JP3232068B2 - 遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法 - Google Patents
遺伝子導入植物内の修飾された貯蔵種子タンパク質遺伝子の発現による生物学的に活性なペプチドの製造方法Info
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Description
【0001】本発明は、適当な植物遺伝子の修飾によ
り、有用で生物学的に活性な、ポリペプチドを生成する
方法に関する。
り、有用で生物学的に活性な、ポリペプチドを生成する
方法に関する。
【0002】容易に純化できる形でかつ有用な量で一定
の生物学的に活性なポリペプチドを生成することには今
なおほとんどの場合において多大な問題点がある。
の生物学的に活性なポリペプチドを生成することには今
なおほとんどの場合において多大な問題点がある。
【0003】代替的な手法として挙げられるのは、化学
的合成又は遺伝的に処理された微生物による製造であ
る。第1の手法は、きわめて費用のかかる手法であり、
しかも往々にして、適正なコンフォーメーション(立体
配座)をもつポリペプチドが得られない。後者の手法
は、ポリペプチドの不安定さ、細胞内沈降そして純粋な
形での生成物の純化といった問題点のため、むずかしい
ものである。その上、ホルモンペプチドを含むいくつか
のクラスのペプチドは、適正なジスルフィドブリッジ形
成、アセチル化、グリコシル化又はメチル化といった付
加的な処理の後に初めて充分な活性を有することにな
る。天然においては、ジスルフィドブリッジは、前駆体
の膜転移の間にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
(異性化酵素)による同時翻訳触媒作用を受けるため、
きわめて高効率で形成される。次に、タンパク質分解印
割により、前駆体から活性形が誘導される。
的合成又は遺伝的に処理された微生物による製造であ
る。第1の手法は、きわめて費用のかかる手法であり、
しかも往々にして、適正なコンフォーメーション(立体
配座)をもつポリペプチドが得られない。後者の手法
は、ポリペプチドの不安定さ、細胞内沈降そして純粋な
形での生成物の純化といった問題点のため、むずかしい
ものである。その上、ホルモンペプチドを含むいくつか
のクラスのペプチドは、適正なジスルフィドブリッジ形
成、アセチル化、グリコシル化又はメチル化といった付
加的な処理の後に初めて充分な活性を有することにな
る。天然においては、ジスルフィドブリッジは、前駆体
の膜転移の間にタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ
(異性化酵素)による同時翻訳触媒作用を受けるため、
きわめて高効率で形成される。次に、タンパク質分解印
割により、前駆体から活性形が誘導される。
【0004】化学的に合成された又は原核系内で過剰生
産されたペプチドは一般に還元された形で得られ、従っ
て、次に、システイン残基の穏やかな酸化によりジスル
フィドブリッジを形成させなくてはならない。往々して
ペプチドの充分に変性された「スクランブル」状態から
出発するため、このときジスルフィドブリッジの形成は
不規則過程であり、この間に分子間架橋(より高い分子
量の会合物を生成する)ならびに不適切なジスルフィド
結合(不活性ペプチドを生成する)が正しく折りたたま
れたペプチドの他に生成される可能性がある。
産されたペプチドは一般に還元された形で得られ、従っ
て、次に、システイン残基の穏やかな酸化によりジスル
フィドブリッジを形成させなくてはならない。往々して
ペプチドの充分に変性された「スクランブル」状態から
出発するため、このときジスルフィドブリッジの形成は
不規則過程であり、この間に分子間架橋(より高い分子
量の会合物を生成する)ならびに不適切なジスルフィド
結合(不活性ペプチドを生成する)が正しく折りたたま
れたペプチドの他に生成される可能性がある。
【0005】一定のペプチドを製造するためのシステム
として植物細胞を用いることも同様に、PCT/US8
6/01599などにおいて提案されてきた。この特許
の中では、既知の技法(EP83112985.3)に
従って前記ペプチドを構造的に発現させることを原理と
する提案されている方法が、植物の生理を乱すことなく
高い発現レベルを得ることそして植物タンパク質から分
離することによりかかるペプチドを回収する上で高い収
量を得ることを可能にするものである、ということは実
証されていない。このことは特に、植物全体があるがま
まの形で用いられ土中で育てられる場合に言えることで
ある。
として植物細胞を用いることも同様に、PCT/US8
6/01599などにおいて提案されてきた。この特許
の中では、既知の技法(EP83112985.3)に
従って前記ペプチドを構造的に発現させることを原理と
する提案されている方法が、植物の生理を乱すことなく
高い発現レベルを得ることそして植物タンパク質から分
離することによりかかるペプチドを回収する上で高い収
量を得ることを可能にするものである、ということは実
証されていない。このことは特に、植物全体があるがま
まの形で用いられ土中で育てられる場合に言えることで
ある。
【0006】本発明の目的は、これらの問題点を克服
し、経済的に価値ある方法及び大量に生産できる遺伝子
的に処理された生物体を提供することにある。この方法
において、一定のポリペプチドは、かかる生物体の生理
を乱すことなく大量に合成されうると同時に、同じ又は
ほぼ同じアミノ酸配列をもつ野生型ペプチドに共通の高
度の生理学的活性を提供する形で生成され、また、かか
る生物体から容易に回収されうる。
し、経済的に価値ある方法及び大量に生産できる遺伝子
的に処理された生物体を提供することにある。この方法
において、一定のポリペプチドは、かかる生物体の生理
を乱すことなく大量に合成されうると同時に、同じ又は
ほぼ同じアミノ酸配列をもつ野生型ペプチドに共通の高
度の生理学的活性を提供する形で生成され、また、かか
る生物体から容易に回収されうる。
【0007】さらに詳しく言うと、本発明の目的は、遺
伝的に修飾された植物DNAならびにかかる植物材料の
細胞で複製可能なこの遺伝的に修飾されたDNAを含む
植物の生きた材料を提供することにある。ここで遺伝的
に修飾された植物のDNAは、相応する植物の成長の少
なくとも1段階においてその発現を実施させる一定の与
えられた植物プロモータによって表現が制御されている
ような前記一定のポリペプチドについてコード付けする
配列を含んでいる。この成長段階は、大量に作られしか
も容易に回収可能な植物の器官又は組織内で発現が起き
るように選ばれる。
伝的に修飾された植物DNAならびにかかる植物材料の
細胞で複製可能なこの遺伝的に修飾されたDNAを含む
植物の生きた材料を提供することにある。ここで遺伝的
に修飾された植物のDNAは、相応する植物の成長の少
なくとも1段階においてその発現を実施させる一定の与
えられた植物プロモータによって表現が制御されている
ような前記一定のポリペプチドについてコード付けする
配列を含んでいる。この成長段階は、大量に作られしか
も容易に回収可能な植物の器官又は組織内で発現が起き
るように選ばれる。
【0008】本発明のもう1つの目的は、種子の貯蔵タ
ンパク質に備わっている、植物中に大量に生産される能
力及びかかる植物の一定の成長段階とくに種子形成段階
において発現される能力を利用することにある。さらに
詳しく言うと、本発明は、水溶性貯蔵タンパク質が相応
する植物の種子から容易に回収されうるという点を利用
することをその目的としている。
ンパク質に備わっている、植物中に大量に生産される能
力及びかかる植物の一定の成長段階とくに種子形成段階
において発現される能力を利用することにある。さらに
詳しく言うと、本発明は、水溶性貯蔵タンパク質が相応
する植物の種子から容易に回収されうるという点を利用
することをその目的としている。
【0009】植物内での外来性遺伝子の発現は充分に立
証されている(De Blaere他、1987年)。いくつか
の事例において、種子の貯蔵タンパク質遺伝子が他の植
物内に移入された。またいくつかの事例において、移入
された種子の貯蔵タンパク質遺伝子がその新しい環境の
中で、組織特異的でかつ発育調製された形で表現される
ということが示された。(Beachy他、1985年;Okam
uro他、1986年;Sengupta-Gopalan他、1985
年;Higgins他、1986年)、このことはすなわち、
移入された遺伝子が、種子の適当な部分内でしかも正規
の時点でのみ発現される、ということを意味している。
同様に、少なくとも1つの事例において、外来性種子貯
蔵タンパク質が宿主植物のタンパク粒の中に位置づけら
れていることも示された(Greenwood & Chrispeels、
1985年)。さらに、イントロン(介在配列)を含む
完全な遺伝子ではなくむしろcDNAがキメラ遺伝子の
ためのベースとして用いられた場合に、安定した機能的
な伝令RNAを得ることができるということも立証され
た(Chee他、1986年)。
証されている(De Blaere他、1987年)。いくつか
の事例において、種子の貯蔵タンパク質遺伝子が他の植
物内に移入された。またいくつかの事例において、移入
された種子の貯蔵タンパク質遺伝子がその新しい環境の
中で、組織特異的でかつ発育調製された形で表現される
ということが示された。(Beachy他、1985年;Okam
uro他、1986年;Sengupta-Gopalan他、1985
年;Higgins他、1986年)、このことはすなわち、
移入された遺伝子が、種子の適当な部分内でしかも正規
の時点でのみ発現される、ということを意味している。
同様に、少なくとも1つの事例において、外来性種子貯
蔵タンパク質が宿主植物のタンパク粒の中に位置づけら
れていることも示された(Greenwood & Chrispeels、
1985年)。さらに、イントロン(介在配列)を含む
完全な遺伝子ではなくむしろcDNAがキメラ遺伝子の
ためのベースとして用いられた場合に、安定した機能的
な伝令RNAを得ることができるということも立証され
た(Chee他、1986年)。
【0010】種子貯蔵タンパク質は、多くの植物の種子
内で全種子タンパク質の最高90%を占めている。これ
らは、発芽直後の若い苗のための栄養源として用いられ
る。これらをコード付けしている遺伝子は、厳しく制御
されており、きわめて組織特異的かつ段階特異的な形で
発現される(Walling他、1986年;Higgins他、19
84年)。従ってこれらは、ほぼ排他的に発育する種子
内でのみ発現され、異なるクラスの種子貯蔵タンパク質
は、その種子の異なる発育段階で発現されうる。これら
は一般にその細胞内位置に関して制限を受けており、タ
ンパク粒(プロテインボディ)又はタンパク質貯蔵液胞
と呼ばれる、膜で結合された細胞小器官(オルガネラ)
内に貯蔵されている。これらの細胞小器官は、プロテア
ーゼの無い環境を提供し、又往々にしてプロテアーゼ抑
制因子をも含んでいる。これらのタンパク質は、開花の
時点で分解され、発育中の種子のための栄養源として役
立つものと考えられている。これらのタンパク質のうち
のいくつかのクラスについて単純な精製技法が記述され
てきた。
内で全種子タンパク質の最高90%を占めている。これ
らは、発芽直後の若い苗のための栄養源として用いられ
る。これらをコード付けしている遺伝子は、厳しく制御
されており、きわめて組織特異的かつ段階特異的な形で
発現される(Walling他、1986年;Higgins他、19
84年)。従ってこれらは、ほぼ排他的に発育する種子
内でのみ発現され、異なるクラスの種子貯蔵タンパク質
は、その種子の異なる発育段階で発現されうる。これら
は一般にその細胞内位置に関して制限を受けており、タ
ンパク粒(プロテインボディ)又はタンパク質貯蔵液胞
と呼ばれる、膜で結合された細胞小器官(オルガネラ)
内に貯蔵されている。これらの細胞小器官は、プロテア
ーゼの無い環境を提供し、又往々にしてプロテアーゼ抑
制因子をも含んでいる。これらのタンパク質は、開花の
時点で分解され、発育中の種子のための栄養源として役
立つものと考えられている。これらのタンパク質のうち
のいくつかのクラスについて単純な精製技法が記述され
てきた。
【0011】種子貯蔵タンパク質は、例えばSvedbergが
規定しているように(Stryer. L.,著「Biochemistry
(生化学)」、第2版内、W.H. Freeman, New York, p
599)、一般に可溶性とサイズ(さらに限定的に言う
と沈降速度)に基づいて分類される。1つの特定のクラ
スの種子貯蔵タンパク質が研究された。すなわち、水溶
性アルブミン類であり従って他のタンパク質から容易に
分離される2S種子貯蔵タンパク質である。これらはサ
イズが小さいこともあって精製が単純になっている。い
くつかの2S貯蔵タンパク質が、タンパク質又はcDN
Aのいずれかのレベルで特徴づけされてきた(Crouch
他、1983年;Sharief & Li、1982年;Ampe
他、1986年;Altenbach他、1987年;Ericson
他、1986年;Scofield & Crouch、1987年;Jo
sefsson他、1987年;そして本出願明細書に記述さ
れている研究)。2Sアルブミンは、ジスルフィドブリ
ッジにより連結された、それぞれ6〜9及び3〜4キロ
ダルトン(kd)の2つのサブユニットから細胞内で形成
される。
規定しているように(Stryer. L.,著「Biochemistry
(生化学)」、第2版内、W.H. Freeman, New York, p
599)、一般に可溶性とサイズ(さらに限定的に言う
と沈降速度)に基づいて分類される。1つの特定のクラ
スの種子貯蔵タンパク質が研究された。すなわち、水溶
性アルブミン類であり従って他のタンパク質から容易に
分離される2S種子貯蔵タンパク質である。これらはサ
イズが小さいこともあって精製が単純になっている。い
くつかの2S貯蔵タンパク質が、タンパク質又はcDN
Aのいずれかのレベルで特徴づけされてきた(Crouch
他、1983年;Sharief & Li、1982年;Ampe
他、1986年;Altenbach他、1987年;Ericson
他、1986年;Scofield & Crouch、1987年;Jo
sefsson他、1987年;そして本出願明細書に記述さ
れている研究)。2Sアルブミンは、ジスルフィドブリ
ッジにより連結された、それぞれ6〜9及び3〜4キロ
ダルトン(kd)の2つのサブユニットから細胞内で形成
される。
【0012】上述の参考図書内の研究は、2Sアルブミ
ンが、数多くの異なる種の2Sアルブミン間で共有の構
成をもつ複合プリプロペプチドとして合成され、図3に
これらの種のうちの3つについて概略的に示されている
とおりである、ということを示していた。いくつかの完
全な配列が図3に示されている。
ンが、数多くの異なる種の2Sアルブミン間で共有の構
成をもつ複合プリプロペプチドとして合成され、図3に
これらの種のうちの3つについて概略的に示されている
とおりである、ということを示していた。いくつかの完
全な配列が図3に示されている。
【0013】2Sアルブミンのタンパク質配列に関する
図3については、以下のような観察が行なわれる。B. n
apus、B. excelsia及びA. thalianaについては、タンパ
ク質及びDNAの両配列が共に決定された。R. communi
sについては、タンパク質配列のみが利用可能である。
(B. napusはCrouch他、1983年及びEricson他、1
986年より;B. excelsiaは、Ampe他、1986年、d
e Castro他、1987年及びAltenbach他、1987年
より;R. communisはSharief他、1982年より)。囲
みは、相同性を表わしており、高くなった点はシステイ
ンの位置を表わしている。
図3については、以下のような観察が行なわれる。B. n
apus、B. excelsia及びA. thalianaについては、タンパ
ク質及びDNAの両配列が共に決定された。R. communi
sについては、タンパク質配列のみが利用可能である。
(B. napusはCrouch他、1983年及びEricson他、1
986年より;B. excelsiaは、Ampe他、1986年、d
e Castro他、1987年及びAltenbach他、1987年
より;R. communisはSharief他、1982年より)。囲
みは、相同性を表わしており、高くなった点はシステイ
ンの位置を表わしている。
【0014】前駆体の初めのタンパク質配列と、シグナ
ルペプチドの標準的コンセンサス配列を比較すると、こ
の前駆体が、成熟タンパク質では存在しない1つではな
く2つのセグメントをアミノ末端基において有してお
り、そのうちの最初のものがシグナル配列であり(Perl
man & Halvorson、1983年)、第2のものはアミノ
末端基処理済フラグメントと呼称された(いわゆるAT
PE)。シグナル配列は、小胞体の膜を横切っての未完
成ポリペプチドの同時翻訳輸送を確実に行なうのに役立
ち(Blobel、1980年)、これまでに研究されてきた
全ての種子貯蔵タンパク質を含む数多くのタイプのタン
パク質内に見い出される(Herman他、1986年)。こ
れは、タンパク質の適当な区画化にとってきわめて重要
である。タンパク質はさらに、正しいジスルフィドブリ
ッジが形成されるような形で折りたたまれる。このプロ
セスはおそらく、酵素ジスルフィドイソメラーゼが局在
化されている小胞体膜の管腔部位に局在化される(Rode
n他、1982年;Bergman& Kuehl、1979年)。小
胞体膜を横切っての転座の後、ほとんどの貯蔵タンパク
質は前記小胞体を経由してゴルジ体へと輸送され、次に
そこから小さな膜で結合された小胞(「密な小胞」)内
をタンパク粒へと輸送される(Chrispeels、1983
年;Craig & Goodchild、1984年;Lord、1985
年)。シグナルペプチドが同時翻訳して除去されるとい
うことはすなわちタンパク粒への種子貯蔵タンパク質の
それ以上の輸送を検出するシグナルが、存在するタンパ
ク質配列の残りの部分にあるにちがいないということを
暗に意味している。
ルペプチドの標準的コンセンサス配列を比較すると、こ
の前駆体が、成熟タンパク質では存在しない1つではな
く2つのセグメントをアミノ末端基において有してお
り、そのうちの最初のものがシグナル配列であり(Perl
man & Halvorson、1983年)、第2のものはアミノ
末端基処理済フラグメントと呼称された(いわゆるAT
PE)。シグナル配列は、小胞体の膜を横切っての未完
成ポリペプチドの同時翻訳輸送を確実に行なうのに役立
ち(Blobel、1980年)、これまでに研究されてきた
全ての種子貯蔵タンパク質を含む数多くのタイプのタン
パク質内に見い出される(Herman他、1986年)。こ
れは、タンパク質の適当な区画化にとってきわめて重要
である。タンパク質はさらに、正しいジスルフィドブリ
ッジが形成されるような形で折りたたまれる。このプロ
セスはおそらく、酵素ジスルフィドイソメラーゼが局在
化されている小胞体膜の管腔部位に局在化される(Rode
n他、1982年;Bergman& Kuehl、1979年)。小
胞体膜を横切っての転座の後、ほとんどの貯蔵タンパク
質は前記小胞体を経由してゴルジ体へと輸送され、次に
そこから小さな膜で結合された小胞(「密な小胞」)内
をタンパク粒へと輸送される(Chrispeels、1983
年;Craig & Goodchild、1984年;Lord、1985
年)。シグナルペプチドが同時翻訳して除去されるとい
うことはすなわちタンパク粒への種子貯蔵タンパク質の
それ以上の輸送を検出するシグナルが、存在するタンパ
ク質配列の残りの部分にあるにちがいないということを
暗に意味している。
【0015】2Sアルブミン類は、成熟ポリペプチド内
には存在しないシグナル配列以外の配列を前駆体のアミ
ノ末端に含んでいる。これは、全ての貯蔵タンパク質に
一般的なことではない。このアミノ末端基処理済フラグ
メントは、図1においてはProと、そして図3ではA
TPFと標識づけされている。
には存在しないシグナル配列以外の配列を前駆体のアミ
ノ末端に含んでいる。これは、全ての貯蔵タンパク質に
一般的なことではない。このアミノ末端基処理済フラグ
メントは、図1においてはProと、そして図3ではA
TPFと標識づけされている。
【0016】さらに、図1及び図2に示されているよう
に、前駆体内で小さなサブユニットと大きなサブユニッ
トの間に位置づけされているいくつかのアミノ酸は除去
される〔図1ではlink、図2ではIPFと標識づけされ
ており、IPFは内部処理フラグメント(internal pro
cessed fragment)を意味する〕。さらに、前駆体のカ
ルボキシル末端基からいくつかの残基が除去される〔図
1はTail、図2ではCTPFと標識づけされており、C
TPFはカルボキシル末端基処理フラグメント(carbox
yl terminal processed fragment)を意味する〕。これ
ら後者の処理段階の細胞位置づけは不確かであるが、タ
ンパク粒である可能性が最も高い(Chrispeels、198
3年;Lord、1985年)。これらの処理段階の結果と
して、小さなサブユニット(Sml. Sub)及び大きいサブ
ユニットが残る。これらは、以下に述べるようにジスル
フィドにより連結される。
に、前駆体内で小さなサブユニットと大きなサブユニッ
トの間に位置づけされているいくつかのアミノ酸は除去
される〔図1ではlink、図2ではIPFと標識づけされ
ており、IPFは内部処理フラグメント(internal pro
cessed fragment)を意味する〕。さらに、前駆体のカ
ルボキシル末端基からいくつかの残基が除去される〔図
1はTail、図2ではCTPFと標識づけされており、C
TPFはカルボキシル末端基処理フラグメント(carbox
yl terminal processed fragment)を意味する〕。これ
ら後者の処理段階の細胞位置づけは不確かであるが、タ
ンパク粒である可能性が最も高い(Chrispeels、198
3年;Lord、1985年)。これらの処理段階の結果と
して、小さなサブユニット(Sml. Sub)及び大きいサブ
ユニットが残る。これらは、以下に述べるようにジスル
フィドにより連結される。
【0017】種々の植物の2S−アルブミン類のタンパ
ク質配列を比較すると、強い構造的類似性がみられる。
このことは、さらに詳しくは、図3及び図4で例示され
ている。これらの図は以下のような異なる植物の代表的
な2S−貯蔵種子アルブミンタンパク質のそれぞれ小サ
ブユニット及び大サブユニットのアミノ酸配列を与えて
いる: R. comm. ; Ricinus communis A. thali ; Arabidopsis thaliana B. napus ; Brassica napus B. excel ; Bertholletia excelsa(ブラジル産ナッ
ツ)
ク質配列を比較すると、強い構造的類似性がみられる。
このことは、さらに詳しくは、図3及び図4で例示され
ている。これらの図は以下のような異なる植物の代表的
な2S−貯蔵種子アルブミンタンパク質のそれぞれ小サ
ブユニット及び大サブユニットのアミノ酸配列を与えて
いる: R. comm. ; Ricinus communis A. thali ; Arabidopsis thaliana B. napus ; Brassica napus B. excel ; Bertholletia excelsa(ブラジル産ナッ
ツ)
【0018】図3及び図4においては以下のことに留意
しなくてはならない。 − 前記サブユニットのアミノ酸配列は、複数のライン
上に広がっている。 − 例として示されている貯蔵タンパク質のアミノ酸配
列及び前記タンパク質のうちのいくつかの中の同様なア
ミノ酸のシステイン基は、垂直に整列させられている;
これらの配列のいくつかの中に現われるハイフン記号
は、アミノ酸欠損言い換えるとそれらととり囲む最も近
いアミノ酸の間の直接連結を表わしている。 − 異なるタンパク質においてはほぼ保存されているア
ミノ酸配列が、枠で囲まれている。
しなくてはならない。 − 前記サブユニットのアミノ酸配列は、複数のライン
上に広がっている。 − 例として示されている貯蔵タンパク質のアミノ酸配
列及び前記タンパク質のうちのいくつかの中の同様なア
ミノ酸のシステイン基は、垂直に整列させられている;
これらの配列のいくつかの中に現われるハイフン記号
は、アミノ酸欠損言い換えるとそれらととり囲む最も近
いアミノ酸の間の直接連結を表わしている。 − 異なるタンパク質においてはほぼ保存されているア
ミノ酸配列が、枠で囲まれている。
【0019】全ての配列は、Arabidopsis thalianaの2
S−アルブミンの実験により立証された真の構造を表わ
すというよりはむしろ(本論述を目的とした)仮想モデ
ルを表わしている図5に概略的に示されているようなジ
スルフィドブリッジ内に参与しうる8つのシステイン残
基(小サブユニット内に第1と第2のもの、残りは大サ
ブユニット内)を含んでいる、ということがわかる。か
かる仮想モデルは、血清アルブミン(Brown、1976
年)、アルファ胎児タンパク(Jagodzinski他、198
7年;Morinaga他、1983年)及び、類似の一定のC
−Cダブレット及びC−X−Cトリプレットがみられた
ビタミンD結合タンパク質(Yang他、1985年)のよ
うな動物性アルブミンのジスルフィドブリッジが媒介と
なったループ形成よりヒントを得たものである。
S−アルブミンの実験により立証された真の構造を表わ
すというよりはむしろ(本論述を目的とした)仮想モデ
ルを表わしている図5に概略的に示されているようなジ
スルフィドブリッジ内に参与しうる8つのシステイン残
基(小サブユニット内に第1と第2のもの、残りは大サ
ブユニット内)を含んでいる、ということがわかる。か
かる仮想モデルは、血清アルブミン(Brown、1976
年)、アルファ胎児タンパク(Jagodzinski他、198
7年;Morinaga他、1983年)及び、類似の一定のC
−Cダブレット及びC−X−Cトリプレットがみられた
ビタミンD結合タンパク質(Yang他、1985年)のよ
