａは、分泌された組換えモネリンタンパク質を精製するための工程を示す
。
。
【図７Ｂ】 図７Ｂは、分泌された組換えモネリンタンパク質を精製するための工程を示す
。
。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ドュアン， リンクスン アメリカ合衆国 ペンシルベニア 19454， エヌ．ウェールズ， グイネド リー ドライブ 130 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA80 CA04 DA12 EA04 GA11 HA01 4B064 AG01 CA06 CA19 CC24 DA10 4B065 AA77X AA99Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA41 4H045 AA10 AA20 BA10 BA41 CA30 EA02 FA74 GA23
Claims (49)
- 【請求項１】 キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離
された核酸であって、該キメラタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以
下： ａ）ネイティブなモネリンのＢ鎖の残基１〜５０に対して少なくとも４０％同
一性を有するアミノ酸配列からなる第１のペプチジルフラグメントであって、こ
こで該％同一性は、該ネイティブなモネリンのＢ鎖と同一のサイズのアミノ酸配
列にわたって決定される、第１のペプチジルフラグメント； ｂ）ペプチジル結合、または１〜１２個のアミノ酸からなる第２のペプチジル
フラグメント；および ｃ）ネイティブなモネリンのＡ鎖の残基１〜４５に対して少なくとも４０％同
一性を有するアミノ酸配列からなる第３のペプチジルフラグメントであって、こ
こで該％同一性は、該ネイティブなモネリンのＡ鎖と同一のサイズのアミノ酸配
列にわたって決定される、第３のペプチジルフラグメント、 を含み、ここで、該キメラタンパク質は安定であり、そして所定の量の該キメラ
タンパク質は、同一量のスクロースと比較した場合に少なくとも１００倍甘く、
そして該核酸において、酵母細胞により優先的に使用されるコドンが使用される
、単離された核酸。 - 【請求項２】 前記第１のペプチジルフラグメントが、前記ネイティブなモ
ネリンのＢ鎖に対して少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列からなる、
請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項３】 前記第１のペプチジルフラグメントが、前記ネイティブなモ
ネリンのＢ鎖に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列からなる、
請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項４】 前記第１のペプチジルフラグメントが、図１（配列番号５）
においてアミノ酸残基１〜５０として示される前記ネイティブなモネリンのＢ鎖
のアミノ酸残基１〜５０からなる、請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項５】 前記第２のペプチジルフラグメントが、アミノ酸残基Ｇｌｙ
からなる、請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項６】 前記第２のペプチジルフラグメントが、アミノ酸配列Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号２）からなる、請求項１に記載の単離され
た核酸。 - 【請求項７】 前記第２のペプチジルフラグメントが、アミノ酸配列Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号１）からなる、請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項８】 前記第３のペプチジルフラグメントが、前記ネイティブなモ
ネリンのＡ鎖に対して少なくとも６０％同一性を有するアミノ酸配列からなる、
請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項９】 前記第３のペプチジルフラグメントが、前記ネイティブなモ
ネリンのＡ鎖に対して少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列からなる、
請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項１０】 前記第３のペプチジルフラグメントが、図１（配列番号５
）においてアミノ酸残基５２〜９６として示される前記ネイティブなモネリンの
Ａ鎖のアミノ酸残基１〜４５からなる、請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項１１】 図１（配列番号５）のアミノ酸残基１〜９６をコードする
、請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項１２】 前記キメラタンパク質が、抗モネリン抗体によって免疫反
応的に結合され得る、請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項１３】 前記キメラタンパク質が、抗タウマチン抗体によって免疫
反応的に結合され得る、請求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項１４】 前記キメラタンパク質がさらに、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓからの該キメラタンパク質の分泌を指向し得るアミノ酸配列を含む、請
求項１に記載の単離された核酸。 - 【請求項１５】 前記分泌を指向する配列が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓの内因性シグナル配列である、請求項１４に記載の単離された核酸。 - 【請求項１６】 前記内因性シグナル配列が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓ酸性ホスファターゼ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアスパラギン酸プロ
テイナーゼ、およびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ＰＲＣ１によってコード
されるＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓカルボキシペプチダーゼＹのシグナル配
列からなる群から選択される、請求項１５に記載の単離された核酸。 - 【請求項１７】 前記分泌を指向する配列が、酵母シグナル配列であり、該
酵母が、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓではない、請求項１４に記載の単離さ
れた核酸。 - 【請求項１８】 前記酵母シグナル配列が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のシグナル配列である、請求項１７に記載の単離され
た核酸。 - 【請求項１９】 前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
シグナル配列が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＳＵＣ
２およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合フェロモン
α因子のシグナル配列からなる群から選択される、請求項１８に記載の単離され
た核酸。 - 【請求項２０】 前記Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
