JPH02501802A - 遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵趣旨タンパク質遺伝子の発現による生物学的 に活性なペプチドの製造方法 本発明は、適当な植物遺伝子の修飾により、有用で生物学的に活性な、ポリペプ チドを生成する方法に関する。

容易に純化できる形でかつ有用な量で一定の生物学的に活性なポリペプチドを生 成することには今なおほとんどの場合において多大な問題点がある。

代替的な手法として挙げられるのは、化学的合成又は遺伝的に処理された微生物 による製造である。第１の手法は、きわめて費用のかかる手法であり、しかも往 々にして、適正なコンフォーメーション（立体配座）をもつポリペプチドが得ら れない、後者の手法は、ポリペプチドの不安定さ、細胞内沈降そして純粋な形で の生成物の純化といった問題点のため、むずかしいものである、その上、ホルモ ンペプチドを含むいくつかのクラスのペプチドは、適正なジスルフィドブリッジ 形成、アセチル化、グリコジル化又はメチル化といった付加的な処理の後に初め て充分な活性を有することになる。天然においては、ジスルフィドブリッジは、 前駆体の膜転移の間にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（異性化酵素）によ る同時翻訳触媒作用を受けるため、きわめて高効率で形成される０次に、タンパ ク質分解印割により、前駆体から活性形が誘導される。

化学的に合成された又は原核系内で過剰生産されたペプチドは一般に還元された 形で得られ、従って、次に、システィン残基の穏やかな酸化によりジスルフィド ブリッジを形成させなくてはならない、往々してペプチドの充分に変性された「 スクランブル」状態から出発するため、このときジスルフィドブリッジの形成は 不規則過程であり、この間に分子間架橋（より高い分子量の会合物を生成する） ならびに不適切なジスルフィド結合（不活性ペプチドを生成する）が正しく折り たたまれたペプチドの他に生成される可能性がある。

一定のペプチドを製造するためのシステムとして植０１５９９などにおいて提案 されてきた。この特許の・中では、既知の技法（ＥＰ８３１１２９８５．３）に 従った前記ペプチドを構造的に表現へともって行くことを原理とする提案されて いる方法が、植物の生理を乱すことなく高い発現レベルを得ることそして植物タ ンパク質から分離することによりかかるペプチドを回収する上で高い収量を得る ことを可能にするものである、ということは実証されていない、このことは特に 、植物全体があるがままの形で用いられ土中で育てられる場合に言えることであ る。

本発明の目的は、これらの問題点を克服し、経済的に価値ある方法及び大量に生 産できる遺伝子的に処理された生物体を提供することにある。この方法において 、一定のポリペプチドは、かかる生物体の生理を乱すことなく大量に合成されつ ると同時に、同じ又はは　′ぼ同じアミノ酸配列をもつ野生型ペプチドに共通の 高度の生理学的活性を提供する形で生成され、また、かかる生物体から容易に回 収されつる。

さらに詳しく言うと、本発明の目的は、遺伝的に修飾された植物ＤＮＡならびに かかる植物材料の細胞で複製可能なこの遺伝的に修飾されたＤＮＡを含む植物の 生きた材料を提供することにある。ここで遺伝的に修飾された植物のＤＮＡは、 相応する植物の成長の少なくとも１段階においてその発現を実施させる一定の与 えられた植物プロモータによって表現が制御されているような前記一定のポリペ プチドについてコード付けする配列を含んでいる。この成長段階は、大量に作ら れしかも容易に回収可能な植物の器官又は組織内で発現が起きるように選ばれる 。

本発明のもう１つの目的は、種子の貯蔵タンパク質に備わっている、植物中に大 量に生産される能力及びかかる植物の一定の成長段階とくに種子形成段階におい て発現される能力を利用することにある。さらに詳しく言うと、本発明は、水溶 性貯蔵タンパク質が相応する植物の種子から容易に回収されつるという点を利用 することをその目的としている。

植物内での外来性遺伝子の発現は充分に立証されている（Ｄｅ　Ｂｌａｅｒｅ他 、１９８７年）、いくつかの事例において、種子の貯蔵タンパク質遺伝子が他の 植物内に移入された。またいくつかの事例において、移入された種子の貯蔵タン パク質遺伝子がその新しい環境の中で、組織特異的でかつ発育調製された形で表 現されるということが示された。　（Ｂｅａｃｈｙ他、１９８５年；Ｏｋａｍｕ ｒｏ他、１９８６年；　Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ他１１９８５年；　 Ｈｉｇｇｉｎｓ他、１９８６年）、このことはすなわち、移入された遺伝子が、 種子の適当な部分内でしかも正規の時点でのみ発現される、ということを意味し ている。同様に、少なくとも１つの事例において、外来性種子貯蔵タンパク質が 宿主植物のタンパク粒の中に位置づけられていることも示されたむしろｃＤＮＡ がキメラ遺伝子のためのベースとじて用いられた場合に、安定した機能的な伝令 ＲＮＡを得ることができるということも立証された（Ｃｈｅｅ他、１９８６年） 。

種子貯蔵タンパク質は、多くの植物の種子内で全種子タンパク質の最高９０％を 占めている。これらは、発芽直後の若い苗のための栄養源として用いられる。こ れらをコード付けしている遺伝子は、厳しく制御されており、きわめて組織特異 的かつ段階特異的な形で発現される（Ｗａｌｌｉｎｇ他、１９８６年；　Ｈｉｇ ｇｉｎｓ他、１９８４年）、従ってこれらは、はぼ排他的に発育する種子内での み発現され、異なるクラスの種子貯蔵タンパク質は、その種子の異なる発育段階 で発現されつる。これらは一般にその細胞内位置に関して制限を受けており、タ ンパク粒（プロティンボディ）又はタンパク質貯蔵液胞と呼ばれる、膜で結合さ れた細胞小器官（オルガネラ）内に貯蔵されている。これらの細胞小器官は、プ ロテアーゼの無い環境を提供し、父性々にしてプロテアーゼ抑制因子をも含んで いる。これらのタンパク質は、開花の時点で減成され、発育中の種子のための栄 養源として役立つものと考えられている。これらのタンパク質のうちのいくつか のクラスについて単純な純化技法が記述されてきた。

種子貯蔵タンパク質は、例えばＳｖｅｄｂｅｒｇが規定しているように（Ｓｔ、 ｒｙｅｒ、　Ｌ、　、著ｒＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（生化学）」、第２版内 、Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ｐ５９９）、一般に可溶性とサイズ（さらに限定的に言うと沈降速度）に基づい て分類される。１つの特定のクラスの種子貯蔵タンパク質が研究された。すなわ ち、水溶性あるアルブミン類であり従って他のタンパク質から容易に分離される ２８種子貯蔵タンパク質である。これらはサイズが小さいこともあって純化が単 純になっている。い（つかの２Ｓ貯蔵タンパク質が、タンパク質又はｃＤＮＡの いずれかのレベルで特徴づけされてきた（　Ｃｒｏｕｃｈ他、１９８３年；　５ ｈａｒｉｅｆ　＆Ｌｉ、１９８２年；　Ａｍｐｅ他、１９８６年；　Ａｌｔｅｎ ｂａｃｈ他、１９８７年；　Ｅｒ１ｃｓｏｎ他、１９８６年：　５ｃｏｆｉｅｌ ｄ　＆Ｃｒｏｕｃｈ、　１９８７年；　Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ他、１９８７年：そ して本出願明細書に記述されている研究）、２Ｓアルブミンは、ジスルフィドブ リッジにより連結された、それぞれ６〜９及び３〜４キロダルトン（ｋｄ）の２ つのサブユニットから細胞内で形成される。

上述の参考図書内の研究は、２Ｓアルブミンが、数多くの異なる種の２Ｓアルブ ミン間で共有の構成をもつ複合ブリプロペプチドとして合成され、第２図にこれ らの種のうちの３つについて概略的に示されているとおりである、ということを 示していた。いくつかの完全な配列が第２図に示されている。

２Ｓアルブミンのタンパク質配列に関する第２図については、以下のような観察 が行なわれる＊Ｌユ肛三、　Ｂ、　ｅｘｃｅｌｓｉａ及びＡ、　ｔｈａｌｉａｎ ａについては、タンパク質及びＤＮＡの両配列が共に決定された。　Ｒ，ｃｏｍ ｍｕｎｉｓについては、タンパク質配列のみが利用可能である。（Ｌユ肛胚はＣ ｒｏｕｃｈ他、１９８３年及びＥｒ１ｃｓｏｎ他、１９８６年より：　Ｂ、　ｅ ｘｃｅｌｓｉａは、Ａｎ＋ｐｅ他、１９８６年、ｄｅ　Ｃａ５ｔｒｏ他、１９８ ７年及びＡｌｔｅｎｂａｅｈ他、１９８７年より：　Ｒ，ｃｏｍｍｕｎｉｓは５ ｈａｒｉｅｆ他、１９８２年より）、囲みは、相同性を表わしており、高くなっ た点はシスティンの位置を表わしている。

前駆体の初めのタンパク質配列と、シグナルペプチドの標準的コンセンサス配列 を比較すると、この前駆体が、成熟タンパク質では存在しない１つではなく２つ のセグメントをアミノ末端基において有しており、そのうちの最初のものがシグ ナル配列であり（Ｐｅｒ１ｍａｎ＆　Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ、１９８３年）、第２ のものはアミノ末端基処理済フラグメントと呼称された（いわゆるＡＴＰＥ）、 シグナル配列は、小胞体の膜を横切っての未完成ポリペプチドの同時翻訳輸送を 確実に行なうのに役立ち（Ｂｌｏｂｅｌ、１９８０年）、これまでに研究されで きた全ての種子貯蔵タンパク質を含む数多くのクイブのタンパク質内に見い出さ れる（　Ｈｅｒｍａｎ他、１９８６年）、これは、タンパク質の適当な区画化に とってきわめて重要である。タンパク質はさらに、正しいジスルフィドブリッジ が形成されるような形で折りたたまれる。このプロセスはおそらく、酵素ジスル フィドイソメラーゼが局在化されている小胞体膜の管腔部位に局在化される（Ｒ ｏｄｅｎ他、１９８２年ＨＢｅｒｇｍａｎ　＆　Ｋｕｅｈｌ、１９７９年）、小 胞体膜を、横切っての転座の後、はとんどの貯蔵タンパク質は前記小胞体を経由 してゴルジ体へと輸送され、次にそこから小さな膜で結合された小胞（「密な小 胞」）内をタンパク粒へと輸送される（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、１９８３年：Ｃ ｒａｉｇ　＆　Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ、１９８４年；　Ｌｏｒｄ、１９８５年）、 シグナルペプチドが同時翻訳して除去されるということはすなわちタンパク粒へ の種子貯蔵タンパク質のそれ以上の輸送を検出するシグナルが、存在するタンパ ク質配列の残りの部分にあるにちがいないということを暗に意味している。

２Ｓアルブミン類は、成熟ポリペプチド内には存在しないシグナル配列以外の配 列を前駆体のアミノ末端に含んでいる。これは、全ての貯蔵タンパク質に一般的 なことではない、このアミノ末端基処理済フラグメントは、第１図においてはＰ ｒｏと、そして第２図ではＡＴＰＦと標識づけされている。

さらに、第１図及び第１Ａ図に示されているように、前駆体内で小さなサブユニ ットと大きなサブユニットの間に位置づけされているいくつかのアミ、ノ酸は除 去される［第１図では１ｉｎｋ、第１Ａ図ではＩＰＦと標識づけされており、Ｉ ＰＦは内部処理フラグメント（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ　ｆｒａ ｇｍｅｎｔ）を意味する］、さらに、前駆体のカルボキシル末端基からいくつか の残基が除去される［第１図はＴａ１ｉ、第１Ａ図ではＣＴＰＦと標識づけされ ており、ＣＴＰＦはカルボキシル末端基処理フラグメント（ｃａｒｂｏｘｙｌ　 ｔｅｒｍｉｎａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）を意味する］、これ ら後者の処理段階の細胞位置づけは不確かであるが、タンパク粒である可能性が 最も高い（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、　１９８３年；Ｌｏｒｄ、１９８５年）、こ れらの処理段階の結果として、小さなサブユニット（Ｓｍ１．５ｕｂ）及び大き いサブユニットが残る。これらは、以下に述べるようにジスルフィドにより連結 される。

種々の植物の２８−アルブミン類のタンパク質配列を比較すると、強い構造的類 似性がみられる。このことは、さらに詳しくは、第２図及び第２Ａ図で例示され ている。これらの図は以下のような異なる植物の代表的な２Ｓ−貯蔵種子アルブ ミンタンパク質のそれぞれ小サブユニット及び大サブユニットのアミノ酸配列を 与えている： Ｒ，ｃｏｍｍ、　：　Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓＡ、　ｔｈａｌｉ　； 　Ａｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａＢ、　ｎａｐｕｓ　；　Ｂｒａｓ ｓｉｃａ　ｎａ　ｕｓＢ、　ｅｘｃｅｌ　；　Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ　ｅｘ ｃｅｌｓａ（ブラジル産ナツツ） 第２図及び第２Ａ図においては以下のことに留意しなくてはならない。

−前記サブユニットのアミノ酸配列は、複数のライン上に広がっている。

−例として示されている貯蔵タンパク質のアミノ酸配列及び前記タンパク質のう ちのいくつかの中の同様なアミノ酸のシスティン基は、垂直に整列させられてい る：これらの配列のいくつかの中に現われるハイフン記号は、アミノ酸欠損言い 換えるとそれら′　ととり囲む最も近いアミノ酸の間の直接連結を表わしている 。

−異なるタンパク質においてはほぼ保存されているアミノ酸配列が、枠で囲まれ ている。

全ての配列は、ｋ吐赳匹紅り旦虱ｎ皿の２８−アルブミンの実験により立証され た真の構造を表わすというよりはむしろ（本論述を目的とした）仮想モデルを表 わしている第３図に概略的に示されているようなジスルフィドブリッジ内に参与 しつる８つのシスティン残基（小サブユニット内に第１と第２のもの、残りは大 サブユニット内）を含んでいる、ということがわかる、かかる仮想モデルは、血 清アルブミン（Ｂｒｏｗｎ。

１９７６年）、アルファ胎児タンパク（Ｊａｇｏｄｚｉｎｓｋｉ他、１９８７年 ；　Ｍｏｒｉｎａｇａ他、１９８３年）及び、類似の一定のＣ−Ｃダブレット及 びＣ−Ｘ−ＣトリブレットがみられたビタミンＤ結合タンパク質（Ｙａｎｇ他、 １９８５年）のような動物性アルブミンのジスルフィドブリッジが媒介となった ループ形成よりヒントを得たものである。

さらに、システィン残基の間の距離は、大サブユニット内の第６と第７のシステ ィン残基の間の距離を除いて、各サブユニット内でほぼ一定に保たれている。こ のことは、これらの配置が構造的に重要であるものの、この第６と第７のシステ ィンの間で大サブユニット内で成る程度の変化が許されるということを示唆して いる。

起こさずに修飾されうるような貯蔵タンパク質の領域の決定に基づいている。こ の領域（第３図に拡幅された斜線入り部分で概略的に示されている）は、以下の 例において「超可変部」と呼ばれる。第３図はまた、前駆体の小サブユニットと 大サブユニットを分離するｒＩＰＦＪセクションならびに、タンパク質サブユニ ットのシスティン残基のほぼ保持された部分内のアミノ酸の数（ａ　ａ）を含め て、前駆体配列の他の部分のそれぞれの位置も示している。処理開裂部位は、マ という記号で示されている。

数多くの植物の種子は、上述の貯蔵タンパク質とほぼ同じサイズのアルブミンを 含んでいる。しかしながら文言を簡略にするため、ここでは、第１図に示されて いる全体的構造のペプチド前駆体をコード付けする遺伝子をもち、ジスルフィド ブリッジにより連結された２つのサブユニットから成る最終的な形に処理される 種子タンパク質を指して、ｒ２Ｓアルブミン」という語を用いる。これは、以下 に記述する方法がこのような２Ｓアルブミンのみに適用できることを意味すると みなされてはならない。

問題の一定のポリペプチドを生成するための本発明に従った方法は、 −−世代又は複数世代にわたり、再生された植物細胞から又はこの再生植物細胞 から得られた植物の゛種子から得た植物を栽培する段階、（なおここにおいて、 かかる植物内で複製可能なこの植物細胞の遺伝的遺産又は情報には、種子特異的 なプロモータの制御下に置かれた核酸配列が含まれている。これは、かかる植物 のシグナルペプチドを含む貯蔵タンパク質の前駆体の少なくとも一部分をコード 付けするｍＲＮＡに転写され、前記核酸は以下「前駆体コード付は核酸」と呼ば れる） ・なおここで、かかる核酸には１つのヌクレオチド配列（以下「関連配列」と呼 ぶ）が含まれ、かかる関連配列は、その中で自らをとり囲む未修飾部分と共に読 みとり段階においてオーブンリーディングフレームを形成する非相同核酸インサ ートにより修飾された可欠領域を含んでいる；・かかるインサートは、前記問題 のポリペプチドをコード付けするヌクレオチドセグメントを含んでいる： ・前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサート又は隣接する末端のい ずれか又はその両方に属するヌクレオチドを有する単数又は複数のコドンにより 、前記関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結されている； ・前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列によりコード付けされた雑 種貯蔵タンパク質又は貯蔵タンパク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲 む選択的に開裂可能な境界部位を構成する単数又は複数のアミノ酸残基をコード 付けするニ ー　栽培された植物の種子を回収し、その中に含まれている雑種貯蔵タンパク質 を抽出する段階；−開裂部位レベルで前記雑種貯蔵タンパク質から問題のペプチ ドを開裂させる段階：そして−問題のペプチドを純化された形で回収する段階を 含んでいる。

上述の条件の下で、栽培された植物の各々全ての細胞が修飾された核酸を含んで いることがわかるだろう、それでも上述の組換え型つまり雑種の配列は、栽培さ れた植物の種子形成段階のみにおいて又はほとんどこの段階において発現され、 従って雑種タンパク質は大部分がこの種子内で生成されることになる。

上述の「非相同核酸インサート」は、少なくとも一部分が当該種子又は植物の貯 蔵タンパク質の前駆体をコード付けする天然の核酸にとって外来性のものである ようなヌクレオチド配列を含むインサートから成る。最も一般的には１問題のポ リペプチドをコード付けするセグメントはそれ自体、前記貯蔵タンパク質の前駆 体をコード付けする天然の核酸にとって外来性のものである。それでも、「非相 同核酸インサート」という語は、上述の種子又は植物細胞の遺伝的財産又は情報 の中に通常存在する上述のようなセグメントを含むインサートをも含んでいる。

このとき前記インサートの「非相同」性は、その両側でそれをとり囲み前記セグ メントを前記前駆体をコード付けする核酸の未修飾部分に連結する単数又は複数 のコドンに向けられているのである。上述の最後に示した状況の下で、本発明は このように、植物の種子形成段階またはその発育のその他の段階のいずれにおい ても、また種子のタンパク球内又は前記植物細胞の他のいずれの場所においてで あれ、通常植物自体の中で作られる貴重なタンパク質を生成し容易に分離し回収 することを可能にするような方法を提供している。

ｒ問題のポリペプチド」は、通常、本発明に基づく方法の最終段階において雑種 貯蔵タンパク質から開裂されたとき、生物学的特性のうち少なくともその問題の 単一のポリペプチド又はタンパク質によって処理されるべきものを保持又は回復 するような単一のポリペプチド又はタンパク質で構成される０問題のポリペプチ ドが保持すべき特性の、制限的な意味をもたない一例として、酵素活性又は治療 効果、一定の抗体により認識されつる能力、免疫学的特性例えば、生きた宿主内 でかかる問題のペプチド又はこの「問題のポリペプチド」と同じ又は類似したア ミノ酸配列を含む抗原を含む病原性因子を中和できる抗体を惹起（誘発）する能 力などを挙げることができる。

ただし、「問題のポリペプチド」はまた、とくに何らかの望ましい生物学的活性 をもつ個々のペプチド又はポリペプチドのユニットの反復をも含みつる。かかる ユニットは、生物学的なユニット又は反復を互いに分離することができるように している開裂可能な部位の上又はその中を通して互いに合わさっている。決定的 なものではないものの、このような開裂可能な部位は、「問題のポリペプチド」 全体が雑種貯蔵タンパク質から開裂されうるようにする上述のような「境界制限 酵素」などの同じ開裂手段と同一であるか又は、これに対して感応性をもつとい う利点がある。実際、活性ユニットの互いからの分離は、このとき上述の「開裂 （切り出し）」オペレーションと同時に達成されつる。それでも異なるユニット 又は反復は、異なる開裂部位を通して結合される可能性があり、こうしてこのユ ニットの互いの分離は、雑種貯蔵タンパク質からの前記「問題のポリペプチド」 の「開裂」オペレーションの後に続いて行なわれつる。

当然のことながら問題のポリペプチド内の反復ユニットの数は、本書中に規定さ れている条件の下で関連する貯蔵タンパク質内に取り込まれつる問題のポリペプ チドの最大長さによって異なる。

本発明に基づく方法についての上述の定義づけにおいて、前駆体をコード付けす る前記核酸の関連配列のいわゆる「可欠領域」は、未修飾の天然の貯蔵タンパク 質のものに比べて結果として得られた上記雑種貯蔵クンバク質の全体的構成が変 わることなく、又、それ相応に修飾された未完成雑種貯蔵タンパク質の上述のタ ンパク球内への輸送に変化を与えることなく、上述のインサートをその中に挿入 するか又はかかるインサートで前記可欠領域の少なくとも一部分を置換すること によって修飾されつるようなヌクレオチド配列をもつ領域から成る。

本発明においては、上述の前駆体コード付は核酸は当然のことながら、本発明に て栽培されているものと同じ植物種から出てきたものであってよい、しがしこれ は又、すでに登記されているＢｅａｃｈｅｙ他、１９８５年及びＯｋａｍｕｒｏ 他、１９８７年の教示に沿って、その他の植物種から出てきたものであってもよ い。

同様に、種子特異的プロモータは、同じ植物種からのものでも異なる植物種から のものでもよい、ただし、後者の場合、宿主植物のポリメラーゼにそれを認識す る能力があることを条件とする。