うな動物性アルブミンのジスルフィドブリッジが媒介と
なったループ形成よりヒントを得たものである。
【0020】さらに、システイン残基の間の距離は、大
サブユニット内の第6と第7のシステイン残基の間の距
離を除いて、各サブユニット内でほぼ一定に保たれてい
る。このことは、これらの配置が構造的に重要であるも
のの、この第6と第7のシステインの間で大サブユニッ
ト内で或る程度の変化が許されるということを示唆して
いる。
サブユニット内の第6と第7のシステイン残基の間の距
離を除いて、各サブユニット内でほぼ一定に保たれてい
る。このことは、これらの配置が構造的に重要であるも
のの、この第6と第7のシステインの間で大サブユニッ
ト内で或る程度の変化が許されるということを示唆して
いる。
【0021】本発明は、遺伝子導入植物の植物種子内の
かかる修飾貯蔵タンパク質の特性及び適切な処理の変化
をひき起こさずに修飾されうるような貯蔵タンパク質の
領域の決定に基づいている。この領域(図5に拡幅され
た斜線入り部分で概略的に示されている)は、以下の例
において「超可変部」と呼ばれる。図5はまた、前駆体
の小サブユニットと大サブユニットを分離する「IP
F」セクションならびに、タンパク質サブユニットのシ
ステイン残基のほぼ保持された部分内のアミノ酸の数
(aa)を含めて、前駆体配列の他の部分のそれぞれの
位置も示している。処理開裂部位は、▼という記号で示
されている。
かかる修飾貯蔵タンパク質の特性及び適切な処理の変化
をひき起こさずに修飾されうるような貯蔵タンパク質の
領域の決定に基づいている。この領域(図5に拡幅され
た斜線入り部分で概略的に示されている)は、以下の例
において「超可変部」と呼ばれる。図5はまた、前駆体
の小サブユニットと大サブユニットを分離する「IP
F」セクションならびに、タンパク質サブユニットのシ
ステイン残基のほぼ保持された部分内のアミノ酸の数
(aa)を含めて、前駆体配列の他の部分のそれぞれの
位置も示している。処理開裂部位は、▼という記号で示
されている。
【0022】数多くの植物の種子は、上述の貯蔵タンパ
ク質とほぼ同じサイズのアルブミンを含んでいる。しか
しながら文言を簡略にするため、ここでは、図1に示さ
れている全体的構造のペプチド前駆体をコード付けする
遺伝子をもち、ジスルフィドブリッジにより連結された
2つのサブユニットから成る最終的な形に処理される種
子タンパク質を指して、「2Sアルブミン」という語を
用いる。これは、以下に記述する方法がこのような2S
アルブミンのみに適用できることを意味するとみなされ
てはならない。
ク質とほぼ同じサイズのアルブミンを含んでいる。しか
しながら文言を簡略にするため、ここでは、図1に示さ
れている全体的構造のペプチド前駆体をコード付けする
遺伝子をもち、ジスルフィドブリッジにより連結された
2つのサブユニットから成る最終的な形に処理される種
子タンパク質を指して、「2Sアルブミン」という語を
用いる。これは、以下に記述する方法がこのような2S
アルブミンのみに適用できることを意味するとみなされ
てはならない。
【0023】問題の一定のポリペプチドを生成するため
の本発明に従った方法は、 − 一世代又は複数世代にわたり、再生された植物細胞
から又はこの再生植物細胞から得られた植物の種子から
得た植物を栽培する段階、(なおここにおいて、かかる
植物内で複製可能なこの植物細胞の遺伝的遺産又は情報
には、種子特異的なプロモータの制御下に置かれた核酸
配列が含まれている。これは、かかる植物のシグナルペ
プチドを含む貯蔵タンパク質の前駆体の少なくとも一部
分をコード付けするmRNAに転写され、前記核酸は以
下「前駆体コード付け核酸」と呼ばれる) ・なおここで、かかる核酸には1つのヌクレオチド配列
(以下「関連配列」と呼ぶ)が含まれ、かかる関連配列
は、その中で自らをとり囲む未修飾部分と共に読みとり
段階においてオープンリーディングフレームを形成する
非相同核酸インサートにより修飾された非必須領域を含
んでいる; ・かかるインサートは、前記問題のポリペプチドをコー
ド付けするヌクレオチドセグメントを含んでいる; ・前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサー
ト又は隣接する末端のいずれか又はその両方に属するヌ
クレオチドを有する単数又は複数のコドンにより、前記
関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結され
ている; ・前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列に
よりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質又は貯蔵タン
パク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲む選択
的に開裂可能な境界部位を構成する単数又は複数のアミ
ノ酸残基をコード付けする; − 栽培された植物の種子を回収し、その中に含まれて
いる雑種貯蔵タンパク質を抽出する段階; − 開裂部位レベルで前記雑種貯蔵タンパク質から問題
のペプチドを開裂させる段階;そして − 問題のペプチドを精製された形で回収する段階を含
んでいる。
の本発明に従った方法は、 − 一世代又は複数世代にわたり、再生された植物細胞
から又はこの再生植物細胞から得られた植物の種子から
得た植物を栽培する段階、(なおここにおいて、かかる
植物内で複製可能なこの植物細胞の遺伝的遺産又は情報
には、種子特異的なプロモータの制御下に置かれた核酸
配列が含まれている。これは、かかる植物のシグナルペ
プチドを含む貯蔵タンパク質の前駆体の少なくとも一部
分をコード付けするmRNAに転写され、前記核酸は以
下「前駆体コード付け核酸」と呼ばれる) ・なおここで、かかる核酸には1つのヌクレオチド配列
(以下「関連配列」と呼ぶ)が含まれ、かかる関連配列
は、その中で自らをとり囲む未修飾部分と共に読みとり
段階においてオープンリーディングフレームを形成する
非相同核酸インサートにより修飾された非必須領域を含
んでいる; ・かかるインサートは、前記問題のポリペプチドをコー
ド付けするヌクレオチドセグメントを含んでいる; ・前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサー
ト又は隣接する末端のいずれか又はその両方に属するヌ
クレオチドを有する単数又は複数のコドンにより、前記
関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結され
ている; ・前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列に
よりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質又は貯蔵タン
パク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲む選択
的に開裂可能な境界部位を構成する単数又は複数のアミ
ノ酸残基をコード付けする; − 栽培された植物の種子を回収し、その中に含まれて
いる雑種貯蔵タンパク質を抽出する段階; − 開裂部位レベルで前記雑種貯蔵タンパク質から問題
のペプチドを開裂させる段階;そして − 問題のペプチドを精製された形で回収する段階を含
んでいる。
【0024】上述の条件の下で、栽培された植物の各々
全ての細胞が修飾された核酸を含んでいることがわかる
だろう。それでも上述の組換え型つまり雑種の配列は、
栽培された植物の種子形成段階のみにおいて又はほとん
どこの段階において発現され、従って雑種タンパク質は
大部分がこの種子内で生成されることになる。
全ての細胞が修飾された核酸を含んでいることがわかる
だろう。それでも上述の組換え型つまり雑種の配列は、
栽培された植物の種子形成段階のみにおいて又はほとん
どこの段階において発現され、従って雑種タンパク質は
大部分がこの種子内で生成されることになる。
【0025】上述の「非相同核酸インサート」は、少な
くとも一部分が当該種子又は植物の貯蔵タンパク質の前
駆体をコード付けする天然の核酸にとって外来性のもの
であるようなヌクレオチド配列を含むインサートから成
る。最も一般的には、問題のポリペプチドをコード付け
するセグメントはそれ自体、前記貯蔵タンパク質の前駆
体をコード付けする天然の核酸にとって外来性のもので
ある。それでも、「非相同核酸インサート」という語
は、上述の種子又は植物細胞の遺伝的財産又は情報の中
に通常存在する上述のようなセグメントを含むインサー
トをも含んでいる。このとき前記インサートの「非相
同」性は、その両側でそれをとり囲み前記セグメントを
前記前駆体をコード付けする核酸の未修飾部分に連結す
る単数又は複数のコドンに向けられているのである。上
述の最後に示した状況の下で、本発明はこのように、植
物の種子形成段階またはその発育のその他の段階のいず
れにおいても、また種子のタンパク質体内又は前記植物
細胞の他のいずれの場所においてであれ、通常植物自体
の中で作られる貴重なタンパク質を生成し容易に分離し
回収することを可能にするような方法を提供している。
くとも一部分が当該種子又は植物の貯蔵タンパク質の前
駆体をコード付けする天然の核酸にとって外来性のもの
であるようなヌクレオチド配列を含むインサートから成
る。最も一般的には、問題のポリペプチドをコード付け
するセグメントはそれ自体、前記貯蔵タンパク質の前駆
体をコード付けする天然の核酸にとって外来性のもので
ある。それでも、「非相同核酸インサート」という語
は、上述の種子又は植物細胞の遺伝的財産又は情報の中
に通常存在する上述のようなセグメントを含むインサー
トをも含んでいる。このとき前記インサートの「非相
同」性は、その両側でそれをとり囲み前記セグメントを
前記前駆体をコード付けする核酸の未修飾部分に連結す
る単数又は複数のコドンに向けられているのである。上
述の最後に示した状況の下で、本発明はこのように、植
物の種子形成段階またはその発育のその他の段階のいず
れにおいても、また種子のタンパク質体内又は前記植物
細胞の他のいずれの場所においてであれ、通常植物自体
の中で作られる貴重なタンパク質を生成し容易に分離し
回収することを可能にするような方法を提供している。
【0026】「問題のポリペプチド」は、通常、本発明
に基づく方法の最終段階において雑種貯蔵タンパク質か
ら開裂されたとき、生物学的特性のうち少なくともその
問題の単一のポリペプチド又はタンパク質によって処理
されるべきものを保持又は回復するような単一のポリペ
プチド又はタンパク質で構成される。問題のポリペプチ
ドが保持すべき特性の、制限的な意味をもたない一例と
して、酵素活性又は治療効果、一定の抗体により認識さ
れうる能力、免疫学的特性例えば、生きた宿主内でかか
る問題のペプチド又はこの「問題のポリペプチド」と同
じ又は類似したアミノ酸配列を含む抗原を含む病原性因
子を中和できる抗体を惹起(誘発)する能力などを挙げ
ることができる。
に基づく方法の最終段階において雑種貯蔵タンパク質か
ら開裂されたとき、生物学的特性のうち少なくともその
問題の単一のポリペプチド又はタンパク質によって処理
されるべきものを保持又は回復するような単一のポリペ
プチド又はタンパク質で構成される。問題のポリペプチ
ドが保持すべき特性の、制限的な意味をもたない一例と
して、酵素活性又は治療効果、一定の抗体により認識さ
れうる能力、免疫学的特性例えば、生きた宿主内でかか
る問題のペプチド又はこの「問題のポリペプチド」と同
じ又は類似したアミノ酸配列を含む抗原を含む病原性因
子を中和できる抗体を惹起(誘発)する能力などを挙げ
ることができる。
【0027】ただし、「問題のポリペプチド」はまた、
とくに何らかの望ましい生物学的活性をもつ個々のペプ
チド又はポリペプチドのユニットの反復をも含みうる。
かかるユニットは、生物学的なユニット又は反復を互い
に分離することができるようにしている開裂可能な部位
の上又はその中を通して互いに合わさっている。決定的
なものではないものの、このような開裂可能な部位は、
「問題のポリペプチド」全体が雑種貯蔵タンパク質から
開裂されうるようにする上述のような「境界制限酵素」
などの同じ開裂手段と同一であるか又は、これに対して
感応性をもつという利点がある。実際、活性ユニットの
互いからの分離は、このとき上述の「開裂(切り出
し)」オペレーションと同時に達成されうる。それでも
異なるユニット又は反復は、異なる開裂部位を通して結
合される可能性があり、こうしてこのユニットの互いの
分離は、雑種貯蔵タンパク質からの前記「問題のポリペ
プチド」の「開裂」オペレーションの後に続いて行なわ
れうる。
とくに何らかの望ましい生物学的活性をもつ個々のペプ
チド又はポリペプチドのユニットの反復をも含みうる。
かかるユニットは、生物学的なユニット又は反復を互い
に分離することができるようにしている開裂可能な部位
の上又はその中を通して互いに合わさっている。決定的
なものではないものの、このような開裂可能な部位は、
「問題のポリペプチド」全体が雑種貯蔵タンパク質から
開裂されうるようにする上述のような「境界制限酵素」
などの同じ開裂手段と同一であるか又は、これに対して
感応性をもつという利点がある。実際、活性ユニットの
互いからの分離は、このとき上述の「開裂(切り出
し)」オペレーションと同時に達成されうる。それでも
異なるユニット又は反復は、異なる開裂部位を通して結
合される可能性があり、こうしてこのユニットの互いの
分離は、雑種貯蔵タンパク質からの前記「問題のポリペ
プチド」の「開裂」オペレーションの後に続いて行なわ
れうる。
【0028】当然のことながら問題のポリペプチド内の
反復ユニットの数は、本書中に規定されている条件の下
で関連する貯蔵タンパク質内に取り込まれうる問題のポ
リペプチドの最大長さによって異なる。
反復ユニットの数は、本書中に規定されている条件の下
で関連する貯蔵タンパク質内に取り込まれうる問題のポ
リペプチドの最大長さによって異なる。
【0029】本発明に基づく方法についての上述の定義
づけにおいて、前駆体をコード付けする前記核酸の関連
配列のいわゆる「非必須領域」は、未修飾の天然の貯蔵
タンパク質のものに比べて結果として得られた上記雑種
貯蔵タンパク質の全体的構成が変わることなく、又、そ
れ相応に修飾された未完成雑種貯蔵タンパク質の上述の
タンパク質体内への輸送に変化を与えることなく、上述
のインサートをその中に挿入するか又はかかるインサー
トで前記非必須領域の少なくとも一部分を置換すること
によって修飾されうるようなヌクレオチド配列をもつ領
域から成る。
づけにおいて、前駆体をコード付けする前記核酸の関連
配列のいわゆる「非必須領域」は、未修飾の天然の貯蔵
タンパク質のものに比べて結果として得られた上記雑種
貯蔵タンパク質の全体的構成が変わることなく、又、そ
れ相応に修飾された未完成雑種貯蔵タンパク質の上述の
タンパク質体内への輸送に変化を与えることなく、上述
のインサートをその中に挿入するか又はかかるインサー
トで前記非必須領域の少なくとも一部分を置換すること
によって修飾されうるようなヌクレオチド配列をもつ領
域から成る。
【0030】本発明においては、上述の前駆体コード付
け核酸は当然のことながら、本発明にて栽培されている
ものと同じ植物種から出てきたものであってよい。しか
しこれは又、すでに登記されているBeachey他、198
5年及びOkamuro他、1987年の教示に沿って、その
他の植物種から出てきたものであってもよい。
け核酸は当然のことながら、本発明にて栽培されている
ものと同じ植物種から出てきたものであってよい。しか
しこれは又、すでに登記されているBeachey他、198
5年及びOkamuro他、1987年の教示に沿って、その
他の植物種から出てきたものであってもよい。
【0031】同様に、種子特異的プロモータは、同じ植
物種からのものでも異なる植物種からのものでもよい。
ただし、後者の場合、宿主植物のポリメラーゼにそれを
認識する能力があることを条件とする。
物種からのものでも異なる植物種からのものでもよい。
ただし、後者の場合、宿主植物のポリメラーゼにそれを
認識する能力があることを条件とする。
【0032】貯蔵タンパク質内の非必須領域の位置づけ
については、どんな方法でも用いることができる。この
領域がひとたびタンパク質配列レベルで規定されると、
前駆体コード付け核酸の相応する領域を変えることがで
きる。例えば、分子モデリングによる二次的及び三次的
タンパク質構造の設定に基づく方法を用いて、非必須領
域を位置付けることができる。このようなモデルは、よ
り高次の集合におけるその構成又は相互作用にとってき
わめて重要なタンパク質の領域の識別を可能にする。こ
のような技術が無い場合、さまざまな植物種からの類似
のタンパク質のペプチド配列を比較することができる。
前記ペプチド配列が共通してもっている副配列(そして
この一応の証明のある事実は、有害な形でペプチドの構
造、処理、細胞内通過又はパッケージングに影響を及ぼ
すことなくこれらを修飾することはできないという仮定
を裏づけることになる)、これらが、そのとき一定の非
相同インサートによる修飾に適しているとみなされうる
「非必須領域」で構成されうるという仮定を裏づけるた
めには互いに異なりすぎているような副配列とは、区別
されうるものである。
については、どんな方法でも用いることができる。この
領域がひとたびタンパク質配列レベルで規定されると、
前駆体コード付け核酸の相応する領域を変えることがで
きる。例えば、分子モデリングによる二次的及び三次的
タンパク質構造の設定に基づく方法を用いて、非必須領
域を位置付けることができる。このようなモデルは、よ
り高次の集合におけるその構成又は相互作用にとってき
わめて重要なタンパク質の領域の識別を可能にする。こ
のような技術が無い場合、さまざまな植物種からの類似
のタンパク質のペプチド配列を比較することができる。
前記ペプチド配列が共通してもっている副配列(そして
この一応の証明のある事実は、有害な形でペプチドの構
造、処理、細胞内通過又はパッケージングに影響を及ぼ
すことなくこれらを修飾することはできないという仮定
を裏づけることになる)、これらが、そのとき一定の非
相同インサートによる修飾に適しているとみなされうる
「非必須領域」で構成されうるという仮定を裏づけるた
めには互いに異なりすぎているような副配列とは、区別
されうるものである。
【0033】このようなアプローチは、異なる植物から
のいくつかの同じような貯蔵タンパク質の核酸配列又は
タンパク質配列が確認されている場合に可能である(2
Sアルブミンの場合のように)。このとき適切な方法に
は、アミノ酸配列又は長さ或いはその両方における可変
性を受けているペプチド領域をコード付けする前記核酸
領域を、逆に前記いくつかの植物種の間でアミノ酸配列
の大方の保存を示している領域との比較において識別す
る作業が含まれている。研究中の貯蔵タンパク質がシス
テイン残基を含み、さらにかかるシステインが、当該貯
蔵タンパク質の構造及びコンフォメーションの設定に重
要な役割を果たす可能性の高いジスルフィドブリッジに
参加するということが考えられている又は実験データを
通してすでにわかっている場合、この方法は、このこと
を考慮に入れるように拡張されなくてはならない。この
場合、システイン残基は貯蔵タンパク質の修飾により変
えられた残基のうちのいずれかであってはならず、類似
タンパク質のタンパク質配列の配列比較によってシステ
イン間の距離(アミノ酸残基内の)が保持されているこ
とがわかった場合、この距離はその後のいかなる修飾に
よっても変えられてはならない。このようにして選択さ
れたタンパク質配列内の前記非必須領域はこのとき、前
駆体コード付け核酸の相応する領域内に望ましいペプチ
ド生成物をコード付けする核酸セグメントを挿入するこ
とにより修飾することができ、かかる修飾が達成された
後、植物の発育の種子形成段階において回収可能な種子
内の修飾された貯蔵タンパク質の発現を検定することが
できる。
のいくつかの同じような貯蔵タンパク質の核酸配列又は
タンパク質配列が確認されている場合に可能である(2
Sアルブミンの場合のように)。このとき適切な方法に
は、アミノ酸配列又は長さ或いはその両方における可変
性を受けているペプチド領域をコード付けする前記核酸
領域を、逆に前記いくつかの植物種の間でアミノ酸配列
の大方の保存を示している領域との比較において識別す
る作業が含まれている。研究中の貯蔵タンパク質がシス
テイン残基を含み、さらにかかるシステインが、当該貯
蔵タンパク質の構造及びコンフォメーションの設定に重
要な役割を果たす可能性の高いジスルフィドブリッジに
参加するということが考えられている又は実験データを
通してすでにわかっている場合、この方法は、このこと
を考慮に入れるように拡張されなくてはならない。この
場合、システイン残基は貯蔵タンパク質の修飾により変
えられた残基のうちのいずれかであってはならず、類似
タンパク質のタンパク質配列の配列比較によってシステ
イン間の距離(アミノ酸残基内の)が保持されているこ
とがわかった場合、この距離はその後のいかなる修飾に
よっても変えられてはならない。このようにして選択さ
れたタンパク質配列内の前記非必須領域はこのとき、前
駆体コード付け核酸の相応する領域内に望ましいペプチ
ド生成物をコード付けする核酸セグメントを挿入するこ
とにより修飾することができ、かかる修飾が達成された
後、植物の発育の種子形成段階において回収可能な種子
内の修飾された貯蔵タンパク質の発現を検定することが
できる。
【0034】1つの領域を修飾にもっていくことができ
るものであると考えるか否か決定するため当業者が利用
できるもう1つの方法は、かかる修飾を行なうこと、そ
しキメラタンパク質を経済的に有利な量だけ生成するに
は適切ではないもののキメラタンパク質が安定していれ
ば分析のため少量を生成するような複数の発現システム
のうちのいずれかでキメラ遺伝子を発現することから成
る。このような実験においては、未修飾のタンパク質も
対照として発現させられなくてはならない。このような
システムとしては(ただし制限的な意味無く)、Xenopu
s leaves 卵母細胞(Bassener他、1983年)、植物
のクロロプラスト(葉緑体)内の一過性発現(Fromm
他、1985年)、酵母菌(Hollenberg他、1985
年)、植物のカルス(仮骨)及びAcetabularia(カサノ
リ属)システムがある。後者のものは、ゼイン遺伝子の
機能的分析及びリジンをコード付けする配列によるその
修飾のためにBrown他(1986年)により用いられ
た。
るものであると考えるか否か決定するため当業者が利用
できるもう1つの方法は、かかる修飾を行なうこと、そ
しキメラタンパク質を経済的に有利な量だけ生成するに
は適切ではないもののキメラタンパク質が安定していれ
ば分析のため少量を生成するような複数の発現システム
のうちのいずれかでキメラ遺伝子を発現することから成
る。このような実験においては、未修飾のタンパク質も
対照として発現させられなくてはならない。このような
システムとしては(ただし制限的な意味無く)、Xenopu
s leaves 卵母細胞(Bassener他、1983年)、植物
のクロロプラスト(葉緑体)内の一過性発現(Fromm
他、1985年)、酵母菌(Hollenberg他、1985
年)、植物のカルス(仮骨)及びAcetabularia(カサノ
リ属)システムがある。後者のものは、ゼイン遺伝子の
機能的分析及びリジンをコード付けする配列によるその
修飾のためにBrown他(1986年)により用いられ
た。
【0035】修飾すべき植物細胞中に移入されるべき修
飾された核酸を生成するために、2S−タンパク質特に
水溶性の2S−タンパク質の前駆体をコード付けする前
駆体コード付け核酸を選択することは、既に記録されて
いる理由により、きわめて魅力のあることである。
飾された核酸を生成するために、2S−タンパク質特に
水溶性の2S−タンパク質の前駆体をコード付けする前
駆体コード付け核酸を選択することは、既に記録されて
いる理由により、きわめて魅力のあることである。
【0036】図3及び図4を見ればわかるように、タン
パク質の小さなサブユニット内では第1及び第2のシス
テインの間、タンパク質の大きいサブユニット内ではま
ず第5と第6のシステイン間そして第7と第8のシステ
イン間に介在している領域は、かなりの保存度つまり類
似性を示している。従って、これらの領域は、なんらか
の形で、植物の種子内で合成されたときのタンパク質の
適切なひだ形成及び/又は安定性にとってきわめて重要
である。
パク質の小さなサブユニット内では第1及び第2のシス
テインの間、タンパク質の大きいサブユニット内ではま
ず第5と第6のシステイン間そして第7と第8のシステ
イン間に介在している領域は、かなりの保存度つまり類
似性を示している。従って、これらの領域は、なんらか
の形で、植物の種子内で合成されたときのタンパク質の
適切なひだ形成及び/又は安定性にとってきわめて重要
である。
【0037】逆に、小サブユニットの終り、大サブユニ
ットの最初と終りにおけるようなその他の領域は、きわ
めて大きな差異を示しているため、これらはタンパク質
の最終的特性に対し多大な影響を全く及ぼすものではな
いものと仮定して保持することができる。重要であると
思われない領域は、大きなサブユニット内で、成熟タン
パク質の第6と第7のシステインの間にある領域の中央
位置から成る。図面(図3)をみるとわかるように、B.
napusは、前にあるQアミノ酸と後にくるVアミノ酸の
間にCKQQM配列を有し、一方同じレベルで、A. tha
liは同じ近隣のseighbouringアミノ酸の間で同様な配列
を全く有しておらず、B. excel及びR. comm.は、それぞ
れさらに短いCEQ及びCQペプチドを含んでいる。従
って、アミノ酸残基のレベルにおける類似性の欠如に加
えて、この領域を最長の2Sアルブミンでの置換及び最
短の2Sアルブミンにおけるアミノ酸付加又はその両方
の延長のために好適なものとしている長さの相違がある
ように思われる。
ットの最初と終りにおけるようなその他の領域は、きわ
めて大きな差異を示しているため、これらはタンパク質
の最終的特性に対し多大な影響を全く及ぼすものではな
いものと仮定して保持することができる。重要であると
思われない領域は、大きなサブユニット内で、成熟タン
パク質の第6と第7のシステインの間にある領域の中央
位置から成る。図面(図3)をみるとわかるように、B.
