JPH0191787A - バーソレティアエクセルサｈ．ｂ．ｋ．の高イオウタンパク - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は植物および植物タンパクに関する。さらに詳細
には１本発明は植物バーツレティア　エクセルサ（Ｂｅ
ｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ　　ｅｘｃｅｌｓａ　）１１．Ｂ
．Ｋ．の高イオウタンパク、および該タンパクによる高
等植物のような生物の栄養価の増大に関する。

（従来の技術） バーツレティア　エクセルサＨ，８，４（、（ブラジル
ナツツ）の種子は、アマシン流域の主要な輸出品である
。ブラジルナツツの種子貯蔵タンパクは。

通常含量アミノ酸の含量が高く（重量当り約８．３％）
。

おそら（これらの必須アミノ酸が最も高い食品である。

ブラジルナツツの全タンパクは、　ＩＩＳ、　７Ｓ。

および２Ｓタンパクの３つの大きさのクラスに分けられ
る水溶性でありアルブミンに分類される２Ｓ画分は、全
タンパクの約３０％を占め、含量アミノ酸が非常に多い
；約１７％メチオニンおよび１３％システィン（Ｙｏｕ
ｌｅおよびＩｌｕａｕｇ（１９８１）　、　Ａｍ、　Ｊ
、Ｂｏｔ。

朋：４４−４８）。

多くの植物タンパク、特にマメ科植物のタンパクは、必
須含量アミノ酸（メチオニンおよびシスナイン）が不足
している。ブラジルナツツのタンパクは、これらの不足
を補うことができる。例えば、脱脂ブラジルナツツ粉は
白インゲン豆の不十分なタンパクの質を補うのに用いら
れ得る（Ａｎ　ｔｕｎｅｓら（１９７７）、　Ｊ、八ｇ
ｒｉｃ　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、　２５：１０９６）。バ
ーツレティア　エクセルサの高イオウタンパクに関する
情報の増加は、含量アミノ酸が不足している植物（およ
びその他の起Ｂ）のタンパク源の栄養価を改善する方法
を提供し得る。

他の種子貯蔵タンパクがクローン化され、異種植物で発
現されている。例えば、フォセオルスブルガリス（Ｐｈ
ａｓｅｏｌｕｓ　　鳳江肛旦；フランスマメ）の種子貯
蔵タンパクがクローン化され、異種植物においてそれ自
身のプロモータおよび異種のプロモータの制御下で発現
されている。例えば。

Ｍｕｒａｉら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２：４
７６；Ｓｅｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎら（１９８５）
　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ　８２：３３２０；欧州特許公開第１２６，５４６
号；欧州特許公開第１２２，７９１号を参照のこと。

以下の報告も興味が持たれ得る：　Ｓｕｎら（１９Ｂ７
）Ｊ、　Ａｇｒｉｃ、　Ｆｏｏｄ　Ｃｈｅｍ、　３５：
２３２−２３５；　Ｓｕｎら（１９８７）Ｅｕｒｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１６２　：４７７−４８３；　Ａｌ
ｔｅｎｂａｃｈ　ら（１９８７）Ｐｌａｎｔ　　Ｍｏ１
．　　Ｂｉｏｌ、８　　：２３９−２５０；　　八ｍｐ
ｅら（１９８６）　　Ｅｕｒ。

Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１５９：５９７−６０４；　Ｃ
ａ５ｔｒｏら（１９８７）　Ｍｏｌ。

Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２０６：３３８−３４３；Ｓ
ｕｎら（１９８３）　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　７Ｂ：２７８Ｈ５ｕｎら（１９８４）　Ｐ
ｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ、　５ｕｐｌ）、７５：６４；＾１
ｄｅｎｂａｃｈら（同上）ＨＳｕｎらＵＳ−八ｕｓｔｒ
ａｌｉａＳｅｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ
（Ｆｅｄ、　　１１−１５＋　　１９８５）；Ａｌｔｅ
ｎｂａｃｈら（１９８５）　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ、　　９Ｃ：２１２ＨＡｌｔｅｎｂａｃｈら（
１９８７）　Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、月Ｂ
：４９ＨＴａｏら（１９８７）Ｆｅｄ、Ｐｒｏｃ、　　
４６：８９１゜（発明の要旨） 本発明は、高等植物を包含するがこれに限定されない食
用の生物の、栄養価の改善を提供する。

特に３本発明はバーツレティア　エクセルサ）１．Ｂ。

Ｋ、の種子の高イオウタンパクおよび該高イオウタンパ
クをコードする核酸配列の導入を提供する。

ある１つの実施態様においては１本発明は２例えば、１
またはそれ以上のバーツレティア　エクセルサ１１．Ｂ
．Ｋ．の高イオウ２Ｓ種子貯蔵タンパクのサブユニット
をコードし、このようなコード配列を発現カセット内に
有するＤＮＡ分子のような核酸を提供する。さらに本発
明は、　２３種子貯蔵タンパクのプロ配列およびプレプ
ロ配列をコードする核酸配列を提供する。

他の実施態様においては９本発明は、バーツレティア　
エクセルサＨ，Ｂ．Ｋ．の高イオウ２Ｓ種子貯蔵タンパ
クの少なくとも１つのサブユニットをコードする発現カ
セットを含むレプリコンを有する細胞を提供する。この
サブユニットは、上記細胞において発現するための調節
配列の制御下にあり。

該サブユニットは該細胞に対し異質である。特に好まし
い実施態様では、宿主細胞は高等植物細胞である。

（発明の構成） 本発明のＤＮＡ分子は、バーツレティア　エクセルサ（
Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ　ｅｘｃｅｌｓａ）　Ｈ，Ｔ
３．に、の高イオウ２Ｓ種子貯蔵タンパクの少なくとも
１つのサブユニットをコードするコード配列を、細胞に
おいて該コード配列を転写させる調節配列の制御下に、
有する発現カセットを含み、該調節配列のプロモータが
該コード配列と異種である。

本発明の他のＤＮＡ分子は、上記発現カセットを含み、
コード配列が該サブユニットと異種であるシグナル配列
もまたコードする。

本発明の細胞は、上記発現カセットを含むレプリコンを
含有し、該サブユニットは該細胞と異種である。

本発明の植物組織は、高等植物の細胞である上記細胞を
含む。

本発明の種子は、上記植物組織を含む。

本発明のマメ科植物の種子は、上記植物組織を含む。

本発明のもう１つの植物種子は、バーツレティア　エク
セルサＨ，Ｂ．Ｋ．の高イオウ２Ｓ貯蔵タンパクを含有
する。バーツレティア　エクセルサＨ，Ｂ、Ｋ。

以外の植物種子である。

以下にに記述する技術に加えて２本発明を実施するには
、全て当該技術分野の範囲内にある分子生物学、微生物
学１組換えＤＮＡ技術および植物科学の従来技術を用い
る。このような技術は文献に十分に説明されている。例
えば、　Ｍａｎｉａｔｉｓら、。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ　（１９８２）；ＤＮＡ　Ｃ
１ｏｎｉ’ｎ　：Ｖｏｌｕｍｅｓ土り、ｈｔ＜工（Ｄ、
Ｎ、　ＧｌｏｖｅｒｋＷ。

１９８５）　；０目ｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓ　ｎｔ
ｈｅｓｉｓ（Ｍ、Ｊ、　Ｇａｉｔｍ。

１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　１１　ｂｒｉ
ｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ、Ｄ、　ｆｌａｍｅｓおよびＳ、
Ｊ、　ｌ１１ｇｇ１ｎｓｌｉ、　１９８５）　；ｎ但ｙ
ｍ印旦卯」肌（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　（Ｂ、Ｄ、　
ＨａｍｅｓおよびＳ、Ｊ、旧ｇ　ｇ　ｉｎ　ｓ　ｋｍ　
＋１９８４）　；＾ｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　（Ｔ１．１．　Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編。

１９８６）；Ｐｌａｎｔ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ（Ｒ，八、　　Ｄｉｘｏｎ　　’ｔ５．　１９８５）
；Ｐｒｏ　ａ　ａｔｉｏｎ　ｏｆ旧ｈｅｒ　Ｐｌａｎｔ
ｓ　ＴｈｒｏＩＪＩＬ！ｌＴｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ
　（Ｋ、Ｗ、　Ｉｌｕｇｈｅｓら）！、　　１９８７）
；Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅａｎｄ　Ｓｏｍａｔｉｃ　
Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ（１
，に、　Ｖａｓｉｌ’ｆＪＡ、　１９８４）；Ｆｒａｌ
ｅｙら（１９８６）　ＣＲＣＣｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖ
ｉｅｗｓｉｎ　Ｐ１ａｎｔＳｃｉｅｎｃｅｓ４　：ｌ　
（以下、　Ｉ’１ａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｂｉｏ
ｔｅｃｈｎｏｌｏ江１Ｌカｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｃｈ
ｅｍ旦ｋＬ：匹鉦Ｓ　ｍ　ｏｓｉｕｍ　５ｅｒｉｅｓ　
　３３４　（ＬｅＢａｒｏｎら）Ｌ　　１９８７）　を
参照のこと。