貯蔵クンバク質内の可欠領域の位置づけについては、どんな方法でも用いること ができる。この領域がひとたびタンパク質配列レベルで規定されると、前駆体コ ード付は核酸の相応する領域を変えることができる０例えば、分子モデリングに よる二次的及び三次的タンパク質構造の設定に基づく方法を用いて、可欠領域を 位置付けることができる。このようなモデルは、より高次の集合におけるその構 成又は相互作用にとってきわめて重要なタンパク質の領域の識別を可能にする。

このような技術が無い場合、さまざまな植物種からの類似のタンパク質のペプチ ド配列を比較することができる。前記ペプチド配列が共通してもっている副配列 （そしてこの一応の証明のある事実は、有害な形でペプチドの構造、処理、細胞 内通過又はパッケージングに影響を及ぼすことなくこれらを修飾することは、で きないという仮定を裏づけることになる）、これらが、そのとき一定の非相同イ ンサートによる修飾に適しているとみなされつる「可欠領域」で構成されうると いう仮定を裏づけるためには互いに異なりすぎているような副配列とは、区別さ れつるものである。

このようなアプローチは、異なる植物からのいくつかの同じような貯蔵タンパク 質の核酸配列又はタンパク質配列が確認されている場合に可能である（２Ｓアル ブミンの場合のように）、このとき適切な方法には、アミノ酸配列又は長さ或い はその両方におレプる可変性を受けているペプチド領域をコード付けする前記核 酸領域を、逆に前記いくつかの植物種の間でアミノ酸配列の大刀の保存を示して いる領域との比較において識別する作業が含まれている。研究中の貯蔵クンバク 質がシスティン残基な含み、さらにかかるシスティンが、当該貯蔵タンパク質の 構造及びコンフォメーションの設定に重要な役割を果たす可能性の高いジスルフ ィドブリッジに参加するということが考えられている又は実験データを通してす でにわがっている場合、この方法は、このことを考慮に入れるように拡張されな くてはならない、この場合、システィン残基は貯蔵タンパク質の修飾により変え られた残基のうちのいずれかであってはならず、類似タンパク質のタンパク質配 列の配列比較によってシスティン間の距離（アミノ酸残基内の）が保持されてい ることがわがった場合、この距離はその後のいかなる修飾によっても変えられて はならない、このようにして選択されたタンパク質配列内の前記可欠領域はこの とき、前駆体コード付は核酸の相応する領域内に望ましいペプチド生成物をコー ド付けする核酸セグメントを挿入することにより修飾することができ、かかる修 飾が達成された後、植物の発育の種子形成段階において回収可能な種子内の修飾 された貯蔵タンパク質の発現を検定することができる。

１つの領域を修飾にもっていくことができるものであると考えるか否か決定する ため当業者が利用できる”　もう１つの方法は、かかる修飾を行なうこと、モし キメラタンパク質を経済的に有利な量だけ生成するには適切ではないもののキメ ラタンパク質が安定していれば分析のため少量を生成するような複数の発現シス テムのうちのいずれかでキメラ遺伝子を発現することから成る。このような実験 においては、未修飾のタンパク質も対照として発現させられなくてはならない、 このようなシステムとしては（ただし制限的な意味無く）、Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ ｅａｖｅｓオオキスト（接合子嚢）　（Ｂａｓ−ｓｅｎｅｒ他、１９８３年）、 植物のクロロプラスト（葉緑体）内の一過性発現（Ｆｒｏｍｍ他、１９８５年） 、酵母菌（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ他、１９８５年）、植物のカルス（仮置）及び Ａｃｅｔａｂｕｌａｒｉａ　（カサノリ属）システムがある。後者のものは、ゼ イン遺伝子の機能的分析及びリジンをコード付けする配列によるその修飾のため にＢｒｏｗｎ他（１９８６年）により用いられた。

修飾すべき植物細胞中に移入されるべき修飾された核酸を生成するために、２Ｓ −タンパク質特に水溶性の２Ｓ−タンパク質の前駆体をコード付けする前駆体コ ード付は核酸を選択することは、既に記録されている理由により、きわめて魅力 のあることである。

第２図及び第２Ａ図を見ればわかるように、タンパク質の小さなづブユニット内 では第１及び第２のシスティンの間、タンパク質の大きいサブユニット内ではま ず第５と第６のシスティン間そして第７と第８のシスティン間に介在している領 域は、かなりの保存度つまり類似性を示している。従って、これらの領域は、な んらかの形で、植物の種子内で合成されたときのタンパク質の適切なひだ形成及 び／又は安定性にとってきわめて重要である。

逆に、小サブユニットの終り、大サブユニットの最初と終りにおけるようなその 他の領域は、きわめて大きな差異を示しているため、これらはタンパク質の最終 的特性に対し多大な影響を全く及ぼすものではないものと仮定して保持すること ができる０重要であると思われない領域は、大きなサブユニット内で、成熟タン パク質の第６と第７のシスティンの間にある領域の中央位置から成る０図面（第 ２図）をみるとわかるように、し」と匹は、前にあるＱアミノ酸と後にくる■ア ミノ酸の間にＣＫＱＱＭ配列を有し、一方同じレベルで、Ａ、　ｔｈａｌｉは同 じ近隣のｓｅｉｇｈｂｏｕｒｉｎｇｈｅｉｇｈｂｏｕｒｉｎｇアミノ酸の間で同 様な配列を全く有しておらず、Ｂ、　ｅｘｅｅｌ及びＲ，ｃｏｍｍ、は、それぞ れさらに短いＣＥＱ及びＣＱペプチドを含んでいる。従り°Ｃ、アミノ酸残基の レベルにおける類似性の欠如に加えて、この領域を最長の２８アルブミンでの置 換及び最短の２５アルブミ：ノにおけるアミノ酸付加又はその両方の延長のため に好適なものとしている長さの相違があるように思われる。

同じ観察は、前記第６と第７のシスティンの間の同じ領域の最初の第３部分のほ ぼ終りのレベルにもあてはまる：その他の例示された２Ｓ−タンパク質の相応す る領域に比べてその領域においてはるかに短いものであるＲ、　ｃｏｍｍｕｎ島 の配列を参照のこと。

当業者の技能の範囲内にある実験によると、成熟タンパク質の上述の第６及び第 ７のシスティンに隣接するその他のアミノ酸のうちのどれほどが、雑種タンパク 質の安定性及び適正な処理を妨げることなくさらに置換されうるかがわかる０例 えば、実験により、Ｌ凹２凹の上述のＧＫＱＱＭ配列にその上流及び下流で隣接 しているその他のアミノ酸のうちのどれほどがさらに、正常な７２Ｓ−アルブミ ンの基本的特性を雑種クンバク質が失うことなしに、形成される可能性のある雑 種タンパク質をさらに置換させること無（置換されつるか、がわかる、考慮され ている修飾は、好ましくは、関連するシスティン例えば２５−成熟タンパク質の 第６及び第７のシスティンに隣接する３つの好ましくは６つのアミノ酸に影響を 与えるべきではない。

当然のことながら、他の場所では甚だしい差異を示すタンパク質の類似した部分 を一列にすることが関わってくるような任意の選択に基づく仮定に対しては用心 しなくてはならないということがわかる。それでも、かかる比較はその他の遺伝 学の分野においては、当業者に対して、異なるソースの類似したタンパク質にお いて一方では局所的な構造的差異から他方では局所的類似性から、（なお外来性 の又は非相同性の配列により局所的に修飾された同じタンパク質内に未修飾タン パク質の基本的特性のいくつかを保持しなくてはならない場合に）かかるタンパ ク質のどの部分が修飾できどの部分が修飾できないかを合理的に推測するための 適切な指針を与えてくれるものである。

従って、確認の要はあるものの、１つのタンパク質又はそのサブユニットのいず れの部分でも、異なるアミノ酸配列を有するペプチドによる置換に適していると みなすことができる、ということが一応の証明ある事実と考えられている。

本発明に基づく方法において用いられるべき適切な可欠領域の選択は、同様に、 問題のペプチドの長さによっても左右される。従って基本的には本発明に基づく 方法は、長さがアミノ酸３〜１００個の範囲にある生物学的に活性のポリペプチ ドの生成を可能にする。この生物学的に活性なポリペプチドは、植物性のもので あってもよいし、又は、細菌、菌類、藻類又は無せきつい動物又は哺乳類のよう なせきつい動物を源とする植物種非特異的なポリペプチドであってもよい。

関連貯蔵タンパク質例えば２Ｓ−タンパク質又はそのサブユニットの適当な領域 内に挿入されるべき配列（インサート）は、通常、この問題のポリペプチドをコ ード付けするセグメントのみならず例えばプロテアーゼ又は化学的処理により開 裂可能な上述のアミノ酸接合部を形成するアミノ酸又はペプチドをコード付けす るコドン（或いは又前駆体コード付は核酸の関連ヌクレオチド配列の非修飾部分 の隣接するヌクレオチドが適当にコドンを補足することになった場合にはこのコ ドンの一部分）をも含んでおり、このため問題めペプチドは後に、純化された２ Ｓタンパク質から回収されつる。この接合部−配列は、２本鎖オリゴマーとして 、或いは又遺伝子の一部分が使用可能である場合には、制限フラグメントとして 作ることができるが、後者の場合、開裂部位例えばプロテアーゼ開裂部位が一般 に付加されなくてはならない０問題のペプチドを縁どる配列の選択は、プロセス の最終段階において、このペプチドを純化するために用いられるべき技法に左右 されるいくつかの要因に応じて異なる０問題のペプチドは、問題のペプチドの配 列が内部の類似開裂部位を含んでいないことを条件として、いかなるタンパク質 分解印割部位でも側面に有することができる。最後に、プロテアーゼ及び／又は 化学的開裂試薬は、特異的でかつ直ちに入手できなくてはならない、これらは、 アミノ末端及びカルボキシル末端の両方において挿入された配列を適正に開裂し なくてはならない１例えば、プロテアーゼトリプシンは、アルギニン又はリジン 残基の後にプロリンがついていないと仮定して、これらの前記の後で開裂する。

従って、アルギニン又はリジン残基のいずれも問題のペプチド内に存在しない場 合（又はこれらの残基の後にプロリンがついている場合）、この配列は、これら ２つのアミノ酸の１つをコード付けするコドンな側面に有することができる。こ のときペプチドを、トリプシンを用いて雑種タンパク質から開裂させることがで き、その後に、余分なカルボキシル末端Ａｒｇ（アルギニン）又はＬｙｓ　（リ ジン）を除去するためエキソブロテアーゼカルボキシベブチダーゼＢで処理がほ どこされる。同様にして、プロテアーゼｅｎｄｏ−Ｌｙｓ−Ｃ（Ｊｅｋｅｌ他、 １９８３年）は、リジン残基の後で開裂し、そのため、このプロテアーゼを用い て２Ｓアルブミンから開裂された形で２つのこのような残基の間にペプチドを１ つ挿入し、カルボキシペブチグーゼＢを用いて再び余分のリジンを除去すること ができる。このような戦略は、２Ｓアルブミンが用いられる場合に特に有益であ る。というのもそのリジン含有量が少ないために、わずかなフラグメントしか生 成されず、その結果純化が容易であるからである。臭化シアンを、化学的開裂試 薬の一例として用いることができる。この試薬による処理は、メチオニンのカル ボキシ・ル側で開裂する。従って各々のケースについて、別々の戦略を展開しな くてはならないが、利用可能なさまざまなプロテアーゼ開裂技法において同一の 基本原理に遵することが可能となっている。できるかぎり頻繁に、戦略には経済 的な市販のプロテアーゼ又は試薬が用いられなくてはならず、又、純化作業段階 数も制限されていなくてはならない、さまざまな酵素による又は化学的な開裂技 術を再検討するためには、［酵素学諸法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ ｌｏｇｙ）Ｊの第１９巻（１９７０年）及び第４７巻（１９７１年）を参照され たい。

最後に、Ｃ−末端アルファ・アミド構造をもついくつかのペプチドは、自然界に 見い出される（アルファーメラノトロピン、カルシトニンその他：　Ｈｕｎｔ　 ＆Ｄａｙｈｏｆｆ、１９７６年参照）、この翻訳後修飾は、ペプチドの生物学的 活性にとってきわめて重要であるということがわかっている。かかるＣ末端でア ミド化されたペプチドは、Ｃ−末端グリシン残基のアミド基への形質転換により 得ることができる（Ｓｅｉｒｉｎｇｅｒ他、１９８５年）、従ってこのようなペ プチドは、Ｃ末端グリシン残基を、純化後にアミド基に形質転換されるペプチド に付加することによって２Ｓ雑種タンパク質から生成され得る。

貯蔵タンパク質内に挿入されるべき領域の完全なタンパク質配列が、問題のポリ ペプチド及び上述の開裂可能な接合部を形成するペプチドのアミノ酸の両方を含 めて決定された時点で、かかるタンパク質配列をコード付けするためのヌクレオ チド配列が決定されなくてはならない、おそらくは絶対的に必要なことではない かもしれないが、コード付は核酸のコドン使用は、できるかぎり修飾される遺伝 子のものに類似しているべきである。当業者は、かかるコドン使用を決定する適 切なコンビニーり解析手段を利用することができるだろう。

選択された前駆体コード付は核酸の一部分の代わりにインサートを置換するため 、又はこれを前記前駆体コード付は核酸の適当な領域内に挿入するためには、適 当ないかなる遺伝子工学技法でも用いることができる。キメラ遺伝子を作るため には、細菌内クローニングを伴う一般的な試験管内組換え技術を用いることがで きる。以下にさらに詳しく例示されるように、同じ目的のために部位指向の突然 変異誘発を用いることができる。現行の専門的文献において開示されている技術 に従って、植物細胞の形質転換に適したプラスミドといったＤＮＡ組換え体も生 成することができる。これは又、最終的に、選択された前駆体コード付は核酸の 関連部分によりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質が表現されつるような形質 転換された植物細胞の生成にも適用できる０例として、この目的のための適当な 技術を開示している公開済みの欧州特許出願明細書第１１６７１８号又は国際特 許出願明細書ＷＯ３４１０２９１３号（本書に参考文献として内含されている） を参照することができる。

以上の詳述は、さらに詳しくは、−例として貯蔵２Ｓアルブミンの修飾を基礎と して行なわれてきた。

しかし、それが分離されつる植物内でそれをコード付けするＤＮＡ配列がすでに 識別されている又は識別されうること、そしてその中の可欠又は「超可変配列」 がすでに検出されている又は検出されうることを条件として、本発明に基づくプ ロセスは、他の沈降係数をもつその他のいかなるタイプの２８−貯蔵タンパク質 又はその他の貯蔵タンパク質（例えば７Ｓ−１１Ｓ及び−１２３貯蔵クンバク質 ）或いは同じものを用いた上で、実施することができるということもわかるだろ う。

このようなその他の貯蔵タンパク質の例（例示を目的とするものにすぎない）と しては以下のようなものがある［再検討のためにはＨｉｇｇｉｎｓ（１９８４年 ）も参照のこと］　ニ ー　エントウ及びその他の豆類から分離できるレクチンのような１２Ｓタンパク 質或いはすでに記録済みの２５アルブミン又はエントウ、ハツカダイコン又はひ まわりから分離できるその他の２Ｓアルブミンといった２Ｓタンパク質などが考 えられる、水溶性貯蔵タンパク質であるその他のアルブミンニー　Ｐｈａｓｅｏ ｌｕｓから分離可能なフェゾリン、エントウから分離可能なヴイシリン、大豆か ら分離可能なコングリシニン、オート麦から分離可能なオートーヴイシリンのよ うな７−８８グロブリンか、又はエントウから分離可能なレグミン、大豆から分 離可能なグリシニン、ひまわりから分離可能なへりアンチンのような１ｌ−１４ Ｓグロブリン、又は、インゲン豆、Ａｒａｂ上泣脛口及びおそらくは小麦から分 離可能なその他の１ｌ−１４Ｓ−グロブリンが考えられる、塩水中で可溶な貯蔵 タンパク質であるグロブリン； −とうもろこしから分離可能なゼイン、大麦から分離可能なｈｏｒｄｉｅｎ　、 小麦から分離可能なグリアジン及びモロコシ属から分離可能なカフィリンといっ たアルコール可溶性貯蔵タンパク質であるプロラミンニ ー　低いｐＨ条件下で可溶性をもち、小麦から分離可能な貯蔵クンバク質である グルテリン。

−例としてのみ挙げられたこれらの貯蔵タンパク質のうちのいくつかは、システ ィン含有量が少ないものである。それでも、同じグループの異なるタンパク質は 、一方では可変的な領域を示し、他方ではよりうま（保存された領域を示す。

言うまでもないことではあるが、これらの貯蔵タンパク質は、相応する溶剤内で のそのそれぞれの特異的可溶性に応じて、上述の雑種タンパク質の生成及び種子 タンパク質からのそのそれぞれの純化のための適当なベクターとして用いること ができる。

以上に一般的に開示されてきた手順は、問題のペプチドをコード化するＤＮＡ配 列を含む非相同性インサートによる上述のその他の貯蔵タンパク質のいずれかの 可欠領域の適切な修飾に、そして次に関連する植物の種子内における問題のペプ チドの配列を含む雑種タンパク質の生成のために得られたキメラ遺伝子による関 連する植物の形質転換に適用され、これらは、かかる植物からの問題のペプチド の回収に適用され、る、言うまでもないことであるが、当業者はあらゆる場合に おいて、かかる問題のペプチドの最良の生産収量を達成するためには、既存の技 術のうちのいずれが、かかる修飾済植物の生産の各段階レベルでのその必要性を 最もうまく満たすことになるかを選定することができることだろう。

これまでの記述は、さらに詳しく言って、−例として、生物学的に活性なペプチ ドをコード付けするインサートによる一定の貯蔵タンパク質の超可変領域の修飾 を基礎としてきた。しかし、当業者はインサートとしてかかる生物学的に活性な ペプチドの反復をコード付けする配列を選ぶことができる。この場合、かかる生 物学的に活性なペプチドをコード付けする全ての配列は、純化の間のその分離を 可能にする選択的開裂部位をコード付けする周縁配列により他から分離される。

例えば、相応する前駆体−コード付は核酸が配列決定されたとき、一定の問題の ポリペプチド又はその反復を種子内で生成するための適切なベクターとして用い られうる貯蔵タンパク質の能力を利用するために、以下の方法を用いることがで きる。このとき、かかる方法には、以下の段階が含まれる： １）その一部を１つのインサートで置換することによって或いはその中にこのイ ンサートを挿入することによって修飾されつるペプチド配列をコード付けする可 欠領域を含む（なおここでかかる修飾は、貯蔵タンパク質の構成の保持と相客れ るものである）前駆体コード付は核酸の前記関連配列の１つを位置づけし、選択 する段階 ２）前記関連配列の未修飾部分を適当なリーディングフレーム関係で前記前駆体 核酸の選択された領域内に核酸インサートを挿入する段階；なお、かかるインサ ートには、問題のポリペプチド又はその反復をコード付けする一定のセグメント 、そしてこのセグメントの下流及び上流に、前記前駆体コード付は核酸内への挿 入が達成された後問題のポリペプチド又はその個々の反復を互いに又は貯蔵タン パク質又はそのサブユニットの関連部分内に連結するアミノ酸接合部をコード付 けするコドンの形成に参加しくこうしてかかるアミノ酸接合部は問題のペプチド をとり囲む周縁部位を構成する）、それ自体特異的ペプチダーゼなどによって選 択的に開裂されつるような、適当なヌクレオチド、コドン又はヌクレオチドのト リブレットが含まれている。

３）完全な種子形成植物に再生されうる植物細胞の形質転換に適したプラスミド 内に得られた修飾された前駆体コード付は核酸を挿入する段階、ここにおいて、 かかる挿入は、調節要素特に、それと結びつけられたオーブンリーディングフレ ームの前記植物の種子内での発現を提供することのできる種子特異的プロモータ の制御下に置かれる）： ４）かかる修飾されたプラスミドで、かかる植物細胞の培養物を形質転換する段 階； ５）その超可変領域内に挿入された形で、問題のポリペプチド又はその反復をコ ード付けするセグメントの一定の配列を有するキメラ貯蔵タンパク質の発現を検 定する段階、そしてこれが達成されると、６）得られた形質転換済み植物細胞か ら前記植物を再生し、かかる植物を種子形成段階まで育てる段階ニ ア）種子を回収し、その中に含まれている貯蔵タンパク質を抽出する段階； ８）例えば前述の特異的ペプチダーゼを用いて前記貯蔵タンパク質を開裂させる 段階、かなりの数のシスティン残基を含む貯蔵２Ｓ−タンパク質の場合（今のと ころこの貯蔵タンパク質が好ましい）、そしてさらに、異なる植物内で同じ機能 を果たししかもそれぞれ前記異なる植物を源としている複数の類似したタンパク 質の前駆体コード付は核酸が利用可能であり、すでに配列決定された（又は配列 決定できる）場合、上述の一般的方法のステップｌ）は、以下のように実施する ことができる（ただし、以下に記されている一連のステップは、任意的なもので あり、同じ結果を目的と、する他のいかなる手順によってでも置き換えることが できる）、このとき前記「ステップｌ）Ｊは、次の作業を含む。

ａ）それぞれ複数の種子形成植物種において入手可能であり識別可能な前記植物 貯蔵タンパク質のいくつかを選択すること： ｂ）前記植物種の各々において前記植物貯蔵タンパク質の前駆体をコード付けす る前駆体コード付ＬＪ核酸配列を位置づけし、かかる前駆体コード付は核酸内に おいて、成熟貯蔵タンパク質をコード付けする配列又はかかる成熟貯蔵タンパク 質のサブユニットに対してコード付目する適当な副配列から成る関連ヌクレオチ ド配列を決定すること： Ｃ）前記成熟タンパク質又はタンパク質すブユニッ　′ト内の連続１−７たシス ティン残基なコード付けするコドンの相対的位置を決定すること、そして、前駆 体コード付は核酸の前記副配列内の前記コドンの上流、間及び下流に位置づけさ れた相応する連続的核酸領域を識別し、さらにかかる連続領域の中に、かかる複 数の植物種内のアミノ酸配列の大刀の保存をまさに示しているようなその他の領 域と比較して、植物種同士でアミノ酸配列又はその長さ又はその両方において可 変性を受りているような部分を識別すること（なお、かかるヌクレオチド領域の １つはこのとき、前記２）に開示されているように問題のペプチド又はその反復 をコード付けするセグメントを含む核酸インサートのその中への挿入のために選 択される）。