napusは、前にあるQアミノ酸と後にくるVアミノ酸の
間にCKQQM配列を有し、一方同じレベルで、A. tha
liは同じ近隣のseighbouringアミノ酸の間で同様な配列
を全く有しておらず、B. excel及びR. comm.は、それぞ
れさらに短いCEQ及びCQペプチドを含んでいる。従
って、アミノ酸残基のレベルにおける類似性の欠如に加
えて、この領域を最長の2Sアルブミンでの置換及び最
短の2Sアルブミンにおけるアミノ酸付加又はその両方
の延長のために好適なものとしている長さの相違がある
ように思われる。
【0038】同じ観察は、前記第6と第7のシステイン
の間の同じ領域の最初の第3部分のほぼ終りのレベルに
もあてはまる:その他の例示された2S−タンパク質の
相応する領域に比べてその領域においてはるかに短いも
のである R. communisの配列を参照のこと。
の間の同じ領域の最初の第3部分のほぼ終りのレベルに
もあてはまる:その他の例示された2S−タンパク質の
相応する領域に比べてその領域においてはるかに短いも
のである R. communisの配列を参照のこと。
【0039】当業者の技能の範囲内にある実験による
と、成熟タンパク質の上述の第6及び第7のシステイン
に隣接するその他のアミノ酸のうちのどれほどが、雑種
タンパク質の安定性及び適正な処理を妨げることなくさ
らに置換されうるかがわかる。例えば、実験により、B.
napusの上述のGKQQM配列にその上流及び下流で隣
接しているその他のアミノ酸のうちのどれほどがさら
に、正常なB. napus2S−アルブミンの基本的特性を雑
種タンパク質が失うことなしに、形成される可能性のあ
る雑種タンパク質をさらに置換させること無く置換され
うるか、がわかる。考慮されている修飾は、好ましく
は、関連するシステイン例えば25−成熟タンパク質の
第6及び第7のシステインに隣接する3つの好ましくは
6つのアミノ酸に影響を与えるべきではない。
と、成熟タンパク質の上述の第6及び第7のシステイン
に隣接するその他のアミノ酸のうちのどれほどが、雑種
タンパク質の安定性及び適正な処理を妨げることなくさ
らに置換されうるかがわかる。例えば、実験により、B.
napusの上述のGKQQM配列にその上流及び下流で隣
接しているその他のアミノ酸のうちのどれほどがさら
に、正常なB. napus2S−アルブミンの基本的特性を雑
種タンパク質が失うことなしに、形成される可能性のあ
る雑種タンパク質をさらに置換させること無く置換され
うるか、がわかる。考慮されている修飾は、好ましく
は、関連するシステイン例えば25−成熟タンパク質の
第6及び第7のシステインに隣接する3つの好ましくは
6つのアミノ酸に影響を与えるべきではない。
【0040】当然のことながら、他の場所では甚だしい
差異を示すタンパク質の類似した部分を一列にすること
が関わってくるような任意の選択に基づく仮定に対して
は用心しなくてはならないということがわかる。それで
も、かかる比較はその他の遺伝学の分野においては、当
業者に対して、異なるソースの類似したタンパク質にお
いて一方では局所的な構造的差異から他方では局所的類
似性から、(なお外来性の又は非相同性の配列により局
所的に修飾された同じタンパク質内に未修飾タンパク質
の基本的特性のいくつかを保持しなくてはならない場合
に)かかるタンパク質のどの部分が修飾できどの部分が
修飾できないかを合理的に推測するための適切な指針を
与えてくれるものである。
差異を示すタンパク質の類似した部分を一列にすること
が関わってくるような任意の選択に基づく仮定に対して
は用心しなくてはならないということがわかる。それで
も、かかる比較はその他の遺伝学の分野においては、当
業者に対して、異なるソースの類似したタンパク質にお
いて一方では局所的な構造的差異から他方では局所的類
似性から、(なお外来性の又は非相同性の配列により局
所的に修飾された同じタンパク質内に未修飾タンパク質
の基本的特性のいくつかを保持しなくてはならない場合
に)かかるタンパク質のどの部分が修飾できどの部分が
修飾できないかを合理的に推測するための適切な指針を
与えてくれるものである。
【0041】従って、確認の要はあるものの、1つのタ
ンパク質又はそのサブユニットのいずれの部分でも、異
なるアミノ酸配列を有するペプチドによる置換に適して
いるとみなすことができる、ということが一応の証明あ
る事実と考えられている。
ンパク質又はそのサブユニットのいずれの部分でも、異
なるアミノ酸配列を有するペプチドによる置換に適して
いるとみなすことができる、ということが一応の証明あ
る事実と考えられている。
【0042】本発明に基づく方法において用いられるべ
き適切な非必須領域の選択は、同様に、問題のペプチド
の長さによっても左右される。従って基本的には本発明
に基づく方法は、長さがアミノ酸3〜100個の範囲に
ある生物学的に活性のポリペプチドの生成を可能にす
る。この生物学的に活性なポリペプチドは、植物性のも
のであってもよいし、又は、細菌、菌類、藻類又は無せ
きつい動物又は哺乳類のようなせきつい動物を源とする
植物種非特異的なポリペプチドであってもよい。
き適切な非必須領域の選択は、同様に、問題のペプチド
の長さによっても左右される。従って基本的には本発明
に基づく方法は、長さがアミノ酸3〜100個の範囲に
ある生物学的に活性のポリペプチドの生成を可能にす
る。この生物学的に活性なポリペプチドは、植物性のも
のであってもよいし、又は、細菌、菌類、藻類又は無せ
きつい動物又は哺乳類のようなせきつい動物を源とする
植物種非特異的なポリペプチドであってもよい。
【0043】関連貯蔵タンパク質例えば2S−タンパク
質又はそのサブユニットの適当な領域内に挿入されるべ
き配列(インサート)は、通常、この問題のポリペプチ
ドをコード付けするセグメントのみならず例えばプロテ
アーゼ又は化学的処理により開裂可能な上述のアミノ酸
接合部を形成するアミノ酸又はペプチドをコード付けす
るコドン(或いは又前駆体コード付け核酸の関連ヌクレ
オチド配列の非修飾部分の隣接するヌクレオチドが適当
にコドンを補足することになった場合にはこのコドンの
一部分)をも含んでおり、このため問題のペプチドは後
に、精製された2Sタンパク質から回収されうる。この
接合部−配列は、2本鎖オリゴマーとして、或いは又遺
伝子の一部分が使用可能である場合には、制限フラグメ
ントとして作ることができるが、後者の場合、開裂部位
例えばプロテアーゼ開裂部位が一般に付加されなくては
ならない。問題のペプチドを縁どる配列の選択は、プロ
セスの最終段階において、このペプチドを精製するため
に用いられるべき技法に左右されるいくつかの要因に応
じて異なる。問題のペプチドは、問題のペプチドの配列
が内部の類似開裂部位を含んでいないことを条件とし
て、いかなるタンパク質分解開裂部位でも側面に有する
ことができる。最後に、プロテアーゼ及び/又は化学的
開裂試薬は、特異的でかつ直ちに入手できなくてはなら
ない。これらは、アミノ末端及びカルボキシル末端の両
方において挿入された配列を適正に開裂しなくてはなら
ない。例えば、プロテアーゼトリプシンは、アルギニン
又はリジン残基の後にプロリンがついていないと仮定し
て、これらの前記の後で開裂する。従って、アルギニン
又はリジン残基のいずれも問題のペプチド内に存在しな
い場合(又はこれらの残基の後にプロリンがついている
場合)、この配列は、これら2つのアミノ酸の1つをコ
ード付けするコドンを側面に有することができる。この
ときペプチドを、トリプシンを用いて雑種タンパク質か
ら開裂させることができ、その後に、余分なカルボキシ
ル末端Arg(アルギニン)又はLys(リジン)を除
去するためエキソプロテアーゼカルボキシペプチダーゼ
Bで処理がほどこされる。同様にして、プロテアーゼe
ndo−Lys−C(Jekel他、1983年)は、リジ
ン残基の後で開裂し、そのため、このプロテアーゼを用
いて2Sアルブミンから開裂された形で2つのこのよう
な残基の間にペプチドを1つ挿入し、カルボキシペプチ
ダーゼBを用いて再び余分のリジンを除去することがで
きる。このような戦略は、2Sアルブミンが用いられる
場合に特に有益である。というのもそのリジン含有量が
少ないために、わずかなフラグメントしか生成されず、
その結果精製が容易であるからである。臭化シアンを、
化学的開裂試薬の一例として用いることができる。この
試薬による処理は、メチオニンのカルボキシル側で開裂
する。従って各々のケースについて、別々の戦略を展開
しなくてはならないが、利用可能なさまざまなプロテア
ーゼ開裂技法において同一の基本原理に遵ずることが可
能となっている。できるかぎり頻繁に、戦略には経済的
な市販のプロテアーゼ又は試薬が用いられなくてはなら
ず、又、精製作業段階数も制限されていなくてはならな
い。さまざまな酵素による又は化学的な開裂技術を再検
討するためには、「酵素学諸法(Methods in Enzymolog
y)」の第19巻(1970年)及び第47巻(197
1年)を参照されたい。
質又はそのサブユニットの適当な領域内に挿入されるべ
き配列(インサート)は、通常、この問題のポリペプチ
ドをコード付けするセグメントのみならず例えばプロテ
アーゼ又は化学的処理により開裂可能な上述のアミノ酸
接合部を形成するアミノ酸又はペプチドをコード付けす
るコドン(或いは又前駆体コード付け核酸の関連ヌクレ
オチド配列の非修飾部分の隣接するヌクレオチドが適当
にコドンを補足することになった場合にはこのコドンの
一部分)をも含んでおり、このため問題のペプチドは後
に、精製された2Sタンパク質から回収されうる。この
接合部−配列は、2本鎖オリゴマーとして、或いは又遺
伝子の一部分が使用可能である場合には、制限フラグメ
ントとして作ることができるが、後者の場合、開裂部位
例えばプロテアーゼ開裂部位が一般に付加されなくては
ならない。問題のペプチドを縁どる配列の選択は、プロ
セスの最終段階において、このペプチドを精製するため
に用いられるべき技法に左右されるいくつかの要因に応
じて異なる。問題のペプチドは、問題のペプチドの配列
が内部の類似開裂部位を含んでいないことを条件とし
て、いかなるタンパク質分解開裂部位でも側面に有する
ことができる。最後に、プロテアーゼ及び/又は化学的
開裂試薬は、特異的でかつ直ちに入手できなくてはなら
ない。これらは、アミノ末端及びカルボキシル末端の両
方において挿入された配列を適正に開裂しなくてはなら
ない。例えば、プロテアーゼトリプシンは、アルギニン
又はリジン残基の後にプロリンがついていないと仮定し
て、これらの前記の後で開裂する。従って、アルギニン
又はリジン残基のいずれも問題のペプチド内に存在しな
い場合(又はこれらの残基の後にプロリンがついている
場合)、この配列は、これら2つのアミノ酸の1つをコ
ード付けするコドンを側面に有することができる。この
ときペプチドを、トリプシンを用いて雑種タンパク質か
ら開裂させることができ、その後に、余分なカルボキシ
ル末端Arg(アルギニン)又はLys(リジン)を除
去するためエキソプロテアーゼカルボキシペプチダーゼ
Bで処理がほどこされる。同様にして、プロテアーゼe
ndo−Lys−C(Jekel他、1983年)は、リジ
ン残基の後で開裂し、そのため、このプロテアーゼを用
いて2Sアルブミンから開裂された形で2つのこのよう
な残基の間にペプチドを1つ挿入し、カルボキシペプチ
ダーゼBを用いて再び余分のリジンを除去することがで
きる。このような戦略は、2Sアルブミンが用いられる
場合に特に有益である。というのもそのリジン含有量が
少ないために、わずかなフラグメントしか生成されず、
その結果精製が容易であるからである。臭化シアンを、
化学的開裂試薬の一例として用いることができる。この
試薬による処理は、メチオニンのカルボキシル側で開裂
する。従って各々のケースについて、別々の戦略を展開
しなくてはならないが、利用可能なさまざまなプロテア
ーゼ開裂技法において同一の基本原理に遵ずることが可
能となっている。できるかぎり頻繁に、戦略には経済的
な市販のプロテアーゼ又は試薬が用いられなくてはなら
ず、又、精製作業段階数も制限されていなくてはならな
い。さまざまな酵素による又は化学的な開裂技術を再検
討するためには、「酵素学諸法(Methods in Enzymolog
y)」の第19巻(1970年)及び第47巻(197
1年)を参照されたい。
【0044】最後に、C−末端アルファ・アミド構造を
もついくつかのペプチドは、自然界に見い出される(ア
ルファ−メラノトロピン、カルシトニンその他;Hunt
& Dayhoff、1976年参照)。この翻訳後修飾は、ペ
プチドの生物学的活性にとってきわめて重要であるとい
うことがわかっている。かかるC末端でアミド化された
ペプチドは、C−末端グリシン残基のアミド基への形質
転換により得ることができる(Seiringer他、1985
年)。従ってこのようなペプチドは、C末端グリシン残
基を、精製後にアミド基に形質転換されるペプチドに付
加することによって2S雑種タンパク質から生成され得
る。
もついくつかのペプチドは、自然界に見い出される(ア
ルファ−メラノトロピン、カルシトニンその他;Hunt
& Dayhoff、1976年参照)。この翻訳後修飾は、ペ
プチドの生物学的活性にとってきわめて重要であるとい
うことがわかっている。かかるC末端でアミド化された
ペプチドは、C−末端グリシン残基のアミド基への形質
転換により得ることができる(Seiringer他、1985
年)。従ってこのようなペプチドは、C末端グリシン残
基を、精製後にアミド基に形質転換されるペプチドに付
加することによって2S雑種タンパク質から生成され得
る。
【0045】貯蔵タンパク質内に挿入されるべき領域の
完全なタンパク質配列が、問題のポリペプチド及び上述
の開裂可能な接合部を形成するペプチドのアミノ酸の両
方を含めて決定された時点で、かかるタンパク質配列を
コード付けするためのヌクレオチド配列が決定されなく
てはならない。おそらくは絶対的に必要なことではない
かもしれないが、コード付け核酸のコドン使用は、でき
るかぎり修飾される遺伝子のものに類似しているべきで
ある。当業者は、かかるコドン使用を決定する適切なコ
ンピュータ解析手段を利用することができるだろう。
完全なタンパク質配列が、問題のポリペプチド及び上述
の開裂可能な接合部を形成するペプチドのアミノ酸の両
方を含めて決定された時点で、かかるタンパク質配列を
コード付けするためのヌクレオチド配列が決定されなく
てはならない。おそらくは絶対的に必要なことではない
かもしれないが、コード付け核酸のコドン使用は、でき
るかぎり修飾される遺伝子のものに類似しているべきで
ある。当業者は、かかるコドン使用を決定する適切なコ
ンピュータ解析手段を利用することができるだろう。
【0046】選択された前駆体コード付け核酸の一部分
の代わりにインサートを置換するため、又はこれを前記
前駆体コード付け核酸の適当な領域内に挿入するために
は、適当ないかなる遺伝子工学技法でも用いることがで
きる。キメラ遺伝子を作るためには、細菌内クローニン
グを伴う一般的な試験管内組換え技術を用いることがで
きる。以下にさらに詳しく例示されるように、同じ目的
のために部位指向の突然変異誘発を用いることができ
る。現行の専門的文献において開示されている技術に従
って、植物細胞の形質転換に適したプラスミドといった
DNA組換え体も生成することができる。これは又、最
終的に、選択された前駆体コード付け核酸の関連部分に
よりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質が表現されう
るような形質転換された植物細胞の生成にも適用でき
る。例として、この目的のための適当な技術を開示して
いる公開された欧州特許出願明細書第116718号又
は国際特許出願明細書WO84/02913号(本書に
参考文献として内含されている)を参照することができ
る。
の代わりにインサートを置換するため、又はこれを前記
前駆体コード付け核酸の適当な領域内に挿入するために
は、適当ないかなる遺伝子工学技法でも用いることがで
きる。キメラ遺伝子を作るためには、細菌内クローニン
グを伴う一般的な試験管内組換え技術を用いることがで
きる。以下にさらに詳しく例示されるように、同じ目的
のために部位指向の突然変異誘発を用いることができ
る。現行の専門的文献において開示されている技術に従
って、植物細胞の形質転換に適したプラスミドといった
DNA組換え体も生成することができる。これは又、最
終的に、選択された前駆体コード付け核酸の関連部分に
よりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質が表現されう
るような形質転換された植物細胞の生成にも適用でき
る。例として、この目的のための適当な技術を開示して
いる公開された欧州特許出願明細書第116718号又
は国際特許出願明細書WO84/02913号(本書に
参考文献として内含されている)を参照することができ
る。
【0047】以上の詳述は、さらに詳しくは、一例とし
て貯蔵2Sアルブミンの修飾を基礎として行なわれてき
た。しかし、それが分離されうる植物内でそれをコード
付けするDNA配列がすでに識別されている又は識別さ
れうること、そしてその中の非必須又は「超可変配列」
がすでに検出されている又は検出されうることを条件と
して、本発明に基づくプロセスは、他の沈降係数をもつ
その他のいかなるタイプの2S−貯蔵タンパク質又はそ
の他の貯蔵タンパク質(例えば7S−11S及び−12
S貯蔵タンパク質)或いは同じものを用いた上で、実施
することができるということもわかるだろう。
て貯蔵2Sアルブミンの修飾を基礎として行なわれてき
た。しかし、それが分離されうる植物内でそれをコード
付けするDNA配列がすでに識別されている又は識別さ
れうること、そしてその中の非必須又は「超可変配列」
がすでに検出されている又は検出されうることを条件と
して、本発明に基づくプロセスは、他の沈降係数をもつ
その他のいかなるタイプの2S−貯蔵タンパク質又はそ
の他の貯蔵タンパク質(例えば7S−11S及び−12
S貯蔵タンパク質)或いは同じものを用いた上で、実施
することができるということもわかるだろう。
【0048】このようなその他の貯蔵タンパク質の例
(例示を目的とするものにすぎない)としては以下のよ
うなものがある〔再検討のためにはHiggins(1984
年)も参照のこと〕: − エンドウ及びその他の豆類から分離できるレクチン
のような12Sタンパク質或いはすでに記録済みの2S
アルブミン又はエンドウ、ハッカダイコン又はひまわり
から分離できるその他の2Sアルブミンといった2Sタ
ンパク質などが考えられる、水溶性貯蔵タンパク質であ
るその他のアルブミン; − Phaseolusから分離可能なフェゾリン、エンドウか
ら分離可能なヴィシリン、大豆から分離可能なコングリ
シニン、オート麦から分離可能なオート−ヴィシリンの
ような7−8Sグロブリンか、又はエンドウから分離可
能なレグミン、大豆から分離可能なグリシニン、ひまわ
りから分離可能なヘリアンチンのような11−14Sグ
ロブリン、又は、インゲン豆、Arabidopsis及びおそら
くは小麦から分離可能なその他の11−14S−グロブ
リンが考えられる、塩水中で可溶な貯蔵タンパク質であ
るグロブリン; − とうもろこしから分離可能なゼイン、大麦から分離
可能なhordien 、小麦から分離可能なグリアジン及びモ
ロコシ属から分離可能なカフィリンといったアルコール
可溶性貯蔵タンパク質であるプロラミン; − 低いpH条件下で可溶性をもち、小麦から分離可能な
貯蔵タンパク質であるグルテリン。
(例示を目的とするものにすぎない)としては以下のよ
うなものがある〔再検討のためにはHiggins(1984
年)も参照のこと〕: − エンドウ及びその他の豆類から分離できるレクチン
のような12Sタンパク質或いはすでに記録済みの2S
アルブミン又はエンドウ、ハッカダイコン又はひまわり
から分離できるその他の2Sアルブミンといった2Sタ
ンパク質などが考えられる、水溶性貯蔵タンパク質であ
るその他のアルブミン; − Phaseolusから分離可能なフェゾリン、エンドウか
ら分離可能なヴィシリン、大豆から分離可能なコングリ
シニン、オート麦から分離可能なオート−ヴィシリンの
ような7−8Sグロブリンか、又はエンドウから分離可
能なレグミン、大豆から分離可能なグリシニン、ひまわ
りから分離可能なヘリアンチンのような11−14Sグ
ロブリン、又は、インゲン豆、Arabidopsis及びおそら
くは小麦から分離可能なその他の11−14S−グロブ
リンが考えられる、塩水中で可溶な貯蔵タンパク質であ
るグロブリン; − とうもろこしから分離可能なゼイン、大麦から分離
可能なhordien 、小麦から分離可能なグリアジン及びモ
ロコシ属から分離可能なカフィリンといったアルコール
可溶性貯蔵タンパク質であるプロラミン; − 低いpH条件下で可溶性をもち、小麦から分離可能な
貯蔵タンパク質であるグルテリン。
【0049】一例としてのみ挙げられたこれらの貯蔵タ
ンパク質のうちのいくつかは、システイン含有量が少な
いものである。それでも、同じグループの異なるタンパ
ク質は、一方では可変的な領域を示し、他方ではよりう
まく保存された領域を示す。
ンパク質のうちのいくつかは、システイン含有量が少な
いものである。それでも、同じグループの異なるタンパ
ク質は、一方では可変的な領域を示し、他方ではよりう
まく保存された領域を示す。
【0050】言うまでもないことではあるが、これらの
貯蔵タンパク質は、相応する溶剤内でのそのそれぞれの
特異的可溶性に応じて、上述の雑種タンパク質の生成及
び種子タンパク質からのそのそれぞれの精製のための適
当なベクターとして用いることができる。
貯蔵タンパク質は、相応する溶剤内でのそのそれぞれの
特異的可溶性に応じて、上述の雑種タンパク質の生成及
び種子タンパク質からのそのそれぞれの精製のための適
当なベクターとして用いることができる。
【0051】以上に一般的に開示されてきた手順は、問
題のペプチドをコード化するDNA配列を含む非相同性
インサートによる上述のその他の貯蔵タンパク質のいず
れかの非必須領域の適切な修飾に、そして次に関連する
植物の種子内における問題のペプチドの配列を含む雑種
タンパク質の生成のために得られたキメラ遺伝子による
関連する植物の形質転換に適用され、これらは、かかる
植物からの問題のペプチドの回収に適用される。言うま
でもないことであるが、当業者はあらゆる場合におい
て、かかる問題のペプチドの最良の生産収量を達成する
ためには、既存の技術のうちのいずれが、かかる修飾済
植物の生産の各段階レベルでのその必要性を最もうまく
満たすことになるかを選定することができることだろ
う。
題のペプチドをコード化するDNA配列を含む非相同性
インサートによる上述のその他の貯蔵タンパク質のいず
れかの非必須領域の適切な修飾に、そして次に関連する
植物の種子内における問題のペプチドの配列を含む雑種
タンパク質の生成のために得られたキメラ遺伝子による
関連する植物の形質転換に適用され、これらは、かかる
植物からの問題のペプチドの回収に適用される。言うま
でもないことであるが、当業者はあらゆる場合におい
て、かかる問題のペプチドの最良の生産収量を達成する
ためには、既存の技術のうちのいずれが、かかる修飾済
植物の生産の各段階レベルでのその必要性を最もうまく
満たすことになるかを選定することができることだろ
う。
【0052】これまでの記述は、さらに詳しく言って、
一例として、生物学的に活性なペプチドをコード付けす
るインサートによる一定の貯蔵タンパク質の超可変領域
の修飾を基礎としてきた。しかし、当業者はインサート
としてかかる生物学的に活性なペプチドの反復をコード
付けする配列を選ぶことができる。この場合、かかる生
物学的に活性なペプチドをコード付けする全ての配列
は、精製の間のその分離を可能にする選択的開裂部位を
コード付けする周縁配列により他から分離される。
一例として、生物学的に活性なペプチドをコード付けす
るインサートによる一定の貯蔵タンパク質の超可変領域
の修飾を基礎としてきた。しかし、当業者はインサート
としてかかる生物学的に活性なペプチドの反復をコード
付けする配列を選ぶことができる。この場合、かかる生
物学的に活性なペプチドをコード付けする全ての配列
は、精製の間のその分離を可能にする選択的開裂部位を
コード付けする周縁配列により他から分離される。
【0053】例えば、相応する前駆体−コード付け核酸
が配列決定されたとき、一定の問題のポリペプチド又は
その反復を種子内で生成するための適切なベクターとし
て用いられうる貯蔵タンパク質の能力を利用するため
に、以下の方法を用いることができる。このとき、かか
る方法には、以下の段階が含まれる:
が配列決定されたとき、一定の問題のポリペプチド又は
その反復を種子内で生成するための適切なベクターとし
て用いられうる貯蔵タンパク質の能力を利用するため
に、以下の方法を用いることができる。このとき、かか
る方法には、以下の段階が含まれる:
【0054】1)その一部を1つのインサートで置換す
ることによって或いはその中にこのインサートを挿入す
ることによって修飾されうるペプチド配列をコード付け
する非必須領域を含む(なおここでかかる修飾は、貯蔵
タンパク質の構成の保持と相容れるものである)前駆体
コード付け核酸の前記関連配列の1つを位置づけし、選
択する段階
ることによって或いはその中にこのインサートを挿入す
ることによって修飾されうるペプチド配列をコード付け
する非必須領域を含む(なおここでかかる修飾は、貯蔵
タンパク質の構成の保持と相容れるものである)前駆体
コード付け核酸の前記関連配列の1つを位置づけし、選
択する段階
【0055】2)前記関連配列の未修飾部分を適当なリ
ーディングフレーム関係で前記前駆体核酸の選択された
領域内に核酸インサートを挿入する段階;なお、かかる
インサートには、問題のポリペプチド又はその反復をコ
ード付けする一定のセグメント、そしてこのセグメント
の下流及び上流に、前記前駆体コード付け核酸内への挿
入が達成された後問題のポリペプチド又はその個々の反
復を互いに又は貯蔵タンパク質又はそのサブユニットの
関連部分内に連結するアミノ酸接合部をコード付けする
コドンの形成に参加し(こうしてかかるアミノ酸接合部
は問題のペプチドをとり囲む周縁部位を構成する)、そ
れ自体特異的ペプチダーゼなどによって選択的に開裂さ
れうるような、適当なヌクレオチド、コドン又はヌクレ
オチドのトリプレットが含まれている。
ーディングフレーム関係で前記前駆体核酸の選択された
領域内に核酸インサートを挿入する段階;なお、かかる
インサートには、問題のポリペプチド又はその反復をコ
ード付けする一定のセグメント、そしてこのセグメント
の下流及び上流に、前記前駆体コード付け核酸内への挿
入が達成された後問題のポリペプチド又はその個々の反
復を互いに又は貯蔵タンパク質又はそのサブユニットの
関連部分内に連結するアミノ酸接合部をコード付けする
コドンの形成に参加し(こうしてかかるアミノ酸接合部
は問題のペプチドをとり囲む周縁部位を構成する)、そ