本発明を記述するにあたり、以下の用語を下記の定義に
従って用いる。

「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自律的単位
としてふるまう、すなわち細胞内でそれ自身の制御下で
複製可能であるあらゆる遺伝的要素（例えば、プラスミ
ド、コスミド、染色体、ウィルスなど）である。

「ベクター」は、別のＤＮＡ断片を結合することができ
、該結合断片を複製できる。プラスミド。

コスミド、またはバクテリオファージのようなレプリコ
ンである。

ｒ　ＤＮＡ分子」は、１本鎖または２本鎖の形のデオキ
シリボヌクレオチド（アデニン、グアニン。

チミンまたはシトシン）のポリマー形を意味する。

２本鎖形では２通常９分子はその典型的な二重らせんの
形で存在する。ｒ　ＤＮＡ分子」という用語は。

ＤＮＡのいかなる特定の三次構造にも限定されない。

従って、この用語は、特に直鎖ＤＮＡ分子、ウィルス、
プラスミドおよび染色体に見られる２本鎖ＤＮＡを包含
する。特定の２本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる場合には
、ここでは通常の慣例に従って、配列をＤＮＡの非転写
（アンチ−センス）鎖（すなわち。

ｍＲＮＡに相同性である配列を有する鎖）の５゛から３
”（左から右）方向に沿って示される配列のみを示すよ
うに記述し得る。もし両方の鎖を示す場合には、アンチ
−センス鎖は上方になる。

ＤＮＡ　ｒコード配列」とは、適当な調節配列の制御下
に置かれた場合に、インビボで転写され、ポリペプチド
に翻訳されるＤＮΔ配列である。コード配列の境界は、
５゛末端の開始コドンおよび３“末端の翻訳停止コドン
により決定される。コード配列の例には、真核生物のｍ
ＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ　。

真核生物の細胞由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成り
ＮＡ配列が包含される。

外来ＤＮＡ配列により「形質転換」された細胞とは、外
来ＤＮＡ　＠導入された細胞である。外来ＤＮへは細胞
のゲノムを構成している染色体ＤＮＡに組み込まれ得る
か（共有結合）、または染色体外に残存し得る。「安定
に」組み込まれたＤＮＡ配列とは。

娘細胞または生物により染色体複製を通して遺伝される
配列である（メンデルの分離の法則により失われること
を考慮する）。この安定性は、外来ＤＮＡを含むＤＮＡ
群を有する細胞系またはクローンを確立する能力により
表される。

「クローン」または「細胞系」は、単一の細胞または有
糸分裂による共通の祖先から生じた細胞の集団であり、
幾世代にもわたりインビトロで安定に増殖できる。

第１種の物質（例えば、コード領域を含むＤＮＡ分子）
の組成物は、この組成物が含有する第２種の物質（例え
ば、コード領域を含まないＤＮＡ分子）の量が第１種お
よび第２種の物質の合計量に対して約１０％（重Ｎ／重
量）より少ない場合には、第２種の物質を「実質的に含
有しない。」好ましくは、この組成物は第２種の物質を
約５％を下回るように含有し、最も好ましくは第２種の
物質を約１％を下回るように含有する。

「バーツレティア　エクセルサ１１．Ｂ．Ｋ．の２Ｓ種
子貯蔵タンパク」という用語は、ブラジルナツツから単
離された相同性の高いアイソ型タンパクから成る当該技
術分野で認められている種類のポリペプチドを意味する
。このタンパク種のアイソフオームは以下により特徴付
けられる：（ｉ）２Ｓの沈降係数を有するブラジルナツ
ツ由来の水溶性アルブミンの主要部分を構成する：（ｉ
ｉ）他の植物貯蔵タンパクに比べて、高いレベルのシス
ティンおよび特に高いレベルのメチオニンを含有する；
　（ｉｉｉ　）インビボで１５ｋｄおよび１２ｋｄのプ
ロペプチドに順にプロセッシングされる。　１７ｋｄの
プレプロタンパク（ゲル電気泳動によると１８ｋｄ　）
としてコードされる（第３図）；および（ｉｖ）これら
の成Ｗ）型において、プレプロタンパクのタンパク分解
プロセッシングにより生じる３ｋｄおよび９ｋｄのダイ
マーから成る。典型的なアイソ型タンパクｃＤＮＡを。

推定アミノ酸配列および天然のペプチドの配列と共に第
１図に示す。第２図は、第２のアイソフオームのｃＤＮ
Ａに対応するゲノムクローンの核酸配列およびその推定
のアミノ酸配列を示す。その他のアイソフオームは、こ
れらの典型的なメンバーとアミノ酸配列レベルで少なく
とも約８０％の相同性があり、好ましくは少なくとも約
８５％の相同性。

そしてより好ましくは少なくとも約９０％の相同性があ
る。

２３種子貯蔵タンパクのインビボでの発現を、第３図に
図示する。２３種子貯蔵タンパクは、最初は約１４６個
のアミノ酸の長さの１７ｋｄプレプロペプチドとして発
現される。１から約２２までのアミノ酸残基はシグナル
配列であると考えられる。タンパク分解によるプロセッ
シングは、このプレ配列を切断して約２３から１４６ま
でのアミノ酸残基から成る約１５ｋｄのプロ配列を与え
る。次いで、このプロペプチドは、アミノ酸残基約４７
〜１４６を構成する約１２ｋｄの第２のプロペプチドに
プロセッシングされる。この第２の前駆体ポリペプチド
は１次いで。

ジスルフィド架橋を介して結合されたダイマーの成熟分
子を共に形成する３ｋｄおよび９ｋｄのサブユニットに
プロセッシングされる。あるデータは。

３ｋｄサブユニットがアミノ酸残基約４７からアミノ酸
残基約６９または７２までの配列から成ることを示す。

他のデータは、３ｋｄサブユニットが４４から６４まで
のアミノ酸残基から成ることを示している。

９ｋｄサブユニットは、約７０から１４６まで、または
約７３から１４６までのアミノ酸残基から成る。

本発明により、バーツレティア　エクセルサ１１．Ｂ、
Ｋ。

の高イオウ２Ｓ種子貯蔵タンパクをコードするコード領
域を含むＤＮＡ分子が提供される。このＤＮＡ分子は種
子貯蔵タンパクのサブユニット（すなわち。

３ｋｄおよび／または９ｋｄサブユニット）の一方また
は両方をコードする。例えば１本発明のＤＮＡ分子は、
３ｋｄサブユニットだけ、または９ｋｄサブユニットだ
けをコードするコード領域を有し得る。

その他１本発明のＤＮＡ分子は、　１２ｋｄプロ配列（
３ｋｄおよび９ｋｄサブユニットの両方を有する）また
は３ｋｄおよび／または９ｋｄサブユニットから成る融
合タンパクをコードすることができる。本発明のその他
の実施態様では、　　ＤＮＡ分子は１５ｋｄプロ配列ま
たは１７ｋｄプレプロ配列をコードすることができた。

本発明のＤＮＡ分子は、天然のＤＮＡ　（例えば。

ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）に完全に相同性を有する
コード領域から構成され得る。その他、コード領域は、
自然において部分的または完全に合成され得る（例えば
、実質的には同じタンパクをコードするが、天然の植物
に見い出されるコドンとは異なるコドンを有する）。こ
れは、異種の宿主でコード領域を発現させることを意図
する場合に特に好適であり、それによって宿主の好むコ
ドンの選択が可能である。例えば、米国特許箱４，３５
６．２７０号；欧州特許筒４６，０３９号を参照のこと
。コード領域は、バーツレティア　エクセルサ配列に対
して異種である配列も有し得る。例えば、天然のシグナ
ルペプチドの代わりに貯蔵タンパクの配列を異種シグナ
ル配列に連結することが望ましいことであり得る。

ブラジルナツツの２Ｓ貯蔵タンパクをコードするＤＮＡ
分子は、オリゴヌクレオチド合成の公知の方法により合
成的に調製し得る。合成コード配列は。

貯蔵タンパクのアミノ酸配列に対するコドンを含む配列
を有するオリゴヌクレオチドを重ねて並べることにより
調製し得る。このようなオリゴヌクレオチドは標準方法
により調製され、完全なコード配列に組み立てられる。

例えばＥｄｇｅ　（１９８１）Ｎａ　ｔｕｒｅ２９１ニ
ア５６；Ｎａｍｂｉａｒら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ
　３２３：１２９９謬Ｊａｙら（１９８４）　Ｊ、Ｂｉ
ｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　」■：６３１１；Ｏｆｆ　ｏ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ鉦旦匝旦Ｌ（前出）を参照のこと
。