この最後に記した本発明の実施態様は、１つの植物内で雑種タンパク質の一部と して問題の非相同ポリペプチド又はその反復を作らせるにあたり、膜の転座の間 に植物タンパク質にジスルフィドイソメラーゼが通り、こうして、その正常な前 駆体状況におけるように雑種前駆体内に正しいジスルフィドブリッジが形成され る一方で間開のポリペプチド又はその反復が、宿主微生物内に外来性ペプチドを 生成するための標準的遺伝子工学技術に関して先に喚起したようなさまざまな欠 点から守られる確率が増加されることになる、ということを蜆定しでいる。

本発明はさらに、本発明に基づく方法において用いうねる組換え型核酸自体特に 以下のものに関するニ ー　前記方法の枠内で定義づけされてきた組換え型前駆体コード付は核酸ニ ー　他の植物のＤＮＡからの前記前駆体コード付は核酸のものと同じＤＮＡを源 としているか否かには無関係の１つの種子特異性プロモータの制御下にある前記 修飾された前駆体：】−ド付は核酸を含む組換λ型核酸。

−ベクター、さらに詳しく言うと、例えば上述の植物細胞の形質転換において用 いるため前述の組換え型核酸のいずれかにより修飾されたＴｉ誘導のプラスミド といった、植物プラスミド。

キメラ遺伝子にシグナル配列が無い場合（全ての貯蔵タンパク質がそうであるよ うに）適切なこのシグナル配列を与えなくてはならない。

本発明は又、完全な植物に再生されつるような種子形成植物細胞又はかかる種子 形成植物の種子のいずれかで形成されている、問題のポリペプチドの再生可能な 供給源にも関する。かかる供給源は、かかる植物又は種子が、前記植物細胞の再 生の結果として得られる植物の一世代又は複数世代の結果として得られること、 さらに前記植物細胞又は種子の遺伝的情報を支持するＤＮＡは、種子特異的プロ モータの制御の下に置かれた、前記植物の貯蔵タンパク質の前駆体に相当するｍ ＲＮＡ内に転写されうる、シグナルペプチドをコード付けする配列を含めた１つ の核酸又はその−郡部を含んでいること、そして ・　前記核酸配列には、成熟した貯蔵タンパク質をコード付けする関連修飾配列 又はこの成熟した貯蔵タンパク質の単数又は複数のサブユニットに対しコード付 けする複数の副配列のうちの１つが含まれていること： ・　前記関連配列の変更は、その可欠領域の１つの中で起こり、関連配列の中で 自らをとり囲んでいる未修飾部分と読取り段階において１つのオーブンリーディ ングフレーム庖形成する非相同核酸インサー１−で構成されること、 ・　前記インサートには、前記問題のポリペプチドをコード付けするヌクレオチ ドセグメントが含まれていること： ・　前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサート又は隣接する末端の いずれか又はその両方に属するヌクレオチドを有する単数又は複数のコドンによ り、前記関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結されていること、 ・　前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列によりコード付けされた 雑種貯蔵タンパク質又は貯蔵タンパク質サブユニット内の問題のペプチドをとり 囲む選択的に開裂可能な周縁部位を構成する単数又は複数のアミノ酸残基なコー ド付けすること を特徴としている。

本発明がこれに限定されているものとみなされてはならないが１問題のポリペプ チド又はその反復なコード付けする核酸インサートは、はとんどの場合において 、ウィルス又は細菌の遺伝子から又はウィルス又は細菌のＲＮＡの誘導ｃＤＮＡ さらには非植物性真核生物遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチド又は人工的 合成ヌクレオチドであり、これらは全て通常、その性質の如何に関わらず生物学 的プロセスを通して本発明に基づく植物細胞又は種子の適切な場所に挿入される 可能性が全く無いものである。換言すると、これらのインサートは通常、とくに 遺伝的に全く関係が無く従って天然交雑プロセスを含む標準的な生物学的方法に よっていかなる遺伝的材料も交換することのできない異なる種類の植物の中に挿 入されつるという点で「植物種に非特異的」なものなのである。

従って、本発明はさらに、前記形質転換された細胞又は種子から得られた種子形 成植物自体にも関するものである。かかる植物は、それがその細胞内で種子プロ モータと結びつけられている前記雑種前駆体コード付は核酸を有していること、 ただしほとんどかかる植物の種子の中でかかるインサートが発現され相応する雑 種タンパク質が生成されていることをその特徴とする。

以下に、２８種子貯蔵タンパク質遺伝子の修飾、遺伝子導入植物中でのその発現 、２Ｓ貯蔵タンパク質の純化そして問題の生物学的に活性のペプチドの回収のた めに用いることのできる好ましい方法の概略を記す、ここに与えられている方法 の概略の後には、特定的な例が記されている。当業者は、この方法をその他の２ Ｓ種子貯蔵タンパク質遺伝子の修飾のためにも適合させることができるものと思 われる。

１、問題の配列による２Ｓ貯蔵タンパク質遺伝子の超可変領域の置換又は補足 ２ＳアルブミンのｃＤＮＡ又はゲノムクローンのいずれでも用いることができる 。第２図の遺伝子の超可変領域の配列の比較をみると、それらの長さが変わって いることがわかる。従って問題の配列が短く、比較的短い超可変領域を伴う２Ｓ アルブミンが用いられる場合、問題の配列を挿入することができる。そうでなけ れば超可変領域の一部を除去して、その問題のセグメント又は配列、及び場合に よって周縁コドンな含むインサートによりこれを置き換える。その結果得られる 雑種貯蔵タンパク質は、修飾された未修飾の天然タンパク質に比べ長いこともあ れば短いこともある。いずれの場合でも、次の２つの標準的技法を適用すること ができる。すなわち、適当な制限部位を利用するか又は突然変異誘発ベクターを 用いる（例えば５ｔａｕｓｓｅｎ他、１９８７年）かである０両方の場合におい て、メツセージのリーディングフレーム（読取り枠）を維持するよう注意しなく てはならない。

２、変えられた２Ｓアルブミンコード付は領域を種子特異的遺伝子プロモータの 制御下に置（。

種子のみにおいて必ずその後の発現が行なわれるようにするため１種子特異的プ ロモータが用いられる。こうして望まれる生成物の回収が容易になり、植物のそ の他の部分に対する抑制の可能性を無くすることができる。原則的に、修飾２Ｓ アルブミンのプロモータを用いることができる。しかしこれは必ずそうでなくて はならないものではない、同じ目的に役立つものであればその他のいかなるプロ モータでも用いることができる。プロモータは、形質転換されるべき植物種にお けるその効率レベルに応じて選択することができる。以下の例においては、大豆 からのレクチンプロモータ及びＡｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓからの２８アルブミンプ ロモータが用いられている。キメラ遺伝子の構造によっては、そのプロモータが 使用中である遺伝子から又は修飾された遺伝子から、単一ペプチドコード付は領 域も同様に含み入れられなくてはならない、キメラ遺伝子の実際の構築は、標準 的な分子生物学技法を用いて行なわれる（例を参照のこと）。

３、キメラ遺伝子構造を、適当な宿主内に移入する。

キラメ又は修飾遺伝子構造が完成すると、これは、植物形質転換ベクター内へと 全て移入させられる。アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から誘導された無力化された（非催腫 瘍性の）Ｔｉ−プラスミドに基づく多種多様のものが、二元性形及び同時組込み 形の両方で利用可能である（Ｄｅ　Ｂｌａｅｒｅ他、１９８７年）、一般に抗生 物質耐性があり、形質転換用の選択可能な標識を含むベクターを選ばなくてはな らない、同様に、植物形質転換の方法も数多くあり、個々の植物に適合されてい る。その大部分は、原形置体形質転換（Ｍａｒｔｏｎ他、１９７９年）又は成体 植物からの組織小片の形質転換（Ｈｏｒｓｃｈ他、１９８５年）に基づくもので ある。以下の例においては、ベクターは、二元性の無防備のＴｉ−プラスミドペ ククーであり、標識は、カナマイシン耐性のあるものでリーフディスク形質転換 方法が用いられている。

形質転換手順からのカルスは、選択可能な標識に基づいて選択され、適切なホル モン導入により成体植物に再生される。これも又、使用されている植物の種に、 応じて変化する。再生された植物は次に種子を収穫できるような安定した系統を 作り上げるのに用いられる。

４、生物学的に活性なポリペプチドの回収。

２Ｓ植物アルブミンの純化は、充分に実証されている（Ｙｏｕｌｅ及びｌｕａｎ ｇ、１９８１年；　Ａｍｐｅ他、１９８６年）、これは成熟した種子内の主要な タンパク質であり、水性緩衝液中で高い可溶性を示す、２Ｓ貯蔵タンパク質の典 型的な純化には、以下のようなステップが関与してくる：ｌ）ドライアイス内で の種子の均質化及びヘキサンでの抽出；２）高塩分緩衝液での抽出及び精製水に 対する透析（汚染グロブリンを析出させる）；３）ゲルろ過クロマトグラフィに よる水溶性分画の付加的な純化（これによりより小さな２Ｓ貯蔵夕　′ンバク質 がより大きな汚染物質から分離される）：千して４）イオン交換クロマトグラフ ィによる最終的純化、使用される正確な方法は、ここで記される技法にとって決 定的な重要性をもつものではなく、ゲルろ過、イオン交換及び逆相クロマトグラ フィ及びアフィニティ又はイムノアフィニティクロマトグラフィを含む、広範な 古典的技法を、キメラ２Ｓアルブミンを純化するためそしてそれがアルブミンか ら開裂された後生物学的に活性なペプチドを純化するための両方に適用すること ができる。この開裂のために用いられる正確な技術は、側面にある配列（上記参 照）の設計の時点で決定される戦略によって決められる。２Ｓアルブミンは、プ ロテアーゼに対し幾分か抵抗性を有するため、プロテアーゼ処理の前に往々にし て変性ステップを含み入れるべきである（例を参照のこと）。

５、生物学的に活性なペプチドの検定。

回収された生成物についての検定は明らかに、生成物自体によって異なる。植物 の初期スクリーニングのためには、問題のペプチドの存在を検出するのに免疫学 的検定を用いることができる。望まれる生成物に対する抗体、往々にして、それ がなお雑種２Ｓタンパク質の一部分である間ででも機能する。そうでない場合に は、これは雑種から部分的又は完全に解放されなくてはならず、その後でペプチ ド混合物を用いることができる。抗体を用いたスクリーニングは、古典的なＥＬ Ｉ　ＳＡ技法（Ｅｎｇｖａｌｌ　＆　Ｐｅ５ｃｅ、１９７８年）によって行なわ れるか又は、以前にポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離されたタンパク 質のニトロセルロースプロットに基づいて行なわれる（ウェスタンプロット法、 Ｔｏｗｂｉｎ他、１９７９年）、純化されたペプチドはさらに、アミノ酸の組成 及び配列分析により分析され、その同一性が確証される。

生物学的活性についての生物学的検定は当然のことながら、問題の最終的ペプチ ドの性質及び機能によって左右される。

本発明はまた、適当なベクターとして植物の種子貯蔵タンパク質を用いた、生物 学的に活性でありう委標識づけされたタンパク質の生成にも適用できるというこ とも、理解しなくてはならない、この場合、上述の項目３）に記されている、得 られた形質転換体の植物再生は、標識づけされた炭素源（ｌ　Ｓ　Ｃ）及び／又 は、窒素源（”Ｎ）及び／又は水素源（８Ｈ）及び／又は硫黄源（ｓｓＳ）及び ／又はリン光体源（ｓａｐ）が形質転換された成長中の植物に対して与えられる べき条件の下で起こらなくてはならない−（Ｋｏｌｌｃａｌ他、１９７９年：　 Ｊｕｎｇ　＆　Ｊｅｔｔｎｅｒ、　１９７２年、Ｄｅ　Ｗｉｔ他、１９７８年） 。

本発明の付加的な特徴は、とくに以下の添付の図面に基づいた、制限的な意味の 無い特定の例の開示を通して明らかになるものと思われるニ ー　第１図、第１Ａ図、第２Ａ図、第２図及び第３図は、すでに上述のような２ Ｓ−貯蔵タンパク質の全体的特長を示している。

−第４図は、以下に指示されているように得られたｐＢＮ２ｓ１プラスミドから 得たブラジルナツツの２８−アルブミンの配列の一部分とその関連要素を表わし ている。

−第５図は、他の図面に示されている構成内で用いられている制限部位を表わし ている。

−第６図及び第７図は、１つの前駆体をコード付けする核酸を含む制限フラグメ ントを含むキメラプラスミドの構成の連続的段階を図式的に示している（なお、 かかる核酸は本書において［前駆体−コード付は核酸」と呼ばれ、この全体は、 特に部位指向性をもつ突然変異誘発を通して問題のポリペプチドをコード付けす るＤＮＡの挿入による変更に適している）。

−第８図は、上述の部位指向性の突然変異誘発の実施に適したプラスミドの制限 部位及び遺伝地図を示している。

−第９図は、一般に適当な場所での核酸の変更に適用できるような５ｔａｎｓｓ ｅｎｓ他（１９８７年）の部位指向性突然変異誘発手順のさまざまな段階を図式 的に示している。

−第１０図、第１１図及び第１２図は、以下の開示において例としてロイ・エン ケファリンが用いられているような１つの問題のポリペプチドをコード付けする インサートを、その前駆体核酸配列の可欠領域内に含み込むため、この前駆体核 酸を含む上述のキメラプラスミドを変更する諸段階を、図式的に示している。

−第１３図は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ２　Ｓアルブミン遺 伝子を含むｌｋｂフラグメントの配列を表わし、関連する要素を示している。

−　第１４図は、上述のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　２　Ｓタンパク質の大きなサ ブユニットのタンパク質配列を、関連するオリゴヌクレオチド配列と共に提供し ている。

−第１５図は、ｐＧｓｃ１７０３の制限地図を示している。

−第１６図は、ｐＧｓｃ１７０３Ａの制限地図を示している。

−第１７Ａ図は、０４カラム上での、標識として用いられた合成ペプチドＹＧＧ ＦＬＫのアリコートのクロマトグラムを表わしている。勾配（破線）は０％の溶 剤で０〜５分で平担であり、溶剤Ｂは７０分で１００％に達するべく増大する。

溶剤Ａ：水水中０．冗 Ｏ３１％のＴＦＡ。

−　第１７Ｂ図は、第１７Ａ図で行なわれたものと同じ条件下での酸化された２ Ｓ上のトリブレシン（ｔｒｙｐｔｉｃ）消化のクロマトグラムを表わす、斜線の ついたピーク部を収集して、さらに純化を行なった。

−　第１８Ｂ図は、ＣＩ８カラム上での、標識として用いられた合成ペプチドＹ ＧＧＦＬＫのアリコートのクロマトグラムを表わす．勾配（破ＩＪｉ）は０％溶 剤にて０分〜５分の間平担であり、溶剤Ｂは７０分で１００％に達するべく増大 する．溶剤Ａ：氷水中．１％ＴＦＡ　：溶剤Ｂニア０％ＣＨ　３　ＣＮＮＯ３１ ％ＴＦＡ。

−　第１８図は、０４カラム上でＨＰＬＣから得られたピークを含むＹＧＧＦＬ ＫのＣ１８カラム上での再クロマトグラフィを表わす（第１７Ｂ図を参照）、実 施条件は、第１８Ａ図の場合と同じである。

−　第１９図は、ＹＧＧＦＬＫ上のアミノ酸配列の決定の結果を表わす、左角の 囲みは、ＰＴＨアミノ酸の標準を示す（各々２０ｐモル）、サイクル１〜６につ いての信号は、基準より８倍減衰されている。

−　第２０Ａ図は、マーカーとして用いられるＹＧＧＦＬペプチドを示すクロマ トグラムである。

このペプチドは合成ペプチドＹＧＧＦＬＫに対するカルボキシペプチダーゼＢ消 化の結果である．実施条件は、第１７Ａ図の場合と同じである。

−　第２０Ｂ図は、植物材料から分離されたＹＧＧＦＬＫペプチドに対するカル ボキシペプチダーゼＢ消化の後の、☆印で表わされたＩＧＧＦ．Ｌペプチドの分 離を示している。

−　第２１図は、超可変領域のほぼ全ての欠失及びそのＡｃｃＩ部位での置換、 以下の開示に例として与えられている開裂部位及びＧＨＲＦをコード付けする配 列の、特に部位指向性突然変異誘発を通してのＡｃｃＩ部位内への挿入ならびに 、植物の形質転換に適した植物ベクター内の前記キメラ遺伝子のクローニングを 含む、キメラ２ＳアルブミンのＡｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎｆａ遺 伝子の構成の連続的段階を、図式的に示している。

−　第２２Ａ図は、ＧＨＲＦＳ及びＧＨＲＦＬ遺伝子の構成に用いられる８つの オリゴヌクレオチドを示している．オリゴヌクレオチドの限界は垂直線で表わさ れ、かかるオリゴヌクレオチドの上下の数字はその番号を示す．オリゴヌクレオ チド４及び８において、囲み内に入っている塩基は除外され、結果としてＧＨＲ ＦＳをコード付けする遺伝子が得られる．このＧＨＲＦＳとＧＨＲＦＬのペプチ ド配列及び、ＣｎＢｒ開裂部位を与えるメチオニン配列は、ＤＮＡ配列の上に示 されている。

−　第２２Ｂ図は、修飾されたＡＴ２Ｓ１遺伝子のＡｃｃＩ部位及び、オーブン リーディングフレームが維持されるようにするこのＡｃｃＩ部位内への前記ＧＨ ＲＦの挿入を示している。

例」２ 記述されている方法の第１の例としてヒトの脳及びその他の神経繊維内において アヘン剤活性をもつペンクペプチドであるロイ・エンケファリンの生成のための 手順が示される．　（Ｈ．　Ｕｇｈｅｓ他、１９７５ａ）、ペプチド及び特異的 プロテアーゼの開裂部位をコード付けする合成オリゴマーが、Ｂｅｒｔｈｏｌｌ ｅｔｉａ　ｅｘｃｅｌｓａ（ブラジルナツツ）の２８アルブミンをコード付けす るｃＤＮＡクローン内で超可変領域の一部と置換される．このキメラ遺伝子は、 大豆のレクチン遺伝子のプロモータ及びシグナルペプチドコード付は領域を含む フラグメントに融合させられる（　Ｇｏｌｄｂｅｒｇ他、１９８３年）、この構 成全体を、アグロバクテリウムを媒介にした形質転換システムを用いてタバコに 移入（転移）させる、この植物を再生させ、開花の後種子を収集し、２Ｓアルブ ミンを純化させる。

オリゴヌクレオチド内に組み込まれた開裂部位をも・つ２つの特異的プロテアー ゼを用いて、２Ｓアルブミンからエンケファリンペプチドを開裂させ、次にＨＰ ＬＣ技法を用いてこれを回収する。

１、ｃＤＮＡの合成及びスクリーニング１ａｒｒｉｓ及びＤｕｒｅにより記述さ れている方法（１９８１年）を用いてブラジルナツツのほぼ成熟した種子から全 ＲＮＡを分離する１次に、オリゴｄＴクロマトグラフィを用いてポリＡ＋ＲＮＡ を分離する（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）、いくつかの公開されている方 法のいずれか（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年；　Ｏｋａｙａｍａ　＆　Ｂｅ ｒｇ、１９８２年；　Ｌａｎｄ他、１９８１年ＨＧｕｂｌｅｒ　＆　Ｈｏｆｆｍ ａｎ、１９８３年）を用いて。

ｃＤＮＡの合成及びクローニングを行なうことができる。この事例においては、 ブラジルナツツからの２Ｓ　’アルブミンが配列決定され（Ａｍｐｅ他、１９８ ６年）、アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチドが構築された。これは、Ｍａ ｎｉａｔｉｓ他（１９８２年）の方法を用いて作られたｃＤＮＡライブラリなス クリーニングするのに用いられた。結果として得られたクローンはあまりにも短 すぎることがわかり、Ｇｕｂｌｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎ（１９８３年）の方法を 用いて第２のライブラリを作り、第１のより短いｃＤＮＡクローンを用いてスク リーニングさせた。ブラジルナツトの２３アルブミン配列を含むＤＮＡ組換え体 を分離した。後者をさらに、プラスミドｐＵＣ１８内でクローニングさせた［Ｙ ａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、及びＭａｓｓｉｎ ｏ。

Ｊ、（１９８５年）、ｒＧｅｎｅ（遺伝子）」３３、Ｐ１０３〜１１９］ 回収されたプラスミドをｐＢＮ２ｓ１と呼称した６誘導されたタンパク質配列、 ＤＮＡ配列、置換されるべき領域及び関連する制限部位は、第４図に示されてい る。

導き出されたタンパク質配列（プラスミドｐＢＮ２ｓ１から得られたもの）は、 ＤＮＡ配列の上に示され、タンパク質分解処理部位が示されている（第４図）、 シグナル配列の終りは、ａで表わされている。第６図、第７図、第１０図、第１ １図及び第１２図中の構造にて用いられている制限部位が表示されている。構造 の後半部分内で用いられるＰｓｔＩ部位を表示する目的で、クローニングベクタ ーのポリリンカーが示されている。挿入されるべきペプチドのタンパク質及びＤ ＮＡ配列は、突然変異誘発に用いられるべきオリゴヌクレオチドの残りと共に、 ｃＤＮＡ配列の下に示されている。突然変異誘発手順の間、図示されているオリ ゴヌクレオチドは、ｃＤＮＡの反対側のストランドに対し交雑される（第１０図 参照）。