れ自体特異的ペプチダーゼなどによって選択的に開裂さ
れうるような、適当なヌクレオチド、コドン又はヌクレ
オチドのトリプレットが含まれている。
【0056】3)完全な種子形成植物に再生されうる植
物細胞の形質転換に適したプラスミド内に得られた修飾
された前駆体コード付け核酸を挿入する段階。ここにお
いて、かかる挿入は、調節要素特に、それと結びつけら
れたオープンリーディングフレームの前記植物の種子内
での発現を提供することのできる種子特異的プロモータ
の制御下に置かれる);
物細胞の形質転換に適したプラスミド内に得られた修飾
された前駆体コード付け核酸を挿入する段階。ここにお
いて、かかる挿入は、調節要素特に、それと結びつけら
れたオープンリーディングフレームの前記植物の種子内
での発現を提供することのできる種子特異的プロモータ
の制御下に置かれる);
【0057】4)かかる修飾されたプラスミドで、かか
る植物細胞の培養物を形質転換する段階;
る植物細胞の培養物を形質転換する段階;
【0058】5)その超可変領域内に挿入された形で、
問題のポリペプチド又はその反復をコード付けするセグ
メントの一定の配列を有するキメラ貯蔵タンパク質の発
現を検定する段階、そしてこれが達成されると、
問題のポリペプチド又はその反復をコード付けするセグ
メントの一定の配列を有するキメラ貯蔵タンパク質の発
現を検定する段階、そしてこれが達成されると、
【0059】6)得られた形質転換済み植物細胞から前
記植物を再生し、かかる植物を種子形成段階まで育てる
段階;
記植物を再生し、かかる植物を種子形成段階まで育てる
段階;
【0060】7)種子を回収し、その中に含まれている
貯蔵タンパク質を抽出する段階;
貯蔵タンパク質を抽出する段階;
【0061】8)例えば前述の特異的ペプチダーゼを用
いて前記貯蔵タンパク質を開裂させる段階、かなりの数
のシステイン残基を含む貯蔵2S−タンパク質の場合
(今のところこの貯蔵タンパク質が好ましい)、そして
さらに、異なる植物内で同じ機能を果たししかもそれぞ
れ前記異なる植物を源としている複数の類似したタンパ
ク質の前駆体コード付け核酸が利用可能であり、すでに
配列決定された(又は配列決定できる)場合、上述の一
般的方法のステップ1)は、以下のように実施すること
ができる(ただし、以下に記されている一連のステップ
は、任意的なものであり、同じ結果を目的とする他のい
かなる手順によってでも置き換えることができる)、こ
のとき前記「ステップ1)」は、次の作業を含む。 a)それぞれ複数の種子形成植物種において入手可能で
あり識別可能な前記植物貯蔵タンパク質のいくつかを選
択すること; b)前記植物種の各々において前記植物貯蔵タンパク質
の前駆体をコード付けする前駆体コード付け核酸配列を
位置づけし、かかる前駆体コード付け核酸内において、
成熟貯蔵タンパク質をコード付けする配列又はかかる成
熟貯蔵タンパク質のサブユニットに対してコード付けす
る適当な副配列から成る関連ヌクレオチド配列を決定す
ること; c)前記成熟タンパク質又はタンパク質サブユニット内
の連続したシステイン残基をコード付けするコドンの相
対的位置を決定すること、そして、前駆体コード付け核
酸の前記副配列内の前記コドンの上流、間及び下流に位
置づけされた相応する連続的核酸領域を識別し、さらに
かかる連続領域の中に、かかる複数の植物種内のアミノ
酸配列の大方の保存をまさに示しているようなその他の
領域と比較して、植物種同士でアミノ酸配列又はその長
さ又はその両方において可変性を受けているような部分
を識別すること(なお、かかるヌクレオチド領域の1つ
はこのとき、前記2)に開示されているように問題のペ
プチド又はその反復をコード付けするセグメントを含む
核酸インサートのその中への挿入のために選択され
る)。
いて前記貯蔵タンパク質を開裂させる段階、かなりの数
のシステイン残基を含む貯蔵2S−タンパク質の場合
(今のところこの貯蔵タンパク質が好ましい)、そして
さらに、異なる植物内で同じ機能を果たししかもそれぞ
れ前記異なる植物を源としている複数の類似したタンパ
ク質の前駆体コード付け核酸が利用可能であり、すでに
配列決定された(又は配列決定できる)場合、上述の一
般的方法のステップ1)は、以下のように実施すること
ができる(ただし、以下に記されている一連のステップ
は、任意的なものであり、同じ結果を目的とする他のい
かなる手順によってでも置き換えることができる)、こ
のとき前記「ステップ1)」は、次の作業を含む。 a)それぞれ複数の種子形成植物種において入手可能で
あり識別可能な前記植物貯蔵タンパク質のいくつかを選
択すること; b)前記植物種の各々において前記植物貯蔵タンパク質
の前駆体をコード付けする前駆体コード付け核酸配列を
位置づけし、かかる前駆体コード付け核酸内において、
成熟貯蔵タンパク質をコード付けする配列又はかかる成
熟貯蔵タンパク質のサブユニットに対してコード付けす
る適当な副配列から成る関連ヌクレオチド配列を決定す
ること; c)前記成熟タンパク質又はタンパク質サブユニット内
の連続したシステイン残基をコード付けするコドンの相
対的位置を決定すること、そして、前駆体コード付け核
酸の前記副配列内の前記コドンの上流、間及び下流に位
置づけされた相応する連続的核酸領域を識別し、さらに
かかる連続領域の中に、かかる複数の植物種内のアミノ
酸配列の大方の保存をまさに示しているようなその他の
領域と比較して、植物種同士でアミノ酸配列又はその長
さ又はその両方において可変性を受けているような部分
を識別すること(なお、かかるヌクレオチド領域の1つ
はこのとき、前記2)に開示されているように問題のペ
プチド又はその反復をコード付けするセグメントを含む
核酸インサートのその中への挿入のために選択され
る)。
【0062】この最後に記した本発明の実施態様は、1
つの植物内で雑種タンパク質の一部として問題の非相同
ポリペプチド又はその反復を作らせるにあたり、膜の転
座の間に植物タンパク質にジスルフィドイソメラーゼが
通り、こうして、その正常な前駆体状況におけるように
雑種前駆体内に正しいジスルフィドブリッジが形成され
る一方で問題のポリペプチド又はその反復が、宿主微生
物内に外来性ペプチドを生成するための標準的遺伝子工
学技術に関して先に喚起したようなさまざまな欠点から
守られる確率が増加されることになる、ということを規
定している。
つの植物内で雑種タンパク質の一部として問題の非相同
ポリペプチド又はその反復を作らせるにあたり、膜の転
座の間に植物タンパク質にジスルフィドイソメラーゼが
通り、こうして、その正常な前駆体状況におけるように
雑種前駆体内に正しいジスルフィドブリッジが形成され
る一方で問題のポリペプチド又はその反復が、宿主微生
物内に外来性ペプチドを生成するための標準的遺伝子工
学技術に関して先に喚起したようなさまざまな欠点から
守られる確率が増加されることになる、ということを規
定している。
【0063】本発明はさらに、本発明に基づく方法にお
いて用いられる組換え型核酸自体特に以下のものに関す
る: − 前記方法の枠内で定義づけされてきた組換え型前駆
体コード付け核酸; − 他の植物のDNAからの前記前駆体コード付け核酸
のものと同じDNAを源としているか否かには無関係の
1つの種子特異性プロモータの制御下にある前記修飾さ
れた前駆体コード付け核酸を含む組換え型核酸。 − ベクター、さらに詳しく言うと、例えば上述の植物
細胞の形質転換において用いるため前述の組換え型核酸
のいずれかにより修飾されたTi誘導のプラスミドとい
った、植物プラスミド。
いて用いられる組換え型核酸自体特に以下のものに関す
る: − 前記方法の枠内で定義づけされてきた組換え型前駆
体コード付け核酸; − 他の植物のDNAからの前記前駆体コード付け核酸
のものと同じDNAを源としているか否かには無関係の
1つの種子特異性プロモータの制御下にある前記修飾さ
れた前駆体コード付け核酸を含む組換え型核酸。 − ベクター、さらに詳しく言うと、例えば上述の植物
細胞の形質転換において用いるため前述の組換え型核酸
のいずれかにより修飾されたTi誘導のプラスミドとい
った、植物プラスミド。
【0064】キメラ遺伝子にシグナル配列が無い場合
(全ての貯蔵タンパク質がそうであるように)適切なこ
のシグナル配列を与えなくてはならない。
(全ての貯蔵タンパク質がそうであるように)適切なこ
のシグナル配列を与えなくてはならない。
【0065】本発明は又、完全な植物に再生されうるよ
うな種子形成植物細胞又はかかる種子形成植物の種子の
いずれかで形成されている、問題のポリペプチドの再生
可能な供給源にも関する。かかる供給源は、かかる植物
又は種子が、前記植物細胞の再生の結果として得られる
植物の一世代又は複数世代の結果として得られること、
さらに前記植物細胞又は種子の遺伝的情報を支持するD
NAは、種子特異的プロモータの制御の下に置かれた、
前記植物の貯蔵タンパク質の前駆体に相当するmRNA
内に転写されうる、シグナルペプチドをコード付けする
配列を含めた1つの核酸又はその一部部を含んでいるこ
と、そして ・ 前記核酸配列には、成熟した貯蔵タンパク質をコー
ド付けする関連修飾配列又はこの成熟した貯蔵タンパク
質の単数又は複数のサブユニットに対しコード付けする
複数の副配列のうちの1つが含まれていること; ・ 前記関連配列の変更は、その可欠領域の1つの中で
起こり、関連配列の中で自らをとり囲んでいる未修飾部
分と読取り段階において1つのオープンリーディングフ
レームを形成する非相同核酸インサートで構成されるこ
と、 ・ 前記インサートには、前記問題のポリペプチドをコ
ード付けするヌクレオチドセグメントが含まれているこ
と; ・ 前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサ
ート又は隣接する末端のいずれか又はその両方に属する
ヌクレオチドを有する単数又は複数のコドンにより、前
記関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結さ
れていること、 ・ 前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列
によりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質又は貯蔵タ
ンパク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲む選
択的に開裂可能な周縁部位を構成する単数又は複数のア
ミノ酸残基をコード付けすることを特徴としている。
うな種子形成植物細胞又はかかる種子形成植物の種子の
いずれかで形成されている、問題のポリペプチドの再生
可能な供給源にも関する。かかる供給源は、かかる植物
又は種子が、前記植物細胞の再生の結果として得られる
植物の一世代又は複数世代の結果として得られること、
さらに前記植物細胞又は種子の遺伝的情報を支持するD
NAは、種子特異的プロモータの制御の下に置かれた、
前記植物の貯蔵タンパク質の前駆体に相当するmRNA
内に転写されうる、シグナルペプチドをコード付けする
配列を含めた1つの核酸又はその一部部を含んでいるこ
と、そして ・ 前記核酸配列には、成熟した貯蔵タンパク質をコー
ド付けする関連修飾配列又はこの成熟した貯蔵タンパク
質の単数又は複数のサブユニットに対しコード付けする
複数の副配列のうちの1つが含まれていること; ・ 前記関連配列の変更は、その可欠領域の1つの中で
起こり、関連配列の中で自らをとり囲んでいる未修飾部
分と読取り段階において1つのオープンリーディングフ
レームを形成する非相同核酸インサートで構成されるこ
と、 ・ 前記インサートには、前記問題のポリペプチドをコ
ード付けするヌクレオチドセグメントが含まれているこ
と; ・ 前記非相同ヌクレオチドセグメントは、このインサ
ート又は隣接する末端のいずれか又はその両方に属する
ヌクレオチドを有する単数又は複数のコドンにより、前
記関連配列の周囲の未修飾部分の隣接する末端に連結さ
れていること、 ・ 前記単数又は複数のコドンは、修飾された関連配列
によりコード付けされた雑種貯蔵タンパク質又は貯蔵タ
ンパク質サブユニット内の問題のペプチドをとり囲む選
択的に開裂可能な周縁部位を構成する単数又は複数のア
ミノ酸残基をコード付けすることを特徴としている。
【0066】本発明がこれに限定されているものとみな
されてはならないが、問題のポリペプチド又はその反復
をコード付けする核酸インサートは、ほとんどの場合に
おいて、ウイルス又は細菌の遺伝子から又はウイルス又
は細菌のRNAの誘導cDNAさらには非植物性真核生
物遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチド又は人工的
合成ヌクレオチドであり、これらは全て通常、その性質
の如何に関わらず生物学的プロセスを通して本発明に基
づく植物細胞又は種子の適切な場所に挿入される可能性
が全く無いものである。換言すると、これらのインサー
トは通常、とくに遺伝的に全く関係が無く従って天然交
雑プロセスを含む標準的な生物学的方法によっていかな
る遺伝的材料も交換することのできない異なる種類の植
物の中に挿入されうるという点で「植物種に非特異的」
なものなのである。
されてはならないが、問題のポリペプチド又はその反復
をコード付けする核酸インサートは、ほとんどの場合に
おいて、ウイルス又は細菌の遺伝子から又はウイルス又
は細菌のRNAの誘導cDNAさらには非植物性真核生
物遺伝子から誘導されたオリゴヌクレオチド又は人工的
合成ヌクレオチドであり、これらは全て通常、その性質
の如何に関わらず生物学的プロセスを通して本発明に基
づく植物細胞又は種子の適切な場所に挿入される可能性
が全く無いものである。換言すると、これらのインサー
トは通常、とくに遺伝的に全く関係が無く従って天然交
雑プロセスを含む標準的な生物学的方法によっていかな
る遺伝的材料も交換することのできない異なる種類の植
物の中に挿入されうるという点で「植物種に非特異的」
なものなのである。
【0067】従って、本発明はさらに、前記形質転換さ
れた細胞又は種子から得られた種子形成植物自体にも関
するものである。かかる植物は、それがその細胞内で種
子プロモータと結びつけられている前記雑種前駆体コー
ド付け核酸を有していること、ただしほとんどかかる植
物の種子の中でかかるインサートが発現され相応する雑
種タンパク質が生成されていることをその特徴とする。
れた細胞又は種子から得られた種子形成植物自体にも関
するものである。かかる植物は、それがその細胞内で種
子プロモータと結びつけられている前記雑種前駆体コー
ド付け核酸を有していること、ただしほとんどかかる植
物の種子の中でかかるインサートが発現され相応する雑
種タンパク質が生成されていることをその特徴とする。
【0068】以下に、2S種子貯蔵タンパク質遺伝子の
修飾、遺伝子導入植物中でのその発現、2S貯蔵タンパ
ク質の精製そして問題の生物学的に活性のペプチドの回
収のために用いることのできる好ましい方法の概略を記
す。ここに与えられている方法の概略の後には、特定的
な例が記されている。当業者は、この方法をその他の2
S種子貯蔵タンパク質遺伝子の修飾のためにも適合させ
ることができるものと思われる。
修飾、遺伝子導入植物中でのその発現、2S貯蔵タンパ
ク質の精製そして問題の生物学的に活性のペプチドの回
収のために用いることのできる好ましい方法の概略を記
す。ここに与えられている方法の概略の後には、特定的
な例が記されている。当業者は、この方法をその他の2
S種子貯蔵タンパク質遺伝子の修飾のためにも適合させ
ることができるものと思われる。
【0069】1.問題の配列による2S貯蔵タンパク質
遺伝子の超可変領域の置換又は補足2Sアルブミンのc
DNA又はゲノムクローンのいずれでも用いることがで
きる。図3の遺伝子の超可変領域の配列の比較をみる
と、それらの長さが変わっていることがわかる。従って
問題の配列が短く、比較的短い超可変領域を伴う2Sア
ルブミンが用いられる場合、問題の配列を挿入すること
ができる。そうでなければ超可変領域の一部を除去し
て、その問題のセグメント又は配列、及び場合によって
周縁コドンを含むインサートによりこれを置き換える。
その結果得られる雑種貯蔵タンパク質は、修飾された未
修飾の天然タンパク質に比べ長いこともあれば短いこと
もある。いずれの場合でも、次の2つの標準的技法を適
用することができる。すなわち、適当な制限部位を利用
するか又は突然変異誘発ベクターを用いる(例えばStau
ssen他、1987年)かである。両方の場合において、
メッセージのリーディングフレーム(読取り枠)を維持
するよう注意しなくてはならない。
遺伝子の超可変領域の置換又は補足2Sアルブミンのc
DNA又はゲノムクローンのいずれでも用いることがで
きる。図3の遺伝子の超可変領域の配列の比較をみる
と、それらの長さが変わっていることがわかる。従って
問題の配列が短く、比較的短い超可変領域を伴う2Sア
ルブミンが用いられる場合、問題の配列を挿入すること
ができる。そうでなければ超可変領域の一部を除去し
て、その問題のセグメント又は配列、及び場合によって
周縁コドンを含むインサートによりこれを置き換える。
その結果得られる雑種貯蔵タンパク質は、修飾された未
修飾の天然タンパク質に比べ長いこともあれば短いこと
もある。いずれの場合でも、次の2つの標準的技法を適
用することができる。すなわち、適当な制限部位を利用
するか又は突然変異誘発ベクターを用いる(例えばStau
ssen他、1987年)かである。両方の場合において、
メッセージのリーディングフレーム(読取り枠)を維持
するよう注意しなくてはならない。
【0070】2.変えられた2Sアルブミンコード付け
領域を種子特異的遺伝子プロモータの制御下に置く。 種子のみにおいて必ずその後の発現が行なわれるように
するため、種子特異的プロモータが用いられる。こうし
て望まれる生成物の回収が容易になり、植物のその他の
部分に対する抑制の可能性を無くすることができる。原
則的に、修飾2Sアルブミンのプロモータを用いること
ができる。しかしこれは必ずそうでなくてはならないも
のではない。同じ目的に役立つものであればその他のい
かなるプロモータでも用いることができる。プロモータ
は、形質転換されるべき植物種におけるその効率レベル
に応じて選択することができる。以下の例においては、
大豆からのレクチンプロモータ及びArabidopsisからの
2Sアルブミンプロモータが用いられている。キメラ遺
伝子の構造によっては、そのプロモータが使用中である
遺伝子から又は修飾された遺伝子から、単一ペプチドコ
ード付け領域も同様に含み入れられなくてはならない。
キメラ遺伝子の実際の構築は、標準的な分子生物学技法
を用いて行なわれる(例を参照のこと)。
領域を種子特異的遺伝子プロモータの制御下に置く。 種子のみにおいて必ずその後の発現が行なわれるように
するため、種子特異的プロモータが用いられる。こうし
て望まれる生成物の回収が容易になり、植物のその他の
部分に対する抑制の可能性を無くすることができる。原
則的に、修飾2Sアルブミンのプロモータを用いること
ができる。しかしこれは必ずそうでなくてはならないも
のではない。同じ目的に役立つものであればその他のい
かなるプロモータでも用いることができる。プロモータ
は、形質転換されるべき植物種におけるその効率レベル
に応じて選択することができる。以下の例においては、
大豆からのレクチンプロモータ及びArabidopsisからの
2Sアルブミンプロモータが用いられている。キメラ遺
伝子の構造によっては、そのプロモータが使用中である
遺伝子から又は修飾された遺伝子から、単一ペプチドコ
ード付け領域も同様に含み入れられなくてはならない。
キメラ遺伝子の実際の構築は、標準的な分子生物学技法
を用いて行なわれる(例を参照のこと)。
【0071】3.キメラ遺伝子構造を、適当な宿主内に
移入する。 キメラ又は修飾遺伝子構造が完成すると、これは、植物
形質転換ベクター内へと全て移入させられる。アグロバ
クテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefa
ciens)から誘導された無力化された(非発がん性)T
i−プラスミドに基づく多種多様のものが、二元性形及
び同時組込み形の両方で利用可能である(De Blaere
他、1987年)。一般に抗生物質耐性があり、形質転
換用の選択可能な標識を含むベクターを選ばなくてはな
らない。同様に、植物形質転換の方法も数多くあり、個
々の植物に適合されている。その大部分は、原形質体形
質転換(Marton他、1979年)又は成体植物からの組
織小片の形質転換(Horsch他、1985年)に基づくも
のである。以下の例においては、ベクターは、二元性の
無防備のTi−プラスミドベクターであり、標識は、カ
ナマイシン耐性のあるものでリーフディスク形質転換方
法が用いられている。
移入する。 キメラ又は修飾遺伝子構造が完成すると、これは、植物
形質転換ベクター内へと全て移入させられる。アグロバ
クテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefa
ciens)から誘導された無力化された(非発がん性)T
i−プラスミドに基づく多種多様のものが、二元性形及
び同時組込み形の両方で利用可能である(De Blaere
他、1987年)。一般に抗生物質耐性があり、形質転
換用の選択可能な標識を含むベクターを選ばなくてはな
らない。同様に、植物形質転換の方法も数多くあり、個
々の植物に適合されている。その大部分は、原形質体形
質転換(Marton他、1979年)又は成体植物からの組
織小片の形質転換(Horsch他、1985年)に基づくも
のである。以下の例においては、ベクターは、二元性の
無防備のTi−プラスミドベクターであり、標識は、カ
ナマイシン耐性のあるものでリーフディスク形質転換方
法が用いられている。
【0072】形質転換手順からのカルスは、選択可能な
標識に基づいて選択され、適切なホルモン導入により成
体植物に再生される。これも又、使用されている植物の
種に応じて変化する。再生された植物は次に種子を収穫
できるような安定した系統を作り上げるのに用いられ
る。
標識に基づいて選択され、適切なホルモン導入により成
体植物に再生される。これも又、使用されている植物の
種に応じて変化する。再生された植物は次に種子を収穫
できるような安定した系統を作り上げるのに用いられ
る。
【0073】4.生物学的に活性なポリペプチドの回
収。 2S植物アルブミンの精製は、充分に実証されている
(Youle及び Huang、1981年;Ampe他、1986
年)。これは成熟した種子内の主要なタンパク質であ
り、水性緩衝液中で高い可溶性を示す。2S貯蔵タンパ
ク質の典型的な精製には、以下のようなステップが関与
してくる:1)ドライアイス内での種子の均質化及びヘ
キサンでの抽出;2)高塩分緩衝液での抽出及び精製水
に対する透析(汚染グロブリンを析出させる);3)ゲ
ルろ過クロマトグラフィによる水溶性分画の付加的な精
製(これによりより小さな2S貯蔵タンパク質がより大
きな汚染物質から分離される);そして4)イオン交換
クロマトグラフィによる最終的精製。使用される正確な
方法は、ここで記される技法にとって決定的な重要性を
もつものではなく、ゲルろ過、イオン交換及び逆相クロ
マトグラフィ及びアフィニティ又はイムノアフィニティ
クロマトグラフィを含む、広範な古典的技法を、キメラ
2Sアルブミンを精製するためそしてそれがアルブミン
から開裂された後生物学的に活性なペプチドを精製する
ための両方に適用することができる。この開裂のために
用いられる正確な技術は、側面にある配列(上記参照)
の設計の時点で決定される戦略によって決められる。2
Sアルブミンは、プロテアーゼに対し幾分か抵抗性を有
するため、プロテアーゼ処理の前に往々にして変性ステ
ップを含み入れるべきである(例を参照のこと)。
収。 2S植物アルブミンの精製は、充分に実証されている
(Youle及び Huang、1981年;Ampe他、1986
年)。これは成熟した種子内の主要なタンパク質であ
り、水性緩衝液中で高い可溶性を示す。2S貯蔵タンパ
ク質の典型的な精製には、以下のようなステップが関与
してくる:1)ドライアイス内での種子の均質化及びヘ
キサンでの抽出;2)高塩分緩衝液での抽出及び精製水
に対する透析(汚染グロブリンを析出させる);3)ゲ
ルろ過クロマトグラフィによる水溶性分画の付加的な精
製(これによりより小さな2S貯蔵タンパク質がより大
きな汚染物質から分離される);そして4)イオン交換
クロマトグラフィによる最終的精製。使用される正確な
方法は、ここで記される技法にとって決定的な重要性を
もつものではなく、ゲルろ過、イオン交換及び逆相クロ
マトグラフィ及びアフィニティ又はイムノアフィニティ
クロマトグラフィを含む、広範な古典的技法を、キメラ
2Sアルブミンを精製するためそしてそれがアルブミン
から開裂された後生物学的に活性なペプチドを精製する
ための両方に適用することができる。この開裂のために
用いられる正確な技術は、側面にある配列(上記参照)
の設計の時点で決定される戦略によって決められる。2
Sアルブミンは、プロテアーゼに対し幾分か抵抗性を有
するため、プロテアーゼ処理の前に往々にして変性ステ
ップを含み入れるべきである(例を参照のこと)。
【0074】5.生物学的に活性なペプチドの検定。 回収された生成物についての検定は明らかに、生成物自
体によって異なる。植物の初期スクリーニングのために
は、問題のペプチドの存在を検出するのに免疫学的検定
を用いることができる。望まれる生成物に対する抗体、
往々にして、それがなお雑種2Sタンパク質の一部分で
ある間ででも機能する。そうでない場合には、これは雑
種から部分的又は完全に解放されなくてはならず、その
後でペプチド混合物を用いることができる。抗体を用い
たスクリーニングは、古典的なELISA技法(Engval
l & Pesce、1978年)によって行なわれるか又は、
以前にポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離され
たタンパク質のニトロセルロースブロットに基づいて行
なわれる(ウエスタンブロット法、Towbin他、1979
年)。精製されたペプチドはさらに、アミノ酸の組成及
び配列分析により分析され、その同一性が確認される。
体によって異なる。植物の初期スクリーニングのために
は、問題のペプチドの存在を検出するのに免疫学的検定
を用いることができる。望まれる生成物に対する抗体、
往々にして、それがなお雑種2Sタンパク質の一部分で
ある間ででも機能する。そうでない場合には、これは雑
種から部分的又は完全に解放されなくてはならず、その
後でペプチド混合物を用いることができる。抗体を用い
たスクリーニングは、古典的なELISA技法(Engval
l & Pesce、1978年)によって行なわれるか又は、
以前にポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離され
たタンパク質のニトロセルロースブロットに基づいて行