ブラジルナツツの貯蔵タンパクのコード配列は。

ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングす
る方法を用いても単離し得る。プローブはここで開示し
た核酸配列から調製され得るが、ブラジルナツツの２Ｓ
貯蔵タンパクの他のアイソフオームのライブラリーをス
クリーニングする場合には。

ここで開示した完全なコード配列をプローブとして用い
るのが好ましい。種々のアイソフオーム間のには高度の
相同性があるため、異なるアイソ型タンパクをコードす
る他のＤＮＡ配列を単離することは、ここに開示した核
酸配列をプローブとして用いることにより、技術範囲内
である。（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ（前出）を参照のこと。

（以下余白） 上記のコード配列を有するＤＮＡ分子の合成または単離
は、貯蔵タンパクをコードしないＤＮＡ分子を実質的に
含まないブラジルナツツ貯蔵タンパクをコードするＤＮ
Ａ分子組成物の調製を当業者に可能とする０本発明のコ
ード配列を有するＤＮＡ分子組成物は、直鎖杖コード配
列、またはクローニングベクター内のコード配列を含有
し得る。多くのクローニングベクターが当業者に公知で
あり、適切なりローニングベクターを選ぶのは選択の問
題である。宿主菌を形質転換させるクローニング用組換
えＤＮＡベクターの例としては、バクテリオファージラ
ムダ（大腸菌；Ｌ聾匪■）　、　ｐＢＲ３２２（Ｅ。

印旦）、ｐ＾ＣＹＣ１７７（Ｅ、延）　、　ｐＫＴ２３
０　（ダラム陰性細菌）　、　ｐＧＶ１１０６　（ダラ
ム陰性細菌）　、　ｐＬＡＰＲｌ（ダラム陰性細菌）　
＋　ｐＭＥ２９０　（Ｆ、、　ｃｏｌｊ以外の陰性細菌
）　、　ｐＨＶ１４　（Ｅ、　ｃｏｌｉ及び枯草菌（バ
チルスズブリティス：　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉ
ｌｉｓ））、　ｐＢＤ９（バチルス）　、　ｐｌＪ６１
（ストレプトマイセス；釘μ■蝕Ｊμ狙）。

ｐｔｌｃ６　（ストレプトマイセス）、アクチノファー
ジｐｈｉ　Ｃ３１（ストレプトマイセス）　、　ＹＩｐ
５　（酵母）。

ＹＣｐ１９　（酵母）、およびウシパピローマウィルス
（哺乳動物細胞）を包含する。一般には、■虹■坦植Ｌ
Ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉおよび■（前出）　；　Ｍｏ１ｅｃ
ｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ鉦Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　
Ｍａｎｕａｌ　（前出）を参照のこと。

本発明により、ブラジルナツツ２Ｓ貯蔵タンパクが異種
宿主菌において発現されるように、上記コード配列が転
写調節配列の制御下に置かれているＤＮＡ構築物が提供
される。このようなりＮＡ構築物は、「発現カセット」
を参照すると、プロモーター、リポソーム結合部位（細
菌での発現のため）および転写終結配列またはポリアデ
ニル化シグナルのような調節配列の制御下にある貯蔵タ
ンパクのコード配列を有している。他の調節配列は、オ
ペレーター、エンハンサ−などを有する。カセットは１
通常９便利な制御部位で切断される。適切な調節配列お
よびコード配列の選択、および特定の宿主における発現
のための該配列の組み立ては。

当該技術分野の範囲内である。

通常９発現カセットの中に選択マーカーを有することが
望ましい。「選択マーカー」遺伝子は。

「選択可能な表現型」　（すなわち、細胞または生物の
表現型であり、これによって選択マーカー遺伝子を発現
する細胞の同定または選択が可能である）をコードする
。当該技術分野でよく知られているマーカー遺伝子は、
以下の遺伝子を包含するが、これに限定されない；クロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ
）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ”
）＊ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ　（凪
−■）、ツバリン合成酵素（ＮＯ５）、ハイグロマイシ
ンホスホトランスフェラーゼグリホゼート耐性遺伝子（
ＥＰＳＰ）。

ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ｍ　ｔｘ”）　＋　　ヒボ
キサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（凪）お
よびチミジンキナーゼ（田）。これらのタンパクをコー
ドする配列で形質転換した細胞は、形質転換していない
細胞には有毒な培地においも生存することができる。β
−ガラクトシダーゼ（皿）のようなその他のタイプのマ
ーカーは、該マーカーで形質転換された細胞の色をある
条件下で変化させ、目視選択を可能にする。発現カセッ
トにおける選択マーカーの存在は、特定の細胞が発現カ
セットによって安定に形質転換されているかどうかの決
定を可能にする。選択マーカーには、貯蔵タンパクを発
現する最終の宿主において機能するもの、および発現カ
セット構築物が存在する中間宿主において機能する付加
的マーカーが包含され得る。

発現カセットは、コード配列が、適当な制御配列を有す
るカセット内に置かれるように構築される。制御配列に
対するコード配列の位置および方向は９発現カセットに
より形質転換される宿主細胞において調節配列の制御下
で（すなわち、制御配列のところでＤＮＡ分子に結合す
るＲＮＡポリメラーゼにより）、該コード配列が転写さ
れるように構築される。上述したようにクローニングベ
クター内に発現カセットを挿入するのに先立って９発現
カセットを構築することが可能である。その他。

すでにプロモータの下流に適切な調節配列および制限部
位を有する発現ベクターの中に、直接にコード配列をク
ローン化することにより発現力セットを構築できる。

微生物宿主（例えば、細菌または酵母）を形質転換する
のに用いる発現ベクターまたは発現カセットの構築は、
他のタンパク源の栄養価を補うために醗酵によって単一
の細胞タンパクを生産するのに望まれ得る。多くの原核
生物の発現ベクターが当該技術分野で公知であり、この
目的のために適用され得る。例えば、米国特許第４．４
４０．８５９号；第４．４３６．８１５号；第４，４３
１，７４０号；第４．４３１．７３９号；第４．４２Ｓ
，９４１号；第４．４２５．４３７号；第４．４１８．
１４９号；第４，４１１．９９４号；第４．３６６．２
４６号；第４．３４２．８３２号；および英国特許筒２
．１２１．０５４号；第２．００８．１２３号；第２．
００７．６７５号および欧州特許公開箱１０３．３９５
号を参照のこと。酵母発現ベクターも当該技術分野に公
知である。米国特許第４．４４６．２３５号、第４．４
４３゜５３９号、第４．４３０．４２Ｓ号、第４．５４
６．０８２号；欧州特許公開箱１０３，４０９号、第１
００，５６１号、第９６．４９１号を参照のこと。

ブラジルナツツの２Ｓ貯蔵タンパクのコード領域を有す
る発現カセットのための異種宿主の好ましい種類は、真
核細胞宿主、特に高等植物細胞（双子葉、単子葉）であ
る。高等植物の中でも特に好ましいのは、グリシン　マ
ックス（射１注吠ｍａｘ；ダイズ）、メディカゴ　サテ
イバ（伽旦匹敬ｓ　ａ　ｔ　ｉ　ｖ　ａ　；アルファル
ファ）、プソホカルブス　テトラゴノロブス（Ｐｓｏ　
ｈｏｃａｒ　ｕｓ　ｔｅｔｒａ　ｏｎｏｌｏｂｕｓ；　
ウイングドビーン）、ビグナ　アコニチホリア（籏氾ａ
ｃｏ−ｎｉｔｉｆｏｌｉａＨモス　ビーン）を包含する
がこれに限定されない、マメ科植物のようなイオウ含有
タンパクの低い食用部分を持つ栽培価値がある植物であ
る。

高等植物で使用するように意図されている発現カセット
には、このような植物において機能性である調節配列が
使用される。例えば、プロモータは、植物プロモータ、
植物ウィルスプロモータ。

およびＴ−ＤＮＡプロモータ（ＴｉおよびＲｉプラスミ
ドの両者に由来する）で成るグループから選択され得る
。当該技術分野に公知の特定のＴ−ＤＮＡプロモータは
、ツバリン合成酵素（ＮＯＳ）プロモータ、およびオク
トピン合成酵素（ＯＣＳ）プロモータである。

これらのプロモータは、構成性プロモータである（例え
ば、　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ（前出）を参照のこ
と）。

植物ウィルスプロモータの例は、カリフラワーモザイク
ウィルス（ＣａＭＶ）由来の１９５および３５Ｓ転写プ
ロモータを包含する。例えば、同上、　Ｋｏｚｉｅｌら
（１９８４）　Ｊ、Ｍｏ１．Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ’ｅｔ、
　２　：５４９を参照のこと。