２、キメラ遺伝子の構成。

まず、大豆のレクチン遺伝子のシグナルペプチドとプロモータをコード付けする ＤＮＡフラグメントに２５アルブミン遺伝子を融合させる。レクチン及びブラジ ルナツツの両方の中のシグナルペプチドの開裂点は、標準的コンセンサスシーケ ンスから誘導される（Ｐｅｒｌｍａｎ　＆　Ｈａｌｖｏｒｓｏｎ、１９８３年） 、以下にそして第４図内に、関連配列が示されている：ＧＣＡ　ＡＡＣＴＣＡ　 ＧＣＧ ＣＧＴ　ＴＴＧ　ＡＧＴ　ＣＧＣ ｄｅ　Ｉ ｃ　／　Ｔ　Ｎ　Ａ　Ｇ ｐｓＯＹＬＥＡｌ ☆ Ｎ５ＤＬ ＧＣＡ　ＡＡＣＴＣＡ　ＧＡＴ　ＣＴＧＣＧＴ　ＴＴＣＡＧＴ　ＣＴＡ　ＧＡＣ Ｂｇｌｌ’Ｉ Ａ／ＧＡＴＣＴ ＢＮ２５１ ☆ ＡＦＲＡＴ ＡＣＣＧＣＣＴＴＣＣＧＧ　ＧＣＣＡＣＣＴＣＣＣＧＧ　ＡＡＧ　ＧＣＣＣＧＧ 　ＴＧＧｇｌ　ＩＩ ＧＣＣＮＮＮＮ／ＮＧＧＣ プラスミドｐＬｅ１．ｐｓＯＹＬＥＡ１及びｐＢＮ２Ｓ１内のシグナルペプチド ／成熟タンパク質配列の領域内のタンパク質配列及び２重鎖ＤＮＡ配列が第５図 に示されている０図面に示されている構造において用いられる制限部位の位置及 び認識部位が示されている。☆印は、シグナル配列の終りのタンパク質開裂部位 を表わす。

構成の出発点は、大豆のゲノムＨｉｎｄｍフラグメントを含むプラスミドｐ　Ｌ 　ｅ　１　（Ｏｋａｍｕｒｏ他、１９８７年）である、このフラグメントには、 大豆レクチン遺伝千金て、そのプロモータ、種子特異的発現にとって重要であり うるプロモータの上流の配列が含まれている。このフラグメントから、適当な大 豆レクチンプロモータ／シグナル配列のカセットが、第６ａ図に示されているよ うに構成された。ＤｄｅＩ部位は、シグナル配列（ＳＳ）をコード付けする配列 の終りにあり、その印割部位（Ｃ／ＴＣＡＧ）はプロセシング部位に相当する。

このプロセシング部位において有効な制限部位を得るために、ＳＳ配列のＫｐｎ Ｉ−ＤｄｅＩフラグメント（以下ｒｓｓＪと呼ぶ）をｐＬＥｌから分離し、それ 自体ＫｐｎＩ及びＢｇｌｎで線形化されたｐＬＫ５７ヘクローニングする（Ｂｏ ｔｔｅｒｍａｎ、１９８６年）、ＤｄｅＩ及びＢｇｌｍ（７）末端には、Ｋｌｅ ｎｏｗＤＮＡボリメラーゼエを満たす、これはＢｇ１ｍ部位（Ａ／ＧＡＴＣＴ） を再構成し、その開裂部位はこのときシグナル配列処理部位に相当する（第６図 、７８図参照）、このようにして得られたプラスミドｐｓＯＹＬＥＡ１は、従っ て、プラスミドｐＬＫ５７から成り、ここにおいて当初ｐＬＥ　ｌ内に含まれて いたＳＳ配列のＫｐｎＩ−ＤｄｅＩフラグメント（ＳＳ）はｐＬＫ５７の初期Ｋ ｐｎＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントで置換されている。　Ｈｉｎｄｍ部位は、第４ 図に図式的に示されているように、ｐｓｏｙＬｅａｌ内の（１）で表わされたＰ ｓｔＩ−ＫｐｎＩフラグメントの代りにｐＬＫ６９からの前記ＨｉｎｄＩ１１部 位を含むＫｐｎＩ−ＰｓｔＩフラグメントを置換することにより、このフラグメ ントの前に置かれている。この中間構成はｐＳｏｙＬｅａ２と呼ばれる。第２段 階においては、ｐＳｏｙＬｅａ２内にｐＬＥｌのＨｉｎｄｍ　−Ｋｐｎ　Ｉフラ グメント（２）を挿入することによりレクチンプロモータを再構成する。このプ ロモータフラグメントの上流には別のＢｇ１１１部位があるため、レクチンプロ モータ／シグナル配列カセットは、このときＢｇｌＩＩ−Ｂｇｌｌｌフラグメン トとしてプラスミドｐＳｏｙＬｅａＳ中に存在する。

このカセットはこのとき、プラスミドｐＢＮ２ｓ１の２０５ｂｐブラジルナツツ ｃＤＮＡフラグメントとレジスタ内で融合する。なおこれは、ブラジルナツツの ブロー２８アルブミンに対するコード付は配列（すなわちシグナル配列を除く前 駆体分千金て）を含んでいる。このことは、第５図に示されているとおりに行な われる。ＢｇｌｌでのｃＤＮＡクローンｐＢＮ２ｓ１の消化（第４図）、Ｂｇｌ Ｉ突出末端を切除するためのに１ｅｎｏｗＤ　Ｎ　Ａボリメラーゼエでの処理及 びＰｓｔＩでの消化の後に得られた２０５ｂｐフラグメントは、Ｓｍａ　Ｉ及び ＰｓｔＩでの消化により線形化されたｐｕｃ　１８へクローニングされる（　Ｙ ａｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他、１９８５年）、結果として得られたプラスミド ｐＵｃ１８−ＢＮＩは、両末端共に充てんされ再結紮されているＥｃｏＲＩ及び ＡｖａＩの両方で消化される。その結果、最初にＥｃ　ｏ　ＲＩ部位をもつ望ま しいブラジルナツツコード付は配列を含むｐＵＣｌ　Ｂ−ＢＮ２と呼ばれる新し いプラスミドが再構成されることになる（第７図）。

レジスタ内のブラジルナツツコード付は配列をレクチンプロモータ／シグナル配 列カセットに融合するために、ｐＵｃｌＢ−ＢＮ２はＥｃｏＲＩで消化され、末 端は、ｄＡＴＰのみが存在する中でＫｌｅｎｏｗ酵素を用いて部分的に充てんさ れる。残りの張出しヌクレオチドはＳ１ヌクレアーゼで除去され、その後Ｐ　ｓ 　ｔ、Ｉ消化が行なわれる。こうして１つの鈍端と１つのＰｓｔＩ消化末端をも つフラグメントが生み出される。レクチンプロモータ／シグナル配列フラグメン トは、充てんされたＢ　ｇ　Ｉ　ＩＩ末端をもっＥｃｏＲＩ−ＢｇｌｌＴフラグ メントとして、ｐＳｏｙＬｅａｌ　（第７図）からとられる、これら２つのセグ メントはＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ消化されたｐＵｃ１８で合わせて結紮される。こ の結果、シグナルペプチドコード付は配列とブラジルナツツ配列の接合部に再構 成されたＢｇｌｌＴ部位をもつｐＵｃ１８ｓＬＢＮ１が得られる（第７図）、従 ってｐＵｃ１８ｓＬＢＮ１は、ｐｓｏｙＬｅａｌのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩフラ グメント（第６図に（３）として示されている）そしてその転写方向上流にはｐ Ｕｃ１８ＢＮ２により供給されブラジルナツツプロー２８アルブミンに対する２ ０５ｂｐｃＤＮＡコード付は配列を含むＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＥｃｏＲＩフラグメ ントが中に挿入されてしまっているＰＵＣｌ　８プラスミドで構成される。

しかしながら、読みとり枠は適切に維持されていない、これを補正するために、 このプラスミドをＢａｌ■で線形化し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理し、再結紮する 。この中間体をｐＵｃ１８ｓＬＢＮ２と呼ぶ、この構成は最後に、ｐＳｏｙＬｅ ａ３からのプロモータの５′部分を担うＫｐｎＩフラグメントを挿入し、ｐＵｃ １８ｓＬＢＮ３を生み出し、ｐＢＮ２ｓ１からのブラジルナツツｃＤＮＡの３′ 部分を含むＰｓｔＩフラグメントを後者に挿入することにより、２段階の作業に て完成される。その結果得られた最終的構成ｐＵＣ３ＬＢＮ４は、ＢａｍＨＩフ ラグメント内に含まれているレクチンプロモータ／シグナル配列−ブラジルナッ ツｃＤＮＡ配列の融合物を含んでいる。

３、エンケファリン及びプロテアーゼ開裂部位をコード付けする配列での超可変 領域の一部分の置換。

ロイ−エンケファリンペプチドはＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇ　ｌ　ｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ の配列を有する（　Ｈｕｇｈｅｓ他、１９７５ｂ）、純化後の雑種２Ｓアルブミ ンから無傷のポリペプチドを回復することができるように、リジンをコード付け するコドンを、エンケファリンコード付は配列のいずれかの側に置く、こうする ことによっ・て、下流の処理段階においてひきつづき、エンドペプチダーゼエン ドリジン・Ｃ及びカルボキシペプチダーゼＢ、２Ｓアルブミンからエンケファリ ンポリペプチドを開裂することができる。最後に、突然変異誘発の間に、オリゴ ヌクレオチドが間隙ある二本鎖分子に交雑できるようにするため（以下参照）、 保持すべきブラジルナッツ配列に対し相補的な追加配列を含み入れる。複数の植 物貯蔵タンパク質遺伝子におけるコドン使用を研究した後決定されたオリゴヌク レオチドの正確な配列は以下のとおりである： ５　′−ＧＣＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＧＴＡＣＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＣ ＡＧＡＴＧＣＧ−３’ブラジルナツツ２Ｓアルブミンの超可変領域をコード付け する配列の一部分の置換は、プライマとしてオリゴヌクレオチドを用い部位指向 の突然変異誘発を使って行なわれる（第４図及び第１０図１．５ｔａｎｓｓｅｎ ｓ他（１９８７年）のシステムが用いられる。

５ｔａｎｓｓｅｎｓ他の方法は第９図に図示されでおり、以下に再現する。これ は、その制限及び遺伝子地図が第８図に示されその主な特長も又以下に再現され ているようなプラスミドｐＭａｃ５−８を用いる。

ｐＭａｃ５−８の関連する遺伝子座は、第８図に示されている。矢印は、その機 能的方向性を示す、ｆｄ、Ｔ：ファージｆｄの中央転写終結信号（ターミネータ ）；Ｆｌ−ＯＲＩ　：繊維状ファージ（ｆｌ）の複数起点：ＯＲＩ：Ｃｏ／Ｅｌ タイプの複数起点；ＢＬＡ／Ａｐ”：β−ラクタマーゼに対しコード付けする領 域：ＣＡＴ／Ｃｍ”：クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼに対し コード付けする領域。ｐＭｃ５−８　（ｂ　１　ａ−ａｍ遺伝子はＳｅａ　Ｘ部 位をもたない）及びｐ　Ｍ　ｃ　５−８　（ｅ　ａ　ｔ　−ａ　ｍ、　：突然変 異は単一のＰ　ｖ　ｕ　Ｉ１１部位を除去する）内に存在するアンバー突然変異 の位置が示されている。１且ユ上及びΣ見２ヱ宿主の両方におけるｃｕｔアンバ ー突然変異の抑制の結果、少なくとも２５μｇ　／　１ｎｌのＣｍに対する耐性 が得られる。ｐＭｃ５−８は、それぞれ５ｕｐＥ及び５ｕｐＦ菌株でのアンバー 抑制の時点で主２０μ 耐性を与える．野生型ｃｕｔ遺伝子内に存在するＥｃｏＲＩ、Ｂａ１Ｉ及びＮｅ ｏＩ部位（星印で示されている）は、突然変異技術を用いて除去された。

以下に記されているように、ここで例示されている２Ｓ−アルブミン領域の選択 された超可変領域に対するロイ−エンケファリンペプチドの置換に対しても適用 されるようなこの５ｔａｎｓｓｅｎｓ方法の原理も同様にまず、以下に再現され る： 基本的に、上述の置換のために用いられる突然変異誘発の１ラウンドは、以下の ように進行する．閉じた円でＡｐ及びＣｍ選択可能標識内のアンバー突然変異が 示されている第９図を参照する．　の記号は、突然変異誘発オリゴヌクレオチド を表わす．突然変異自体は矢印の頭で示されている。

このプロセスの個々の段階は、以下のとおりであるニ ー　標的ＤＮＡフラグメントのｐ　Ｍ　ａ　５　−　８へのクローニング（１） 、このベクターは、ＣｍＩ″遺伝子内のアンバー突然変異を続行し、アンピシリ ンに対する耐性を規定するニ ー　偽ウィルス粒子からのこの組換え体の一本鎖ＤＮＡの調製（■）ニ ー　相補的ｐＭｃ型プラプラスミドの制限フラグメントの調製（Ｉｌｌ）　、　 ｐＭＣ型ベクターは、Ａｐ耐性標識内にアンバー突然変異がとり込まれている一 方で、野生型Ｃｍ”遺伝子を含んでいるニー　試験管内ＤＮＡ／ＤＮＡ交雑によ る間隙二本鎖ＤＮＡ（以下ｇｄＤＮＡと呼ぶ）の構成（ＩＶ）、ｇｄＤＮＡ内に おいて、標的配列は一本鎖ＤＮＡとして露出される．交雑のその他のコンポーネ ントからのｇｄＤＮＡの予備的純化は必要でないニ ー　ｇｄＤＮＡへの合成オリゴヌクレオチドのアニーリング（Ｖ）ニ ー　同時試験管内ＤＮＡポリメラーゼ／ＤＮＡリガーゼ反応による残りの間隙の 充てんならびにニックのシーリング（■）ニ ー　Ｃｍ耐性について選択する、ｍｕｔＳ宿主、すなわち誤対合修復において欠 失している菌株の形質転換．この結果、混合プラスミド後代が生成される（■） ニ ー　アンバー突然変異を抑制することのできない宿主の再形質転換による鋳型ス トランド（ｐＭａ型）から誘導される後代の除去（■）、Ｃｍ耐性に関する選択 の結果、間隙あるストランドすなわちその中．に突然変異誘発オリゴヌクレオチ ドが取り込まれているストランドから誘導された後代が豊富になるニ ー　望ましい突然変異の存在に関する、再形質転換の結果として得られたクロー ンのスクリーニング。

第９図に描かれている突然変異誘発実験において、Ｃｍ耐性は、合成標識のため の間接的な選択として用いられる．明らかに、Ａｐ選択可能な標識が開発利用さ れるように、実験をセットアツプすることもできる．後者の場合、−重鎖鋳型（ ＩＩ）及びフラグメント（Ｉｌｌ）はそれぞれｐＭｃ及びｐ　Ｍ　ａ−型である ．単一の突然変異誘発プロセスは、望ましい突然変異の導入はその逆の変換とい う結果をもたらす．従って、これら２つの形態の間の循環（アンピシリン又はク ロラムフェニコールに対する抵抗性についての交互選択も含む）を用いて、連続 する突然変異誘発ラウンド中に標的配列内で多くの突然変異を構成することがで きる。

ここで、ブラジルナツツ２Ｓアルブミンの超可変領域をコード付けする配列の一 部分の置換に関する本例に戻ると、　５ｔａｎＳＳｅｎＳ他のシステムは以下の ように適用される： 問題の領域を含むキメラ遺伝子のＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩフラグメント（第１０図 、第１１図及び第４図参照）を、アンバー突然変異を伴うクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ遺伝子と無傷のべ一タラククマーゼ遺伝子を運ぶｐ Ｍａベクター内に挿入しく第１０図）、出発プラスミドがアンピシリン耐性のみ を付与し、クロラムフェニコール耐性を付与しないようにする。−重鎖ＤＮＡ　 （第４図に示されているものと反対のストランドを表わす）を調製し、Ｅ　ｃ　 ｏ　ＲＩ　−Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ　４１ｉ形化形状のｐＭｃ型プラプラスミドニーリ ングし、間隙ある二本鎖分子を生成する。オリゴヌクレオチドをこの間隙二本鎖 にアニーリングする。−重鎖間隙を、ＫｌｅｎｏｖＤ　Ｎ　Ａポリメラーゼエで 充てんし、結紮し、混合物を適切な宿主に形質転換させる。望ましい突然変異を 有するクローンは、アンピシリンに対し敏感であるが、クロラムフェニコールに 対する耐性をもつ、クロラムフェニコール耐性をもつ形質転換体を選び、ＤＮＡ 配列づけにより分析する。最後に、ｐＵｃ１８ｓＬＢＮ’４内のＰｓｔｌ−Ｎｃ ｏｌフラグメントをｐＭＣ５８ＢＮからの突然変異誘発されたものと置換するこ とにより、雑種遺伝子フラグメントをレクチン／ブラジルナツツキメラに挿入し 直す（第１１図）、結果として得られたプラスミドｐＵＣ１８ＳＬＢＮ５は、全 てＢａｍＨＩフラグメントとして、雑種ブラジルナツツ−エンケファリン遺伝子 に融合されたレクチンプロモータ及びシグナルシーケンスを含む。

４、タバコの形質転換 キメラ遺伝子を含むＢａｍＨＩフラグメントを、二元性ベクターｐＧＳＣ１７０ ２のＢａｍＨ１部位内に挿入する（第１２図）、このベクターは、大腸菌（Ｅ、 ｃｏｌｉｌ及びＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの両方における安定性及び選択の ための官能基ならびにＴ−ＤＮＡフラグメントとして外来性ＤＮＡの植物ゲノム への転移のための官能基を含んでいる（Ｄｅｂｌａｅｒｅ他、１９８７年）、後 者は、オクトビンニー領域の末端反復配列から成る。

フラグメントがクローニングされるＢａｍＨＩ部位は、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子７のポ リアデニル化シグナルの前にある。ツバリン合成（ｎｏｓ）プロモータ、ネオマ イシンフォスフオドランスフェラーゼタンパク質コード付は領域（ｎｅｏ）及び ｏＣ８遺伝子の３′末端基から成るキメラ遺伝子が存在するため、形質転換され た植物はカナマイシン耐性をもつことになる。標準的な手順（Ｄｅｂｌａｅｒｅ 他、１９８７年）を用いて、プラスミドを、プラスミドｐＧＶ２２６０をもつア グロバクテリウム菌株Ｃ５８ＣＩＲｉｆに転移させる。後者は植物のゲノムへＴ −ＤＮＡ領域をうまく転移させるのに必要とされるｉｎ　ｔｒａｎｓ及びｖｉｒ 遺伝子官能基を与える０次にこのアグロバクテリウムを用いて、標準の手順によ り菌株ＳＲＩのタバコを形質転換する（　Ｄｅｂｌａｅｒｅ他、１９８７年）、 １００μｇ／−のカナマイシン上でカルスを選択し、耐性あるカルスは、植物を 再生するのに用いる。これらの植物から調製されたＤＮＡを、ブラジルナツツの ２Ｓアルブミンクローン又はオリゴヌクレオチドとの交雑により雑種遺伝子の存 在についてチェックする。陽性の植物を生育させ、以下に記されているように処 理する。

５、種子からの２３アルブミンの純化 陽性の植物を生育させ種子を生じさせる。これには約１５週間が必要である１個 々の植物の種子を収穫しドライアイス中で均質化（ホモシナイス）し、ヘキサン で抽出する。残留物をＬａｅｍｍｌｉ標本緩衝液に溶かし、沸とうさせ、ＳＤＳ ポリアクリルアミドゲル上に置（（Ｌａｅｍｌｉ、１９７０年）０分離させたタ ンパク質をニトロセルロースシート上にて電気プロットしくＴｏｗｂｉｎ他、１ ９７９年）、ロイ−エンケファリン抗原の市販の多クローン性抗体で検定する（ ＵＣＢｃａｔ、ｆｉ７２１００１．１ｂ７２１００２）。

上述の免疫学的検定を用いて、強度に陽性の植物を選択する０次にこれらをさら に大量に育て、種子を収穫する。ヘキサン粉末を調製し、高塩度緩衝液（０，５ Ｍ　ＮａＣＱ、０．０５Ｍのリン酸ナトリウムｐＨ７，２）で抽出する０次にこ の抽出物を水に対し透析し、遠心分離で清澄にさせ（３０分間５０、　ＯＯＯＸ 　ｇ）　、同じ高塩分緩衝液内で行なわれた５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−７５カラム 上でのゲルろ過により上澄みをさらに純化する。ＤＥＡＥ−セルロースカラム上 ・の非イオン、非タンパク質材料のイオン交換クロマトグラフィから、さらにタ ンパク質を純化する０次に、２Ｓタンパク質混合物を含む分画と組合せ、０．５ ％のＮＨ４ＨＣＯＩに対し透析し、乾燥凍結させる。

６、ロイ−エンケファリンの回収 純化された内生の２８貯蔵タンパク質と雑種２Ｓタンパク質の混合物を、Ｅｎｄ ｏ−Ｌｙｓ−Ｃで消化する。効果的にタンパク質分解減成を行なうため、ます過 ギ酸で２Ｓタンパク質を酸化させる（旧ｒｓ、１９５６年）、この酸化段階は、 ジスルフィドブリッジを開き、タンパク質を変性させる。ロイ−エンケファリン は過ギ酸と反応しうるアミノ酸残基を含んでいないので、この処理によってアヘ ン誘導体が変わる　′ことはない、Ｅｎｄｏ−Ｌｙｓ−Ｃ消化は、３７℃で１２ 時間、０．５％のＮＨ，ＨＣＯ，溶液中で実施され、凍結乾燥で終結する。この 消化によりロイ−エンケファリンは遊離させられるが、なおＣ末端リジン残基に 付着したままである。雑種クンバク質にはその他のりジン残基がきわめてわずか しか含まれていないため、ｅｎｄｏ−Ｌｙｓ−Ｃペプチドの数はきわめて少なく 、このペプチドの付加的な純化を単純なものにしている。エンケファリン−Ｌｙ ｓペプチドは、ＣＩ８カラムを用いて（例えばＶＹＤＡＣの商標で市販されてい るもの）ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィで純化する。勾配は、初期溶剤としての ０．１％のトリフルオロ酢酸（Ａ）そしてグイリュータ溶剤としての０．　１％ のトリフルオロ酢酸中の７０％のアセトニトリル（Ｂ）で構成されている。−分 あたり１．５％のＡ中Ｂ溶剤の勾配を、Ａｍｐｅ他（１９８７年）により開示さ れている条件の下で用いる。純化されたエンケファリン−Ｌｙｓペプチドは、ア ミノ酸分析及び／又は免疫学的方法により識別する。さらに、カルボキシル末端 リジン残基を除去するためＡｍｂ）、ｅｒ　（１９７２年）が開示したようにカ ルボキシペプチダーゼＢでこれを処理する。最後に、Ｌｅｗｊ、ｓ他（１９７９ 年）が開示している方法に従って逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィによりオピオイ ドペプチドの分離及び純化を達成する。