なわれる(ウエスタンブロット法、Towbin他、1979
年)。精製されたペプチドはさらに、アミノ酸の組成及
び配列分析により分析され、その同一性が確認される。
【0075】生物学的活性についての生物学的検定は当
然のことながら、問題の最終的ペプチドの性質及び機能
によって左右される。
然のことながら、問題の最終的ペプチドの性質及び機能
によって左右される。
【0076】本発明はまた、適当なベクターとして植物
の種子貯蔵タンパク質を用いた、生物学的に活性であり
うる標識づけされたタンパク質の生成にも適用できると
いうことも、理解しなくてはならない。この場合、上述
の項目3)に記されている、得られた形質転換体の植物
再生は、標識づけされた炭素源(1 3C)及び/又は、窒
素源(1 5N)及び/又は水素源(2H)及び/又は硫黄源
(3 5S)及び/又はリン光体源(3 2P)が形質転換され
た成長中の植物に対して与えられるべき条件の下で起こ
らなくてはならない。(Kollman他、1979年;Jung
& Jettner、1972年、De Wit他、1978年)。
の種子貯蔵タンパク質を用いた、生物学的に活性であり
うる標識づけされたタンパク質の生成にも適用できると
いうことも、理解しなくてはならない。この場合、上述
の項目3)に記されている、得られた形質転換体の植物
再生は、標識づけされた炭素源(1 3C)及び/又は、窒
素源(1 5N)及び/又は水素源(2H)及び/又は硫黄源
(3 5S)及び/又はリン光体源(3 2P)が形質転換され
た成長中の植物に対して与えられるべき条件の下で起こ
らなくてはならない。(Kollman他、1979年;Jung
& Jettner、1972年、De Wit他、1978年)。
【0077】本発明の付加的な特徴は、とくに以下の添
付の図面に基づいた、制限的な意味の無い特定の例の開
示を通して明らかになるものと思われる:
付の図面に基づいた、制限的な意味の無い特定の例の開
示を通して明らかになるものと思われる:
【0078】− 図1、図2、図3、図4及び図5は、
すでに上述のような2S−貯蔵タンパク質の全体的特長
を示している。
すでに上述のような2S−貯蔵タンパク質の全体的特長
を示している。
【0079】− 図6は、以下に指示されているように
得られたpBN2S1プラスミドから得たブラジルナッ
ツの2S−アルブミンの配列の一部分とその関連要素を
表わしている。
得られたpBN2S1プラスミドから得たブラジルナッ
ツの2S−アルブミンの配列の一部分とその関連要素を
表わしている。
【0080】− 図7は、他の図面に示されている構成
内で用いられている制限部位を表わしている。
内で用いられている制限部位を表わしている。
【0081】− 図8及び図9は、1つの前駆体をコー
ド付けする核酸を含む制限フラグメントを含むキメラプ
ラスミドの構成の連続的段階を図式的に示している(な
お、かかる核酸は本書において「前駆体−コード付け核
酸」と呼ばれ、この全体は、特に部位指向性をもつ突然
変異誘発を通して問題のポリペプチドをコード付けする
DNAの挿入による変更に適している)。
ド付けする核酸を含む制限フラグメントを含むキメラプ
ラスミドの構成の連続的段階を図式的に示している(な
お、かかる核酸は本書において「前駆体−コード付け核
酸」と呼ばれ、この全体は、特に部位指向性をもつ突然
変異誘発を通して問題のポリペプチドをコード付けする
DNAの挿入による変更に適している)。
【0082】− 図10は、上述の部位指向性の突然変
異誘発の実施に適したプラスミドの制限部位及び遺伝地
図を示している。
異誘発の実施に適したプラスミドの制限部位及び遺伝地
図を示している。
【0083】− 図11は、一般に適当な場所での核酸
の変更に適用できるようなStanssens他(1987年)
の部位指向性突然変異誘発手順のさまざまな段階を図式
的に示している。
の変更に適用できるようなStanssens他(1987年)
の部位指向性突然変異誘発手順のさまざまな段階を図式
的に示している。
【0084】− 図12、図13及び図14は、以下の
開示において例としてLeu−エンケファリンが用いら
れているような1つの問題のポリペプチドをコード付け
するインサートを、その前駆体核酸配列の可欠領域内に
含み込むため、この前駆体核酸を含む上述のキメラプラ
スミドを変更する諸段階を、図式的に示している。
開示において例としてLeu−エンケファリンが用いら
れているような1つの問題のポリペプチドをコード付け
するインサートを、その前駆体核酸配列の可欠領域内に
含み込むため、この前駆体核酸を含む上述のキメラプラ
スミドを変更する諸段階を、図式的に示している。
【0085】− 図15は、Arabidopsis thaliana2S
アルブミン遺伝子を含む1kbフラグメントの配列を表わ
し、関連する要素を示している。
アルブミン遺伝子を含む1kbフラグメントの配列を表わ
し、関連する要素を示している。
【0086】− 図16は、上述のArabidopsis 2Sタ
ンパク質の大きなサブユニットのタンパク質配列を、関
連するオリゴヌクレオチド配列と共に提供している。
ンパク質の大きなサブユニットのタンパク質配列を、関
連するオリゴヌクレオチド配列と共に提供している。
【0087】− 図17は、pGSC1703の制限地
図を示している。
図を示している。
【0088】− 図18は、pGSC1703Aの制限
地図を示している。
地図を示している。
【0089】− 図19のA図は、C4カラム上での、
標識として用いられた合成ペプチドYGGFLKのアリ
コートのクロマトグラムを表わしている。勾配(破線)
は0%の溶剤で0〜5分で平担であり、溶剤Bは70分
で100%に達するべく増大する。溶剤A:水中0.1
%TFA;溶剤B:70%CH3CN中0.1%のTF
A。
標識として用いられた合成ペプチドYGGFLKのアリ
コートのクロマトグラムを表わしている。勾配(破線)
は0%の溶剤で0〜5分で平担であり、溶剤Bは70分
で100%に達するべく増大する。溶剤A:水中0.1
%TFA;溶剤B:70%CH3CN中0.1%のTF
A。
【0090】− 図19のB図は、図19のA図で行な
われたものと同じ条件下での酸化された2S上のトリプ
シン消化のクロマトグラムを表わす、斜線のついたピー
ク部を収集して、さらに精製を行なった。
われたものと同じ条件下での酸化された2S上のトリプ
シン消化のクロマトグラムを表わす、斜線のついたピー
ク部を収集して、さらに精製を行なった。
【0091】− 図20のA図は、C18カラム上で
の、標識として用いられた合成ペプチドYGGFLKの
アリコートのクロマトグラムを表わす。勾配(破線)は
0%溶剤Bにて0分〜5分の間平担であり、溶剤Bは7
0分で100%に達するべく増大する。溶剤A:水中
0.1%TFA;溶剤B:70%CH3CN中0.1%
TFA。
の、標識として用いられた合成ペプチドYGGFLKの
アリコートのクロマトグラムを表わす。勾配(破線)は
0%溶剤Bにて0分〜5分の間平担であり、溶剤Bは7
0分で100%に達するべく増大する。溶剤A:水中
0.1%TFA;溶剤B:70%CH3CN中0.1%
TFA。
【0092】− 図20のB図は、C4カラム上でHP
LCから得られたピークを含むYGGFLKのC18カ
ラム上での再クロマトグラフィを表わす(図19のB図
を参照)。実施条件は、図20のA図の場合と同じであ
る。
LCから得られたピークを含むYGGFLKのC18カ
ラム上での再クロマトグラフィを表わす(図19のB図
を参照)。実施条件は、図20のA図の場合と同じであ
る。
【0093】− 図21は、YGGFLK上のアミノ酸
配列の決定の結果を表わす。左の角の囲みは、PTHア
ミノ酸の標準を示す(各々20pモル)。サイクル1〜
6についての信号は、基準より8倍減衰されている。
配列の決定の結果を表わす。左の角の囲みは、PTHア
ミノ酸の標準を示す(各々20pモル)。サイクル1〜
6についての信号は、基準より8倍減衰されている。
【0094】− 図22のA図は、マーカーとして用い
られるYGGFLペプチドを示すクロマトグラムであ
る。このペプチドは合成ペプチドYGGFLKに対する
カルボキシペプチダーゼB消化の結果である。実施条件
は、図19のA図の場合と同じである。
られるYGGFLペプチドを示すクロマトグラムであ
る。このペプチドは合成ペプチドYGGFLKに対する
カルボキシペプチダーゼB消化の結果である。実施条件
は、図19のA図の場合と同じである。
【0095】− 図22のB図は、植物材料から分離さ
れたYGGFLKペプチドに対するカルボキシペプチダ
ーゼB消化の後の、*印で表わされたIGGFLペプチ
ドの分離を示している。
れたYGGFLKペプチドに対するカルボキシペプチダ
ーゼB消化の後の、*印で表わされたIGGFLペプチ
ドの分離を示している。
【0096】− 図23は、超可変領域のほぼ全ての欠
失及びそのAccI部位での置換、以下の開示に例とし
て与えられている開裂部位及びGHRFをコード付けす
る配列の、特に部位指向性突然変異誘発を通してのAc
cI部位内への挿入ならびに、植物の形質転換に適した
植物ベクター内の前記キメラ遺伝子のクローニングを含
む、キメラ2SアルブミンのArabidopsis thaliana遺伝
子の構成の連続的段階を、図式的に示している。
失及びそのAccI部位での置換、以下の開示に例とし
て与えられている開裂部位及びGHRFをコード付けす
る配列の、特に部位指向性突然変異誘発を通してのAc
cI部位内への挿入ならびに、植物の形質転換に適した
植物ベクター内の前記キメラ遺伝子のクローニングを含
む、キメラ2SアルブミンのArabidopsis thaliana遺伝
子の構成の連続的段階を、図式的に示している。
【0097】− 図24のA図は、GHRFS及びGH
RFL遺伝子の構成に用いられる8つのオリゴヌクレオ
チドを示している。オリゴヌクレオチドの限界は垂直線
で表わされ、かかるオリゴヌクレオチドの上下の数字は
その番号を示す。オリゴヌクレオチド4及び8におい
て、囲み内に入っている塩基は除外され、結果としてG
HRFSをコード付けする遺伝子が得られる。このGH
RFSとGHRFLのペプチド配列及び、CnBr開裂
部位を与えるメチオニン配列は、DNA配列の上に示さ
れている。
RFL遺伝子の構成に用いられる8つのオリゴヌクレオ
チドを示している。オリゴヌクレオチドの限界は垂直線
で表わされ、かかるオリゴヌクレオチドの上下の数字は
その番号を示す。オリゴヌクレオチド4及び8におい
て、囲み内に入っている塩基は除外され、結果としてG
HRFSをコード付けする遺伝子が得られる。このGH
RFSとGHRFLのペプチド配列及び、CnBr開裂
部位を与えるメチオニン配列は、DNA配列の上に示さ
れている。
【0098】− 図24のB図は、修飾されたAT2S
1遺伝子のAccI部位及び、オープンリーディングフ
レームが維持されるようにするこのAccI部位内への
前記GHRFの挿入を示している。
1遺伝子のAccI部位及び、オープンリーディングフ
レームが維持されるようにするこのAccI部位内への
前記GHRFの挿入を示している。
【0099】例1 記述されている方法の第1の例としてヒトの脳及びその
他の神経繊維内においてアヘン剤活性をもつペンタペプ
チドであるLeu−エンケファリンの生成のための手順
が示される。(H. Ughes他、1975a)。ペプチド及
び特異的プロテアーゼの開裂部位をコード付けする合成
オリゴマーが、Bertholletia excelsa(ブラジルナッ
ツ)の2Sアルブミンをコード付けするcDNAクロー
ン内で超可変領域の一部と置換される。このキメラ遺伝
子は、大豆のレクチン遺伝子のプロモータ及びシグナル
ペプチドコード付け領域を含むフラグメントに融合させ
られる(Goldberg他、1983年)。この構成全体を、
アグロバクテリウムを媒介にした形質転換システムを用
いてタバコに移入(転移)させる。この植物を再生さ
せ、開花の後種子を収集し、2Sアルブミンを精製す
る。
他の神経繊維内においてアヘン剤活性をもつペンタペプ
チドであるLeu−エンケファリンの生成のための手順
が示される。(H. Ughes他、1975a)。ペプチド及
び特異的プロテアーゼの開裂部位をコード付けする合成
オリゴマーが、Bertholletia excelsa(ブラジルナッ
ツ)の2Sアルブミンをコード付けするcDNAクロー
ン内で超可変領域の一部と置換される。このキメラ遺伝
子は、大豆のレクチン遺伝子のプロモータ及びシグナル
ペプチドコード付け領域を含むフラグメントに融合させ
られる(Goldberg他、1983年)。この構成全体を、
アグロバクテリウムを媒介にした形質転換システムを用
いてタバコに移入(転移)させる。この植物を再生さ
せ、開花の後種子を収集し、2Sアルブミンを精製す
る。
【0100】オリゴヌクレオチド内に組み込まれた開裂
部位をもつ2つの特異的プロテアーゼを用いて、2Sア
ルブミンからエンケファリンペプチドを開裂させ、次に
HPLC技法を用いてこれを回収する。
部位をもつ2つの特異的プロテアーゼを用いて、2Sア
ルブミンからエンケファリンペプチドを開裂させ、次に
HPLC技法を用いてこれを回収する。
【0101】1.cDNAの合成及びスクリーニング Harris及びDureにより記述されている方法(1981
年)を用いてブラジルナッツのほぼ成熟した種子から全
RNAを分離する。次に、オリゴdTクロマトグラフィ
を用いてポリA+RNAを分離する(Maniatis他、19
82年)。いくつかの公開されている方法のいずれか
(Maniatis他、1982年;Okayama & Berg、198
2年;Land他、1981年;Gubler & Hoffman、19
83年)を用いて、cDNAの合成及びクローニングを
行なうことができる。この事例においては、ブラジルナ
ッツからの2Sアルブミンが配列決定され(Ampe他、1
986年)、アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチド
が構築された。これは、Maniatis他(1982年)の方
法を用いて作られたcDNAライブラリをスクリーニン
グするのに用いられた。結果として得られたクローンは
あまりにも短すぎることがわかり、Gubler及びHoffman
(1983年)の方法を用いて第2のライブラリを作
り、第1のより短いcDNAクローンを用いてスクリー
ニングさせた。ブラジルナットの2Sアルブミン配列を
含むDNA組換え体を分離した。後者をさらに、プラス
ミドpUC18内でクローニングさせた〔Yanisch-Perr
on, C., Vieira, J.及びMassino, J.(1985年)、
「Gene(遺伝子)」33、p103〜119〕
年)を用いてブラジルナッツのほぼ成熟した種子から全
RNAを分離する。次に、オリゴdTクロマトグラフィ
を用いてポリA+RNAを分離する(Maniatis他、19
82年)。いくつかの公開されている方法のいずれか
(Maniatis他、1982年;Okayama & Berg、198
2年;Land他、1981年;Gubler & Hoffman、19
83年)を用いて、cDNAの合成及びクローニングを
行なうことができる。この事例においては、ブラジルナ
ッツからの2Sアルブミンが配列決定され(Ampe他、1
986年)、アミノ酸配列に基づくオリゴヌクレオチド
が構築された。これは、Maniatis他(1982年)の方
法を用いて作られたcDNAライブラリをスクリーニン
グするのに用いられた。結果として得られたクローンは
あまりにも短すぎることがわかり、Gubler及びHoffman
(1983年)の方法を用いて第2のライブラリを作
り、第1のより短いcDNAクローンを用いてスクリー
ニングさせた。ブラジルナットの2Sアルブミン配列を
含むDNA組換え体を分離した。後者をさらに、プラス
ミドpUC18内でクローニングさせた〔Yanisch-Perr
on, C., Vieira, J.及びMassino, J.(1985年)、
「Gene(遺伝子)」33、p103〜119〕
【0102】回収されたプラスミドをpBN2S1と呼
称した。誘導されたタンパク質配列、DNA配列、置換
されるべき領域及び関連する制限部位は、図6に示され
ている。
称した。誘導されたタンパク質配列、DNA配列、置換
されるべき領域及び関連する制限部位は、図6に示され
ている。
【0103】導き出されたタンパク質配列(プラスミド
pBN2S1から得られたもの)は、DNA配列の上に
示され、タンパク質分解処理部位が示されている(図
6)。シグナル配列の終りは、aで表わされている。図
8、図9、図12、図13及び図14中の構造にて用い
られている制限部位が表示されている。構造の後半部分
内で用いられるPstI部位を表示する目的で、クロー
ニングベクターのポリリンカーが示されている。挿入さ
れるべきペプチドのタンパク質及びDNA配列は、突然
変異誘発に用いられるべきオリゴヌクレオチドの残りと
共に、cDNA配列の下に示されている。突然変異誘発
手順の間、図示されているオリゴヌクレオチドは、cD
NAの反対側のストランドに対し交雑される(図12参
照)。
pBN2S1から得られたもの)は、DNA配列の上に
示され、タンパク質分解処理部位が示されている(図
6)。シグナル配列の終りは、aで表わされている。図
8、図9、図12、図13及び図14中の構造にて用い
られている制限部位が表示されている。構造の後半部分
内で用いられるPstI部位を表示する目的で、クロー
ニングベクターのポリリンカーが示されている。挿入さ
れるべきペプチドのタンパク質及びDNA配列は、突然
変異誘発に用いられるべきオリゴヌクレオチドの残りと
共に、cDNA配列の下に示されている。突然変異誘発
手順の間、図示されているオリゴヌクレオチドは、cD
NAの反対側のストランドに対し交雑される(図12参
照)。
【0104】2.キメラ遺伝子の構成。 まず、大豆のレクチン遺伝子のシグナルペプチドとプロ
モータをコード付けするDNAフラグメントに2Sアル
ブミン遺伝子を融合させる。レクチン及びブラジルナッ
ツの両方の中のシグナルペプチドの開裂点は、標準的コ
ンセンサスシーケンスから誘導される(Perlman & Hal
vorson、1983年)。以下にそして図6内に、関連配
列が示されている:
モータをコード付けするDNAフラグメントに2Sアル
ブミン遺伝子を融合させる。レクチン及びブラジルナッ
ツの両方の中のシグナルペプチドの開裂点は、標準的コ
ンセンサスシーケンスから誘導される(Perlman & Hal
vorson、1983年)。以下にそして図6内に、関連配
列が示されている:
【0105】プラスミドpLe1、pSOYLEA1及
びpBN2S1内のシグナルペプチド/成熟タンパク質
配列の領域内のタンパク質配列及び2本鎖DNA配列が
図7に示されている。図面に示されている構造において
用いられる制限部位の位置及び認識部位が示されてい
る。*印は、シグナル配列の終りのタンパク質開裂部位
を表わす。
びpBN2S1内のシグナルペプチド/成熟タンパク質
配列の領域内のタンパク質配列及び2本鎖DNA配列が
図7に示されている。図面に示されている構造において
用いられる制限部位の位置及び認識部位が示されてい
る。*印は、シグナル配列の終りのタンパク質開裂部位
を表わす。
【0106】構成の出発点は、大豆のゲノムHindIIIフ
ラグメントを含むプラスミドpLe1(Okamuro他、1
987年)である。このフラグメントには、大豆レクチ
ン遺伝子全て、そのプロモータ、種子特異的発現にとっ
て重要でありうるプロモータの上流の配列が含まれてい
る。このフラグメントから、適当な大豆レクチンプロモ
ータ/シグナル配列のカセットが、図8に示されている
ように構成された。DdeI部位は、シグナル配列(S
S)をコード付けする配列の終りにあり、その開裂部位
(C/TCAG)はプロセシング部位に相当する。この
プロセシング部位において有効な制限部位を得るため
に、SS配列のKpnI−DdeIフラグメント(以下
「SS」と呼ぶ)をpLE1から分離し、それ自体Kp
nI及びBg1IIで線形化されたpLK57へクローニ
ングする(Botterman、1986年)。DdeI及びB
g1IIの末端には、Klenow DNAポリメラーゼIを満
たす。これはBg1II部位(A/GATCT)を再構成
し、その開裂部位はこのときシグナル配列処理部位に相
当する(図8、図9参照)。このようにして得られたプ
ラスミドpSOYLEA1は、従って、プラスミドpL
K57から成り、ここにおいて当初pLE1内に含まれ
ていたSS配列のKpnI−DdeIフラグメント(S
S)はpLK57の初期KpnI−Bg1IIフラグメン
トで置換されている。HindIII部位は、図6に図式的に
示されているように、pSoyLea1内の(1)で表
わされたPstI−KpnIフラグメントの代りにpL
K69からの前記HindIII部位を含むKpnI−Pst
Iフラグメントを置換することにより、このフラグメン
トの前に置かれている。この中間構成はpSoyLea
2と呼ばれる。第2段階においては、pSoyLea2
内にpLE1のHindIII−KpnIフラグメント(2)
を挿入することによりレクチンプロモータを再構成す
る。このプロモータフラグメントの上流には別のBg1
II部位があるため、レクチンプロモータ/シグナル配列
カセットは、このときBg1II−Bg1IIフラグメント
としてプラスミドpSoyLea3中に存在する。
ラグメントを含むプラスミドpLe1(Okamuro他、1
987年)である。このフラグメントには、大豆レクチ
ン遺伝子全て、そのプロモータ、種子特異的発現にとっ
て重要でありうるプロモータの上流の配列が含まれてい
る。このフラグメントから、適当な大豆レクチンプロモ
ータ/シグナル配列のカセットが、図8に示されている
ように構成された。DdeI部位は、シグナル配列(S
S)をコード付けする配列の終りにあり、その開裂部位
(C/TCAG)はプロセシング部位に相当する。この
プロセシング部位において有効な制限部位を得るため
に、SS配列のKpnI−DdeIフラグメント(以下
「SS」と呼ぶ)をpLE1から分離し、それ自体Kp
nI及びBg1IIで線形化されたpLK57へクローニ
ングする(Botterman、1986年)。DdeI及びB
g1IIの末端には、Klenow DNAポリメラーゼIを満
たす。これはBg1II部位(A/GATCT)を再構成
し、その開裂部位はこのときシグナル配列処理部位に相
当する(図8、図9参照)。このようにして得られたプ
ラスミドpSOYLEA1は、従って、プラスミドpL
K57から成り、ここにおいて当初pLE1内に含まれ
ていたSS配列のKpnI−DdeIフラグメント(S
S)はpLK57の初期KpnI−Bg1IIフラグメン
トで置換されている。HindIII部位は、図6に図式的に
示されているように、pSoyLea1内の(1)で表
わされたPstI−KpnIフラグメントの代りにpL
K69からの前記HindIII部位を含むKpnI−Pst
Iフラグメントを置換することにより、このフラグメン
トの前に置かれている。この中間構成はpSoyLea
2と呼ばれる。第2段階においては、pSoyLea2
内にpLE1のHindIII−KpnIフラグメント(2)
を挿入することによりレクチンプロモータを再構成す
る。このプロモータフラグメントの上流には別のBg1
II部位があるため、レクチンプロモータ/シグナル配列
カセットは、このときBg1II−Bg1IIフラグメント
としてプラスミドpSoyLea3中に存在する。
【0107】このカセットはこのとき、プラスミドpB
N2S1の205bpブラジルナッツcDNAフラグメ
ントとレジスタ内で融合する。なおこれは、ブラジルナ
ッツのプロ−2Sアルブミンに対するコード付け配列
(すなわちシグナル配列を除く前駆体分子全て)を含ん
でいる。このことは、図7に示されているとおりに行な
われる。Bg1IでのcDNAクローンpBN2S1の
消化(図6)、Bg1I突出末端を切除するためのKlen
owDNAポリメラーゼIでの処理及びPstIでの消化
の後に得られた205bpフラグメントは、SmaI及
びPstIでの消化により線形化されたpUC18へク
ローニングされる(Yannish-Perron他、1985年)。
結果として得られたプラスミドpUC18−BN1は、
両末端共に充てんされ再結紮されているEcoRI及び
AvaIの両方で消化される。その結果、最初にEco
RI部位をもつ望ましいブラジルナッツコード付け配列
を含むpUC18−BN2と呼ばれる新しいプラスミド
が再構成されることになる(図9)。
N2S1の205bpブラジルナッツcDNAフラグメ
ントとレジスタ内で融合する。なおこれは、ブラジルナ
ッツのプロ−2Sアルブミンに対するコード付け配列
(すなわちシグナル配列を除く前駆体分子全て)を含ん
でいる。このことは、図7に示されているとおりに行な
われる。Bg1IでのcDNAクローンpBN2S1の
消化(図6)、Bg1I突出末端を切除するためのKlen
owDNAポリメラーゼIでの処理及びPstIでの消化
の後に得られた205bpフラグメントは、SmaI及
びPstIでの消化により線形化されたpUC18へク
ローニングされる(Yannish-Perron他、1985年)。
結果として得られたプラスミドpUC18−BN1は、
両末端共に充てんされ再結紮されているEcoRI及び
AvaIの両方で消化される。その結果、最初にEco
RI部位をもつ望ましいブラジルナッツコード付け配列
を含むpUC18−BN2と呼ばれる新しいプラスミド
が再構成されることになる(図9)。
【0108】レジスタ内のブラジルナッツコード付け配
列をレクチンプロモータ/シグナル配列カセットに融合
するために、pUC18−BN2はEcoRIで消化さ
れ、末端は、dATPのみが存在する中でKlenow酵素を
用いて部分的に充てんされる。残りの張出しヌクレオチ
ドはS1ヌクレアーゼで除去され、その後PstI消化
が行なわれる。こうして1つの平滑末端と1つのPst
I消化末端をもつフラグメントが生み出される。レクチ
ンプロモータ/シグナル配列フラグメントは、充てんさ
れたBg1II末端をもつEcoRI−Bg1IIフラグメ
ントとして、pSoyLea1(図9)からとられる。
これら2つのセグメントはPstI−EcoRI消化さ
れたpUC18で合わせて結紮される。この結果、シグ
ナルペプチドコード付け配列とブラジルナッツ配列の接
合部に再構成されたBg1II部位をもつpUC18SL
BN1が得られる(図9)。従ってpUC18SLBN
1は、pSoyLea1のBg1II−EcoRIフラグ
メント(図8に(3)として示されている)そしてその
転写方向上流にはpUC18BN2により供給されブラ
ジルナッツプロ−2Sアルブミンに対する205bpc
DNAコード付け配列を含むEcoRI−PstEco
RIフラグメントが中に挿入されてしまっているpUC
18プラスミドで構成される。
列をレクチンプロモータ/シグナル配列カセットに融合