多くの植物プロモータが異種システムにおいて作用する
ことが示されており、該プロモータは以下のプロモータ
を包含するが、これに限定されない：エンドウマメの小
さなサブユニットＲＵＢＰカルボキシラーゼ（ｐＳＳ）
プロモータ（Ｍｏｒｅｌｌｉら（１９８５）　Ｎａｔｕ
ｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ’）　３１５：２００ｓ　Ｂｒｏｇ
ｌｉｅら（１９８４）　５ｃｉｅｎｃｅ２２４：８３８
；　Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ　ら（１９８４
）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）３１０：１１５；
　Ｃｏｒｕｚｚｉら（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、　３　
：１６７１）　ｉダイスの小さなサブユニットＲＵＢＰ
カルボキシラーゼ（ｓｂｓｓ）プロモータ（Ｆａｃｃｉ
ｏｔｔｉ　ら（１９８５）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ　３　：２４１）　；　　）ウモロコシゼインのプ
ロモータ（Ｍａｔｚｋｅら（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、
　３　：１５２５　）　　：　コムギの葉緑体ａ／ｂ結
合タンパクプロモータ（Ｌａｎ＋ｐａら（１９８６）　
Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１６：７５０−７
５２）　：ダイスの７Ｓ　αゝコングリシニンプロモー
タ（Ｂｅａｃｈｙら（１９８５）　ＥＭＢＯＪ、土：３
０４７　）　；ダイスのグリシニンＧ２プロモータ；ダ
イスのヒートショックプロモータ（欧州特許公開箱１５
９，８８４号）；およびフランス豆のファセオリンプロ
モータ（Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎら（１９８
５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
８２：３３２０；　Ｍｕｒａｉら（１９８４）　５ｃｉ
ｅｎｃｅ２２２：４７６）　、適用に応じて１組織特異
的（例えば１種子１葉など）および／または調節性（例
えば、光誘導性、温度または熱誘患性９発生調節性など
）の、利用しうるプロモータの中から選択することが望
ましいことであり得る。

特に好ましいプロモータは、異種植物の種子内でブラジ
ルナツツ２Ｓ貯蔵タンパクの発現を可能にするプロモー
タである。このようなプロモータの例には、ファセオリ
ンのプロモータおよびダイスの７Ｓα°コングリシニン
プロモータが包含されるが、これに限定されない。種子
特異的発現のための発現カセットとしては、これらのよ
うな異種プロモータまたは同種２Ｓ貯蔵タンパクのプロ
モータのいずれかが採用され得る。同様に５発現カセッ
トは、コード配列内の異種シグナルペプチド（特に、異
種プロモータに関連するシグナルペプチド）。

または２Ｓタンパク自身のシグナルペプチドを使用でき
る。

本発明の発現カセットを用いて高等植物細胞を形質転換
する様々な方法が、当業者に利用され得る。最も一般的
な形質転換方法は、　ＴｉまたはＲｉプラスミド由来の
Ｔ−ＤＮＡから成る形質転換ベクターに基づく方法であ
る。特に、バイナリ−Ｔ−ＤＮ八へクターを用いるのが
好ましい（例えば＋　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ（前
出）を参照のこと）。Ｔ−ＤＮＡに基づくベクターは、
双子葉植物および単子葉植物を形質転換することが示さ
れている。これらの植物は、マメ科植物（例えば、ダイ
ズ、エントウ、およびアルファルファ）、綿花、西洋ア
ブラナ、トマト、リリアシー（例えば、アスパラガス）
、アマリリダシーなどを包含するが、これらに限定され
ない。例えば＋　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅ（前出）
およびその中の引用文献；　Ｐａｃｃｉｏｔｔｉら（１
９８５）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３　：２４
１；Ｂｙｒｎｅ　　ら（１９８７）　　Ｐｌａｎｔ　　
Ｃｅ１ｌ、　　Ｔｉ５ｓｕｅ　　ａｎｄ　　Ｏｒｇａｎ
Ｃｕｌｔｕｒｅ　８　：３；　５ｕｋｈａｐｉｎｄａら
（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏ。

８　：２０９−２１６；　Ｌｏｒｚら（１９８４）　Ｐ
ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ＥＥＣ−Ｓｙｍｐ、：Ｉ
ｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ−Ｐｒｏｐａｇ
ａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｌ。

ｎｇ−Ｔｅｒｍ　ＳｔｏｒａｇｅＨＬｏｒｚ　ら（１９
８５）　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

１９９：１７８；　Ｐｏｔｒｙｋｕｓら（１９８５）　
Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、１９９：１８３を参照の
こと。

その他の形質転換方法が当業者に利用され得る。

ウィルスの形質転換ベクターとしては、　ＣａＭＶに基
づいてベクターが知られている。例えば＋　Ｂｒ１ｓｓ
ｏｎら（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）
　３１０：５１１；　Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎら（１９８
１）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　２９４ニア３
３を参照のこと。トランスボゾンも、特に単子葉植物で
ある植物を形質転換するのに使用できる。トウモロコシ
のトランスポゾンは１例えば、　ＡｃおよびＤｓ）ラン
スボゾンならびにＭｕｌ　）ランスボゾンを含む。例え
ば、　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（前出）を参照
のこと。

所望の高等植物宿主のための適切な形質転換ベクターが
存在しない場合１本発明の発現カセットを有するＤＮＡ
を直接導入することにより、このような細胞が形質転換
され得る。種々の化学物質を用いて植物細胞内に外来Ｄ
ＮＡを取り込ませることが知られている。例えば、　Ｉ
）ａｖｅｙら（１９８０）　ＰｌａｎｔＳｃｉ、Ｌｅｔ
ｔ、　１８：３０７；　Ｄｒａｐｅｒら（１９８２）　
Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＰｈｙｓｉｏ１．２３：１；　Ｋ
ｒｅｎｓ　ら（１９８２）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄ
ｏｎ）２９６：７２；　Ｈａｉｎら（１９８５）　Ｍｏ
１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、　、ｌｉ：１６１；Ｈｏｏｙ
ｋａａｓ−ｖａｎ　Ｓｌｏｇｔｅｒｅｎら（１９８４）
　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）３１１ニア６３；　
Ｈｅｒｎａｌｓｔｅｅｎｓら（１９８５）　ＥＭＢＯＪ
、　３　：３０３９を参照のこと。高等植物のプロトプ
ラストは、エレクトロポレーションの技術によっても形
質転換されている。例えば、　Ｆｒｏｗｎら（１９８６
）　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）　３１９ニア９１
；　Ｆｒｏｍｍら（１９８５）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８２：５８２４ｊ　Ｐｏｔｔｅｒら（
１９８４）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８１ニア１６１を参照のこと。植物細
胞はまた。

公知の技術を用いたマイクロインジェクションにより、
またはＲＮＡもしくはＤＮＡで被覆した高速金属粒子に
より外来ＤＮＡで形質転換され得る。例えば、　Ｋ１１
ｎｅ、Ｗｏｌｆ、Ｗｕおよび５ａｎｆｏｒｄ（１９Ｂ？
）　Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）　３２７　：　７０
を参照のこと。

形質転換された植物細胞が一度生産されれば。

形質転換細胞をカルス組織または懸濁液中で細胞株にま
で増殖させることが通常望ましい。カルスへの再生およ
び細胞株を生産する技術は、当該技術分野で公知である
。例えば、　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ（
前出）　；　Ｐｒｏ　ａ　ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｉ　ｈ
ｅｒ　Ｐｌａｎｔｓ　Ｔｈｒｏｕ　ｈＴｉｓｓｕｅ　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅ　（前出）を参照のこと。形質転換細胞は
、器官発生誘導することもできる。このように、形質転
換細胞は未分化な組織として、または器官培養物で維持
され得る。それゆえ、これらの植物細胞培養物または器
官培養物を、ブラジルナツツの２３貯蔵タンパクを生産
するのに用いることができる。例えば、　Ｐｌｏｒｅｓ
＋…狼里叫Ｕ庶江」閃Ａ　　ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　　
Ｃｈｅｍｔｓｔｒ　　；　　八ＳＣＳ　　ｍ　　ｏｓｉ
ｕｍ　　５ｅｒｉｅｓ３３４、ｐ、６６　（ＬｅＢａｒ
ｏｎらｍ、　１９８７）を参照のこと。

本発明のもう一つの重要な適用は、ブラジルナツツの２
３貯蔵タンパクをコードする配列で形質転換した植物を
つ（ることである。形質転換されたプロトプラストまた
はカルス細胞株のような組織培養物から植物体を再生す
る技術は、当該技術分野で公知である。例えば、　Ｂｉ
ｎｇｈａｍら（１９７５）　ＣｒｏｐＳｃｉ、１５ニア
１９−７２１；　Ｋａｏ　ら（１９８０）　Ｚ、Ｐｆｌ
ａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌＢｄ、　９６：１３５−１４
１；　Ｒｅ１ｓｃｈら（１９８０）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃ
ｉ、Ｌｅｔｔ。