例Ｈに示されているとおり、その他の方法も利用可能である。

７、ロイ−エンケファリンの生物学的活性の検定エンケファリンは、テンジクネ ズミの脳のナトリウムの無いホモジエネート内で［３Ｈ］−ナロクソンの結合を 抑制する。前述のように（Ｓｉｍａｎｔｏｖ他、１９７６年）、ラットの脳膜に 対する特異的［”Ｈ］−ナロクソン結合を抑制する能力として、オピオイド活性 を検定することが可能である（Ｐａｓｔｅｒｎａｋ他、１９７５年）、ｒエンケ ファリン」のオピオイド活性の１ユニツトは、２００ｄの検定において５０％の 占有度を生むような量として定義づけされた（Ｃｏｌｑｕｈａｕｎ他、１９７３ 年）。

例■： 当該技法の柔軟性を立証するものとして、異なる１つの２８アルブミンを用いた ロイ−エンケファリンの生成手順が与えられる。この場合、構成の基礎としてＢ ｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ　ｅｘｃｅｌｓａからのｃＤＮＡクローンを用いる代り に、紅蝕力遼脛口」加状国匣から分離したゲノムクローンを用いる。１つのゲノ ムクローンが用いられるため、その遺伝子自身のプロモータが用いられ、構成は 著しく簡略なものとなる。当該技術の一般性をさらに立証するため、タバコ、Ａ ｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ及びその近縁植物であり同様に２８アルブミンを有するＢ ｒａｓ■競」朋口（導入部参照）といった異なる３つの植物において、変化した ２Ｓアルブミン遺伝子を発現させる。この例の細部の多（は前述の例と同様であ るため、ここではさらに簡単に説明する。

１、Ａｒ吐胆並旦り止虹旦胚の２８アルブミン遺伝子のクローニング ２Ｓアルブミンの純化が容易であるとすると（導入部、例（１）参照）、Ａｒａ ｂｉｄｏ　ｓｉｓの２Ｓアルブミン遺伝子をクローニングする最も直接的な方法 は、タンパク質配列に基づきオリゴヌクレオチドプローブを作り上げることであ る。タンパク質配列は、標準的な技法すなわち基本的にブラジルナツツの２８ア ルブミンのものと同じ方法で決定された（　Ａｍｐｅ他、１９８６年）、第１３ 図は、Ａｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａの２８アルブミン遺伝子を含 むｌ　ｋｂ　Ｈｉｎｄｍフラグメントの配列を示している。導き出されたタンパ ク質配列はＤＮＡ配列の上に示され、タンパク質分解処理部位が表示されている 。シグナル配列の終りはａで示されており、ＳＳＵは小さなサブユニットを表わ す、挿入されるべきペプチドのタンパク質配列及びＤＮＡ配列は、突然変異誘発 に用いるべきオリゴヌクレオチドの、残りのものと同じく、ｃＤＮＡ配列の下に 示されている。突然変異手順の間、示されているオリゴヌクレオチドは、示され ているＤＮＡ配列の反対側のストランドに交雑される。構成中にＨｉ　ｎ　ｄ　 ｎＩフラグメントの方向性をチェックするために用いられるＮｄｅＩ部位には下 線が引かれている（ｂｐ−１１７）、番号づけシステムは、開始コドンのＡが塩 基対Ｊとしてとられるようなものである。

オリゴヌクレオチドプローブを用いる上での問題点は、１つ以上のコドンが１つ のアミノ酸をコード付けする可能性があるため、タンパク質配列からＤＮＡ配列 をあいまいでなく決定することが不可能である、ということにある、従って、あ いまいな位置では、塩基イノシンが用いられた。イノシンの構造は、交雑の強度 を増大させはしないものの減少させもしないというようなものである（大塚他、 １９８５年：高橋他、１９８５年）、これに基づき、第１４図「紅並居二社し肋 ユ■月の２８アルブミンの大きいサブユニットのタンパク質配列」に示されてい るように、３つのオリゴヌクレオチドプローブが設計された。タンパク質配列の 下には、遺伝子をクローニングするための交雑プローブとして用いられるオリゴ ヌクレオチドの配列がある。■はイノシンを表わす。

標準的な方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年ＨＢｅｎｔｏｎ　＆Ｄａｖｉｓ 、１９７７年）を用いて、ファージＣｈａｒｏｎ３５内で作られたＡｒａｂｉｏ ｄｏ　５ｉｓＤ　Ｎ　Ａのゲノムライブラリなスクリーニングするのに、この３ つのオリゴヌクレオチドを用いた（Ｌｏｅｎｅｎ　＆　Ｂｌａｔｔｎｅｒ、１９ ８３年）、オリゴヌクレオチドをキナーゼ化しくＭｉｌｌｅｒ　＆Ｂａｒｎｅｓ 、１９８６年）　、５　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｐ　Ｅ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２ 年）、ｏ、ｉ％のＳＤＳ、０．０２％のフィコール、０．０２％のポリビニルピ ロリドンそして５０Ｉ４／−の音波処理されたニシンの精液ＤＮＡの中で４５℃ で交雑を行なった。フィルターは、４〜８分４５度で５ＸＳＳＰＥ、０．１％Ｓ ＤＳ中で洗浄した。これらの条件を用いて、これら３つのオリゴヌク離した。適 当な領域を、標準的な技法（νａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）を用いてｐＵＣ ｌ　８にサブクローニングしく　Ｙａｎｉ、５ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他、１９８５ 年）、Ｍａｘａｍ　＆Ｇ１１ｂｅｒｔ　（１９８０年）の方法を用いて配列づけ した。この遺伝子を含む領域の配列は、第】３図に示されている。

２、エンケファリン及びプロテアーゼ開裂部位をコード付けする配列での可変領 域の一部分の置換上述の分離された遺を、ロイ−エンケファリン／２Ｓアルブミ ンキメラの構成のために直接使用した９第１の例の場合と同様に、下流の処理段 階においてエンケファリンポリペプチドを回収することができるようにロイエン ケファリン配列とその両側にリジンコード付はコドンを、そして突然変異誘発の 間オリゴヌクレオチドが間隙ある二本鎖分子に交雑できるように側面にあるＡｒ ａｂｉｄｏ　ｓｉｓ配列に対し相補性のある追加配列を取込む１つのオリゴを設 計した。その結果として得られたオリゴヌクレオチドの配列は、以下のようなも のである： ５’　−ＣＡＡＧＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＴＧＧＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＣＡ ＧＣＡＣＣＡＡＣ−３’配列中のその位置は第８図に示されている。

遺伝子及び必要な全ての調節信号を含むのに充分な側面の（ｆｌａｎｋｉｎｇｌ 領域を含む領域は、クローニングベクターｐＪＢ６５内に挿入された３、５ｋｂ のＢ　ｇ　ｌ　ＩＩ　７ラグメント上で含まれている（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ他、 １９８７年）、このクローンはｐＡＴ２ｓＩＢｇと呼ばれる。突然変異誘発され るべき領域は、３，６ｋｂのＢｇ１ｍフラグメント内でｌｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ フラグメント上で含まれており、この比較的小さいフラグメントは、５ｔａｎｓ ｓｅｎｓ他（１９８７年）のｐ　Ｍ　ａ　５−８べ、フタ−のＨｉｎｄＩＩＩ部 位内に挿入される（第５Ｃ図）、非対称のＮｄｅＩを用いて方向性をチェックす る（第８図）、突然変異誘発は、例１のステップ３に記されている戦略そのもの を用いて行なわれる。その後、標準的な技法（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年 ）を用いて、雑種遺伝子を、突然変異誘発されたものを伴うより大きいフラグメ ント内に再度挿入する。再びＮｄｅＩ部位を用いて方向性をチェックする。

３、植物の形質転換 雑種遺伝子ならびに、遺伝子調節のための適当な信号が確かに存在するようにす るためのコード付は領域に対する充分な側面配列（５′と３′の両方）を含んで いるＢ　ａ　Ｉ　ＩＩフラグメントを、例１において用いられているのと同じ二 元性ベクターｐＧｓｃ１７０２のＢａｍＨＩ部位内に挿入する（第１２図）、こ のベクターについては、例１の第４節に記されている。タバコの形質転換はまさ にそこに記述されているとおりに行なわれる。　Ａｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ　ｔｈ ａｌｉａｎａ及びＢｒａｓｓｉｃａ−堕！凹の形質転換は、同じベクター内で全 （同じ構成が用いられうるようなものである０例１の第４節に記されているよう にアゲロバクチ１ウム・ツメファシエ７２に対する授動の後、それぞれＡｒａｂ ｉｄｏ　ｓｉｓ及びＢｒａｓｓｉｃａの形質転換のために、Ｌｌｙｏｄ他（１９ ８６年）及びｋｌｉｍａｓｚｅｗｓｋａ他（１９８５年）の手順を用いる。各々 の場合において、タバコについてと同様、カルスを１００μｇ　／　ｄのカナマ イシン上で選択し、耐性あるカルスを植物の再生に用いることができる。このよ うな植物から調製されたＤＮＡを、突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチ ドとの交雑により、雑種遺伝子の存在についてチェックする（タバコ及びＢｒａ ｓｓｉｃａの場合、雑種構成の比較的大きい部分を用いることができるが、Ａｒ ａｂｉｄｏ　ｓｉｓの場合、これらは内生の遺伝子と交雑する。

本発明の実施態様において、雑種遺伝子ならびに、遺伝子調節のための適切な信 号が必ず存在するようにするのに充分なコード付は領域に対する側面配列（５′ 及び３′の両方）を含むＢａ１ＩＩフラグメントは、二元性ベクターｐＧｓｃ１ ７０３　（第１５図）又はｐＧｓｃ１７０３Ａ　（第１６図）のＢｇｌＩＩ部位 内に挿入される。ｐＧｓｃ１７０３は、大腸菌及びアグロバクテリウムの両方に おける選択のための官能基、ならびに外来性ＤＮＡの植物ゲノム内への転移を可 能にするＴ−ＤＮＡフラグメントを含んでいる（　Ｄｅｂｌａｅｒｅ他、１９８ ７年）、これにはさらに、ネオマイシンフォスフオドランスフェラーゼタンパク 質コード付は領域（ＮＰＴｌｒ）及びｏｃｓ遺伝子の３′末端基を伴う両方向性 プロモータＴ　Ｒ（Ｖｅｌｔｅｎ他、１９８４年）が含まれている。これには、 ＰＧＳＣ１７０２のようにアンピシリン耐性をコード付けする遺伝子は含まれて おらず、そのため、感染段階の後アゲロバクチリアを殺すのにカルベニシリンな らびにクラフオランを用いることができる。ベクターｐＧＳＣ１７０３Ａは、ハ イグロマイシントランスフェラーゼをコード付けする付加的な遺伝子と共に、ベ クターｐＧｓｃ１７０３と同じ官能基を含んでいる。このためカナマイシン及び ハイグロマイシンの両方について形質転換体を選択することが可能である。タバ コの形質転換は、例１の第４節に記されているとおりに行なわれ、こうして雑種 遺伝子は、植物形質転換ベクターｐＧＳ１７０３内に挿入される。江蝕上應四ｎ ｔｈａｌｉａｎａ及びＢｒａｓｓｉｃａ　ｎａ　ｕｓの形質転換は、その中に雑 種ＡＴ２Ｓ１遺伝子が挿入されたｐＧｓｃ１７０３Ａを用いて行なわれた。プラ スミドｐＭＰ９０をもつアゲロバクチ賃ウム・ツメファシェンスＣ５８ＣＩＲ１ ｆへの授動の後（Ｋｏｎｃｚ　＆　５ｃｈｅｌｌ、１９８６年）、（なおこのプ ラスミドは、ｉｎ　ｔｒａｎｓ及びｖｉｒ遺伝子官能基を与えるがアンピシリン 耐性をコード付けする遺伝子は有していない）、それぞれＡｒａｂｉｄｏ　ｓｉ ｓ及びＢｒａｓｓｉｃａを形質転換するためにＬｙｏｙｄ他（１９８６年）及び Ｋｌｉｍａｓｚｅｗｓｋａ他（１９８５年）の手順が用いられる。同時培養が起 こった後アグロバクテリウムを殺すためにカルベニシリンを用いる。各々の場合 において、タバコの場合と同様に、カルスを１００μｇ／−のカナマイシン上で 選択し、耐性あるカルスを植物の再生のために用いることができる。このような 植物から調製されたＤＮＡを、突然変異誘発において用いられたオリゴヌクレオ チドとの交雑により、雑種遺伝子の存在についてチェックする。（タバコの場合 、雑種構成の比較的大きい部分を用いることができるが、Ｂｒａｓｓｉｃａ及び Ａｒａｂｉｏｄｏ　ｓｉｓの場合、これらは、内生の遺伝子と交雑する） ４、種子からの２８アルブミンの純化及び付加的な処理 各種属からの陽性の植物を育てて種子をつけさせる。タバコの場合、これには約 １５週間が必要であるが、Ａｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ及びＢｒａｓｓｉｃａについ てはそれぞれ６週間及び３力月が必要である。異なる品種を使用すると、これら の期間も異なりうる０種子からの２８アルブミンの純化、ロイ−エンケファリン 及び生物学的活性についての後者の検定は、以下のように行なわれる。

Ａｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ　からのエンケファリンの　離に肛旦並ゑ１」 Ａｒａｂ力墜旺ム種子からエンケファリンを分離するのに２つの方法を用いた。

まず第１に、複数の個々の形質転換体から分離された少量の種子を、キメラ２Ｓ アルブミンの存在についてスクリーニングした。これは、Ｊｏｎｅｓ他（１９８ ５年）が記述しているように導入された遺伝子の表現が個々の形質転換体の間で 大幅に変わりうるという理由から行なわれるものである。この予備的スクリーニ ングにより見られた個々の植物からの種子を用いて次に、より多い量を分離し、 収量をより正確に測定する０両方の手順が以下に記さスフ１−ニング 個々の植物の種子（約５０ｍｇ）を収集し、ｌ：ｐｐｅｎｄｏｒｆ管の中でこの 管に合う形の小さなプラスチック製グラインダを用いて磨砕した。この手順では 、ドライアイスは全く用いない、結果として得られたペーストを１−のへブタン で３回抽出し、残留物を乾燥させた。粉末をＩＭのＮａＣβ　０．２−中で懸濁 させ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離機内で５分間遠心分離した。この抽出を三回 （り返し、上澄みを組合せ、合計的０．５−の量が得られた。この溶液を水で２ ０倍に希釈し、最終的に０．０５ＭのＮａＣｌ２濃度を得た。これを−晩４℃で 保存し、次に５ｏｒｖａｌｌ　Ｓ　Ｓ　−３４０−ターで４０分間５０００ｒｐ ｍの速さで回転させた。結果として得られた上澄みを、使い捨てのＣ１Ｂカート リツジ上に通過させた（　Ｓ　Ｅ　Ｐ　−Ｐ　Ａ　Ｃ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ。

Ｍｉｌｆｏｒｄ、米国マサチニーセッツ州）、このカートリッジには、５−７分 の速さでカラムを通し注射器で１０ｄの上澄みを注入して装荷した０次にこのカ ートリッジを、０．１％のＴＦＡ　２Ｍ１で洗い、７％、１４％、２１％等々で 最高７０％までのアセトニトリルを含むＯ，１％のＴＦＡ溶液の２一部分で段階 的に溶出することによって脱饗させた。２８％から４９％の範囲のアセトニトリ ル中に溶出している分画な、異なる分画からとったアリコートについて行なった ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル分析によって判断されるように、２Ｓアルブミ ンについて富化する。２Ｓアルブミン含有分画を組合わせ、５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ 濃縮器（Ｓａｖａｎｔ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ｓ）内で乾燥させた。

組合わされた分画を水中１％ＴＦＡ　Ｏ，９５ｉ内で再構成させ、ＨＶ　−４Ｍ ｉｌｌｅｘフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通してろ過し、長さ２５ｃｍ直 径（、）、４６ｃｍの逆相Ｃ４カラムを適用したｆＶｙｄａｃ２１４ＴＰ５４、 気孔径３００オングストローム、粒径５＋Ｉｍ）、ＨＰＬＣ機器は、２台のポン プ（５１０型）、１台の勾配制御装置（６８０型）そして１台のＬＣ分光検知器 （Ｌａｍｄａ−Ｍａｘ４８１型、全て米国マサヂューセッツ州、　Ｍｉｌｆｏｒ ｄのＷａｔｅｒｓ社からのもの）で構成されていた。勾配は、以下のように実行 した：すなわち、溶液Ａは、、ＨｚＯ中０．１％のＴＦＡであり、溶液Ｂは７０ ％のＣＨ、ＣＮＮＯ３１％のＴＦＡであった。５分間、ＢＯ％Ａ１００％の溶液 なカラム上に流し、その後Ｂの濃度を７０分にわたり線形的に１００％にまで上 昇させていった。２１４ｎｍの吸収度によりカラムの溶出物を検出した。２Ｓア ルブミンを含む分画を収集し、５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ濃縮器内で乾燥させた。

プロテアーゼでのより完全な消化を得るためには、過ギ酸でジスルフィドブリッ ジを酸化させることによりタンパク質を変性することが勧められる。このことは 、９−の蟻酸と１−の３０％Ｈ２０ｔを室温で混合して作った溶液を０．５−加 えて行なわれる。この溶液は、使用より２時間前に作られた。０℃で３０分反応 を進ませ、　５ｐｅｅｄ　Ｖａｃ濃縮器内での乾燥で終らせた。微量の残留蟻酸 は、水５００ジを２度加え、標本を凍結乾燥させることによって除去した。

残渣をｐｎｓ、５の０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｆｉＯ１７５ｉ中に再度溶解させ 、その後ＡｕｇのＴＰＣＫ処理されたトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を 加えた１反応を３時間３７℃で放置し、その後ＴＦＡ　１０ｄを加えて終結させ 、分析に先立ち一２０℃で保存した。結果として得られたペプチド混合物を、前 述の勾配混合物及びカラムを用いてＨＰＬＣで分離させる。標準として、期待さ れるものと同じ配列（ＹＧＧＦＬＫ）のペプチドを、標準的な技術を用いてＢｉ ｏｌｙｎｘ４１７５ペプチド合成装置（ＬＫＢ）で合成した。このペプチドをカ ラム上に流し、保持時間を測定した０次に同じカラム上で、トリプシン消化物か ら得られたペプチドの混合物を装荷し、標準と同じ保持時間のペプチドを収集し 、乾燥し、Ｃ１８−逆相カラム上に再度装荷した。標識ペプチドの溶出時間はこ こでも、エンケファリン含有ペプチドの正しい位置についての基準として役立っ た。アミノ酸配列づけによってこのペプチドの同一性を確認し、又これによって 大力の定量を行なうこともできた８分析された６つの形質転換体のうち４つの植 物が有効量のロイ−エンケファリンを含んでいることがわかった９例として、こ れらの４つの植物のうちの１つについての詳しい分析及び処理段階が以下に示さ れている。

前記植物からの２．１１ｇの種子をドライアイス内でモルタルの中でグラインデ ィングした。５−のへブタンで三回抽出することによって結果として得られた粉 末から脂質を除去した。結果として得られた残渣を乾燥した。

之ンバ先ｉΔ笹止 粉末を約４−の１．ＯＭ　Ｎａ０ｇ内に溶かした。

結果として得られたペーストを５Ｓ−３４０−ター内で１７５０ｏｒｐｍの速さ で４０分間回転させた。各回転の後に、上澄みを新しい試験管内に移し、ベレッ トを再び４−の１．０ＭＮａＣβ中に懸濁させた。この手順を三度くり返した。

０．４５Ｆのフィルター（ＨＡ、　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に３回の上澄み（計１ ２−）を通した。

ゲルろ過による２Ｓアルブミンの　離 削段階からの溶液１２−を６艷のバッチ２つに分けて５ｅｐｈａｄｅｘＧ　−５ ０媒質（Ｐｈａｒｍａｃｉａｌ上を通過させた。カラムは、直径２．５ｃｍ、長 さ１００ｃｍで０．５ＭのＮａＣｆｆ中毎時約２７−の流量で作動した。約７− の分画を収集した。この分画を次の２つの方法でタンパク質について監視した。

すなわち、まず第一に、鉛筆で分画番号を表わしたＷｈａｔｍａｎ　３　Ｍ　Ｍ ペーパー片に各分画を１０４適用することにより、合計タンパク質を検出した。

暖気の中で斑点を乾燥させ、１０％のＴＣＡ溶液中にペーパーをすばやく浸して （３０秒）タンパク質を定着させた０次に紙片を、ポリアクリルアミドゲル染色 に用いられるものと類似したＣｏｍｍａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ溶液へと移す、１分 後、ペーパーをとり出し水道水で洗う、クンバク質を含む分画は、白の地に青の 斑点を示す、この技術の最小検出限界は、約０．０５ｍｇ／−である、これらの タンパク質含有分画を、７−分画２ｐを１０１Ｌ！！の標本緩衝液に加え次に１ ７．５％のポリアクリルアミドのミニゲル上にこの混合物６ｐを装荷することに よって、２Ｓアルブミンの存在について検定した。２Ｓアルブミンを含むことが わかった分画をプールしておいた。プールした分画の合計量は１７５−であった 。