するために、pUC18−BN2はEcoRIで消化さ
れ、末端は、dATPのみが存在する中でKlenow酵素を
用いて部分的に充てんされる。残りの張出しヌクレオチ
ドはS1ヌクレアーゼで除去され、その後PstI消化
が行なわれる。こうして1つの平滑末端と1つのPst
I消化末端をもつフラグメントが生み出される。レクチ
ンプロモータ/シグナル配列フラグメントは、充てんさ
れたBg1II末端をもつEcoRI−Bg1IIフラグメ
ントとして、pSoyLea1(図9)からとられる。
これら2つのセグメントはPstI−EcoRI消化さ
れたpUC18で合わせて結紮される。この結果、シグ
ナルペプチドコード付け配列とブラジルナッツ配列の接
合部に再構成されたBg1II部位をもつpUC18SL
BN1が得られる(図9)。従ってpUC18SLBN
1は、pSoyLea1のBg1II−EcoRIフラグ
メント(図8に(3)として示されている)そしてその
転写方向上流にはpUC18BN2により供給されブラ
ジルナッツプロ−2Sアルブミンに対する205bpc
DNAコード付け配列を含むEcoRI−PstEco
RIフラグメントが中に挿入されてしまっているpUC
18プラスミドで構成される。
【0109】しかしながら、読みとり枠は適切に維持さ
れていない。これを補正するために、このプラスミドを
Ba1IIで線形化し、S1ヌクレアーゼで処理し、再結
紮する。この中間体をpUC18SLBN2と呼ぶ。こ
の構成は最後に、pSoyLea3からのプロモータの
5′部分を担うKpnIフラグメントを挿入し、pUC
18SLBN3を生み出し、pBN2S1からのブラジ
ルナッツcDNAの3′部分を含むPstIフラグメン
トを後者に挿入することにより、2段階の作業にて完成
される。その結果得られた最終的構成pUCSLBN4
は、BamHIフラグメント内に含まれているレクチン
プロモータ/シグナル配列−ブラジルナッツcDNA配
列の融合物を含んでいる。
れていない。これを補正するために、このプラスミドを
Ba1IIで線形化し、S1ヌクレアーゼで処理し、再結
紮する。この中間体をpUC18SLBN2と呼ぶ。こ
の構成は最後に、pSoyLea3からのプロモータの
5′部分を担うKpnIフラグメントを挿入し、pUC
18SLBN3を生み出し、pBN2S1からのブラジ
ルナッツcDNAの3′部分を含むPstIフラグメン
トを後者に挿入することにより、2段階の作業にて完成
される。その結果得られた最終的構成pUCSLBN4
は、BamHIフラグメント内に含まれているレクチン
プロモータ/シグナル配列−ブラジルナッツcDNA配
列の融合物を含んでいる。
【0110】3.エンケファリン及びプロテアーゼ開裂
部位をコード付けする配列での超可変領域の一部分の置
換。 Leu−エンケファリンペプチドはTyr−Gly−G
ly−Phe−Leuの配列を有する(Hughes他、19
75b)。精製後の雑種2Sアルブミンから無傷のポリ
ペプチドを回復することができるように、リジンをコー
ド付けするコドンを、エンケファリンコード付け配列の
いずれかの側に置く。こうすることによって、下流の処
理段階においてひきつづき、エンドペプチダーゼエンド
リジン・C及びカルボキシペプチダーゼB、2Sアルブ
ミンからエンケファリンポリペプチドを開裂することが
できる。最後に、突然変異誘発の間に、オリゴヌクレオ
チドが間隙ある二本鎖分子に交雑できるようにするため
(以下参照)、保持すべきブラジルナッツ配列に対し相
補的な追加配列を含み入れる。複数の植物貯蔵タンパク
質遺伝子におけるコドン使用を研究した後決定されたオ
リゴヌクレオチドの正確な配列は以下のとおりである:
5′−GCAACAGGAGAAGTACGGTGGA
TTCTTGAAGCAGATGCG−3′
部位をコード付けする配列での超可変領域の一部分の置
換。 Leu−エンケファリンペプチドはTyr−Gly−G
ly−Phe−Leuの配列を有する(Hughes他、19
75b)。精製後の雑種2Sアルブミンから無傷のポリ
ペプチドを回復することができるように、リジンをコー
ド付けするコドンを、エンケファリンコード付け配列の
いずれかの側に置く。こうすることによって、下流の処
理段階においてひきつづき、エンドペプチダーゼエンド
リジン・C及びカルボキシペプチダーゼB、2Sアルブ
ミンからエンケファリンポリペプチドを開裂することが
できる。最後に、突然変異誘発の間に、オリゴヌクレオ
チドが間隙ある二本鎖分子に交雑できるようにするため
(以下参照)、保持すべきブラジルナッツ配列に対し相
補的な追加配列を含み入れる。複数の植物貯蔵タンパク
質遺伝子におけるコドン使用を研究した後決定されたオ
リゴヌクレオチドの正確な配列は以下のとおりである:
5′−GCAACAGGAGAAGTACGGTGGA
TTCTTGAAGCAGATGCG−3′
【0111】ブラジルナッツ2Sアルブミンの超可変領
域をコード付けする配列の一部分の置換は、プライマと
してオリゴヌクレオチドを用い部位指向の突然変異誘発
を使って行なわれる(図6及び図12)。Stanssens他
(1987年)のシステムが用いられる。
域をコード付けする配列の一部分の置換は、プライマと
してオリゴヌクレオチドを用い部位指向の突然変異誘発
を使って行なわれる(図6及び図12)。Stanssens他
(1987年)のシステムが用いられる。
【0112】Stanssens他の方法は図11に図示されて
おり、以下に再現する。これは、その制限及び遺伝子地
図が図10に示されその主な特長も又以下に再現されて
いるようなプラスミドpMac5−8を用いる。
おり、以下に再現する。これは、その制限及び遺伝子地
図が図10に示されその主な特長も又以下に再現されて
いるようなプラスミドpMac5−8を用いる。
【0113】pMac5−8の関連する遺伝子座は、図
10に示されている。矢印は、その機能的方向性を示
す。fdT:ファージfdの中央転写終結信号(ターミ
ネータ);F1−ORI:繊維状ファージ(f1)の複
数起点;ORI;Co/E1タイプの複数起点;BLA
/ApR:β−ラクタマーゼに対しコード付けする領
域;CAT/CmR:クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼに対しコード付けする領域。pMc5
−8(bla−am遺伝子はScaI部位をもたない)
及びpMc5−8(cat−am:突然変異は単一のP
vuIII部位を除去する)内に存在するアンバー突然変
異の位置が示されている。supE及びsupF宿主の
両方におけるcatアンバー突然変異の抑制の結果、少
なくとも25μg/mlのCmに対する耐性が得られる。p
Mc5−8は、それぞれsupE及びsupF菌株での
アンバー抑制の時点で±20μg/ml及び100μg/mlの
Apに対する耐性を与える。野生型cat遺伝子内に存
在するEcoRI、BalI及びNcoI部位(星印で
示されている)は、突然変異技術を用いて除去された。
10に示されている。矢印は、その機能的方向性を示
す。fdT:ファージfdの中央転写終結信号(ターミ
ネータ);F1−ORI:繊維状ファージ(f1)の複
数起点;ORI;Co/E1タイプの複数起点;BLA
/ApR:β−ラクタマーゼに対しコード付けする領
域;CAT/CmR:クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼに対しコード付けする領域。pMc5
−8(bla−am遺伝子はScaI部位をもたない)
及びpMc5−8(cat−am:突然変異は単一のP
vuIII部位を除去する)内に存在するアンバー突然変
異の位置が示されている。supE及びsupF宿主の
両方におけるcatアンバー突然変異の抑制の結果、少
なくとも25μg/mlのCmに対する耐性が得られる。p
Mc5−8は、それぞれsupE及びsupF菌株での
アンバー抑制の時点で±20μg/ml及び100μg/mlの
Apに対する耐性を与える。野生型cat遺伝子内に存
在するEcoRI、BalI及びNcoI部位(星印で
示されている)は、突然変異技術を用いて除去された。
【0114】以下に記されているように、ここで例示さ
れている2S−アルブミン領域の選択された超可変領域
に対するLeu−エンケファリンペプチドの置換に対し
ても適用されるようなこのStanssens方法の原理も同様
にまず、以下に再現される:
れている2S−アルブミン領域の選択された超可変領域
に対するLeu−エンケファリンペプチドの置換に対し
ても適用されるようなこのStanssens方法の原理も同様
にまず、以下に再現される:
【0115】基本的に、上述の置換のために用いられる
突然変異誘発の1ラウンドは、以下のように進行する。
閉じた円でAp及びCm選択可能標識内のアンバー突然
変異が示されている図11を参照する。記号は、突然変
異誘発オリゴヌクレオチドを表わす。突然変異自体は矢
印の頭で示されている。
突然変異誘発の1ラウンドは、以下のように進行する。
閉じた円でAp及びCm選択可能標識内のアンバー突然
変異が示されている図11を参照する。記号は、突然変
異誘発オリゴヌクレオチドを表わす。突然変異自体は矢
印の頭で示されている。
【0116】このプロセスの個々の段階は、以下のとお
りである: − 標的DNAフラグメントのpMa5−8へのクロー
ニング(I)。このベクターは、CmR遺伝子内のアン
バー突然変異を続行し、アンピシリンに対する耐性を規
定する; − 偽ウイルス粒子からのこの組換え体の一本鎖DNA
の調製(II); − 相補的pMc型プラスミドからの制限フラグメント
の調製(III)。pMc型ベクターは、Ap耐性標識内
にアンバー突然変異がとり込まれている一方で、野生型
CmR遺伝子を含んでいる; − 試験管内DNA/DNA交雑による間隙二本鎖DN
A(以下gdDNAと呼ぶ)の構成(IV)。gdDNA
内において、標的配列は一本鎖DNAとして露出され
る。交雑のその他のコンポーネントからのgdDNAの
予備的精製は必要でない; − gdDNAへの合成オリゴヌクレオチドのアニーリ
ング(V); − 同時試験管内DNAポリメラーゼ/DNAリガーゼ
反応による残りの間隙の充てんならびにニックのシーリ
ング(VI); − Cm耐性について選択する、mutS宿主、すなわ
ちミスマッチ修復において欠失している菌株の形質転
換。この結果、混合プラスミド後代が生成される(VI
I); − アンバー突然変異を抑制することのできない宿主の
再形質転換による鋳型ストランド(pMa型)から誘導
される後代の除去(VIII)。Cm耐性に関する選択の結
果、間隙あるストランドすなわちその中に突然変異誘発
オリゴヌクレオチドが取り込まれているストランドから
誘導された後代が豊富になる; − 望ましい突然変異の存在に関する、再形質転換の結
果として得られたクローンのスクリーニング。
りである: − 標的DNAフラグメントのpMa5−8へのクロー
ニング(I)。このベクターは、CmR遺伝子内のアン
バー突然変異を続行し、アンピシリンに対する耐性を規
定する; − 偽ウイルス粒子からのこの組換え体の一本鎖DNA
の調製(II); − 相補的pMc型プラスミドからの制限フラグメント
の調製(III)。pMc型ベクターは、Ap耐性標識内
にアンバー突然変異がとり込まれている一方で、野生型
CmR遺伝子を含んでいる; − 試験管内DNA/DNA交雑による間隙二本鎖DN
A(以下gdDNAと呼ぶ)の構成(IV)。gdDNA
内において、標的配列は一本鎖DNAとして露出され
る。交雑のその他のコンポーネントからのgdDNAの
予備的精製は必要でない; − gdDNAへの合成オリゴヌクレオチドのアニーリ
ング(V); − 同時試験管内DNAポリメラーゼ/DNAリガーゼ
反応による残りの間隙の充てんならびにニックのシーリ
ング(VI); − Cm耐性について選択する、mutS宿主、すなわ
ちミスマッチ修復において欠失している菌株の形質転
換。この結果、混合プラスミド後代が生成される(VI
I); − アンバー突然変異を抑制することのできない宿主の
再形質転換による鋳型ストランド(pMa型)から誘導
される後代の除去(VIII)。Cm耐性に関する選択の結
果、間隙あるストランドすなわちその中に突然変異誘発
オリゴヌクレオチドが取り込まれているストランドから
誘導された後代が豊富になる; − 望ましい突然変異の存在に関する、再形質転換の結
果として得られたクローンのスクリーニング。
【0117】図11に描かれている突然変異誘発実験に
おいて、Cm耐性は、合成標識のための間接的な選択と
して用いられる。明らかに、Ap選択可能な標識が開発
利用されるように、実験をセットアップすることもでき
る。後者の場合、一本鎖鋳型(II)及びフラグメント
(III)はそれぞれpMc及びpMa−型である。単一
の突然変異誘発プロセスは、望ましい突然変異の導入の
みならずプラスミドのpMa型からpMc型への又はそ
の逆の変換という結果をもたらす。従って、これら2つ
の形態の間の循環(アンピシリン又はクロラムフェニコ
ールに対する抵抗性についての交互選択も含む)を用い
て、連続する突然変異誘発ラウンド中に標的配列内で多
くの突然変異を構成することができる。
おいて、Cm耐性は、合成標識のための間接的な選択と
して用いられる。明らかに、Ap選択可能な標識が開発
利用されるように、実験をセットアップすることもでき
る。後者の場合、一本鎖鋳型(II)及びフラグメント
(III)はそれぞれpMc及びpMa−型である。単一
の突然変異誘発プロセスは、望ましい突然変異の導入の
みならずプラスミドのpMa型からpMc型への又はそ
の逆の変換という結果をもたらす。従って、これら2つ
の形態の間の循環(アンピシリン又はクロラムフェニコ
ールに対する抵抗性についての交互選択も含む)を用い
て、連続する突然変異誘発ラウンド中に標的配列内で多
くの突然変異を構成することができる。
【0118】ここで、ブラジルナッツ2Sアルブミンの
超可変領域をコード付けする配列の一部分の置換に関す
る本例に戻ると、Stanssens他のシステムは以下のよう
に適用される:
超可変領域をコード付けする配列の一部分の置換に関す
る本例に戻ると、Stanssens他のシステムは以下のよう
に適用される:
【0119】問題の領域を含むキメラ遺伝子のPstI
−EcoRIフラグメント(図12、図13及び図6参
照)を、アンバー突然変異を伴うクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子と無傷のベータラク
タマーゼ遺伝子を運ぶpMaベクター内に挿入し(図1
2)、出発プラスミドがアンピシリン耐性のみを付与
し、クロラムフェニコール耐性を付与しないようにす
る。一本鎖DNA(図6に示されているものと反対のス
トランドを表わす)を調製し、EcoRI−PstI線
形化形状のpMc型プラスミドでアニーリングし、間隙
ある二本鎖分子を生成する。オリゴヌクレオチドをこの
間隙二本鎖にアニーリングする。一本鎖間隙を、Klenow
DNAポリメラーゼIで充てんし、結紮し、混合物を適
切な宿主に形質転換させる。望ましい突然変異を有する
クローンは、アンピシリンに対し敏感であるが、クロラ
ムフェニコールに対する耐性をもつ。クロラムフェニコ
ール耐性をもつ形質転換体を選び、DNA配列づけによ
り分析する。最後に、pUC18SLBN4内のPst
1−NcoIフラグメントをpMC58BNからの突然
変異誘発されたものと置換することにより、雑種遺伝子
フラグメントをレクチン/ブラジルナッツキメラに挿入
し直す(図13)。結果として得られたプラスミドpU
C18SLBN5は、全てBamHIフラグメントとし
て、雑種ブラジルナッツ−エンケファリン遺伝子に融合
されたレクチンプロモータ及びシグナルシーケンスを含
む。
−EcoRIフラグメント(図12、図13及び図6参
照)を、アンバー突然変異を伴うクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ遺伝子と無傷のベータラク
タマーゼ遺伝子を運ぶpMaベクター内に挿入し(図1
2)、出発プラスミドがアンピシリン耐性のみを付与
し、クロラムフェニコール耐性を付与しないようにす
る。一本鎖DNA(図6に示されているものと反対のス
トランドを表わす)を調製し、EcoRI−PstI線
形化形状のpMc型プラスミドでアニーリングし、間隙
ある二本鎖分子を生成する。オリゴヌクレオチドをこの
間隙二本鎖にアニーリングする。一本鎖間隙を、Klenow
DNAポリメラーゼIで充てんし、結紮し、混合物を適
切な宿主に形質転換させる。望ましい突然変異を有する
クローンは、アンピシリンに対し敏感であるが、クロラ
ムフェニコールに対する耐性をもつ。クロラムフェニコ
ール耐性をもつ形質転換体を選び、DNA配列づけによ
り分析する。最後に、pUC18SLBN4内のPst
1−NcoIフラグメントをpMC58BNからの突然
変異誘発されたものと置換することにより、雑種遺伝子
フラグメントをレクチン/ブラジルナッツキメラに挿入
し直す(図13)。結果として得られたプラスミドpU
C18SLBN5は、全てBamHIフラグメントとし
て、雑種ブラジルナッツ−エンケファリン遺伝子に融合
されたレクチンプロモータ及びシグナルシーケンスを含
む。
【0120】4.タバコの形質転換 キメラ遺伝子を含むBamHIフラグメントを、二元性
ベクターpGSC1702のBamHI部位内に挿入す
る(図14)。このベクターは、大腸菌(E.coli)及び
A. tumefaciensの両方における安定性及び選択のための
官能基ならびにT−DNAフラグメントとして外来性D
NAの植物ゲノムへの転移のための官能基を含んでいる
(Deblaere他、1987年)。後者は、オクトピンT−
領域の末端反復配列から成る。フラグメントがクローニ
ングされるBamHI部位は、T−DNA遺伝子7のポ
リアデニル化シグナルの前にある。ノパリン合成(no
s)プロモータ、ネオマイシンフォスフォトランスフェ
ラーゼタンパク質コード付け領域(neo)及びOCS
遺伝子の3′末端基から成るキメラ遺伝子が存在するた
め、形質転換された植物はカナマイシン耐性をもつこと
になる。標準的な手順(Deblaere他、1987年)を用
いて、プラスミドを、プラスミドpGV2260をもつ
アグロバクテリウム菌株C58C1Rifに転移させ
る。後者は植物のゲノムへT−DNA領域をうまく転移
させるのに必要とされるin trans及びvir遺伝子官能
基を与える。次にこのアグロバクテリウムを用いて、標
準の手順により菌株SR1のタバコを形質転換する(De
blaere他、1987年)。100μg/mlのカナマイシン
上でカルスを選択し、耐性あるカルスは、植物を再生す
るのに用いる。これらの植物から調製されたDNAを、
ブラジルナッツの2Sアルブミンクローン又はオリゴヌ
クレオチドとの交雑により雑種遺伝子の存在についてチ
ェックする。陽性の植物を生育させ、以下に記されてい
るように処理する。
ベクターpGSC1702のBamHI部位内に挿入す
る(図14)。このベクターは、大腸菌(E.coli)及び
A. tumefaciensの両方における安定性及び選択のための
官能基ならびにT−DNAフラグメントとして外来性D
NAの植物ゲノムへの転移のための官能基を含んでいる
(Deblaere他、1987年)。後者は、オクトピンT−
領域の末端反復配列から成る。フラグメントがクローニ
ングされるBamHI部位は、T−DNA遺伝子7のポ
リアデニル化シグナルの前にある。ノパリン合成(no
s)プロモータ、ネオマイシンフォスフォトランスフェ
ラーゼタンパク質コード付け領域(neo)及びOCS
遺伝子の3′末端基から成るキメラ遺伝子が存在するた
め、形質転換された植物はカナマイシン耐性をもつこと
になる。標準的な手順(Deblaere他、1987年)を用
いて、プラスミドを、プラスミドpGV2260をもつ
アグロバクテリウム菌株C58C1Rifに転移させ
る。後者は植物のゲノムへT−DNA領域をうまく転移
させるのに必要とされるin trans及びvir遺伝子官能
基を与える。次にこのアグロバクテリウムを用いて、標
準の手順により菌株SR1のタバコを形質転換する(De
blaere他、1987年)。100μg/mlのカナマイシン
上でカルスを選択し、耐性あるカルスは、植物を再生す
るのに用いる。これらの植物から調製されたDNAを、
ブラジルナッツの2Sアルブミンクローン又はオリゴヌ
クレオチドとの交雑により雑種遺伝子の存在についてチ
ェックする。陽性の植物を生育させ、以下に記されてい
るように処理する。
【0121】5.種子からの2Sアルブミンの精製 陽性の植物を生育させ種子を生じさせる。これには約1
5週間が必要である。個々の植物の種子を収穫しドライ
アイス中で均質化(ホモジナイス)し、ヘキサンで抽出
する。残留物をLaemmli標本緩衝液に溶かし、沸とうさ
せ、SDSポリアクリルアミドゲル上に置く(Laemli、
1970年)。分離させたタンパク質をニトロセルロー
スシート上にて電気ブロットし(Towbin他、1979
年)、Leu−エンケファリン抗原の市販の多クローン
性抗体で検定する(UCBcat、fi72/001、
ib72/002)。
5週間が必要である。個々の植物の種子を収穫しドライ
アイス中で均質化(ホモジナイス)し、ヘキサンで抽出
する。残留物をLaemmli標本緩衝液に溶かし、沸とうさ
せ、SDSポリアクリルアミドゲル上に置く(Laemli、
1970年)。分離させたタンパク質をニトロセルロー
スシート上にて電気ブロットし(Towbin他、1979
年)、Leu−エンケファリン抗原の市販の多クローン
性抗体で検定する(UCBcat、fi72/001、
ib72/002)。
【0122】上述の免疫学的検定を用いて、強度に陽性
の植物を選択する。次にこれらをさらに大量に育て、種
子を収穫する。ヘキサン粉末を調製し、高塩度緩衝液
(0.5M NaCl、0.05Mのリン酸ナトリウムpH
7.2)で抽出する。次にこの抽出物を水に対し透析
し、遠心分離で清澄にさせ(30分間50,000×
g)、同じ高塩分緩衝液内で行なわれたSephadexG−7
5カラム上でのゲルろ過により上澄みをさらに精製す
る。DEAE−セルロースカラム上の非イオン、非タン
パク質材料のイオン交換クロマトグラフィから、さらに
タンパク質を精製する。次に、2Sタンパク質混合物を
含む分画と組合せ、0.5%のNH4HCO3に対し透析
し、凍結乾燥させる。
の植物を選択する。次にこれらをさらに大量に育て、種
子を収穫する。ヘキサン粉末を調製し、高塩度緩衝液
(0.5M NaCl、0.05Mのリン酸ナトリウムpH
7.2)で抽出する。次にこの抽出物を水に対し透析
し、遠心分離で清澄にさせ(30分間50,000×
g)、同じ高塩分緩衝液内で行なわれたSephadexG−7
5カラム上でのゲルろ過により上澄みをさらに精製す
る。DEAE−セルロースカラム上の非イオン、非タン
パク質材料のイオン交換クロマトグラフィから、さらに
タンパク質を精製する。次に、2Sタンパク質混合物を
含む分画と組合せ、0.5%のNH4HCO3に対し透析
し、凍結乾燥させる。
【0123】6.Leu−エンケファリンの回収 精製された内生の2S貯蔵タンパク質と雑種2Sタンパ
ク質の混合物を、Endo−Lys−Cで消化する。効
果的にタンパク質分解を行なうため、まず過ギ酸で2S
タンパク質を酸化させる(Hirs、1956年)。この酸
化段階は、ジスルフィドブリッジを開き、タンパク質を
変性させる。Leu−エンケファリンは過ギ酸と反応し
うるアミノ酸残基を含んでいないので、この処理によっ
てアヘン誘導体が変わることはない。Endo−Lys
−C消化は、37℃で12時間、0.5%のNH4HC
O3溶液中で実施され、凍結乾燥で終結する。この消化
によりLeu−エンケファリンは遊離させられるが、な
おC末端リジン残基に付着したままである。雑種タンパ
ク質にはその他のリジン残基がきわめてわずかしか含ま
れていないため、endo−Lys−Cペプチドの数は
きわめて少なく、このペプチドの付加的な精製を単純な
ものにしている。エンケファリン−Lysペプチドは、
C18カラムを用いて(例えばVYDACの商標で市販
されているもの)HPLC逆相クロマトグラフィで精製
する。勾配は、初期溶剤としての0.1%のトリフルオ
ロ酢酸(A)そしてダイリュータ溶剤としての0.1%
のトリフルオロ酢酸中の70%のアセトニトリル(B)
で構成されている。一分あたり1.5%のA中B溶剤の
勾配を、Ampe他(1987年)により開示されている条
件の下で用いる。精製されたエンケファリン−Lysペ
プチドは、アミノ酸分析及び/又は免疫学的方法により
識別する。さらに、カルボキシル末端リジン残基を除去
するためAmbler(1972年)が開示したようにカルボ
キシペプチダーゼBでこれを処理する。最後に、Lewis
他(1979年)が開示している方法に従って逆相HP
LCクロマトグラフィによりオピオイドペプチドの分離
及び精製を達成する。
ク質の混合物を、Endo−Lys−Cで消化する。効
果的にタンパク質分解を行なうため、まず過ギ酸で2S
タンパク質を酸化させる(Hirs、1956年)。この酸
化段階は、ジスルフィドブリッジを開き、タンパク質を
変性させる。Leu−エンケファリンは過ギ酸と反応し
うるアミノ酸残基を含んでいないので、この処理によっ
てアヘン誘導体が変わることはない。Endo−Lys
−C消化は、37℃で12時間、0.5%のNH4HC
O3溶液中で実施され、凍結乾燥で終結する。この消化
によりLeu−エンケファリンは遊離させられるが、な
おC末端リジン残基に付着したままである。雑種タンパ
ク質にはその他のリジン残基がきわめてわずかしか含ま
れていないため、endo−Lys−Cペプチドの数は
きわめて少なく、このペプチドの付加的な精製を単純な
ものにしている。エンケファリン−Lysペプチドは、
C18カラムを用いて(例えばVYDACの商標で市販
されているもの)HPLC逆相クロマトグラフィで精製
する。勾配は、初期溶剤としての0.1%のトリフルオ
ロ酢酸(A)そしてダイリュータ溶剤としての0.1%
のトリフルオロ酢酸中の70%のアセトニトリル(B)
で構成されている。一分あたり1.5%のA中B溶剤の
勾配を、Ampe他(1987年)により開示されている条
件の下で用いる。精製されたエンケファリン−Lysペ
プチドは、アミノ酸分析及び/又は免疫学的方法により
識別する。さらに、カルボキシル末端リジン残基を除去
するためAmbler(1972年)が開示したようにカルボ
キシペプチダーゼBでこれを処理する。最後に、Lewis
他(1979年)が開示している方法に従って逆相HP
LCクロマトグラフィによりオピオイドペプチドの分離
及び精製を達成する。
【0124】例IIに示されているとおり、その他の方法
も利用可能である。
も利用可能である。
【0125】7.Leu−エンケファリンの生物学的活
性の検定 エンケファリンは、テンジクネズミの脳のナトリウムの
無いホモジエネ−ト内で〔3H〕−ナロクソンの結合を
抑制する。前述のように(Simantov他、1976年)、