２０ニア１−７７；米国特許第４，５４８，９０１号；
　Ｗｒｉｇｈｔら（１９８７）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　
Ｒｐｔｓ、　６　：８３；　Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ
　ら（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２２：６３２；　
Ｈａｍｍａｔｔら（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　５ｃｉ−
ｅｎｃｅ　４８：１２９；　Ｇｈａｚｉ　ら（１９８６
）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｐｔｓ。

５：４５２；　Ｂａｒｉｖａｌｅら（１９８６）　Ｐｌ
ａｎｔａ　１６７：４７３；　Ｎｅ５ｙｅｌｌら（１９
８５）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｏｒｇ
ａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ土：１４５；　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ
　ら（１９８１）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕ
ｅ　ＯｒｇａｎＣｕｌｔｕｒｅ上：１２３；　Ｅａｐｅ
ｎ　ら＜１９８６）　Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅ
ｔ。

７２：３８４：　Ｋｒｉｓｈｎａｍｕｒｔｈｙ　ら（１
９８４）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｐｔｓ。

３　：３０；Ｓｈｅｋｈａｗａｔ　ら（１９８３）　Ｐ
ｌａｎｔ　Ｓｃｉ、Ｌｅｔｔ、３２：４３；Ｗｉｌｓｏ
ｎら（１９８５）　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ、４１：６１；
　Ｖｅｎｓｔｅｓｎａｒａｎら（１９８５）　Ｉｎ　Ｖ
ｉｔｒｏ　２１　（３ＩＩ）：３６Ａを参照のこと。

以下の記述は、説明の目的のみを意図する本発明のある
特定の実施例である。これらの実施例は。

いかなる方法においても本発明を制限することを意図し
ない。ここで示した文献を、参照文献としてここに引用
する。

（以下余白） （実施例） ■、フ゛−ジルナ・ン゛ン２Ｓ　　ンパクｃＤＮへのク
ローニｌ久 ブラジルナツツの果実を、開花の約９ケ月後にブラジル
（Ｍａｎａｕｓ）またはペルー（［ｑｕｉｔｏｓまたは
Ｐｕｅｒｔｏ　Ｍａｌｄｏｎａｌｄｏ　）から入手した
。

ブラジルナツツの脛部を微細なペーストにすりつぶし、
ヘキサンで抽出することにより脱脂した。

次いで、得られた脱脂ブラジルナツツ粉を、　ＩＭ　Ｎ
ａＣ１を含有する０、０３５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７，５）で抽出した。この粗抽出液から高イオウ
タンパクを、　ＹｏｕｌｅおよびＨｕａｎｇ　（１９８
１）　Ａｍｅｒ、Ｊ、　Ｂｏｔ、６８：４４−４８の方
法により精製した。得られたショ糖密度勾配画分を脱イ
オン水に対して４°Ｃにて充分に透析し、混入している
グロブリンタンパクを沈澱させた。最終的に得られたタ
ンパク試料は、　５Ｏ３−２０％ポリアクリルアミドゲ
ルで分析すると９ｋｄおよび３ｋｄのポリペプチドを含
有していた。

配列決定に用いるタンパクは、２■の精製高イオウタン
パクを、１ｍＭＥＤＴＡおよび０．１５Ｍ　２−メルカ
プトエタノールを含有する１？ｆ）リス−塩酸緩衝液（
ｐＨ８，８）とともに３７°Ｃにて４．５時間、窒素ガ
ス下でインキュベートすることにより調製した。インキ
ュベーションの終わりにヨード酢酸を最終濃度が０．２
２Ｍとなるように添加し、試料を３７°Ｃの暗所にて３
０分間インキヱベートした。この処理の後。

タンパク試料を脱イオン水に対して充分に透析し。

凍結乾燥した。

高イオウタンパクの配列分析は、キャリアーとして０．
１Ｍクアドロール（ＱｕａｄｒｏｌＨＢｅｃｋｍａｎ　
Ｉｎｓｔｒｕ−ｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、）およびポリプ
レン（２■）を用い。

プログラム０５０７８３を使用して、冷却トラップを備
えたＢｅｃｋｍａｎ　８９０Ｃ液相配列決定装置による
自動エドマン分解［Ｅｄｍａｎら（１９６７）Ｅｕｒ、
Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　　１　：８０−９０］により行っ
た。約１０ｎｏ＋ｏｌＯ高イオウタンパクを、液相配列
決定装置にかけた。両分にノルロイシンを添加し、各定
量サイクルの内部標準として用いた。フェニルチオヒダ
ントイン−アミノ酸を。

（Ｐａｃｋａｒｄ　４１９）ガス液体クロマトグラフィ
ー（（１９７２）Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、　４
５：４３−５２）　、（Ｗａｔｅｒ　６０００Ａ）高速
液体クロマトグラフィ［（１９７８）　Ｊ、Ｃｈｔｏｍ
ａｔｏｇｒ。

１４８：５３２−５３５）および薄層クロマトグラフィ
ー〔（１９７４）　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｍ、５９
：５６４−５７３）により同定し。

測定した。全部で６０サイクルの分解を行い、９７％の
反復収率が観察された。ＰＴＨ−アミノ酸はサイクル５
７の後では同定できなかった。

カルボキシメチル化高イオウタンパクの分析から２つの
アミノ酸配列が得られた；一方は大きな配列（８０％）
であり、一方は小さな配列（２０％）であった。大きい
ほうの配列はＮ）１２末端アミノ酸がＰｒｏ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−・・から始まり、小さいほう
の配列はＧｌｙ−Ｍｅｔ・・・から始まる（第６Ａ図）
。

この２つのタンパク配列は、小さいほうのタンパク配列
が大きいほうの配列よりもＮＨ，末端のアミノ酸が３個
少ないことを除いては、配列決定した領域が同じであっ
た。従って、小さいほうのタンパク配列の最初の５７ア
ミノ酸を決定することが可能であった。高イオウタンパ
クは９ｋｄポリペプチドおよび３ｋｄポリペプチドの２
つのサブユニットからなる。５４個および５７個のアミ
ノ酸配列は両方とも３ｋｄポリペプチドよりも大きいの
で、これらの配列は９ｋｄポリペプチドを表わすはずで
あり。

おそら＜９ｋｄポリペプチド群の２つのメンバーである
。３ｋｄポリペプチドに対するアミノ酸配列は得られな
かったので、３ｋｄポリペプチド配列が９ｋｄの配列と
同じであるか、または３ｋｄポリペプチドのＮＨ２末端
がブロックされている。のいずれかであることが示唆さ
れた。

このアミノ酸配列は９ｋｄサブユニットの約７７％を表
わす。この配列は非常に高レベルの含量アミノ酸（２１
％メチオニンおよび７％システィン）を含有する。アミ
ノ酸配列は部分的にメチオニン残基とアルギニン残基と
が局在している２つの領域がある：第２９−３５番目ま
での残基（＾ｒｇ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−
Ｍｅｔ−Ｍｅｔ　）および第４７−５７番目の残基（Ｍ
ｅｔ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ）であ
る（第６Ａ図）。

これらのメチオニンに富んだ領域（アミノ酸残基第３０
−３５番目まで、第６Ｂ図）の１つをコードする６つの
可能なＲＮＡ配列と相補的である。１つのオリゴヌクレ
オチドプローブを合成した（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ＋Ｉｎ
ｃ、による）。ファセオルス　ブルガリスについて以前
に記載された方法（Ｉｌａｌｌら（１９７８）、　Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：３１９６
−３２００３を用いて、９ヶ月のブラジルナツツの種子
からポリアデニル化ＲＮＡを調製し、ダイマー−ブライ
マーベクターｐ＾ＲＣ７にクローン化した（Ａｌｅｘａ
ｎｄｅｒ　ら（１９８４）　、　Ｇｅｎｅ３１ニア９−
８９３゜得られたクローンを、上述の５°末端標識プロ
ーブを用いたコロニーハイブリダイゼーション（Ｔａｕ
ｂら（１９８２）、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１
２６：２２２−２３０〕によりスクリーニングした。プ
ローブをフィルターに、　　６　ＸＮＥＴ（０，９Ｍ　
ＮａＣ１，０，０９Ｍ　）リス−塩酸、　ｐＨ７，５，
０，００６Ｍ　ＥＤＴ八）、　　０．０５％ＮＰ−４０
，および２５０　ｔｔ　ｇｉｒｄの酵母ｔＲＮＡの中で
３７°Ｃにて２０時間ハイブリダイズさせた。このフィ
ルターをオートラジオグラフィーにかける前に、６ＸＳ
ＳＣで３７°Ｃにて洗浄した。　　３５０ｂｐから７０
０ｂｌ）のインサートを有する１２個のクローンを同定
し、さらに分析した。

１つのクローンｐＨ５−３のｃＤＮＡ配列を、ジデオキ
シチェーンターミネーション法（Ｓａｎｇｅｒら（１９
７７）　。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４
：５４６３−５４６７）により両方のＤＮＡ　ｔＡから
決定した。このクローンの必要な領域もマキサム−ギル
バートの方法（Ｍａｘａａ＋およびＧ１１ｂｅｒｔ（１
９７７）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ
ＳＡ　７４：５６０−５６４　）により配列決定した。