離された２Ｓアルブミンの　塩 これは、長さ２５ｃｍ、直径０．４６ｃｍの０４カラム上でＨＰＬＣによって行 なった（Ｖｙｄａｃ２１４ＴＰ５４、気孔径３００オングストローム、粒径５Ｆ ）、ＨＰＬＣ装置は、２台のポンプ（５１ｏ型）、勾配制御装置（６８０型）及 びＬＣ分光検出器ｆＬａｍｄａ−Ｍａｘ４８１型、全て米国マサチューセッツ州 、ＭｉｌｆｏｒｄのＷａｔｅｒｓ社のもの）で構成されていた。各々３．５−ず つ６回にわけてこのシステムに１７５ｄのうち２１−を装荷した。勾配は以下の ように実行した：すなわち、溶液ＡはＨ，Ｏ中の０．１％ＴＦＡであり、溶液Ｂ は７０％ＣＨＳ　ＣＮ中の０．１％ＴＦＡであった。５分間０％のＢと１００％ のＡをカラム上に流し、その後Ｂの濃度を７０分にわたって線形に１００％まで 上昇させた。各回共その間に２８アルブミンの分画を収集し、６回全てが終了し た時点でこれらの分画をプールして３本の試験管に分けてとり、従ってこれらの 試験管の各々には２．１１ｇの種子がらの２３アルブミンが７７１７５人ってい た。さらに別々にアリコートの各々を処理し、収量の量的評価のために使用した 。

トリフと乙五止量 トリプシンでの消化に先立ち、３つのアリコートを上述の要領で酸化させた。ト リプシン消化は、基本的に上述のように行なった。各アリコートに０．９５ｍ１ ’のＯ，ＩＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＥ、ｐｎｓ、ｓを付加し、これに５０１４のトリ プシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）を補足して、３７℃で４時間反応させた。

ＹＧＧＦＬＫペプチドｑ立亘 カルボキシル末端残基な含むエンケファリンペプチドを２つの連続したＨＰＬＣ 段階を用いて分離した。上記小規模分離手順内に説明されているように、期待さ れているものと同じ配列のペプチドを合成し、上述の脱塩段階で記されているの と同じカラム及び勾配条件を用いてＨＰＬＣシステム上に流した０合成ペプチド の保持時間を測定した（第１７Ａ図）０次に３つのトリプシン消化物を（別々に ）同じカラム上に装荷し、合成ペプチドを同じ保持時間の材料を収集しく第１７ Ｂ図斜線の部分）、乾燥させた９次に、ＣＩ８カラム（２５Ｘ　０．４６ｃｍ、 Ｖｙｄａｃ２１８ＴＰ１０４材料、気孔径３００オングストローム、粒径１０Ｐ ）を用いたことを除いて同じ装置及び勾配を用い同じ手順に従った。ここでも、 合成ペプチドと同じ保持時間の材料を収集した（第１８Ａ図及び第１８Ｂ図）、 この結果、各々合計２３アルブミンの７／１７５から誘導された３つの調製物が 得られた。

これらの３つのアリコートの１つにある材料の１７２０を用いて、分離されたペ プチドの配列をチェックした。これは、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ 　Ｉｎｃ。

（Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　ｌの４７ＯＡ気相シークエネークー（５ｅｑｕｅｎａ−ｔ ｏｒ）を用いた自動気相配列決定によって確認された６段階的に遊離されたフェ ニルチオヒグントイン（ＰＴＨ）アミノ酸誘導体をオンラインＰＴＨアミノ酸分 析器（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ、１２　ＯＡ　）で分析 した。シークエネーター（５ｅｑｕｅｎａｔｏｒ）及びＰＴＨ分析器は、製造業 者の指示に従って作動させた。サイクル１から６までの遊離されたＰＴＨアミノ 酸のＨＰＬＣクロマトグラムが、第１９図に示されている。配列は、予想とおり ＹＧＧＦＬＫであった。この中間ペプチドの収量を計算するのには、第１のサイ クルのＰＴＨアミノ酸の収量を用いた（種子１グラムあたり２５１〜２７７　ｎ ｍｏｌ）　ｅ エンケファリンからの余　なリジンの２、去前段階の結果得られた３つのアリコ ートをｐＨ８，５の０．２ＭのＮ−エチルモルフォリン１００４中に再度懸濁さ せ（ベルギー、　Ｊａｎｓｓｅｎ　Ｃｈｉｍｉｃａ）、各々の３分の１を３７℃ で０．２ｕｇのカルボキシベブチターゼＥ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｈ ｅｉｍ、配列決定グレード）で処理した。３つのアリコートをそれぞれ５分、１ ２分及び１７分間処理したが、３つの消化物は全て同等に有効であることがわか った。消化の後、上記脱塩の項で記されているものと同じ装置、カラム及び勾配 を用いてＨＰＬＣによってエンケファリンを純化させた。

アミノ酸分析を行なうことにより、エンケファリンの最終的収量を決定した。上 述の３つのアリコートの合計量の１／１５０にあたるアリコートを６ＮＨＣＪ２ ．０　、０５　％　７　エノ）Ｉｉ　４００　Ｎ　（Ｄ中で１１０℃で２４時間 加水分解した。加水分解産物を乾燥させ、アミノ酸をフェニルチオカルバモイル （ＰＴＣ）残基に誘導体合成した（Ｂｉｌｄｉｎｇｍｅｙｅｒ他、１９８４年） 、Ｐ　Ｉ　Ｃｏ−ＴＡＧアミノ酸分析システム（米国マサチューセッツ州Ｍｉｌ ｆｏｒｄ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ。

Ｗａｔｅｒｓ社）を用いて数量化した。内標準としてアルファアミノブチル酸を 用いて３つの標本の各々についてエンケファリンペプチドの収量を計算した。３ つの測定値の平均に基づき１種子１ｇあたり２０６　ｎｍｏｌのエンケファリン という最終収量を計算した。

最終的に得られたペプチドの同一性は三つの方法で確認された。まず第一に、そ のアミノ酸組成であリ、これは、Ｇｌｙ、１．７６；Ｔｙｒ、１．００；Ｌｅｕ 、１．１５及びＰｈｅ、１．０２の分子比を示していた。第２に、その逆相ＨＰ ＬＣカラム上での保持時間は、基準エンケファリンペプチドのものと一致してお り（第２０図）、最後に、そのアミノ酸配列が決定された。これらの基準は、明 確に、キメラ２Ｓアルブミンから分離されたペプチドをロイ−エンケファリンで あるものとして識別している。

鳳旦 上述の方法の第３の例として、２つの成長ホルモン放出因子（ＧＨＲＦ）の類似 体の生成のための手順が与えられる０位置２７におけるメチオニンがロイシンに より置換され、カルボキシル末端基がさまざまな方法で変更されているか又は４ つのアミノ酸により短縮されてさえいるような当初分離された４４のアミノ酸ペ プチド（Ｇｕｉ１１ｅｍｉｎ他、１９８２年）の合成及び天然の類似体は、活性 であることが示された（Ｋｅｍｐｅ他、１９８６年：　Ｒｉｖｉｅｒ他、１９８ ２年）、この場合、以下ＧＨＲＦＬ及びＧＨＲＦＳと呼称される２つの類似体が 生成される０両方の場合共、位置２７にメチオニンの代りにロイシンの置換を取 り込んでいる。Ｇ）ＩＲＦＬは、ペプチドの天然形態においてみられるようにカ ルボキシル末端基がＬ　ｅ　ｕ　−Ｎ　Ｈ＊であるような形で生成される（Ｇｕ ｉｌｌｅｍｉｎ他、１９８２年）、ＧＨＲＦＳはＡｒｇ−Ｈｓｅ−ＮＨ＊で終る 。ここでＨｓｅはホモセリンを意味する。この類似体は、生物学的に活性である ことがＫｅｍｐｅ他（１９８６年）により示されている６両方の類似体は共に、 ２Ｓアルブミン内でメチオニンコドンを側面に有しており、そのためＣｎＢｒで の処理によって開裂されつる。このことはいずれの類似体も内部メチオニンを含 んでいないことから可能なのである。ＨＰＬＣ技術を用いた２つのペプチドの分 離の後、これらは化学的に修飾されて、その結果Ｌｅｕ−ＮＨ＊及びＡｒｇ−Ｈ ｓｅ−ＮＨｇカルボキシル末端が得られる。

２つのＧＨＲＦ類似体及びＣｎＢｒ開裂部位をコード付けする１組の合成オリゴ ヌクレオチドは、紅助力鼠旺旦」加状匡凹の２Ｓアルブミンをコード付けするゲ ノミッククローン内の超可変領域全体について置換される。６番目及び７番目の システィン残基に隣接するいくつかのアミノ酸のみが残った。このキメラ遺伝子 は、その天然のプロモータ及びシグナルペプチドの制御下にある。そのプロセス 及び構造は、第２１図及び第２２図に図式的に示されている。構成全体を、アグ ロバクテリウムを媒介とする形質転換システムを用いてタバコ、Ａｒａｂｉｄｏ 　ｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ及びＢｒａｓｓｉｃａ　ｎ社胚へと移入（転移）さ せる、植物を再生させ、開花後に種子を収集して、２Ｓアルブミンを純化させる 。ＧＨＲＦペプチドを、ＣｎＢｒを用いて２Ｓアルブミンから開裂させ、（なお この印割部位はオリゴヌクレオチド内に組込まれている）、次にＨＰＬＣ技術を 用いて回収する。

Ａｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ２　Ｓアルブミン゛　のり三二三之 ｌ ｋ吐■肚旦り旦旦ｎ皿遺伝子は、例■に示されている事項に従ってクローニング された（　Ｋｒｅｂｂｅｒｓ他、１９８８年も参照のこと）、すでに公式の記録 に載っているように、この遺伝子を含むプラスミドはＰＡＴ２Ｓ１と呼ばれる。

ＡＴ２Ｓ１と呼ばれる、この遺伝子を含む領域の配列は、第１３図に示されてい る。

２、ＡＴ２Ｓ１’　の　口　パ　の　びＡｃｃＩｏ＜による ＡＴ２Ｓ１の超可変領域の一部分は、以下のオリゴヌクレオチドと置換される： ５’−ＣＣＡ　ＡＣＣＴＴＧ　ＡＡＡ　ＧＧＴｍｅｒ なおここで下線の配列は、ＡｃｃＩ部位を表わし。

周囲の配列は、保持されるべきＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　２　Ｓアルブミン遺伝 子の超可変領域のコード付は配列に対し相補的な配列である。この結果、最終的 に、オリゴヌクレオチドの下に記されているアミノ酸配列が得られる。

ＡＴ２Ｓ１の超可変領域をコード付けする配列の一部分の欠失及び置換は、プラ イマーとしてオリゴヌクレチドを用い、部位指向性突然変異誘発を使って行なわ れる０例工に示されているように、５ｔａｎｓｓｅｎｓ他（１９８７年）のシス テムが用いられる。

このプロセスの個々の段階は、以下のとおりである。

−ＡＴ２Ｓ１遺伝子のコード付は領域を含むｐＡＴ２ｓ１のＨｉｎｄＩｒｌフラ グメントのｐＭａ５−８へのクローニング（Ｉ）、このベクターはＣｍ”遺伝子 内でアンバー突然変異を続行し、アンピシリン耐性を規定する。この結果得られ るプラスミドは、ｐＭａｃＡＴ２ｓｌと呼称される（第２１図、ステップ１を参 照）ニ ー　偽ウィルス粒子からのこの組換え体の一本鎖ＤＮＡの調製（■）： −相補性ｐ　Ｍ　ｃ型プラスミドからのＨｉｎｄＩＩＩ制限フラグメントの調製 （１）、ｐＭｃ型のベクターは、Ａｐ耐性標識内にアンバー突然変異が取り込ま れている一方で、野生型Ｃｍ”遺伝子を含んでいる；−試験管内ＤＮＡ／ＤＮＡ 交雑による間隙二本鎖ＤＮＡ　（以下ｇｄＤＮＡと呼ぶ）の構成（■）。

ｇｄＤＮＡにおいて、標的配列は一本鎖ＤＮＡとして露出されている。交雑混合 物のその他の構成成分からのｇｄＤＮＡの予備的な純化は不要であるニー　ｇｄ ＤＮＡへの３０−ｍａｒ合成オリゴヌクレオチドのアニーリング（Ｖ）。

−同時試験管内ｋｌｅｎｏｗＤ　Ｎ　Ａボリメラーゼエ／ＤＮＡリガーゼ反応に よる、残りの一本鎖間隙の充てんとニックのシーリング（■）； −Ｃｍ耐性について選択する、ｍｕｔＳ宿主すなわち誤対合修復における欠失菌 株の形質転換：この結果、混合プラスミド後代が生成される（■）。

−アンバー突然変異を抑制することのできない宿主の再形質転換による鋳型スト ランド（ｐ　Ｍ　ａ−型）から誘導される後代の除去（■）、Ｃｍ耐性に関する 選択の結果、間隙あるストランドすなわちその中に突然変異誘発オリゴヌクレオ チドが取り込まれているストランドから誘導された後代が豊富になるニ ー　望ましい突然変異の存在に関する、再形質転換の結果として得られたクロー ンのスクリーニング、結果として得られるＡＴ２Ｓ１の欠失した圧可変領域を含 むプラスミドはｐＭａ　（ＡＴ２ＳＩＣ４０と呼ばれる（第２１図ステップ２を 参照）。

３、召口・・弔域をコード・しする　ダが　したＡＴ２Ｓｌ遺伝　へのＧＨＲＦ をコード・口する西牲二垣込 上述のように、超可変ループのほとんどをコード付けする配列が除去されたとき 、ＡｃｃＩ部位がその代りに挿入された１問題の配列はこのＡｃｃＩ部位内に挿 入されるが、第２のＡｃｃＩ部位も又、変更された遺伝子を含むＨｉ　ｎ　ｄ　 ＩＩＩフラグメント内に存在する。従って、変更された遺伝子を含むＮ　ｄ　ｅ 　Ｉ　−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、同様にＮｄｅ　Ｉ及びＨｉ　ｎ　ｄ　 ＩＩＩで切断されたクローニングベクターｐ　Ｂ　Ｒ（３２２）　（Ｂｏｌｉｖ ｅｒ、１９７７年）にサブクローニングされる。２Ｓアルブミン遺伝子内のＮｄ ｅＩ部位の位置は、第４図に示されている。結果として得られるサブクローンは ｐＢＲＡＴ２ｓ１と呼ばれる（第２１図、ステップ３）、成長ホルモンの２つの バージョンをコード付けする配列は、アニーリングされたときＧＨＲＦの完全な 配列を形成するような一連の相補的合成オリゴヌクレオチドを構成することによ りｐＢＲＡＴ２ｓｌのＡｃｃＩ部位内に挿入される。ＡＴ２Ｓ１のものとほぼ一 致するようにコドン使用が選択され、診断目的で用いられるべき制限部位（Ｓｔ ｙＩ）が含み入れられ、ＧＨＲＦコード付は配列の末端にはＥａｍＨＩ及びＰｓ ｔＩ部位に対し相補的な千鳥型末端基が、上述のステップの後２Ｓアルブミン遺 伝子の読取り枠が維持されるようにするための追加の塩基と合わせて含み入れら れた。２つの構成において用いられた８つのオリゴヌクレオチドが第２２図に示 されている。第２２Ａ図において、オリゴヌクレオチドの限界は垂直線により示 されており、配列の上下の数字はその番号を表している。オリゴヌクレオチド（ ４及び８）において、囲み内に入っている塩基は除外され、その結果、この構成 のＧＨＲＦＳバージョンが得られる。第２２Ａ図中☆印が付いている塩基は、Ｇ ＨＲＦＬをさらに構成するために用いられるクローン（ｐＥＫ７）内でＴに突然 変異させられたということがわかったが、これらの変化はアミノ酸配列に影響を 及ぼさなかったため、補正されなかった。ＧＨＲＦペプチドのペプチド配列及び ＣｎＢｒ部位を与えるために含まれているメチオニンは、ＤＮＡ配列の上に示さ れている。各末端の張出し塩基は、フラグメントをＢ　ａ　ｍ　ＨＩ及びＰｓｔ Ｉ部位に結紮するのに役立つ、これらはＳ１消化により除去される０次に、第２ ２Ｂ図に示されているように、鈍端フラグメントがｐＢＲＡＴ２ｓ１のＫｌｅｎ ｏｗ処理されたＡｃｃＩ部位へと結紮される。ＡｃｃＩ部位の読取り枠文脈は、 図の上部に示されており、開裂部位はマで表わされている。処理の結果は下にあ り、ＡｃｃＩ部位及びその充てんの結果得られた塩基は、太字で示されている。

各々の構成において用いられている６つのオリゴヌクレオチドは全て、キナーゼ 化された。アニーリング反応のためには、各々のオリゴヌクレオチド２ｐモルを 合計１２ｐＪ！の体積になるよう組合わせた。混合物を１０分間９０℃で保温し 、１０分間約６５〜７０’Ｃの温度へと移行させ、それから３５〜４５分にわた って３０〜３５℃まで漸進的に冷却させた。この時間の終了時点で、リガーゼバ ッフｙ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）及び１．５ユニツトのＴ４−リガ ーゼを付加し、体積を１５ｄに調整し、混合物を１６℃で一晩保温した０次に混 合物を５分間６５℃に保温し、その後、１００ｍＭ　ＮａＣε制限エンドヌクレ アーゼバッファ２−５１ｔＪｌ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）、Ｂａｍ ＨＩ及びＰａｔＩの各々を５〜１０ユニツト付加し、体積を２５４に調整した。

この消化物は、結紮段階中に形成したコンカテマーを開裂するためのものである 。４５分間の消化の後、反応物をフェノール／クロロホルムで抽出し、沈降させ 、ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化され細菌アルカリフォスファターゼで処理され たｐ　Ｕ　Ｃ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他、１９８５年）と結紮され たもの５μを含む１０パ中に再度懸濁させた。標準的な技術による細菌細胞の形 質転換の後（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、１９８２年）　、　ｓｔｐという標識のつい たオリゴヌクレオチドＮｏ、　１末端を用いてＧｒｕｎｓｔｅｉｎ（１９７５年 ）の方法により組換え体コロニーなスクリーニングした。ＧＨＲＦ遺伝子の各バ ージョンからのクローンを配列決定し、ｐＥＫ７　（ＧＨＲＦＬを含む）及びｐ ＥＫ８　（ＧＨＲＦＳを含む）と呼ばれる各バージョンについて１つずつのクロ ーンを、その後のステップで用いた（第２１図のステップ４参照）。

ｐＥＫ７及びｐＥＫ８のＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをｐＢＲＡＴ２ｓ１ のＡｃｃＩ部位内に挿入した（第２１図、ステップ５）、オーブンリーディング フレームを維持するために行なわれた処理の詳細は、第２２図に示されている。

ｐＥＫ７及びｐＥＫ８を各々ＢａＨＩ及びＰｓｔＩの両方で切断し、Ｓ１ヌクレ アーゼで処理し、ＧＨＲＦコード付は配列を含むフラグメントを、ゲル電気泳動 の後分離させた。吹にこれらのフラグメントを、ＡｃｃＩで切断されＤＮＡポリ メラーゼエのＫｌｅｎｏｗフラグネントで処理されたｐＢＲＡＴ２ｓ１と個別に 結紮した。結果として得られたクローンを、この目的のための合成配列が含み入 れら０れた部位である５ｔａｙ　Ｉ及びＨｉｎｄＩＨとの消化によりＧＨＲＦコ ード付は配列の適切な方向性についてチェックした。正しい方向性でインサート を含んでいることがわかったいくつかのクローンを配列決定した。これは、＄１ ヌクレアーゼ消化がつねに厳密に制御できないことから、必要となることである 。２つのＧＨＲＦ構成の各々について正しい配列をもつことの確認された１つの クローンを、その後のステップで用いた。これらは、それぞれＧＨＲＦＬ及びＧ ＨＲＦＳについてｐＥＫ　１００及びｐＥＫ２００と呼称された。

４、　真された６　なＡＴ２Ｓ１゛　五　のその　醪プロモータによる 完全なキメラ遺伝子は、以下のように再構成される（第２１図参照）：クローン ｐＡＴ２ｓＩＢｇは、遺伝子ＡＴ２Ｓ１のコード付は領域を含む１．ＯｋｂのＨ ｉｎｄＩＩＩフラグメントのみならず、遺伝子の適切な発現にとって充分な配列 をこのフラグメントの上流及び下流にて包含しているクローニングベクターｐＪ Ｂ６５（Ｂｏｔｔｅｒｍａｎ他、１９８７年）内に挿入された３、６ｋｂのＢ　 ｇ　ｌ　ＩＩフラグメントを含んでいる。このプラスミドはＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ Ｉで切断され、５．２ｋｂのフラグメント〔すなわちＡＴ２Ｓ１のコード付は領 域を含んでいないプラスミドの一部分）が分離される。クローンｐＡＴ２ｓｌは Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ及びＮｄｅＩで切断され、結果として得られる３２０ｂｐ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｎｄｅ　Ｉフラグメントが分離される。このフラグメントは、 追加のＡｃｃ　Ｉ部位の複雑さ無く第２１図のステップ５のオリゴヌクレオチド の挿入が進められうるように、ｐＢＲＡＴ２ｓ１の構成中に変更された２Ｓアル ブミンから除去されたもの（第２１図のステップ３）を表わす０次にこれら２つ の分離されたフラグメントを、３方向結紮にて、修飾されたコード付は配列を含 むそれぞれｐＥＫｌｏｏ及びｐＥＫ　（２００）からのＮ　ｄ　ｅ　ｌ−Ｈ１ｎ ｄＩｒＩフラグメントと結紮させる。数多くの部位のうちのいずれかを用いて、 Ｂ　ａ　Ｉ　ＩＩフラグメント内の再構成されたＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの 適当な方向性についてチェックするため、個々の形質転換体をスクリーニングす ることができる。結果として得られるプラスミドｐ　Ｅ　Ｋ　５０２及びｐＥＫ ６０１１は、全体的にＢａ１ＩＩフラグメント上に含まれている、未修飾遺伝子 と同じ側面配列ひいては同じブロモークによりとり囲まれた、超可変領域内のみ において修飾された２Ｓアルブミン遺伝子で構成されている。