ラットの脳膜に対する特異的〔3H〕−ナロクソン結合
を抑制する能力として、オピオイド活性を検定すること
が可能である(Pasternak他、1975年)。「エンケ
ファリン」のオピオイド活性の1ユニットは、200μ
lの検定において50%の占有度を生むような量として
定義づけされた(Colquhaun他、1973年)。
性の検定 エンケファリンは、テンジクネズミの脳のナトリウムの
無いホモジエネ−ト内で〔3H〕−ナロクソンの結合を
抑制する。前述のように(Simantov他、1976年)、
ラットの脳膜に対する特異的〔3H〕−ナロクソン結合
を抑制する能力として、オピオイド活性を検定すること
が可能である(Pasternak他、1975年)。「エンケ
ファリン」のオピオイド活性の1ユニットは、200μ
lの検定において50%の占有度を生むような量として
定義づけされた(Colquhaun他、1973年)。
【0126】例II:当該技法の柔軟性を立証するものと
して、異なる1つの2Sアルブミンを用いたLeu−エ
ンケファリンの生成手順が与えられる。この場合、構成
の基礎としてBertholletia excelsaからのcDNAクロ
ーンを用いる代りに、Arabisopsisthalianaから分離し
たゲノムクローンを用いる。1つのゲノムクローンが用
いられるため、その遺伝子自身のプロモータが用いら
れ、構成は著しく簡略なものとなる。当該技術の一般性
をさらに立証するため、タバコ、 Arabidopsis及びその
近縁植物であり同様に2Sアルブミンを有するBrassica
napis(導入部参照)といった異なる3つの植物におい
て、変化した2Sアルブミン遺伝子を発現させる。この
例の細部の多くは前述の例と同様であるため、ここでは
さらに簡単に説明する。
して、異なる1つの2Sアルブミンを用いたLeu−エ
ンケファリンの生成手順が与えられる。この場合、構成
の基礎としてBertholletia excelsaからのcDNAクロ
ーンを用いる代りに、Arabisopsisthalianaから分離し
たゲノムクローンを用いる。1つのゲノムクローンが用
いられるため、その遺伝子自身のプロモータが用いら
れ、構成は著しく簡略なものとなる。当該技術の一般性
をさらに立証するため、タバコ、 Arabidopsis及びその
近縁植物であり同様に2Sアルブミンを有するBrassica
napis(導入部参照)といった異なる3つの植物におい
て、変化した2Sアルブミン遺伝子を発現させる。この
例の細部の多くは前述の例と同様であるため、ここでは
さらに簡単に説明する。
【0127】1.Arabidopsis thalianaの2Sアルブミ
ン遺伝子のクローニング 2Sアルブミンの精製が容易であるとすると(導入部、
例(1)参照)、Arabidopsisの2Sアルブミン遺伝子
をクローニングする最も直接的な方法は、タンパク質配
列に基づきオリゴヌクレオチドプローブを作り上げるこ
とである。タンパク質配列は、標準的な技法すなわち基
本的にブラジルナッツの2Sアルブミンのものと同じ方
法で決定された(Ampe他、1986年)。図15は、Ar
abidopsis thalianaの2Sアルブミン遺伝子を含む1kb
HindIIIフラグメントの配列を示している。導き出され
たタンパク質配列はDNA配列の上に示され、タンパク
質分解処理部位が表示されている。シグナル配列の終り
はaで示されており、ssuは小さなサブユニットを表
わす。挿入されるべきペプチドのタンパク質配列及びD
NA配列は、突然変異誘発に用いるべきオリゴヌクレオ
チドの残りのものと同じく、cDNA配列の下に示され
ている。突然変異手順の間、示されているオリゴヌクレ
オチドは、示されているDNA配列の反対側のストラン
ドに交雑される。構成中にHindIIIフラグメントの方向
性をチェックするために用いられるNdeI部位には下
線が引かれている(bp−117)。番号づけシステム
は、開始コドンのAが塩基対1としてとられるようなも
のである。
ン遺伝子のクローニング 2Sアルブミンの精製が容易であるとすると(導入部、
例(1)参照)、Arabidopsisの2Sアルブミン遺伝子
をクローニングする最も直接的な方法は、タンパク質配
列に基づきオリゴヌクレオチドプローブを作り上げるこ
とである。タンパク質配列は、標準的な技法すなわち基
本的にブラジルナッツの2Sアルブミンのものと同じ方
法で決定された(Ampe他、1986年)。図15は、Ar
abidopsis thalianaの2Sアルブミン遺伝子を含む1kb
HindIIIフラグメントの配列を示している。導き出され
たタンパク質配列はDNA配列の上に示され、タンパク
質分解処理部位が表示されている。シグナル配列の終り
はaで示されており、ssuは小さなサブユニットを表
わす。挿入されるべきペプチドのタンパク質配列及びD
NA配列は、突然変異誘発に用いるべきオリゴヌクレオ
チドの残りのものと同じく、cDNA配列の下に示され
ている。突然変異手順の間、示されているオリゴヌクレ
オチドは、示されているDNA配列の反対側のストラン
ドに交雑される。構成中にHindIIIフラグメントの方向
性をチェックするために用いられるNdeI部位には下
線が引かれている(bp−117)。番号づけシステム
は、開始コドンのAが塩基対1としてとられるようなも
のである。
【0128】オリゴヌクレオチドプローブを用いる上で
の問題点は、1つ以上のコドンが1つのアミノ酸をコー
ド付けする可能性があるため、タンパク質配列からDN
A配列をあいまいでなく決定することが不可能である、
ということにある。従って、あいまいな位置では、塩基
イノシンが用いられた。イノシンの構造は、交雑の強度
を増大させはしないものの減少させもしないというよう
なものである(大塚他、1985年;高橋他、1985
年)。これに基づき、図16「Arabidopsis thalianaの
2Sアルブミンの大きいサブユニットのタンパク質配
列」に示されているように、3つのオリゴヌクレオチド
プローブが設計された。タンパク質配列の下には、遺伝
子をクローニングするための交雑プローブとして用いら
れるオリゴヌクレオチドの配列がある。Iはイノシンを
表わす。
の問題点は、1つ以上のコドンが1つのアミノ酸をコー
ド付けする可能性があるため、タンパク質配列からDN
A配列をあいまいでなく決定することが不可能である、
ということにある。従って、あいまいな位置では、塩基
イノシンが用いられた。イノシンの構造は、交雑の強度
を増大させはしないものの減少させもしないというよう
なものである(大塚他、1985年;高橋他、1985
年)。これに基づき、図16「Arabidopsis thalianaの
2Sアルブミンの大きいサブユニットのタンパク質配
列」に示されているように、3つのオリゴヌクレオチド
プローブが設計された。タンパク質配列の下には、遺伝
子をクローニングするための交雑プローブとして用いら
れるオリゴヌクレオチドの配列がある。Iはイノシンを
表わす。
【0129】標準的な方法(Maniatis他、1982年;
Benton & Davis、1977年)を用いて、ファージCha
ron35内で作られたArabiodopsisDNAのゲノムライ
ブラリをスクリーニングするのに、この3つのオリゴヌ
クレオチドを用いた(Loenen& Blattner、1983
年)。オリゴヌクレオチドをキナーゼ化し(Miller &B
arnes、1986年)、5×SSPE(Maniatis他、1
982年)、0.1%のSDS、0.02%のフィコー
ル、0.02%のポリビニルピロリドンそして50μg/
mlの音波処理されたニシンの精液DNAの中で45℃で
交雑を行なった。フィルターは、4〜8分45度で5×
SSPE、0.1%SDS中で洗浄した。これらの条件
を用いて、これら3つのオリゴヌクレオチドプローブ全
てと交雑した1つのクローンを分離した。適当な領域
を、標準的な技法(Maniatis他、1982年)を用いて
pUC18にサブクローニングし(Yanisch-Perron他、
1985年)、Maxam & Gilbert(1980年)の方法
を用いて配列づけした。この遺伝子を含む領域の配列
は、図15に示されている。
Benton & Davis、1977年)を用いて、ファージCha
ron35内で作られたArabiodopsisDNAのゲノムライ
ブラリをスクリーニングするのに、この3つのオリゴヌ
クレオチドを用いた(Loenen& Blattner、1983
年)。オリゴヌクレオチドをキナーゼ化し(Miller &B
arnes、1986年)、5×SSPE(Maniatis他、1
982年)、0.1%のSDS、0.02%のフィコー
ル、0.02%のポリビニルピロリドンそして50μg/
mlの音波処理されたニシンの精液DNAの中で45℃で
交雑を行なった。フィルターは、4〜8分45度で5×
SSPE、0.1%SDS中で洗浄した。これらの条件
を用いて、これら3つのオリゴヌクレオチドプローブ全
てと交雑した1つのクローンを分離した。適当な領域
を、標準的な技法(Maniatis他、1982年)を用いて
pUC18にサブクローニングし(Yanisch-Perron他、
1985年)、Maxam & Gilbert(1980年)の方法
を用いて配列づけした。この遺伝子を含む領域の配列
は、図15に示されている。
【0130】2.エンケファリン及びプロテアーゼ開裂
部位をコード付けする配列での可変領域の一部分の置換 上述の分離された遺を、Leu−エンケファリン/2S
アルブミンキメラの構成のために直接使用した。第1の
例の場合と同様に、下流の処理段階においてエンケファ
リンポリペプチドを回収することができるようにLeu
−エンケファリン配列とその両側にリジンコード付けコ
ドンを、そして突然変異誘発の間オリゴヌクレオチドが
間隙ある二本鎖分子に交雑できるように側面にあるArab
idopsis配列に対し相補性のある追加配列を取込む1つ
のオリゴを設計した。その結果として得られたオリゴヌ
クレオチドの配列は、以下のようなものである:5′−
CAAGCTGCCAAGTACGGTGGATTCT
TGAAGCAGCACCAAC−3′
部位をコード付けする配列での可変領域の一部分の置換 上述の分離された遺を、Leu−エンケファリン/2S
アルブミンキメラの構成のために直接使用した。第1の
例の場合と同様に、下流の処理段階においてエンケファ
リンポリペプチドを回収することができるようにLeu
−エンケファリン配列とその両側にリジンコード付けコ
ドンを、そして突然変異誘発の間オリゴヌクレオチドが
間隙ある二本鎖分子に交雑できるように側面にあるArab
idopsis配列に対し相補性のある追加配列を取込む1つ
のオリゴを設計した。その結果として得られたオリゴヌ
クレオチドの配列は、以下のようなものである:5′−
CAAGCTGCCAAGTACGGTGGATTCT
TGAAGCAGCACCAAC−3′
【0131】配列中のその位置は図10に示されてい
る。
る。
【0132】遺伝子及び必要な全ての調節信号を含むの
に充分なフランキング領域を含む領域は、クローニング
ベクターpJB65内に挿入された3.5kbのBg1II
フラグメント上で含まれている(Botterman他、198
7年)。このクローンはpAT2S1Bgと呼ばれる。
突然変異誘発されるべき領域は、3.6kbのBg1IIフ
ラグメント内で1kbのHindIIIフラグメント上で含まれ
ており、この比較的小さいフラグメントは、Stanssens
他(1987年)のpMa5−8ベクターのHindIII部
位内に挿入される(図7)。非対称のNdeIを用いて
方向性をチェックする(図10)。突然変異誘発は、例
1のステップ3に記されている戦略そのものを用いて行
なわれる。その後、標準的な技法(Maniatis他、198
2年)を用いて、雑種遺伝子を、突然変異誘発されたも
のを伴うより大きいフラグメント内に再度挿入する。再
びNdeI部位を用いて方向性をチェックする。
に充分なフランキング領域を含む領域は、クローニング
ベクターpJB65内に挿入された3.5kbのBg1II
フラグメント上で含まれている(Botterman他、198
7年)。このクローンはpAT2S1Bgと呼ばれる。
突然変異誘発されるべき領域は、3.6kbのBg1IIフ
ラグメント内で1kbのHindIIIフラグメント上で含まれ
ており、この比較的小さいフラグメントは、Stanssens
他(1987年)のpMa5−8ベクターのHindIII部
位内に挿入される(図7)。非対称のNdeIを用いて
方向性をチェックする(図10)。突然変異誘発は、例
1のステップ3に記されている戦略そのものを用いて行
なわれる。その後、標準的な技法(Maniatis他、198
2年)を用いて、雑種遺伝子を、突然変異誘発されたも
のを伴うより大きいフラグメント内に再度挿入する。再
びNdeI部位を用いて方向性をチェックする。
【0133】3.植物の形質転換 雑種遺伝子ならびに、遺伝子調節のための適当な信号が
確かに存在するようにするためのコード付け領域に対す
る充分なフランキング配列(5′と3′の両方)を含ん
でいるBa1IIフラグメントを、例1において用いられ
ているのと同じ二元性ベクターpGSC1702のBa
mHI部位内に挿入する(図14)。このベクターにつ
いては、例1の第4節に記されている。タバコの形質転
換はまさにそこに記述されているとおりに行なわれる。
Arabidopsis thaliana及びBrassica hapusの形質転換
は、同じベクター内で全く同じ構成が用いられうるよう
なものである。例1の第4節に記されているようにアグ
ロバクテリウム・ツメファシエンスに対する授動の後、
それぞれArabidopsis及びBrassicaの形質転換のため
に、Llyod他(1986年)及びklimaszewska他(19
85年)の手順を用いる。各々の場合において、タバコ
についてと同様、カルスを100μg/mlのカナマイシン
上で選択し、耐性あるカルスを植物の再生に用いること
ができる。このような植物から調製されたDNAを、突
然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドとの交雑に
より、雑種遺伝子の存在についてチェックする(タバコ
及びBrassicaの場合、雑種構成の比較的大きい部分を用
いることができるが、Arabidopsisの場合、
これらは内生の遺伝子と交雑する)。
確かに存在するようにするためのコード付け領域に対す
る充分なフランキング配列(5′と3′の両方)を含ん
でいるBa1IIフラグメントを、例1において用いられ
ているのと同じ二元性ベクターpGSC1702のBa
mHI部位内に挿入する(図14)。このベクターにつ
いては、例1の第4節に記されている。タバコの形質転
換はまさにそこに記述されているとおりに行なわれる。
Arabidopsis thaliana及びBrassica hapusの形質転換
は、同じベクター内で全く同じ構成が用いられうるよう
なものである。例1の第4節に記されているようにアグ
ロバクテリウム・ツメファシエンスに対する授動の後、
それぞれArabidopsis及びBrassicaの形質転換のため
に、Llyod他(1986年)及びklimaszewska他(19
85年)の手順を用いる。各々の場合において、タバコ
についてと同様、カルスを100μg/mlのカナマイシン
上で選択し、耐性あるカルスを植物の再生に用いること
ができる。このような植物から調製されたDNAを、突
然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドとの交雑に
より、雑種遺伝子の存在についてチェックする(タバコ
及びBrassicaの場合、雑種構成の比較的大きい部分を用
いることができるが、Arabidopsisの場合、
これらは内生の遺伝子と交雑する)。
【0134】本発明の実施態様において、雑種遺伝子な
らびに、遺伝子調節のための適切な信号が必ず存在する
ようにするのに充分なコード付け領域に対するフランキ
ング配列(5′及び3′の両方)を含むBa1IIフラ
グメントは、二元性ベクターpGSC1703(図1
7)又はpGSC1703A(図18)のBg1II部位
内に挿入される。pGSC1703は、大腸菌及びアグ
ロバクテリウムの両方における選択のための官能基、な
らびに外来性DNAの植物ゲノム内への転移を可能にす
るT−DNAフラグメントを含んでいる(Deblaere他、
1987年)。これにはさらに、ネオマイシンフォスフ
ォトランスフェラーゼタンパク質コード付け領域(NP
TII)及びocs遺伝子の3′末端基を伴う両方向性プ
ロモータTR(Velten他、1984年)が含まれてい
る。これには、pGSC1702のようにアンピシリン
耐性をコード付けする遺伝子は含まれておらず、そのた
め、感染段階の後アグロバクテリウムを殺すのにカルベ
ニシリンならびにクラフォランを用いることができる。
ベクターpGSC1703Aは、ハイグロマイシントラ
ンスフェラーゼをコード付けする付加的な遺伝子と共
に、ベクターpGSC1703と同じ官能基を含んでい
る。このためカナマイシン及びハイグロマイシンの両方
について形質転換体を選択することが可能である。タバ
コの形質転換は、例1の第4節に記されているとおりに
行なわれ、こうして雑種遺伝子は、植物形質転換ベクタ
ーpGS1703内に挿入される。Arabidopsis thalia
na及びBrassicanapusの形質転換は、その中に雑種AT
2S1遺伝子が挿入されたpGSC1703Aを用いて
行なわれた。プラスミドpMP90をもつアグロバクテ
リウム・ツメファシエンスC58C1Rifへの授動の
後(Koncz & Schell、1986年)、(なおこのプラ
スミドは、in trans及びvir遺伝子官能基を与えるが
アンピシリン耐性をコード付けする遺伝子は有していな
い)、それぞれArabidopsis及びBrassicaを形質転換す
るためにLyoyd他(1986年)及びKlimaszewska他
(1985年)の手順が用いられる。同時培養が起こっ
た後アグロバクテリウムを殺すためにカルベニシリンを
用いる。各々の場合において、タバコの場合と同様に、
カルスを100μg/mlのカナマイシン上で選択し、耐性
あるカルスを植物の再生のために用いることができる。
このような植物から調製されたDNAを、突然変異誘発
において用いられたオリゴヌクレオチドとの交雑によ
り、雑種遺伝子の存在についてチェックする。(タバコ
の場合、雑種構成の比較的大きい部分を用いることがで
きるが、Brassica及びArabiodopsisの場合、これらは、
内生の遺伝子と交雑する)
らびに、遺伝子調節のための適切な信号が必ず存在する
ようにするのに充分なコード付け領域に対するフランキ
ング配列(5′及び3′の両方)を含むBa1IIフラ
グメントは、二元性ベクターpGSC1703(図1
7)又はpGSC1703A(図18)のBg1II部位
内に挿入される。pGSC1703は、大腸菌及びアグ
ロバクテリウムの両方における選択のための官能基、な
らびに外来性DNAの植物ゲノム内への転移を可能にす
るT−DNAフラグメントを含んでいる(Deblaere他、
1987年)。これにはさらに、ネオマイシンフォスフ
ォトランスフェラーゼタンパク質コード付け領域(NP
TII)及びocs遺伝子の3′末端基を伴う両方向性プ
ロモータTR(Velten他、1984年)が含まれてい
る。これには、pGSC1702のようにアンピシリン
耐性をコード付けする遺伝子は含まれておらず、そのた
め、感染段階の後アグロバクテリウムを殺すのにカルベ
ニシリンならびにクラフォランを用いることができる。
ベクターpGSC1703Aは、ハイグロマイシントラ
ンスフェラーゼをコード付けする付加的な遺伝子と共
に、ベクターpGSC1703と同じ官能基を含んでい
る。このためカナマイシン及びハイグロマイシンの両方
について形質転換体を選択することが可能である。タバ
コの形質転換は、例1の第4節に記されているとおりに
行なわれ、こうして雑種遺伝子は、植物形質転換ベクタ
ーpGS1703内に挿入される。Arabidopsis thalia
na及びBrassicanapusの形質転換は、その中に雑種AT
2S1遺伝子が挿入されたpGSC1703Aを用いて
行なわれた。プラスミドpMP90をもつアグロバクテ
リウム・ツメファシエンスC58C1Rifへの授動の
後(Koncz & Schell、1986年)、(なおこのプラ
スミドは、in trans及びvir遺伝子官能基を与えるが
アンピシリン耐性をコード付けする遺伝子は有していな
い)、それぞれArabidopsis及びBrassicaを形質転換す
るためにLyoyd他(1986年)及びKlimaszewska他
(1985年)の手順が用いられる。同時培養が起こっ
た後アグロバクテリウムを殺すためにカルベニシリンを
用いる。各々の場合において、タバコの場合と同様に、
カルスを100μg/mlのカナマイシン上で選択し、耐性
あるカルスを植物の再生のために用いることができる。
このような植物から調製されたDNAを、突然変異誘発
において用いられたオリゴヌクレオチドとの交雑によ
り、雑種遺伝子の存在についてチェックする。(タバコ
の場合、雑種構成の比較的大きい部分を用いることがで
きるが、Brassica及びArabiodopsisの場合、これらは、
内生の遺伝子と交雑する)
【0135】4.種子からの2Sアルブミンの精製及び
付加的な処理 各種属からの陽性の植物を育てて種子をつけさせる。タ
バコの場合、これには約15週間が必要であるが、Arab
idopsis及びBrassicaについてはそれぞれ6週間及び3
カ月が必要である。異なる品種を使用すると、これらの
期間も異なりうる。種子からの2Sアルブミンの精製、
Leu−エンケファリン及び生物学的活性についての後
者の検定は、以下のように行なわれる。
付加的な処理 各種属からの陽性の植物を育てて種子をつけさせる。タ
バコの場合、これには約15週間が必要であるが、Arab
idopsis及びBrassicaについてはそれぞれ6週間及び3
カ月が必要である。異なる品種を使用すると、これらの
期間も異なりうる。種子からの2Sアルブミンの精製、
Leu−エンケファリン及び生物学的活性についての後
者の検定は、以下のように行なわれる。
【0136】Arabidopsis種子からのエンケファリンの
分離に用いられる方法 Arabidopsis 種子からエンケファリンを分離するのに2
つの方法を用いた。まず第1に、複数の個々の形質転換
体から分離された少量の種子を、キメラ2Sアルブミン
の存在についてスクリーニングした。これは、Jones他
(1985年)が記述しているように導入された遺伝子
の発現が個々の形質転換体の間で大幅に変わりうるとい
う理由から行なわれるものである。この予備的スクリー
ニングにより見られた個々の植物からの種子を用いて次
に、より多い量を分離し、収量をより正確に測定する。
両方の手順が以下に記されている。
分離に用いられる方法 Arabidopsis 種子からエンケファリンを分離するのに2
つの方法を用いた。まず第1に、複数の個々の形質転換
体から分離された少量の種子を、キメラ2Sアルブミン
の存在についてスクリーニングした。これは、Jones他
(1985年)が記述しているように導入された遺伝子
の発現が個々の形質転換体の間で大幅に変わりうるとい
う理由から行なわれるものである。この予備的スクリー
ニングにより見られた個々の植物からの種子を用いて次
に、より多い量を分離し、収量をより正確に測定する。
両方の手順が以下に記されている。
【0137】A)エンケファリン含有2Sタンパク質の
ための高速スクリーニング手順 個々の植物の種子(約50mg)を収集し、Eppendorf管
の中でこの管に合う形の小さなプラスチック製グライン
ダを用いて磨砕した。この手順では、ドライアイスは全
く用いない。結果として得られたペーストを1mlのヘプ
タンで3回抽出し、残留物を乾燥させた。粉末を1Mの
NaCl 0.2ml中で懸濁させ、Eppendorf遠心分離機
内で5分間遠心分離した。この抽出を三回くり返し、上
澄みを組合せ、合計約0.5mlの量が得られた。この溶
液を水で20倍に希釈し、最終的に0.05MのNaC
l濃度を得た。これを一晩4℃で保存し、次にSorvall
SS−34ローターで40分間5000 rpmの速さで回
転させた。結果として得られた上澄みを、使い捨てのC
18カートリッジ上に通過させた(SEP−PAC、Mi
llipore, Milford, 米国マサチューセッツ州)。このカ
ートリッジには、5ml/分の速さでカラムを通し注射器
で10mlの上澄みを注入して装荷した。次にこのカート
リッジを、0.1%のTFA 2mlで洗い、7%、14
%、21%等々で最高70%までのアセトニトリルを含
む0.1%のTFA溶液の2ml部分で段階的に溶出する
ことによって脱着させた。28%から49%の範囲のア
セトニトリル中に溶出している分画を、異なる分画から
とったアリコートについて行なったSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル分析によって判断されるように、2Sアル
ブミンについて富化する。2Sアルブミン含有分画を組
合わせ、Speed Vac濃縮器(Savant Instruments)内で
乾燥させた。
ための高速スクリーニング手順 個々の植物の種子(約50mg)を収集し、Eppendorf管
の中でこの管に合う形の小さなプラスチック製グライン
ダを用いて磨砕した。この手順では、ドライアイスは全
く用いない。結果として得られたペーストを1mlのヘプ
タンで3回抽出し、残留物を乾燥させた。粉末を1Mの
NaCl 0.2ml中で懸濁させ、Eppendorf遠心分離機
内で5分間遠心分離した。この抽出を三回くり返し、上
澄みを組合せ、合計約0.5mlの量が得られた。この溶
液を水で20倍に希釈し、最終的に0.05MのNaC
l濃度を得た。これを一晩4℃で保存し、次にSorvall
SS−34ローターで40分間5000 rpmの速さで回
転させた。結果として得られた上澄みを、使い捨てのC
18カートリッジ上に通過させた(SEP−PAC、Mi
llipore, Milford, 米国マサチューセッツ州)。このカ
ートリッジには、5ml/分の速さでカラムを通し注射器
で10mlの上澄みを注入して装荷した。次にこのカート
リッジを、0.1%のTFA 2mlで洗い、7%、14
%、21%等々で最高70%までのアセトニトリルを含
む0.1%のTFA溶液の2ml部分で段階的に溶出する
ことによって脱着させた。28%から49%の範囲のア
セトニトリル中に溶出している分画を、異なる分画から
とったアリコートについて行なったSDS−ポリアクリ
ルアミドゲル分析によって判断されるように、2Sアル
ブミンについて富化する。2Sアルブミン含有分画を組
合わせ、Speed Vac濃縮器(Savant Instruments)内で
乾燥させた。
【0138】組合わされた分画を水中1%TFA 0.