高イオウタンパクをコードするｍＲＮＡの５゛末端の２
５ヌクレオチドはｐｕｓ−３には示されなかった。しか
し、このヌクレオチドは、　ｍＲＮＡの５°末端に相補
的なりＮＡを合成するためのプライマーとしてヌクレオ
チド１１４９−６９に相補的な合成オリゴデオキシ−ヌ
クレオチドを用い、得られた延長された生成物の配列決
定をすることにより得られた。プライマー延長のために
。

５′末端を標識したオリゴデオキシヌクレオチド５’−
ＡＡＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴ−３’を
９ケ月のブラジルナツツ種子から得たポリ（Ａ）”ＲＮ
Ａ　３■とアニールした。これは、　　５　ｍＭＥＤＴ
Ａ含有８ＩＩＩＭトリス緩衝液（ｐＨ７，５）中で、９
０°Ｃに続いて２５°Ｃにて１５分間行った。

アニールしたＤＮＡ試料は、最終濃度が５０ｍＭ　）リ
ス（ｐｆ１８．３）、　　５ｍＭ　ＤＴＴ、　１５ｍＭ
　ＭｇＣｈ＋　０．５ｍＭ　ｄＮＴＰｓおよび０．１ｍ
ｇ／ｍＢｓＡの溶液に入れた。これにＡＭＶ逆転写酵素
（ＢＲＬ、、　３７．５単位）を添加し、３７℃にて９
０分間インキュベートした。ＥＤＴＡを２０ｍＭとなる
ように添加し、フェノール：クロロホルム；イソアミル
アルコール（２５：２４：１）で２回抽出し。

エタノール沈澱を行った。変性後、試料を配列決定用の
８％ゲルでの電気泳動にかけた。３つのバンドが得られ
たが、これらは単一のヌクレオチドとは長さが異なって
いた。３つのバンドのそれぞれからのＤＮＡをゲルから
溶出し、マキサム−ギルバート法により配列決定した。

ｐＨ５−３の配列分析は、明らかにこのｃＤＮＡは極め
て含量アミノ酸が多いポリペプチドをコードすることを
示した（第１図）。ｐＨ５−３の配列は、ポリ（Ａ）鎖
を除くと５９９ヌクレオチドである。ｐＨ５−３の５゛
末端付近の領域に相補的な２１塩基の合成オリゴデオキ
シヌクレオチドを用いたプライマー延長分析により、こ
のｃＤＮＡクローンは高イオウタンパクをコードするｍ
ＲＮＡの５゛末端の２５ヌクレオチドが欠けており、短
いことがわかった。プライマー延長により得られた生成
物の配列にはＡＴＧコドンがない。従って、　ｐＨ５−
３（第５８−６０番までの残基）に見い出される最初の
ＡＴＧコドンは、タンパク合成の開始コドンを表わす。

このＡＴＧは、真核細胞のタンパク開始部位のコンセン
サス配列（Ｋｏｚａｋ　（１９８３）　。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｒｅｖ、４７：１−４５　）と一
致する。停止コドンＴＧＡは、　ｐｕｓ−３の１１４９
５−４９７ヌクレオチドによりコードされる。得られる
オープンリーディングフレームは、２０％以上が含量ア
ミノ酸である。アミノ酸が１４６個のポリペプチド（こ
のアミノ酸残基の１５．１％はメチオニンであり、５．
５％はシスティンである）をコードし得る。コードされ
たポリペプチドの最初の部分は、疎水性の残基を大きな
割合で含有する。このタンパク末端の２２残基の３６％
はアラニンであり、１８％はロイシンである。比較する
と、残りのポリペプチドはアルギニン、グルタミンおよ
びグルタミン酸に冨んでおり、その組成は他の植物種子
貯蔵タンパクの特徴でもある。

親水性についてプロットすると、ポリペプチドのアミノ
末端は疎水性であるが、該ポリペプチドの残りは非常に
親水性であることを示す。

ヌクレオチド配列から得られるアミノ酸配列を。

精製された９ｋｄサブユニットから決定された大きいほ
うの配列と整列させることにより、９ｋｄポリペプチド
に対応するコード領域はｍＲＮＡの５゛末端から２６５
ヌクレオチドのところから始まることが見い出された。

この領域によりコードされる個々のアミノ酸の分子量を
合計することにより、はぼ９ｋｄの値となる。ヌクレオ
チド２６５と４３５との間のオーブンリーディングフレ
ームの一部のヌクレオチド配列から得たアミノ酸配列は
、正確ではないが、高イオウタンパクの９ｋｄサブユニ
ットにおける大きいほうの５７残基部分アミノ酸配列と
非常によく一致する（第１図）。メチオニン残基は、成
熟タンパクの９ｋｄサブユニット中で非常に顕著である
。この領域には１４個のメチオニン残基が存在し、７７
個のアミノ酸のポリペプチドの１８．２％に相当する。

これら１４個のメチオニンのうち８個は。

このポリペプチドの２つの領域にあるアルギニン残基と
ともに局在していることが見い出されている。第１の局
在系はアミノ酸残基１１９９と１０４の間にあり、６個
の残基のうち５個がメチオニンであり、４個のメチオニ
ンは隣接している。第２の局在系はアミノ酸残基＃１１
６と１２１の間にあり、３個のメチオニン残基と３個の
アルギニンとを含有する。興味深いことには、タンパク
から決定されたアミノ酸配列とヌクレオチド配列から得
られたアミノ酸配列との間に見られる４個のアミノ酸の
相違のうちの２個は１合成オリゴデオキシヌクレオチド
プローブの主要部分として用いたメチオニンの多い領域
に見い出される。同じプローブを用いて選択される第２
のｃＤＮＡクローンは、プローブ中に示される配列の１
つと全く同じであり、これは高イオウタンパクはこれら
のメチオニンの多い領域においていくつかの変異がある
遺伝子群によりコードされることを示唆している。ブラ
ジルナツツタンパクの９ｋｄサブユニットは高い割合（
７，７％）でシスティンも含有する。

ハイブリッド選択翻訳により、　ｐＨ３−３は、インビ
トロで１８ｋｄポリペプチドを合成するのに用いられる
９ケ月のブラジルナツツのＲＮＡ群から、　ｍＲＮＡを
選択しうろことが見い出された。この１８ｋｄポリペプ
チドは、ウサギで生産されたブラジルナツツの精製高イ
オウタンパクに対するポリクローナル抗体と免疫沈降す
ることができ、このことは高イオウタンパクが最初に大
きなポリペプチド前駆体として合成されることを結果と
して示している。

Ａ　Ｉ　ｔｅｎｂａｃｈ　ら（１９８７）、　Ｐｌａｎ
ｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　　８：２３９−２５０を参照
のこと。この文献の開示内容をここに参照文献として引
用する。

■、ジブ−ルナツツ２Ｓ　　ンパクの゛ツムクロー新鮮
なブラジルナツツ果実の胚からゲノムＤＮＡを、インゲ
ンマメについて以前に記述されている方法（Ｓｕｎら（
１９８１）、Ｎａｔｕｒｅ　２Ｓ０：３７　）を用いて
単離した。ブラジルナツツＤＮＡのＥｃｏＲ１部分分解
断片を有する１、２　ＸＩＯ’シャロン４Ａバクテオリ
ファージ組換え体のゲノムＤＮＡライブラリーの構築は
、　ＢｌａｔｔｎｅｒらＪ（１９７８）、　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　２０２：１２７９およびＳｌｉｇｈｔｏｍら（１
９８０）、Ｃｅ１ｌ　２１：６２７に記載されているよ
うにして行った。このオリジナルライブラリーを４．５
Ｘ１０１０組換え体ファージにまで増幅させ。

これらのうちの約１．２Ｘ１０’を３２Ｐ標識したブラ
ジルナツツ高イオウタンパクｃＤＮＡ　（ｐｕｓ−３）
プローブを用いてスクリーニングした。高イオウタンパ
ク遺伝子配列を有するいくつかのクローンが同定された
。第２図は、ブラジルナツツ２ｓタンパクの１個のゲノ
ムクｏ−７（Ｃｈ４Ａ　ＢＮ−７，２，１，１，）　（
Ｄヌクレオチド配列を示す。

ブラジルナツツ貯蔵タンパクの発現カセットを有する構
築物を、以下に記述するようにして調製した。この構築
を第４図に図示する。

ファセオリンゲノムクローンＣｈ４Ａ−１７７，４（、
Ｓｕｎら（１９８１）、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏ
ｎ）　２Ｓ０：３７　）の３．８ｋｂシｄｌＩ／Ｂａｍ
ＨＩ断片を、プラスミドｐＢＲ３２２の石旧部位にサブ
クローン化し、クローンｐＰｈ３．８を得た。