５．１１二皿且旦１ キメラ遺伝子を含むＢａ１ｍフラグメントを、例２の第３節で用いられ説明され ている二元性ベクターｐＧｓｃ１７０３ＡのＢｇｌＩＩ内に挿入する（第２１図 、ステップ６も参照のこと）、結果として得られたプラスミドはｐＴＡＤ　１２ と呼ばれる。標準的な手順を用いて（Ｄｅｂｌａｅｒｅ他、１９８７年）、ｐＴ ＡＤ１２を、同様に例■の第３節で用いられているプラスミドｐＭＰ９０を有す るアグロバクテリウム菌株Ｃ５８ＣＩＲｉｆに移入する。このアグロバクテリウ ムを次に植物の形質転換のために用いる。ＳＲＩ株のタバコを、標準的な手順を 用いて形質転換する（Ｄｅｂｌａｅｒｅ他、１９８７年）　、　ｌ　ＯＯｕｇ／ ＭＩのカナマイシン上でカルスを選択し、耐性あるカルスを植物の再生に用いる 。

Ａｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ及びＢｒａｓｓｉｃａ　ｎａ　ｕｓ の形質転換のための技法は、同じベクター内で全く同じ構成を用いることができ るようなものである。上述のようなア　ロバクチ１ウム・ツメファシェンスに対 する授動の後、それぞれＡｒａｂｉｄｏ　ｓｉｓ及びＢｒａｓｓｉｃａの形質転 換のために、Ｌｌｏｙｄ他（１９８６年）及びｋｌｉｍａｓｚｅｗｓｋａ他（１ ９８５年）の手順を使用する。

各々のケースについて、タバコの場合と同様に、カルスを１００μｇ　／　１ｎ １のカナマイシン上で選択し、耐性あるカルスを植物の再生に用いることができ る。

全三種の場合、再生の初期段階において、カナマイシンを補足した媒質上で葉か らカルスを導き出すことにより、形質転換について再生体をチェックする。

（第６項も参照のこと）。

全三種の場合において、再生された植物を種子をつけるよう育てる。形質転換さ れたさまざまな植物は、異なる表現レベルをもつと予想されうるため（「位置の 効果Ｊ　Ｊｏｎｅｓ他、１９８５年）、当初複数の形質転換体を分析しなくては ならない、これは原則として、ＲＮＡ又はタンパク質のいずれかのレベルで行な うことができる。この場合、Ｂｅａｃｂｙ他（１９８５年）に記されているよう に種子ＲＮＡを調製し、標準的な技法を用いて（Ｔｈｏｍａｓ他、１９８０年） 、ノーザン・プロット法を行なった。　Ｂｒａｓｓｉｃａ及びＡｒａｂｉｄｏ　 ｓｉｓの両方の場合においては、キメラ遺伝子全体は内因性遺伝子との交差交雑 という結果をもたらすため、２Ｓアルブミン内の挿入に対し相補性のオリゴヌク レオチドプローブを用いた。すなわち構成を作るのに用いたようなオリゴヌクレ オチドの１つを用いることができる、各々の種について、１つ又は２つの個々の 植物を選択し、以下に開示するようなさらに詳しい分析に用いた。

まず、キメラ遺伝子のコピ一番号を、形質転換された植物の葉の組織からＤＮＡ を調製しくＤｅｌｌａｐｏｒｔａ他、１９８３年）、上で用いられているオリゴ ヌクレオチドでブロービングすることによって決定する。

例ＩＩに説明されているように、高塩分抽出、ゲルろ過及び逆相ＨＰＬＣによっ て、２Ｓアルブミンを純化する。

天然ＧＨＲＦに対する市販の抗体（ｔＪ　ＣＢ　−Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、　 Ｄｒｏｇｅｎｂｏｓ、ベルギー）を用いた免疫学的技法により、キメラ２Ｓアル ブミンの正しい溶離回数（時間）を測定する。

Ｂ）キメラ２Ｓアルブミンの　裂　びＧＨＲＦオ似体１り１塁 ２Ｓアルブミンを含む脱塩、ＨＰＬＣ純化されたＧＨＲＦを次にＣＮ　Ｂ　ｒ　 （Ｇｒｏｓｓ　＆　Ｗｉｔｋｏｐ、１９６１年）で処理する。ＣｎＢｒは、なお Ｃ０ＯＨ末端基に付いている余分なホモセリン／ホモセリン−ラクトンでＧＨＲ Ｆ類似体を遊離させる。ＧＨＲＦ類似体を、例ＩＩに示されているように、古典 的な逆相ＨＰＬＣ技法を用いて純化させ、例Ｈに示されている方法を用いて、そ のアミノ酸配列を決定する。　Ｋｅｍｐｅ他（１９８６年）が記しているように アンモニア、ｎ−ブチルアミン及びｎ−ドデシルアミンを用いて、分離されたＧ ＨＲＦＳＢ似体をアミド化する。この結果が、説明されるＡｒｇ−Ｈｓｅ−ＮＨ ＊末端である。

カルボキシル末端になお余分なメチオニンを有する第２の類似体ＧＨＲＦＬをま ずカルボキシペプチダーゼＢで処理し、カルボキシル末端ホモセリン残基を除去 する（Ａｍｂｌｅｒ、１９７２年）、その結果、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＣＯＯＨ末端 が得られる。　Ｋｒｅｉｌ　（１９８４年）に記されているように、カタラーゼ 及びアスコルビン酸塩の存在する中でＤ−アミノ酸オキシグーゼで処理すること により、グリシン−Ｃｏｏ）Ｉ末端は、アミド−ＣＯＮＨ、及びグリオキシル酸 末端に変換される。この−組の酵素段階の結果、最終的なアミド化されたＧＨＲ ＦＬ類似体が得られる。

従って、前記諸例は、ロイ−エンケファリン又は成長ホルモン放出因子をコード 付けするインサートを中にとり込むよう２Ｓアルブミン貯蔵タンパク質をいかに 変更するか、そしてそれに続く相応する変更された前駆体核酸を含む適切なプラ スミドを用いたタバコ、紅蝕力桓匣旦及びＢｒａｓｓｉｃａ細胞の形質転換、形 質転換された植物細胞の相応する植物への再生、種子形成段階に至るまでのその 栽培、種子の回収、そこからの雑種２Ｓアルブミンの分離そして最終的に純粋な 形でのかかる雑種タンパク質からのロイエンケファリン又はＧＨＲＦの回収につ いての完全な例示を与えている。

従って本発明が、タンパク質又はポリペプチドの遺伝的処理技術及びその天然の 形態に近い形態でそれらを生み出す条件の下で大量にこれらを生産する技術を提 供するものであるということは直ちに明白である。

又当然のことながら、本発明は上述の例に限られているわけではない、当業者は 、各々のケースにおいて、問題となっているいずれかの一定のポリペプチド又は ペプチドの生産に用いるべき貯蔵タンパク質、その性質（例えば、相応するＤＮ Ａインサートを最もうまく収納するためそれが含んでいる適切な制限部位に応じ て）を選択し、問題のペプチドが究極的に開裂、回収及び純化されつるもとであ る相応する雑種タンパク質を生成するための、形質転換されるべき種子形成植物 の性質に基づく最適な種子特異的プロモータの選択を適切に行なうことになる。

以下に、本書に記されているプロセスの段階のいくつかを達成するための既知の 方法又は本発明の実施に先立って立証された一般的知識に対し参照指示がなされ た範囲内で本開示全体を通して基準とされてきた参考文献を、妃ず。

なお、以下のことをさらに確認しておく：・−ブラ、スミドｐＧＶ２２６０は、 １９８３年１２月にＤＳＭに２７９９にて寄託されたこと、−プラスミドＩ）　 Ｓ　ＯＹ　Ｌ　Ｅ　Ａは、１９８７年８月３日付で、ＤＳＭに４２０５にて寄託 されたこと、−ブラスミドエ３ＢＮ２Ｓｌけ、１９８７年８月３日付でＤＳＭに ４２０５にて寄託されたこと、−プラスミドｐ　Ｍ　ａ　５−８は、１９８８年 ５月３日付で４５６７にて、又ｐＭｃは同日４５６６にてＤＳＭに寄託されたご と、 −プラスミドｐＡＴ２Ｓ　１は、１９８８年１０月７日付で、Ｄ　Ｓ　Ｍに４８ ７９にて寄託されたこと、−プラスミドｐＡＴ２ｓＩＢｇは、１９８８年１０月 ７日付でＤＳＨに４８７８にて寄託されたこと、 −プラスミドｐＧｓｃ１７０３Ａは、１９８８年１０月７日付でＤＳＭに４８８ ０にて寄託されたこと、 −プラスミドｐＥＫ７は、１９８８年１０月７日イ寸でＤＳＭに４８７６にて寄 託されたこと、−プラスミドｐＥＫ８は、１９８８年ＪＯ月７日イ寸でＤＳＭに ４８７７にで寄託されたこと６ただし、これらは全て、当業者がいかなる発明性 の作業を実施しなくても入手可能な遺伝材料から再生することのできるような構 成である。

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Ｒ，Ａ、、　Ｓａｍｐａｉｏ、　Ｍ、Ｊ、Ａ、Ｍ、及びＧａｎｄｅｒ　Ｅ、Ｓ、 共著（１９８７年）　ｒ　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ　（分子遺伝子遺伝 学？）Ｊ２０６．３３８−３４３゜ −Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ　Ｓ、Ｌ　：　Ｊ、　；　Ｗｏｏｄ、　Ｊ、及びＨｉｃ ｋｓ、　Ｂ。

（１９８３年）「植物分子生物学報告書」１．１　９−２　１゜ −Ｄｅ　Ｗｉｔ、　Ｊ、Ｌ、著（１９７８年）、「タバコのモザイクウィルスの 核磁気共鳴」に関する理学博士論文、　Ｌａｎｄｂｏｕｗｈｏｇｅｓｃｈｏｏｌ 　Ｗｏｇｅｎｉｎｇｅｎ、オランダ、ｐ７２−８５゜ −Ｅｌｌｉｓ、　Ｊ、Ｒ，、５ｈｉｒｓａｔ、　Ａ、Ｈ，、Ｈｅｐｈｅｒ、　Ａ 、。

Ｙａｒｗｏｏｄ、　Ｊ、Ｎ、、　Ｇａｔｅｈｏｕｓｅ、　Ｊ、Ａ、、　Ｃｒｏｙ 、　Ｒ，Ｒ，Ｄ。

’　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（植物分子生物学）」１旦、２０３− ２１４゜ −Ｅｎｇｖａｌｌ、　Ｅ、及びＰｅ５ｃｅ　Ａ、Ｊ、共著（１９７８年）、ｒＳ ｃａｎｄ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　５ｕｐｐ１．　（スカンジアビア免疫学増刊号 」７゜ −Ｅｒ１ｃｓｏｎ、Ｍ、Ｌ、、Ｒｏｄｉｎ、Ｊ、、Ｌｅｎｍａｎ、Ｍ、。

Ｇｌｉｍｅｌｉｕｍｓ、　Ｋ、、　Ｌａｒｓ−Ｇｏｒａｎ、　Ｊ、及びＲａｋ、 　Ｌ、共著（１９８６年）　ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（生化学ジャー ナル）Ｊ２６１．１４５７６−１４５８１゜−Ｆｒｏｍｍ、　・・・、Ｔａｙｌ ｏｒ、　Ｗ、及びＷａｌｂｏｔ、　Ｖ、共著（１９８５年）　ｒＰｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ　（国立科学アカデミ−会報」且、５８２４−５ ８２８゜−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｈｏ５ｃｈｅｋ、　Ｇ、、及びＶ ｏｄｋｉｎ。

Ｌ、０．共著（１９８３年）ｒｃｅｌｌ（細胞）Ｊ３３．４６５−４７５゜ −Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ、　Ｊ、Ｓ、及びＣｈｒｉｓｐｅｅｌｓ、　Ｍ、Ｊ、共著 （１９８５年）、ｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（植物生理学）」エユ、 ６５−７１゜ −Ｇｒｏｓｓ、　Ｅ、及びＷｉｔｋｏｐ、　Ｂ、共著（１９６１年）ｒＪ、　ｏ ｆ　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｍ、　５ｏｃｉ　（米国化学学会誌）」８３．１５１０ −１５１１゜ −Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、及びＨｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、共著（１９７５−Ｇ ｕｂｌｅｒ、　Ｕ−及びＨｏｆｆｍａｎ、　Ｂ、Ｊ、共著ｒＧｅｎｅ（遺伝子） 」旦、２６３−２６９゜ −Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ、Ｒ，、Ｂｒａｚｅａｕ、Ｐ、、Ｂ　Ｂ　１３ｈｌｅｎ、 Ｐ、。

Ｅｓｃｈ、　ｆ、、　Ｌｉｎｇ、　Ｎ、及びＷｅｈｒｅｎｂｅｒｇ、　Ｗ、Ｂ、 共著（１９８２年）　ｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　（科学）」スユ、５８５−５８７゜ −Ｈａｒｒｉｓ、　Ｂ、及びＤｕｒｅ、　Ｌ、共著（１９８１年）ｒ　Ｂｉｏｃ ｈｅｍｉｓｔｒｙ　（生化学）」１ユ、３２５０−３２５６゜ −Ｈｅｒｍａｎ、　Ｅ、Ｍ、、　５ｈａｎｎｏｎ、　Ｌ、Ｍ、及びＣｈｒｉｓｐ ｅｅｌｓ。

ν、Ｊ、共著（１９８６年）、掲載書「種子貯蔵タンパク質及びレクチンの分子 生物学Ｊ　Ｌ、Ｍ、、　５ｈａｎｎｏｎａｎｄ　Ｍ、Ｊ、Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ 　Ｅｄｓ、、米国植物生理学者学会。

−Ｈｉｇｇｉｎｓ、　Ｔ、Ｊ、Ｖ、著（１９８４年）　ｒ　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（植物生理学年報）Ｊ３５．１９１−２２１゜ −Ｈｉｇｇｉｎｓ、　Ｔ、Ｊ、Ｖ、、Ｌｌｅｗｅｌｌｙｎ、　Ｄ、、　ｎｅｗｂ ｉｇｉｎ、Ｅ。

及び５ｐｅｎｃｅｒ、　Ｄ、共著（ＥＫ？シンポジウム参照資料十日イ寸） −Ｈｉｒｓ、　Ｃ，Ｈ，Ｗ、共著（１９５６年）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　（生化学ジャーナル）２１９，６１１−６２１　。

−Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｌ、Ｍ、、Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ、Ｄ、Ｄ、、Ｂｏｏｋｌａｎ ｄ。

Ｒ，、Ｒａ５ｈｋａ、　Ｋ１．　Ｈｅｒｍａｎ、　Ｅ、Ｍ、共著（１９８７年） ＥＭＢＯＪ、旦、３２１３−３２２１゜−Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ、Ｃ，Ｐ、、Ｒ ｏｇｇｅｎｋａｍｐ、Ｒ，、Ｒｅ１ｐｅｎ、Ｇ。

及びＢｉｅｌｅｆｅｌｄ、　Ｍ、（１９８５年）、掲載書：ｒＱｕｏ　ｖａｄｉ ｓ　Ｊ　ｒ遺伝子工学により生み出される治療薬」０編集者：　Ｊｏｙｅｕｘ、 　Ａ、、　Ｌｅｙｇｎｅ、　Ｇ、、　Ｍｏｒｒｅ。

Ｍ、、　Ｒｏｎｃｕｃｃｉ、　Ｒ，、及びＳｃｈｍｅｌｃｋ、　Ｒ，Ｐ、Ｈ，５ ＡＮＯＦＩ−Ｈｏｒｓｃｈ、　Ｒ，Ｂ、、　Ｆｒｙ、　Ｊ、Ｅ、、　Ｈｏｆｆｍ ａｎｎ、　Ｎ、Ｌ、。

Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ、　Ｄ、、　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、Ｇ、及びＦｒａｌｅｙ、 　Ｒ−Ｔ−共著（１９８５年）、ｒＳｃｉｅｎｃｅ　（科学）Ｊ２２７．１２２ ９−１２３１゜ −Ｈｕｇｈｅｓ、　Ｊ、、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｔ、、　Ｍｏｒｇａｎ、　Ｂ、及び Ｆｏｔｈｅｒｇｉｌｌ、　Ｌ、共著（１９７５ａ）　ｒｌｉｆｅ　Ｓｃｉ。

（生命科学）」１互、１７５３−１７５８゜−Ｈｕｇｈｅｓ、　Ｊ、、　Ｓｍ１ ｔｈ、　Ｔ、Ｗ、、　Ｋｏｓｔｅｒｌｉｔｚ、　ＨＪ、。

Ｆｏｔｈｅｒｇｉｌｌ、　Ｌ、Ａ、、　Ｍｏｒｇａｎ、　Ｂ、Ａ、及びＭｏｒｒ ｉｓ。

Ｈ，Ｒ，（１９７５ｂ）　、ｒＮａｔｕｒｅＪ　２５Ｂ、５７７−５７９゜ −Ｈｕｎｔ、　Ｌ、Ｔ、及びＤａｙｈｏｆｆ、　Ｍ、０．　（１９７６年）。

掲載書：「タンパク質の配列及び構造地図」、繻集音：　Ｄａｙｈｏｆｆ、　Ｍ 、０．、　Ｎａｔｉｏｎａｌ　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏ ｕｎｄａｔｉｏｎ　（国立生化学研究基金）、５ｉｌｖｅｒ　Ｓｐｒｉｎｇ、　 Ｍｄ、　Ｖｏｌ、　５．追補Ｉ１．ｐｐＨ３−１４５゜ −Ｊａｇｏｄｚｉｎｓｋｉ、Ｌ、、Ｓａｒｇｅｎｔ、Ｔ、、Ｙａｎｇ、Ｍ、。

Ｇｌａｃｋｉｎ、　Ｃ，、Ｂｏｎｎｅｒ、　Ｊ、共著（１９８７年）、Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、１旦、３５２１−３５２ ５゜ −Ｊｅｋｅｌ、　Ｐ、Ａ、、　Ｗｅｉｊｅｒ、　ＷＪ、及びＢｅｉｎｋｅｍａ、 　Ｊ、Ｊ。

共著（１９８３年）　ｒ　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（分析生化学）Ｊ１ ３４，３４７−３５４゜ −Ｊｏｎｅｓ　Ｊ、Ｄ、Ｇ、　；　Ｄｕｎｓｍｕｉｒ、　Ｐ、及びＢｅｄｋｒｏ ｏｋ、　Ｊ。

共著（１９８５年）ＥＭＢＯＪ、　４　（１０）、　２４１１−２４１８゜ −Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ、　Ｌ−Ｇ　：　Ｌｅｎｍａｎ、　Ｍ、、　Ｅｒ１ｃｓｏ ｎ、　Ｍ、Ｌ、及びＲａ５ｋ、　Ｌ、共著（１９８７年）　、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ 、　Ｃｈｅｍ。

（生化学ジャーナル）、２６２　（２５）、１２１９６−１２２０１゜ −Ｊｕｎｇ、　Ｇ、、　Ｊ　（３ｕβｔｔｎｅｒ、　Ｆ、、　ｒｃｈｅｍ、Ｚｔ ｇｌ　９６（１１）、６０３−６１１゜ −Ｋｅｍｐｅ、　Ｔ　：　Ｃｈｏｗ、　Ｆ、、　Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｓ、Ｍ、 、　Ｂａｋｅｒ。

Ｐ、、　Ｈａｙｓ、　Ｗ、、　Ｏｐｐｅｒｍａｎ、　Ｇ、、　Ｌ’Ｉｔａｌｉａ ｎ、　Ｊｊ、。

Ｌｏｎｇ、　Ｃ，、及びＰａｕｌｓｏｎ、　Ｂ、共著（１９８６年）ｒ　Ｂｉｏ ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（バイオテクノロジー）」丘、５６５−５６８゜ −Ｋｌｉｍａｓｚｅｗｓｋａ、　Ｋ、及びＫｅｌｌｅｒ、　Ｗ、Ａ、共著（１９ ８５年）「植物細胞組織器官培養」迭、１８３−１９７゜ −Ｋｏｌｌｍａｎ、Ｖ、Ｈ，、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｒ，Ｅ、、Ｈａｎｎｅｒｓ、Ｊ、 Ｌ、。

Ｇｒｅｇｇ、　Ｃ，Ｔ、、　Ｗｈａｌｅｙ、　Ｔ、Ｗ、、共著ｒ　Ｊ、　Ｌａｂ ｅｌｌｅｄＣｏｍｐｄ、　Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ、　（標識化合物放射性薬品ジ ャーナル）」、１互（６）　、８３３−８４２゜−Ｋｏｎｃｚ、　Ｃ，及び５ｃ ｈｅｅ１．　Ｊ、共著（１９８６年）、Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ　（分 子遺伝学？）２０４．３８３−３９６゜ −Ｋｒｅｂｅｒｓ、　Ｅ、、　Ｈｅｒｄｉｅｓ、　Ｌ、、　ＤｅＣｌｅｒｃｑ、 　Ａ、。

５ｅｕｒｉｎｃｋ、Ｊ、、Ｌｅｅｍａｎｓ、Ｊ、、Ｖａｎｄａｍｍｅ、Ｊ、。

Ｓｅｇｕｒａ、　Ｍ、、　Ｇｈｅｙｓｅｎ、　Ｇ、、　Ｖａｎ　Ｍｏｎｔａｇｕ 、　Ｍ、及びＶａｎｄｅｋｅｒｃｋｈｏｖｅ、　Ｊ、共著（１９８８年）　、ｒ ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ、　（植物生理学）」、旦旦（４）、８５９−８６６ ゜ −Ｋｒｅｉｌ、　Ｇ、著（１９８４年）、「酵素学諸法」然）Ｊ２２７．６８０ −６８５゜ −Ｌａｎｄ、Ｈ，、Ｇｒｅｚ、ｋｌ、、Ｈａｕｓｅｒ、Ｈ，、Ｌｉｎｄｅｎｍａ ｉｅｒ。