シグナル配列が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合フェ
ロモンα因子のシグナル配列である、請求項１９に記載の単離された核酸。 - 【請求項２１】 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓからの前記キメラタンパ
ク質の分泌を指向し得るアミノ酸配列をさらに含む、請求項１１に記載の単離さ
れた核酸。 - 【請求項２２】 前記分泌を指向する配列が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合フェロモンα因子のシグナル配列である、請求項２
１に記載の単離された核酸。 - 【請求項２３】 請求項１４に記載の単離された核酸であって、前記分泌を
指向する配列が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｉｇａｎｔｅｕｓのα−Ｓａｒｃ
ｉｎ、α−Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、ＯｍｐＡタンパク質、マウスの
α因子（ｃＣｅｌｌ）、コショウのエンド−β−１，４−グルカナーゼ、リグニ
ン溶解性真菌Ｔｒａｍｅｔｅｓから単離されたラッカーゼ、マウスのリソソーム
酸性α−マンノシダーゼ、ブタのカルボニックアンヒドラーゼのインヒビター、
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉのグルコアミラーゼ、マウスの主要尿
タンパク質、ｐｈｏ１、ウサギのアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）、および
細菌の熱安定性αアミラーゼのシグナル配列からなる群から選択される、核酸。 - 【請求項２４】 ＤＮＡである、請求項１に記載の核酸。
- 【請求項２５】 請求項１に記載のヌクレオチド配列に対して相補的なヌク
レオチド配列を含む、単離された核酸。 - 【請求項２６】 請求項２４に記載のＤＮＡ配列にハイブリダイズし得る、
単離された核酸。 - 【請求項２７】 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタンパク質の発
現を指向し得るプロモーターをさらに含む、請求項２４に記載のＤＮＡ。 - 【請求項２８】 前記プロモーターが、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの
内因性プロモーターである、請求項２７に記載のＤＮＡ。 - 【請求項２９】 前記内因性プロモーターが、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒ
ｉｓグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターである、
請求項２８に記載のＤＮＡ。 - 【請求項３０】 請求項２４に記載のＤＮＡであって、該ＤＮＡは、図１（
配列番号５）のアミノ酸残基１〜９６をコードし、そして該ＤＮＡは、Ｐｉｃｈ
ｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼのプ
ロモーターおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ接合フェ
ロモンα因子のシグナル配列をさらに含む、ＤＮＡ。 - 【請求項３１】 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞により優先的に使用
されるコドンが使用される、請求項２４に記載のＤＮＡ。 - 【請求項３２】 図１に示されるようなヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ分
子。 - 【請求項３３】 図４に示されるような、ｐＧＷＹＳ１ ＤＮＡベクター。
- 【請求項３４】 請求項１に記載の核酸を含む、組換えＰｉｃｈｉａ ｐａ
ｓｔｏｒｉｓ細胞。 - 【請求項３５】 請求項３２に記載のＤＮＡを含む、組換えＰｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞。 - 【請求項３６】 請求項３３に記載のＤＮＡを含む、組換えＰｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞。 - 【請求項３７】 キメラタンパク質を産生するプロセスであって、該プロセ
スは、請求項１に記載の核酸を含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞
を増殖させ、その結果、コードされるキメラタンパク質が、該細胞により発現お
よび分泌される工程、ならびに該発現および分泌されたキメラタンパク質を回収
する工程、を包含する、プロセス。 - 【請求項３８】 キメラタンパク質を産生するプロセスであって、該プロセ
スは、請求項３２に記載のＤＮＡを含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
細胞を増殖させ、その結果、コードされるキメラタンパク質が、該細胞により発
現および分泌される工程、ならびに該発現および分泌されたキメラタンパク質を
回収する工程、を包含する、プロセス。 - 【請求項３９】 キメラタンパク質を産生するプロセスであって、該プロセ
スは、請求項３３に記載のＤＮＡを含む組換えＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
細胞を増殖させ、その結果、コードされるキメラタンパク質が該細胞により発現
および分泌される工程、ならびに該発現および分泌されたキメラタンパク質を回
収する工程、を包含する、プロセス。 - 【請求項４０】 前記発現および分泌されたキメラタンパク質を、イオン交
換クロマトグラフィーを含む手段によって回収する、請求項３７に記載のプロセ
ス。 - 【請求項４１】 使用される前記イオン交換クロマトグラフィーが、ＣＭ−
Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィーである、請求項４０に記載のプロセ
ス。 - 【請求項４２】 使用される前記イオン交換クロマトグラフィーが、ＤＥＡ
Ｅ−Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムクロマトグラフィーである、請求項４０に記載のプ
ロセス。 - 【請求項４３】 請求項３７に記載のプロセスの産物。
- 【請求項４４】 請求項３８に記載のプロセスの産物。
- 【請求項４５】 請求項３９に記載のプロセスの産物。
- 【請求項４６】 請求項４０に記載のプロセスの産物。
- 【請求項４７】 請求項４１に記載のプロセスの産物。
- 【請求項４８】 請求項４２に記載のプロセスの産物。
- 【請求項４９】 キメラタンパク質であって、該キメラタンパク質は、Ｎ末
端からＣ末端に向かって、以下： ａ）ネイティブなモネリンのＢ鎖の残基１〜５０に対して少なくとも４０％同
一性を有するアミノ酸配列からなる第１のペプチジルフラグメントであって、こ
こで該％同一性は、該ネイティブなモネリンのＢ鎖と同一のサイズのアミノ酸配
列にわたって決定される、第１のペプチジルフラグメント； ｂ）ペプチジル結合、または１〜１２個のアミノ酸からなる第２のペプチジル
フラグメント；および ｃ）ネイティブなモネリンのＡ鎖の残基１〜４５に対して少なくとも４０％同
一性を有するアミノ酸配列からなる第３のペプチジルフラグメントであって、こ
こで該％同一性は、該ネイティブなモネリンのＡ鎖と同一のサイズのアミノ酸配
列にわたって決定される、第３のペプチジルフラグメント、 を含み、ここで、該キメラタンパク質は安定であり、そして所定の量の該キメラ
タンパク質は、同一量のスクロースと比較した場合に少なくとも１００倍甘く、
そして該核酸において、酵母細胞により優先的に使用されるコドンが使用される
、キメラタンパク質。
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