ファセオリン配列およびｐＢＲ３２２の小部分を有する
ｐＰｈ３．８（７）　４　ｋｂｓａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨ
Ｉ断片をヘクターｐＴＺ１９Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＋
Ａｎａｌｅｃｔｓ＋　１３：４）に挿入し、クローンｐ
ＳＢ−９を得た。部位特異的変異を用いてＣ残基をへ残
基に変え、このことによってファセオリンの停止コドン
からヌクレオチド４個上流にＡｃｃ　１部位を付は加え
た。変異を誘導するために、　０．０２Ｍ）　！Ｊ　ス
（ｐＨ７，５）、　０．Ｏｆ　ＭｇＣ１ｇ、　０．０１
Ｍ　ＤＴＴ中テ８゜°Ｃにて５分間、　ｐｓＢ−９から
調製した１本鎖ＤＮＡを２１塩基のオリゴヌクレオチド
５’　−ＴＡＴＴＣＡＧＴＡＴＡＣＡＡＡＴＧＣＡＣＣ
−３°とアニールした。このアニール混合物を室温にて
１５分間インキュベートした。１０μ！のアニール混合
物に３μｌの１０×Ｂ緩衝液（２００ｍＭトリス（ｐＨ
７，５）、　１００ｍＭ　ＭｇＣｈ＋　４０ｍＭ　ＤＴ
Ｔ）　、　１．５ａＸの１０ｍＭ　ＡＴＰ、　　Ｉ　Ｉ
Ｉ　ＩＩ！の２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、　２２．５μｍの１
１□０．３単位のＤＮＡリガーゼおよび３単位のＰｏ１
ｌのクレノー断片を添加した。この混合物を３０″Ｃに
て１時間インキュベートした。次いで、さらに１μｆの
Ｂ緩衝液、１μ！の２ｍＭ　ｄＮＴＰｓ、　６μｌのＨ
２Ｏ。

３単位のＤＮＡリガーゼおよび３単位のＰｏ１ｌのクレ
ノー断片を添加し、混合物をさらに３０′ｃにて３時間
インキュベートした。変異誘導混合物（ｌμｌ）はＮＭ
５２２細胞（Ｇｏｕｇｈ　ら（１９８３）、　Ｍ、Ｍｏ
１．Ｂｉｏｌ、１６６：１−１９３を形質転換するのに
用いた。付加されたＡｃｃ　Ｉ制限部位を有する１個の
クローンｐｎ−ｔ３が選択された。

次いで、　ｐＢ−１３および２１塩基のオリゴヌクレオ
チド５”−ＣＴＣＡＴＣＡＴＡＧＴＡＧＡＣＴＡＧＴＡ
Ｔ−３”から調製した１本鎖ＤＮＡを用いた部位特異的
変異を、Ｃ残基をＣ残基に変えたプラスミドｐＤ−３を
作製するために用い、これによってファセオリンの開始
コドンの５ヌクレオチド上流にＡｃｃ１部位を付は加え
た。

次に、　ｐＴＺ１９Ｕのポリリンカー領域に含まれるＡ
ｃｃＩ部位をｐＤ−３から除去した。これは、５ａｌＩ
およびＢａｍＨＩでｐＤ−３を制限切断し、　Ｐｏ１ｌ
のクレノー断片を用いて末端を充填し、ファセオリン配
列を有する末端を充填された４ｋｂ断片を単離し、この
断片を１ＩｉｎｃＩ［で切断しであるｐＴＺ１９Ｕに挿
入することにより行った（この工程は第４図には示して
いない）。

次いで、得られたプラスミドＰＤ３−８をＡｃｃｌで消
化し、ファセオリンをコードする領域を除去し、末端を
充填し、プロモータおよびファセオリン遺伝子の３゛側
の非翻訳領域を有する５ｋｂ断片をゲルを用いて精製し
た。ブラジルナツツ高イオウタンパクのｃＤＮＡクロー
ンｐＨ３−３は、　Ｈｉｎｆｌで消化し、末端を充填し
、　１７ｋｂコード領域を有する４４９ｂｐ断片をゲル
を用いて精製した。ファセオリンの調節配列を有する５
ｋｂ断片と高イオウタンパクをコードする４４９ｂｐ断
片とを連結し、　ＮＭ５２２に導入して形質転換させた
。得られたクローンを、適切な方向でコード配列を有す
るクローンについて制限分析によりスクリーニングし、
ファセオリンとブラジルナツツ領域との間の連結部を配
列決定した。クローンｐＤ３−８−１２は、ブラジルナ
ツツの高イオウタンパクｃＤＮＡの１７ｋｄ前駆体をコ
ードする配列に結合したファセオリンのプロモータおよ
びファセオリンの３°側の非翻訳配列を存する。

Ｅ、　　ｃｏｌｉ　　ＮＭ５２２（ｐＢ３−８−１２）
　は１９８７年６月１９日にアメリカンタイプカルチャ
ーコレクション（ＡＴＣＣ。

１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、、Ｒｏｃｋｖｉ
ｌｌｅ、ＭＤ　２０８５２）に寄託し、受託番号６７４
４５で受託されている。

ブラジルナツツ貯蔵タンパクサブユニットをコ−ドする
付は加えた発現カセットの構築を以下に記述し、第５図
に図示する。

１７ｋｄキメラ遺伝子の構築について記述したプラスミ
ドｐＬ１３を、３つの融合タンパク遺伝子全部の構築に
用いた。■ｓｋｄ、ｉよび９ｋｄ構築物のために。

オリゴヌクレオチド５’−ＣＣＴＣＣＴＣＣＣＧＧＧＧ
ＴＧＡＡＧ−３’を用いた部位特異的変異処理により、
推定されるシグナルペプチド切断部位をちょうど越えた
ところのｐＢ−１３のファセオリン配列内にＳｍａ　１
部位を挿入した。ベクターｐＴＺ１９１１のポリリンカ
ー領域に含まれるＡｃｃ１部位およびＳｍａ　１部位を
、得られたプラスミドｐＨ−７から除去した。これは、
プラスミドｐＨ７−５２−１を得るための１７ｋｂ構築
物の構築で上述したのと同様の方法で行った（第５図に
は示していない）。次に、ファセオリンをコードする配
列を除去するためにｐＥ７−５２−１を違υＩおよびＡ
ｃｃｌで消化し、　Ｐｏ１ｌのクレノー断片を用いて末
端を充填し。

ファセオリンのプロモータ、シグナルペプチドおよび３
′側の非翻訳領域を有する５ｋｂ断片をゲルを用いて精
製した。ブラジルナツツｃＤＮＡクローンｐｕｓ−３を
ＲｓａＩおよびｊ；１ｎｆＩ　（９ｋｄ構築物のため）
、またはｊｌｌおよび１Ｉｉｎｆｌ断片（１５ｋｄ構築
物のため）をゲルを用いて精製した。次いで、これらの
ブラジルナツツの断片をファセオリンの５ｋｂ断片に連
結し、　ＮＭ５２２細胞に導入して形質転換させた。ク
ローンｐＲｓａ−１５（９ｋｄ構築物）およびｐｎｇｔ
−３２（１５ｋｄ構築物）は、適切な方向でブラジルナ
ツツの配列を有していた。

１２ｋｄキメラ遺伝子の構築のために、オリゴヌクレオ
チド５’−ＣＴＣＣＴＣＣＴＣＧＡＧＴＧ八八ＧＴ−３
’を用いた部位へへ的変異処理により、推定されるシグ
ナルペプチド切断部位をちょうど越えたところのｐＢ−
１３のファセオリン遺封予肉にＸｈｏ１部位を挿入し、
プラスミドルルーｎ得た。再び、　ｐＦ−１１のｐＴＺ
１９０部分に見い出されるＡｃｃ１部位を除去し、プラ
スミドｐＦ１１−５０を作製した（この工程は第５図に
は示していない）。次いで、ファセオリンをコードする
配列を除去するためにＸｈｏｌおよび担に■でｐＦｌｌ
−５０を消化し、末端を充填し、ファセオリンのプロモ
ータ、シグナルペプチドおよび３”側の非翻訳領域を有
する５ｋｂ断片をゲルを用いて精製した。ブラジルナツ
ツ高イオウタンパクｃＤＮＡクローンｐＨ５−３をＴｈ
ａ　Ｉおよび１Ｉｉｎｆｌで消化し、末端を充填し、高
イオウタンパクの１２ｋｄｐＪｒ域をコードする３２１
ｂｐ断片をゲルを用いて精製した。次いで、このブラジ
ルナツツの断片とファセオリンの５ｋｂ断片とを連結し
、　ＮＭ５２２細胞に導入して形質転換させた。クロー
ンｐＴｈａ−１８は、ブラジルナツツのインサートを適
切な方向で有していた。