Ｗ、及び５ｃｈｕｅｔｚ、　Ｇ、共著（１９８１年）。

ｒＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（核酸研究）」旦、２２５１−２２６６ ゜ −Ｌａｒｋｉｎｓ、　Ｂ、Ａ、及びＨｕｒｋｍａｎ、　Ｗ、Ｊ、（１９７８年） 　ｒＰｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　（植物生理学）」、且、２５６−２６３゜ −Ｌｅｗｉｓ、　Ｒ，Ｖ、、　５ｔｅｉｎ、　Ｓ、及びＵｄｅｎｆｒｉｅｎｄ、 　Ｓ、共著（１９７９年）　、ｒＩｎｔ、　Ｊ、　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅ ｉｎ　Ｒｅｓ。

（国際ペプチドタンパク質研究ジャーナル）」。

■、４９３−４９７゜ −Ｌｌｏｙｄ、　Ａ、Ｍ、、　Ｂａｒｎａｓｏｎ、　Ａ、Ｒ，、Ｒｏｇｅｒｓ、 　Ｓ、Ｇ、。

Ｂｙｒｎｅ、　Ｍ、Ｃ，、Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、及びＨｏｒｓｈ、　Ｒ，Ｂ 、共著（１９８６年）　、ｒＳｃｉｅｎｃｅ　（科学）Ｊ２３４゜４６４−４６ ６゜ −Ｌｏｅｎｅｎ及びＢｌａｔｔｎｅｒ共著（１９８３年）、ｒＧｅｎｅＣ遺伝子 ）」且、１７１゜ −Ｌｏｒｄ、　Ｊ、Ｍ、著（１９８５年）　、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ。

（欧州生化学ジャーナル）、１４６．４０３−４０９゜ −Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、及びＳａｍｂｒｏ ｏｋ、　Ｊ。

共著（１９８２年）、「分子クローニングＪ　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ。

ニューヨーク。

−Ｍａｒｒｉｓ、　Ｃ，、Ｇａ１ｌｏｉｓ、　Ｐ、、　Ｃｏｐｌｅｙｊ、及びＫ ｒｅｉｓ。

Ｎ、共著（１９８８年）、「植物分子生物学」−り旦、３５９−３６６゜ −Ｍａｒｔｏｎ、　Ｌ、、　Ｗｕｌｌｅｍｓ、　Ｇ、Ｊ、、　Ｍｏ１ｅｎｄｉｊ ｋ、　Ｌ、及び５ｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ、　Ｒ，Ａ、共著（１９７９年］、　 ｒＮａｔｕｒｅＪ、２７７．１２９−１３１゜ −Ｍａｘａｍ、　Ａ、Ｍ、及びＧ１１ｂｅｒｔ、　’ｉｔ、共著（１９８０年） 「酵素学諸法Ｊ旦、４９９−５６０゜−Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、に、及びＢａｒｎ ｅｓ、　Ｗ、Ｍ、共著（１９８６年）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｏｄ 、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８３．１０２６−１０３０゜ −モリナガ、Ｔ１．サカイ、　Ｎ、、　Ｗｅｇｍａｎｎ、　Ｔ、、クナオキ、Ｔ 、共著（１９８３年）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、旦０．４６０４−４６０６゜ −オオツ力、Ｅ２．マツイ、Ｓ、、イヶハラ９Ｍ、。

タカハシ、Ｙ、及びマツパラ、Ｌ共著（１９８５年）　、ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｍ、Ｊ　２６０．２６０５−２６０８゜ −オカムＯ，Ｊ、に、、ジョフクに、　Ｄ、及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｒ。

Ｂ、共著（１９８６年）　＊　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、１旦、８２４０−８２４４゜ −オカヤマ、Ｈ９及びＢｅｒｇ、　Ｐ、共著（１９８２年）。

ｒ　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　（分子細胞生物学）」Ｚ。

１６１−１７０゜ −Ｐａ５ｔｅｒｎａｋ、　Ｇ、Ｗ、、　Ｗｉｌｓｏｎ、　Ｈ，Ａ、及び５ｎｙｄ ｅｒ、　Ｓ。

Ｈ４共著（１９７５年）　、　Ｍｏ１．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、（分子薬理学） 、上ユ、３４０−３５０゜ −Ｐｅｒｌｍａｎ、　＋１．及びＨａＬｖｏｒｓｏｎ、　Ｈ，０，共著（１９８ ３年）　ｒＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、（分子生物学ジャーナル」１６７．３９ １−４０９゜−Ｒａｄｋｅ、Ｓ、Ｅ、、Ａｎｄｒｅｗｓ、Ｂ、Ｍ、、　Ｍｏ１ｏ ｎｅｙ、　Ｍ、Ｍ、。

Ｃｒｏｕｃｈ、　Ｍ、Ｌ、、　Ｋｒ１ｄｌ、　Ｊ、Ｃ：、及びＫｎａｕｆ、　Ｖ 、Ｃ，共著（１９８８年）　、　Ｔｈｅｏｒ、　Ａｐｐｌｉ、　Ｇｅｎｅｔ、　 （理論的応用遺伝学）７５１．６８５−６９４゜ −Ｒｉｖｉｅｒ、　Ｊ、、　５ｐｉｅｓｓ、　Ｊ、、　Ｔｈｏｒｎｅｒ、　Ｍ、 及びＶａｌｅ、　Ｗ、共著（１９８２年）　、ｒＮａｔｕｒｅＪ　３００．２７ ６−２７８゜ −Ｒｏｄｅｎ、　Ｌ、Ｔ、、　Ｍｉｆｌｉｎ、　Ｂ、Ｊ、、　Ｆｒｅｅｄｍａｎ 、　Ｒ，Ｂ、共著（１９８２年）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　１３８．１２１−１ ２４゜ −５ｃｏｆｉｅｌｄ、　Ｓ、Ｒ，及びＣｒｏｕｃｈ、　Ｍ、Ｌ、共著（１９８７ 年）　、ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（生化学ジャーナル）」２６２　（ ２５）、１２２０２−１２２０８゜−Ｓｅｉｒｉｎｇｅｒ、Ｂ、Ｒ，、Ｌｉｅｂ ｉｓｃｈ、Ｄ、Ｃ，、Ｇｒａｍｓｃｈ。

Ｃ，、Ｈｅｒｚ、　Ａ、、　Ｗｅｂｅｒ、　Ｅ、、　Ｅｖａｎｓ、　Ｃ１，、Ｅ ｓｃｈ、　Ｆ。

Ｓ、及びＢｏｅｈｌｅｎ、　Ｐ、共著（１９８５年）　、　ｒＮａｔｕｒｅＪ３ １３、５７−５９゜ −Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ、Ｃ，、Ｒｅ１ｃｈｅｒｔ、Ｎ、Ａ、。

Ｂａｒｋｅｒ、　Ｒ，Ｆ、、　Ｈａｌｌ、　Ｔ、Ｃ，及びＫｅｍｐ、　Ｊ、Ｄ、 共著（１９８５年）　、ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡＪ８２、３３２０−３３２４゜ 一５ｈａｒｉｅｆ、　Ｆ、及びＬｉ、　Ｓ、Ｓ、共著（１９８２年）。

ｒ　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　（生化学ジャーナル）Ｊ２５７．１４７５ ３−１４７５９゜ −Ｓｉｍａｎｔｏｖ、　Ｒ，及び５ｎｙｄｅｒ、　Ｓ、Ｈ，（１９７６年）ｒ　 Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、（生命科学）Ｊ　１８．７８１−７８８゜ −Ｓｌｉｇｈｔｏｍ、　Ｊ、Ｌ、及びＣｈｅｅ、　Ｐ、Ｐ、共著（１９８７年） 　、ｒＢｉｏｔｅｃｈ、　Ａｄｖ、（バイオテクノロジーの進歩？）」旦、２９ −４５゜ −５ｔａｎｓｓｅｎｓ、　Ｐ、、　ＭｃＫｅｏｗｎ、　Ｙ、、　Ｆｒ１ｅｄｒｉ ｃｈ、　Ｋ、、及びＦｒ１ｔｚ、　Ｈ，Ｊ、共著（１９８７年）　、　ＥＮＢＯ 実験所講座マニュアル：　「指向性突然変異誘発及びタンパク質工学Ｊ、１９８ ７年７月４〜１８日於：　Ｍａｘ　Ｐｌａｎｃｋ　１ｎｓｔｉｔｕｔｅ　ＦＢｕ βｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ。

Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、西ドイツ。

−Ｓｔａｓｗｉｃｋ、　Ｐ、Ｅ、著（１９８８年）　ｒ　ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉ ｏｌ、　（植物生理学）Ｊ８ユ、２５０−２５４゜ −タカハシ、Ｙｌ、カトウ、キクヤ、ハヤシザキ。

Ｙｌ、ワカバヤシ、■、、オーツカ、Ｅ、、マツイ、Ｓ、。

イケハラ９Ｍ、及びマツバラ、に、共著（１９８５年）、ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　Ｊ、８２．１９３１−１９３５年 。

−Ｔｈｏｍａｓ、　Ｐ、Ｓ、著（１９８０年）　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７７．５２０１゜−Ｔｏｗｂｉｎ、　Ｈ，、５ｔａｅｈ ｅｌｉｎ、　Ｔ、及びＧｏｒｄｏｎ、　Ｊ、共著（１９７９年）　、　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（υ、Ｓ、Ａ、）ヱ」−１４３５０−４３５４゜−Ｖｅｌｔｅｕ、　Ｊ、、　Ｖ ｅｌｔｅｎ、　Ｌ、、　Ｈａｉｎ、　Ｒ，及び５ｃｈｅｌｌ。

Ｊ、共著（１９８４年）　ＥＭＢＯＪ、旦、２７２３−２７３０゜ −Ｗａｌｌｉｎｇ、　Ｌ、　Ｄｒｅｗｓ、　Ｇ、Ｎ、及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、　 Ｒ，共著（１９８６年）　、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、８ ３．２１２３−２１２７゜ −Ｙａｎｇ、　Ｆ、、　Ｌｕｎａ、　Ｖ、Ｇ、、　ＭｃＡｎｅｌｌｙ、　Ｒ，Ｄ 、。

Ｎｏｂｅｒｈａｕｓ、Ｋ、Ｈ，、Ｃｕｐｐｌｅｓ、　Ｒ，Ｌ、、　Ｂｏｗｍａｎ 、Ｂ、Ｈ，共著（１９８５年）、ｒＮｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　（核酸 研究）１皿、８００７−８０１７゜ −Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、及びＭｅｓｓ ｉｎｇ。

Ｊ、共著（１９８５年）ｒＧｅｎｅ（遺伝子）」、−Ｙｏｕｌｅ、　Ｒ，及びＨ ｕａｎｇ、　Ａ、Ｉ（、Ｃ，共著（１９８１年）　ｒＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｊ、　 Ｂｏｔ、　（米国植物学ジャーナル）」且、４４−４８゜ へ計種　タンパク”の　率で表わした２ＳアルブＣｏｍｐｏｓｉｔａｅ Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ　ａｎｎｕｕｓ　（ヒマワリ）　６２％Ｃｒｕｃｉｆｅｒ ａｅ Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｓｐｐ、（アブラナ）　６２％Ｌｉｎａｃｅａｅ Ｌｉｎｕｍ　ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ　（アマニ）　４２％Ｌｅｇｕｍｉｎ ｏｓａｅ は且二Ｌｚ山比肚旦胚　（ハウチワマメ）　３８％Ａｒａｃｈｉｓ　ｈ　ｏ　ａ ｅａ　（ビーナツツ）　２０％Ｌｅｃｙｔｈｉｄａｃｅａｅ Ｂｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａ　ｅｘｃｅｌｓａ　（ブラジルナツツ）３０％Ｌｉ１ ｉａｃｅａｅ 世：ｃａ　ｓｐｐ、（ユッカ）　２７％Ｅｕｐｈｏｒｂｉａｃａｅ Ｒｉｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｍｕｎｉｓ　（トウゴマの実）　４４％（出典　Ｙｏｕ ｌｅ　＆　Ｈｕａｎｇ、１９８１年）さ ト ２Ｓアルブミンタンパク質配列の比較 ＦＩＧＵＲＥ　３ 大きなサブユニット ＦＩＧ、４ ｐＬ・　Ｉ Ｄｄ・■ Ｃ／　Ｔ　ＮＡＧ ｐＢＮ２ｓ１　ｐＵｃ　１Ｂ 区瓜胆虱印史 ｐＬ）Ｃ１ＢＳＬＢＮ３ −木鎖調製 ＰＳ　ＦＹ会　１６４ ＣＣＴＴＣｒＴＴＣ丁ＡＣＴＡＡＡＴＣＴＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＣＴＣＡＡＡＧ ＣＧＴＡＴＧｋＧＡＧＴＧＴＧＧＴＴＧＴＴＧＡＴ＾５ｔＯＴＡ丁＾ＣＡＴＧＴ 丁ＧＡＣＡＣＴ丁ＧＡＣＡＣＡＴＡＣＣＡＣＡＣＣＴＣＡＴＣＧＴ＋ｄＧＴＴＴ ＴＡＴＧＡＴＡＡＡＴＧＴ　５９フＦＬＧ、１３ ＰＱＧＱＱＱＥＱＱＬＦＱＱＣＣＮ！ＬＲＱ！ＧＧＩＣＡＩＣＡＩＣＡＩＧＡＩ ＣＡＩＣＡＩＸＴＩＴＴＩＣＡＩＣＡＩＴＧＩＴＧＩＡＡＩＧ＾ＦＩＧ、Ｉｋ た■ニ一旦 ■トμＬ■ ムｎニー往 Ｆｉａｕｒｅ　２２： ＫＧＩ　Ｈ ＡＡＡ　ＧＧＴ’ＡＴ　Ａ　ＣＡＣ ＴＴＴ　ＣＣＡ　ＴＡ’Ｔ　ＧＴＧ 国際調査報告 Ｌ＋＋＋−南−＾帥’−””ＮＩＩ　ＰＣＴ／ＥＰ　８１１１００９４４＋ｍｍ −＾ｍ−１””　ＰＣＴ／ＥＰ　８８１００９４４−一−−−＾陣−−＋−ｍ、 ＰＣＴ／ＥＰ　８８１００９４４国際調査報告 ＥＰ　８８００９４４ ＳＡ　２５６４８

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. （１）種子形成植物内で関心の対象である一定のポリペプチドを製造するための 方法において、−一世代又は複数世代にわたり、再生された植物細胞から又はこ の再生植物細胞から得られた植物の種子から得た植物を栽培する段階、（なおこ こにおいてかかる植物内で複製可能なこの植物細胞の遺伝的遺産又は情報には、 種子特異的なプロモータの制御下に置かれた各酸配列が含まれている）；−栽培 された植物の種子を回収し、その中に含まれている雑種貯蔵タンパク質を抽出す る段階；−開裂部位レベルで前記雑種貯蔵タンパク質から関心の対象であるペプ チドを切り出す段階；そして −問題のペプチドを純化された形で回収する段階（なおこのペプチドは、かかる 植物のシグナルペプチドを含む貯蔵タンパク質の前駆体の少なくとも一部分をコ ード付けするｍＲＮＡに転写され、前記核酸は、以下「前駆体コード付け核酸」 と呼ばれる） を含むこと、 ・かかる核酸には、１つのヌクレオチド配列（以下「関連配列」と呼ぶ）が含ま れ、かかる関連配列は、その（関連配列）中で自ら（インサート）をとり囲む未 修飾部分と共に読取り段階においてオープンリーディングフレームを形成する非 相同核酸インサートにより修飾された可欠領域を含んでいること、 ・かかるインサートは、前記問題のポリペプチドをコード付けするヌクレオチド セグメントを含んでいること、 ・前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサート又は隣接する末端のい ずれか又はその両方に属するヌクレオチドを有する単数又は複数のコドンにより 、前記関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結されていること、 ・前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列によりコード付けされた雑 種貯蔵タンパク質又は貯蔵タンパク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲 む選択的に開裂可能な周縁部位を構成する単数又は複数のアミノ酸残基をコード 付けすることを特徴とする方法。
2. （２）前記問題のペプチドが、純化中又はその後のいずれかにおけるその分離を 可能にする選択的な開裂部位により互いから分離された生物学的に活性なポリペ プチド又はタンパク質で構成された１ユニットの反復で形作られている各請求項 に記載の方法。
3. （３）前記植物の貯蔵タンパク質が水溶液である請求項（１）又は（２）に記載 の方法。
4. （４）前記植物の貯蔵タンパク質が、２Ｓアルブミンー貯蔵タンパク質といった ２Ｓ−タンパク質である請求項（１）乃至（３）のいずれかに記載の方法。
5. （５）前記種子特異的プロモータが、その性質上前駆体核酸と同じ核酸に属して いる請求項（１）乃至（４）のいずれかに記載の方法。
6. （６）前記種子特異的プロモータが、その前駆体核酸との関係において非相同で ある請求項（１）乃至（５）のいずれかに記載の方法。
7. （７）前記、問題のポリペプチドが、質量数１４の炭素、質量数１５の窒素、質 量数３の水素そして質量数３２のリン光体から成るグループの中から選ばれた原 子を含む標識付けされたタンパク質である請求項（１）乃至（５）のいずれかに 記載の方法。
8. （８）問題のポリペプチドをコード付けする核酸セグメントが、前記貯蔵タンパ ク質の前駆体をコード付けする天然の核酸に対し外来性のものである請求項（１ ）乃至（７）のいずれかに記載の方法。
9. （９）非相同インサートには、通常前記種子又は植物細胞の遺伝子的遺産又は情 報中に存在する前述のようなセグメントが１つ含まれていること、そしてこのと きかかるインサートの「非相同」性は、その両側でそれをとり囲み、前記前駆体 をコード付けする核酸の未変更部分に前記セグメントを連結させるような単数又 は複数のコドンに対し向けられている請求項（１）乃至（８）のいずれかに記載 の方法。
10. （１０）以下「前駆体コード付け核酸」と呼ばれ、前記植物のシグナルペプチド を含む貯蔵タンパク質の前駆体の少なくとも一部分をコード付けするｍＲＮＡ内 に転写されうる核酸配列を含む組換え型ＤＮＡにおいて、 ・前記核酸にはヌクレオチド配列が１つ含まれており（以下「関連配列」と呼ぶ ）、かかる関連配列は、その中で自らをとり囲む未修飾部分と共に読取り段階に おいてオーブンリーディングフレームを形成する非相同核酸インサートにより修 飾された可欠領域を含んでいること； ・かかるインサートは、前記問題のポリペプチドをコード付けするヌクレオチド セグメントを含んでいること、 ・前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサート又は隣接する末端のい ずれか又はその両方に属するヌクレオチドを有する単数又は複数のコドンにより 、前記関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結されていること、 ・前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列によりコード付けされた雑 種貯蔵タンパク質又は貯蔵タンパク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲 む選択的に開裂可能な周縁部位を構成する単数又は複数のアミノ酸残基をコード 付けすること、 を特徴とする組換え型ＤＮＡ。
11. （１１）前記前駆体コード付け核酸が、種子特異的プロモータの制御下に置かれ ている組換え型ＤＮＡ。
12. （１２）前記植物貯蔵タンパク質が２Ｓアルブミンのような２Ｓ−タンパク質で ある請求項（１１）に記載の組換え型ＤＮＡ。
13. （１３）プラスミドである請求項（１０）乃至（１２）のいずれかに記載の組換 え型ＤＮＡ。
14. （１４）植物細胞を形質転換することそしてかかる植物細胞内で前記修飾された 前駆体核酸配列を複製することができる請求項（１３）に記載の組換え型ＤＮＡ 。
15. （１５）Ｔｉ−誘導のプラスミドである請求項（１４）に記載の組換え型ＤＮＡ 。
16. （１６）完全な植物に再生されうるような種子形成植物の植物細胞又はかかる種 子形成植物の種子のいずれかで形成されている、問題のポリペプチドの再生可能 な供給源において、かかる植物又は種子は、前記植物細胞の再生の結果として得 られる植物の一世代又は複数の世代の結果として得られること、さらに前記植物 細胞又は種子の遺伝的情報を支持するＤＮＡは、種子特異的プロモータの制御の 下に置かれた、前記植物の貯蔵タンパク質の前駆体に相当するｍＲＮＡ内に転写 されうる、シグナルペプチドをコード付けする配列を含めた１つの核酸又はその 一部分を含んでいること、そして ・前記核酸配列には、成熟した貯蔵タンパク質をコード付けする関連修飾配列又 はこの成熟した貯蔵タンパク質の単数又は複数のサブユニットに対しコード付け する複数の副配列のうちの１つが含まれていること； ・前記関連配列の修飾は、その可欠領域の１つの中で起こり、自らをとり囲んで いる未修飾部分と読取り段階において１つのオーブンリーディングフレームを形 成する非相同核酸インサートで構成されること、 ・前記インサートには、前記問題のポリペプチドをコード付けするヌクレオチド セグメントが含まれていること； ・前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサート又は隣接する末端のい ずれか又はその両方に属するヌクレオチドを有する単数又は複数のコドンにより 、前記関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結されていること、 ・前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列によりコード付けされた雑 種貯蔵タンパク質又は貯蔵タンパク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲 む選択的に開裂可能な周縁部位を構成する単数又は複数のアミノ酸残基をコード 付けすること； を特徴とするポリペプチド供給源。
17. （１７）前記植物貯蔵タンパク質が、２Ｓアルブミンのような２Ｓ−タンパク質 であるポリペプチド供給源。
18. （１８）前記インサートが、合成の人工的オリゴヌクレオチドである請求項（１ ６）又は（１７）のいずれかに記載のポリペプチド供給源。
19. （１９）前記インサート内に含まれている非相同セグメントが、植物品種に非特 異的なポリペプチドをコート付けする請求項（１６）、（１７）又は（１８）に 記載のポリペプチド源。
20. （２０）植物細胞環境内にある請求項（１０）乃至（１５）のいずれかに記載の 組換え型ＤＮＡ。
21. （２１）全ての細胞が請求項（１０）乃至（１５）のいずれかに記載の組換え型 ＤＮＡを含んでいる、通常２Ｓ−タンパク質を含む遺伝子的に処理された種子形 成植物又はかかる植物の一部分。
22. （２２）通常２Ｓ−タンパク質を含み、その細胞の全てが請求項（１０）乃至（ １５）のいずれかの組換え型ＤＮＡを含んでいるような遺伝子的に処理された種 子。