ｐＲｓａ−１５，ｐＢｇｌ−３２およびｐＴｈａ−１８
のファセオリン領域とブラジルナツツ領域との連結部を
配列決定し、この２つのタンパク由来のコード領域が適
切なリーディングフレームを有するように結合されてい
ることを確認した。

キメラ遺伝子をＨｉｎｄＩ［ＩまたはＥｃｏＲＩのいず
れかで消化し、　ｐＡＲＣ８から誘導したプラスミドｐ
ＡＲｃ１２（Ｓｉｍｐｓｏｎ　ら（１９８６）、Ｐｌａ
ｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　６　：４０３；第７図にこ
の構築を示す〕に挿入した。このプラスミドはアグロバ
クテリウム　ツメファシェンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｍ　　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のバイナリ−Ｔｉ
プラスミドベクター系の一部であり、形質転換させた植
物細胞の選択マーカーとしてツバリン合成酵素／ネオマ
イシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＯＳ／ＮＰＴ）キ
メラ遺伝子を有する。ブラジルナツツのキメラ遺伝子を
有するベクターを、アクロバクテリウムＬＢＡ４４０４
株（Ｉｌｏｃｋｅｍａ　ら（１９８３）、Ｎａｔｕｒｅ
　３０３：１７９−１８１１に接合により導入し、得ら
れたバクテリアをタバコの葉部ディスク片に接種するの
に用いた。この植物をカナマイシンを含有する選択培地
（Ｈｏｒｓｈら（１９８５）、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２
７：１２２９−１２３１）で再生させた。

ブラジルナツツのキメラ遺伝子を有するベクターｐＡＲ
ｃ１２を、まずアグロバクテリウム　リゾゲネス（ハｐ
あ巴迫吐Ｕ」旦姐肌競）Ａ４株に接合により導入しくＷ
ｈｉｔｅら（１９８０）、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１
４１：１１３４）　。

得られたバクテリアを成熟アルファルファ植物〔メディ
カゴ　サテイバ　Ｌ、　（勤…９紐５ａｔｉｖａ　Ｌ、
））の茎部に接種するのに用いた。ＴＭ−１固形培地で
２〜３週間週間インキ−ベート後、これらの茎部に根毛
が誘導された。この根毛を切除し、さらに増殖させるた
めにホルモンを含有しないＴＭ−４培地で培養した（Ｓ
ｈａｈｉｎ（１９８５）、Ｔｈｅｏｒ、Ａｐｐｌ、Ｇｅ
ｎｅｔ、６９：２３６）。

形質転換をモニターするために、　ＮＰＴ分析［Ｒｅ１
ｓｓら（１９８４）、Ｇｅｎｅ　３０：２１１）を用い
た。この根毛をカルス誘導培地に移植した。次に根毛か
ら誘導されたカルスをＬＢ−３培地に移植し１次いで胚
芽を分化させるためにＴト４０培地に移植した。アルフ
ァルファ植物の再生は、　ＴＭ−１培地またはＢＯｉＹ
２培地〔Ｂｉｎｇｈａｍら（１９７６）、Ｃｒｏｐ、５
ｃｉｅｎｃｅ　１５：　７１９　）における胚芽の連続
的な２次培養により行うことができた。この培養は、　
５ｕｋｈａｐｉｎｄａら（１９８７）、　ＰｌａｎｔＭ
ｏｌ、Ｂｉｏｌ、　　８　：２０９が報告したようにし
て行った。

上述の実施態様の変更は、当業者カセ容易に実施しうる
ちのであり、特許請求の範囲に記載されているような本
発明の範囲から逸脱するものではない。

（発明の要約） バーツレティア　エクセルサＨ，に、Ｂ、由来の高イオ
う２Ｓ種子貯蔵タンパクの生産を誘導することにより、
植物および植物組織の栄養を改良する方法および構成が
提供される。

４、゛　の　−な普゛■ 第１図は、ブラジルナツツの高イオウ２Ｓ種子貯蔵タン
パクのアイソフオームをコードするｃＤＮＡの全核酸配
列を示す配列図である。推定アミノ酸配列および精製タ
ンパクで決定したアミノ酸配列も共に示す。

第２図は、ブラジルナツツの高イオウ貯蔵タンパクのゲ
ノムクローンの配列、および該配列とｃＤＮＡ配列との
比較を示す配列図である。

第３図は、ブラジルナツツの高イオウ貯蔵タンパクのプ
レプロ配列の、２つの成熟サブユニットへのプロセッシ
ングを示す模式図である。

第４図および第５図は、ブラジルナツツの高イオウポリ
ペプチドをコードする発現カセット構築の模式図である
。

第６図は、　　（Ａ）　９　ｋｄサブユニットの部分ア
ミノ酸配列、および（Ｂ）　ｃＤＮＡのクローニングに
用いるプローブを示す配列図である。

第７図は、　ｐＡＲｃ１２の構築を示す模式図である。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バーソレティアエクセルサ（￥Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅ
   ｔｉａ￥￥ｅｘｃｅｌｓａ￥）Ｈ．Ｂ．Ｋ．の高イオウ
   ２Ｓ種子貯蔵タンパクの少なくとも１つのサブユニット
   をコードするコード配列を、細胞において該コード配列
   を転写させる調節配列の制御下に、有する発現カセット
   を含み、該調節配列のプロモータが該コード配列と異種
   である、ＤＮＡ分子。２、バーソレティアエクセルサＨ
   ．Ｂ．Ｋ．の高イオウ２Ｓ種子貯蔵タンパクの少なくと
   も１つのサブユニットをコードするコード配列を、細胞
   において該コード配列を転写させる調節配列の制御下に
   、有する発現カセットを含み、該コード配列が該サブユ
   ニットと異種であるシグナル配列もまたコードする、Ｄ
   ＮＡ分子。 ３、前記プロモータが種子貯蔵タンパクのプロモータで
   ある、特許請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。 ４、前記シグナル配列が種子貯蔵タンパクのシグナル配
   列である、特許請求の範囲第２項に記載のＤＮＡ分子。 ５、前記種子貯蔵タンパクがファセオリンである、特許
   請求の範囲第３項に記載のＤＮＡ分子。 ６、前記種子貯蔵タンパクがファセオリンである、特許
   請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ分子。 ７、前記コード配列が前記貯蔵タンパクの１７ｋｄプレ
   プロペプチドをコードする、特許請求の範囲第１項に記
   載のＤＮＡ分子。 ８、前記コード配列が前記貯蔵タンパクの１５ｋｄプロ
   ペプチドをコードする、特許請求の範囲第１項に記載の
   ＤＮＡ分子。 ９、前記コード配列が前記貯蔵タンパクの１２ｋｄプロ
   ペプチドをコードする、特許請求の範囲第１項に記載の
   ＤＮＡ分子。 １０、前記コード配列が前記貯蔵タンパクの９ｋｄサブ
   ユニットをコードする、特許請求の範囲第１項に記載の
   ＤＮＡ分子。 １１、前記コード配列が前記貯蔵タンパクの３ｋｄサブ
   ユニットをコードする、特許請求の範囲第１項に記載の
   ＤＮＡ分子。 １２、バーソレティアエクセルサＨ．Ｂ．Ｋ．の高イオ
   ウ２Ｓ種子貯蔵タンパクの少なくとも１つのサブユニッ
   トをコードするＤＮＡコード配列を、細胞において該コ
   ード配列を転写させるＤＮＡ調節配列の制御下に、有す
   る発現カセットを含むレプリコンを含有し、該サブユニ
   ットが該細胞と異種である、細胞。 １３、前記調節配列のプロモータが前記２Ｓ種子貯蔵タ
   ンパクのプロモータとは異なるプロモータである、特許
   請求の範囲第１０項に記載の細胞。 １４、前記サブユニットが異種のシグナル配列と結合し
   て発現される、特許請求の範囲第１３項に記載の細胞。 １５、高等植物細胞である、特許請求の範囲第１２項に
   記載の細胞。 １６、前記プロモータが種子貯蔵タンパクのプロモータ
   である、特許請求の範囲第１５項に記載の細胞。 １７、前記種子貯蔵タンパクがファセオリンである、特
   許請求の範囲第１６項に記載の細胞。 １８、前記サブユニットがファセオリンのシグナル配列
   と結合して発現される、特許請求の範囲第１５項に記載
   の細胞。 １９、特許請求の範囲第１５項に記載の細胞を含む植物
   組織。 ２０、特許請求の範囲第１９項に記載の植物組織を含む
   種子。 ２１、特許請求の範囲第２０項に記載のマメ科植物の種
   子。 ２２、バーソレティアエクセルサＨ．Ｂ．Ｋ．の高イオ
   ウ２Ｓ貯蔵タンパクを含有する、バーソレティアエクセ
   ルサＨ．Ｂ．Ｋ．以外の植物種子。 ２３、特許請求の範囲第１９項に記載の植物組織を含む
   植物。