95ml内で再構成させ、HV−4Millexフィルター(Mi
llipore)を通してろ過し、長さ25cm直径0.46cmの
逆相C4カラムを適用した(Vydac214 TP54、気孔
径300オングストローム、粒径5μm)。HPLC機
器は、2台のポンプ(510型)、1台の勾配制御装置
(680型)そして1台のLC分光検知器(Lamda-Max
481型、全て米国マサチューセッツ州、MilfordのWat
ers社からのもの)で構成されていた。勾配は、以下の
ように実行した:すなわち、溶液Aは、H2O中0.1
%のTFAであり、溶液Bは70%のCH3CN中0.
1%のTFAであった。5分間、B0%A100%の溶
液をカラム上に流し、その後Bの濃度を70分にわたり
線形的に100%にまで上昇させていった。214nmの
吸収度によりカラムの溶出物を検出した。2Sアルブミ
ンを含む分画を収集し、Speed Vac濃縮器内で乾燥させ
た。
95ml内で再構成させ、HV−4Millexフィルター(Mi
llipore)を通してろ過し、長さ25cm直径0.46cmの
逆相C4カラムを適用した(Vydac214 TP54、気孔
径300オングストローム、粒径5μm)。HPLC機
器は、2台のポンプ(510型)、1台の勾配制御装置
(680型)そして1台のLC分光検知器(Lamda-Max
481型、全て米国マサチューセッツ州、MilfordのWat
ers社からのもの)で構成されていた。勾配は、以下の
ように実行した:すなわち、溶液Aは、H2O中0.1
%のTFAであり、溶液Bは70%のCH3CN中0.
1%のTFAであった。5分間、B0%A100%の溶
液をカラム上に流し、その後Bの濃度を70分にわたり
線形的に100%にまで上昇させていった。214nmの
吸収度によりカラムの溶出物を検出した。2Sアルブミ
ンを含む分画を収集し、Speed Vac濃縮器内で乾燥させ
た。
【0139】プロテアーゼでのより完全な消化を得るた
めには、過ギ酸でジスルフィドブリッジを酸化させるこ
とによりタンパク質を変性することが勧められる。この
ことは、9mlのギ酸と1mlの30%H2O2を室温で混合
して作った溶液を0.5ml加えて行なわれる。この溶液
は、使用より2時間前に作られた。0℃で30分反応を
進ませ、Speed Vac濃縮器内での乾燥で終らせた。微量
の残留ギ酸は、水500μlを2度加え、標本を凍結乾
燥させることによって除去した。
めには、過ギ酸でジスルフィドブリッジを酸化させるこ
とによりタンパク質を変性することが勧められる。この
ことは、9mlのギ酸と1mlの30%H2O2を室温で混合
して作った溶液を0.5ml加えて行なわれる。この溶液
は、使用より2時間前に作られた。0℃で30分反応を
進ませ、Speed Vac濃縮器内での乾燥で終らせた。微量
の残留ギ酸は、水500μlを2度加え、標本を凍結乾
燥させることによって除去した。
【0140】残渣をpH8.5の0.1MのTris−H
Cl 0.75ml中に再度溶解させ、その後4μgのTP
CK処理されたトリプシン(Worthington)を加えた。
反応を3時間37℃で放置し、その後TFA 10μlを
加えて終結させ、分析に先立ち−20℃で保存した。結
果として得られたペプチド混合物を、前述の勾配混合物
及びカラムを用いてHPLCで分離させる。標準とし
て、期待されるものと同じ配列(YGGFLK)のペプ
チドを、標準的な技術を用いてBiolynx4175ペプチ
ド合成装置(LKB)で合成した。このペプチドをカラ
ム上に流し、保持時間を測定した。次に同じカラム上
で、トリプシン消化物から得られたペプチドの混合物を
装荷し、標準と同じ保持時間のペプチドを収集し、乾燥
し、C18−逆相カラム上に再度装荷した。標識ペプチ
ドの溶出時間はここでも、エンケファリン含有ペプチド
の正しい位置についての基準として役立った。アミノ酸
配列づけによってこのペプチドの同一性を確認し、又こ
れによって大方の定量を行なうこともできた。分析され
た6つの形質転換体のうち4つの植物が有効量のLeu
−エンケファリンを含んでいることがわかった。例とし
て、これらの4つの植物のうちの1つについての詳しい
分析及び処理段階が以下に示されている。
Cl 0.75ml中に再度溶解させ、その後4μgのTP
CK処理されたトリプシン(Worthington)を加えた。
反応を3時間37℃で放置し、その後TFA 10μlを
加えて終結させ、分析に先立ち−20℃で保存した。結
果として得られたペプチド混合物を、前述の勾配混合物
及びカラムを用いてHPLCで分離させる。標準とし
て、期待されるものと同じ配列(YGGFLK)のペプ
チドを、標準的な技術を用いてBiolynx4175ペプチ
ド合成装置(LKB)で合成した。このペプチドをカラ
ム上に流し、保持時間を測定した。次に同じカラム上
で、トリプシン消化物から得られたペプチドの混合物を
装荷し、標準と同じ保持時間のペプチドを収集し、乾燥
し、C18−逆相カラム上に再度装荷した。標識ペプチ
ドの溶出時間はここでも、エンケファリン含有ペプチド
の正しい位置についての基準として役立った。アミノ酸
配列づけによってこのペプチドの同一性を確認し、又こ
れによって大方の定量を行なうこともできた。分析され
た6つの形質転換体のうち4つの植物が有効量のLeu
−エンケファリンを含んでいることがわかった。例とし
て、これらの4つの植物のうちの1つについての詳しい
分析及び処理段階が以下に示されている。
【0141】B)Arabidopsis種子からのエンケファリ
ンのさらに大規模な分離及び処理 磨砕及び初期抽出 前記植物からの2.11gの種子をドライアイス内でモ
ルタルの中でグラインディングした。5mlのヘプタンで
三回抽出することによって結果として得られた粉末から
脂質を除去した。結果として得られた残渣を乾燥した。
ンのさらに大規模な分離及び処理 磨砕及び初期抽出 前記植物からの2.11gの種子をドライアイス内でモ
ルタルの中でグラインディングした。5mlのヘプタンで
三回抽出することによって結果として得られた粉末から
脂質を除去した。結果として得られた残渣を乾燥した。
【0142】タンパク質の抽出 粉末を約4mlの1.0M NaCl内に溶かした。結果と
して得られたペーストをSS−34ローター内で175
00rpmの速さで40分間回転させた。各回転の後に、
上澄みを新しい試験管内に移し、ペレットを再び4mlの
1.0M NaCl中に懸濁させた。この手順を三度くり
返した。0.45μmのフィルター(HA,Millipore)に
3回の上澄み(計12ml)を通した。
して得られたペーストをSS−34ローター内で175
00rpmの速さで40分間回転させた。各回転の後に、
上澄みを新しい試験管内に移し、ペレットを再び4mlの
1.0M NaCl中に懸濁させた。この手順を三度くり
返した。0.45μmのフィルター(HA,Millipore)に
3回の上澄み(計12ml)を通した。
【0143】ゲルろ過による2Sアルブミンの分離 前段階からの溶液12mlを6mlのバッチ2つに分けてSe
phadexG−50媒質(Pharmacia)上を通過させた。カラ
ムは、直径2.5cm、長さ100cmで0.5MのNaC
l中毎時約27mlの流量で作動した。約7mlの分画を収
集した。この分画を次の2つの方法でタンパク質につい
て監視した。すなわち、まず第一に、鉛筆で分画番号を
表わしたWhatman 3MMペーパー片に各分画を10μl
適用することにより、合計タンパク質を検出した。暖気
の中で斑点を乾燥させ、10%のTCA溶液中にペーパ
ーをすばやく浸して(30秒)タンパク質を定着させ
た。次に紙片を、ポリアクリルアミドゲル染色に用いら
れるものと類似したCommassie Blue溶液へと移す。1分
後、ペーパーをとり出し水道水で洗う。タンパク質を含
む分画は、白の地に青の斑点を示す。この技術の最小検
出限界は、約0.05mg/mlである。これらのタンパク
質含有分画を、7ml分画2μlを10μlの標本緩衝液に
加え次に17.5%のポリアクリルアミドのミニゲル上
にこの混合物6μlを装荷することによって、2Sアル
ブミンの存在について検定した。2Sアルブミンを含む
ことがわかった分画をプールしておいた。プールした分
画の合計量は175mlであった。
phadexG−50媒質(Pharmacia)上を通過させた。カラ
ムは、直径2.5cm、長さ100cmで0.5MのNaC
l中毎時約27mlの流量で作動した。約7mlの分画を収
集した。この分画を次の2つの方法でタンパク質につい
て監視した。すなわち、まず第一に、鉛筆で分画番号を
表わしたWhatman 3MMペーパー片に各分画を10μl
適用することにより、合計タンパク質を検出した。暖気
の中で斑点を乾燥させ、10%のTCA溶液中にペーパ
ーをすばやく浸して(30秒)タンパク質を定着させ
た。次に紙片を、ポリアクリルアミドゲル染色に用いら
れるものと類似したCommassie Blue溶液へと移す。1分
後、ペーパーをとり出し水道水で洗う。タンパク質を含
む分画は、白の地に青の斑点を示す。この技術の最小検
出限界は、約0.05mg/mlである。これらのタンパク
質含有分画を、7ml分画2μlを10μlの標本緩衝液に
加え次に17.5%のポリアクリルアミドのミニゲル上
にこの混合物6μlを装荷することによって、2Sアル
ブミンの存在について検定した。2Sアルブミンを含む
ことがわかった分画をプールしておいた。プールした分
画の合計量は175mlであった。
【0144】分離された2Sアルブミンの脱塩 これは、長さ25cm、直径0.46cmのC4カラム上で
HPLCによって行なった(Vydac214 TP54、気孔
径300オングストローム、粒径5μm)。HPLC装
置は、2台のポンプ(510型)、勾配制御装置(68
0型)及びLC分光検出器(Lamda-Max481型、全て
米国マサチューセッツ州、MilfordのWaters社のもの)
で構成されていた。各々3.5mlずつ6回にわけてこの
システムに175mlのうち21mlを装荷した。勾配は以
下のように実行した:すなわち、溶液AはH2O中の
0.1%TFAであり、溶液Bは70%CH3CN中の
0.1%TFAであった。5分間0%のBと100%の
Aをカラム上に流し、その後Bの濃度を70分にわたっ
て線形に100%まで上昇させた。各回共その間に2S
アルブミンの分画を収集し、6回全てが終了した時点で
これらの分画をプールして3本の試験管に分けてとり、
従ってこれらの試験管の各々には2.11gの種子から
の2Sアルブミンが7/175入っていた。さらに別々
にアリコートの各々を処理し、収量の量的評価のために
使用した。
HPLCによって行なった(Vydac214 TP54、気孔
径300オングストローム、粒径5μm)。HPLC装
置は、2台のポンプ(510型)、勾配制御装置(68
0型)及びLC分光検出器(Lamda-Max481型、全て
米国マサチューセッツ州、MilfordのWaters社のもの)
で構成されていた。各々3.5mlずつ6回にわけてこの
システムに175mlのうち21mlを装荷した。勾配は以
下のように実行した:すなわち、溶液AはH2O中の
0.1%TFAであり、溶液Bは70%CH3CN中の
0.1%TFAであった。5分間0%のBと100%の
Aをカラム上に流し、その後Bの濃度を70分にわたっ
て線形に100%まで上昇させた。各回共その間に2S
アルブミンの分画を収集し、6回全てが終了した時点で
これらの分画をプールして3本の試験管に分けてとり、
従ってこれらの試験管の各々には2.11gの種子から
の2Sアルブミンが7/175入っていた。さらに別々
にアリコートの各々を処理し、収量の量的評価のために
使用した。
【0145】トリプシン消化物 トリプシンでの消化に先立ち、3つのアリコートを上述
の要領で酸化させた。トリプシン消化は、基本的に上述
のように行なった。各アリコートに0.95mlの0.1
M Tris−HCl、pH8.5を付加し、これに50μ
gのトリプシン(Worthington)を補足して、37℃で4
時間反応させた。
の要領で酸化させた。トリプシン消化は、基本的に上述
のように行なった。各アリコートに0.95mlの0.1
M Tris−HCl、pH8.5を付加し、これに50μ
gのトリプシン(Worthington)を補足して、37℃で4
時間反応させた。
【0146】YGGFLKペプチドの分離 カルボキシル末端残基を含むエンケファリンペプチドを
2つの連続したHPLC段階を用いて分離した。上記小
規模分離手順内に説明されているように、期待されてい
るものと同じ配列のペプチドを合成し、上述の脱塩段階
で記されているのと同じカラム及び勾配条件を用いてH
PLCシステム上に流した。合成ペプチドの保持時間を
測定した(図19のA図)。次に3つのトリプシン消化
物を(別々に)同じカラム上に装荷し、合成ペプチドを
同じ保持時間の材料を収集し(図19のB図斜線の部
分)、乾燥させた。次に、C18カラム(25×0.4
6cm、Vydac218 TP104材料、気孔径300オング
ストローム、粒径10μm)を用いたことを除いて同じ
装置及び勾配を用い同じ手順に従った。ここでも、合成
ペプチドと同じ保持時間の材料を収集した(図20のA
図及び図20のB図)。この結果、各々合計2Sアルブ
ミンの7/175から誘導された3つの調製物が得られ
た。
2つの連続したHPLC段階を用いて分離した。上記小
規模分離手順内に説明されているように、期待されてい
るものと同じ配列のペプチドを合成し、上述の脱塩段階
で記されているのと同じカラム及び勾配条件を用いてH
PLCシステム上に流した。合成ペプチドの保持時間を
測定した(図19のA図)。次に3つのトリプシン消化
物を(別々に)同じカラム上に装荷し、合成ペプチドを
同じ保持時間の材料を収集し(図19のB図斜線の部
分)、乾燥させた。次に、C18カラム(25×0.4
6cm、Vydac218 TP104材料、気孔径300オング
ストローム、粒径10μm)を用いたことを除いて同じ
装置及び勾配を用い同じ手順に従った。ここでも、合成
ペプチドと同じ保持時間の材料を収集した(図20のA
図及び図20のB図)。この結果、各々合計2Sアルブ
ミンの7/175から誘導された3つの調製物が得られ
た。
【0147】これらの3つのアリコートの1つにある材
料の1/20を用いて、分離されたペプチドの配列をチ
ェックした。これは、Applied Biosystems Inc.(U.S.
A.) の470A気相シークエネーター(sequena-tor)を
用いた自動気相配列決定によって確認された。段階的に
遊離されたフェニルチオヒダントイン(PTH)アミノ
酸誘導体をオンラインPTHアミノ酸分析器(Applied
Biosystems Inc. 120A)で分析した。シークエネー
ター(sequenator)及びPTH分析器は、製造業者の指
示に従って作動させた。サイクル1から6までの遊離さ
れたPTHアミノ酸のHPLCクロマトグラムが、図2
1に示されている。配列は、予想どおりYGGFLKで
あった。この中間ペプチドの収量を計算するのには、第
1のサイクルのPTHアミノ酸の収量を用いた(種子1
グラムあたり251〜277nmol)。
料の1/20を用いて、分離されたペプチドの配列をチ
ェックした。これは、Applied Biosystems Inc.(U.S.
A.) の470A気相シークエネーター(sequena-tor)を
用いた自動気相配列決定によって確認された。段階的に
遊離されたフェニルチオヒダントイン(PTH)アミノ
酸誘導体をオンラインPTHアミノ酸分析器(Applied
Biosystems Inc. 120A)で分析した。シークエネー
ター(sequenator)及びPTH分析器は、製造業者の指
示に従って作動させた。サイクル1から6までの遊離さ
れたPTHアミノ酸のHPLCクロマトグラムが、図2
1に示されている。配列は、予想どおりYGGFLKで
あった。この中間ペプチドの収量を計算するのには、第
1のサイクルのPTHアミノ酸の収量を用いた(種子1
グラムあたり251〜277nmol)。
【0148】エンケファリンからの余分なリジンの除去 前段階の結果得られた3つのアリコートをpH8.5の
0.2MのN−エチルモルフォリン100μl中に再度懸
濁させ(ベルギー、Janssen Chimica)、各々の3分の
1を37℃で0.2μgのカルボキシペプチダーゼB(B
oehringer Manheim、配列決定グレード)で処理した。
3つのアリコートをそれぞれ5分、12分及び17分間
処理したが、3つの消化物は全て同等に有効であること
がわかった。消化の後、上記脱塩の項で記されているも
のと同じ装置、カラム及び勾配を用いてHPLCによっ
てエンケファリンを精製した。
0.2MのN−エチルモルフォリン100μl中に再度懸
濁させ(ベルギー、Janssen Chimica)、各々の3分の
1を37℃で0.2μgのカルボキシペプチダーゼB(B
oehringer Manheim、配列決定グレード)で処理した。
3つのアリコートをそれぞれ5分、12分及び17分間
処理したが、3つの消化物は全て同等に有効であること
がわかった。消化の後、上記脱塩の項で記されているも
のと同じ装置、カラム及び勾配を用いてHPLCによっ
てエンケファリンを精製した。
【0149】アミノ酸分析を行なうことにより、エンケ
ファリンの最終的収量を決定した。上述の3つのアリコ
ートの合計量の1/150にあたるアリコートを6N H
Cl、0.05%フェノール400μlの中で110℃
で24時間加水分解した。加水分解産物を乾燥させ、ア
ミノ酸をフェニルチオカルバモイル(PTC)残基に誘
導体合成した(Bildingmeyer他、1984年)。PIC
O−TAGアミノ酸分析システム(米国マサチューセッ
ツ州 Milford Millipore, Waters社)を用いて数量化し
た。内標準としてアルファアミノブチル酸を用いて3つ
の標本の各々についてエンケファリンペプチドの収量を
計算した。3つの測定値の平均に基づき、種子1gあた
り206nmolのエンケファリンという最終収量を計算し
た。
ファリンの最終的収量を決定した。上述の3つのアリコ
ートの合計量の1/150にあたるアリコートを6N H
Cl、0.05%フェノール400μlの中で110℃
で24時間加水分解した。加水分解産物を乾燥させ、ア
ミノ酸をフェニルチオカルバモイル(PTC)残基に誘
導体合成した(Bildingmeyer他、1984年)。PIC
O−TAGアミノ酸分析システム(米国マサチューセッ
ツ州 Milford Millipore, Waters社)を用いて数量化し
た。内標準としてアルファアミノブチル酸を用いて3つ
の標本の各々についてエンケファリンペプチドの収量を
計算した。3つの測定値の平均に基づき、種子1gあた
り206nmolのエンケファリンという最終収量を計算し
た。
【0150】最終的に得られたペプチドの同一性は三つ
の方法で確認された。まず第一に、そのアミノ酸組成で
あり、これは、Gly、1.76;Tyr、1.00;
Leu、1.15及びPhe、1.02の分子比を示し
ていた。第2に、その逆相HPLCカラム上での保持時
間は、基準エンケファリンペプチドのものと一致してお
り(図22)、最後に、そのアミノ酸配列が決定され
た。これらの基準は、明確に、キメラ2Sアルブミンか
ら分離されたペプチドをLeu−エンケファリンである
ものとして識別している。
の方法で確認された。まず第一に、そのアミノ酸組成で
あり、これは、Gly、1.76;Tyr、1.00;
Leu、1.15及びPhe、1.02の分子比を示し
ていた。第2に、その逆相HPLCカラム上での保持時
間は、基準エンケファリンペプチドのものと一致してお
り(図22)、最後に、そのアミノ酸配列が決定され
た。これらの基準は、明確に、キメラ2Sアルブミンか
ら分離されたペプチドをLeu−エンケファリンである
ものとして識別している。
【0151】例III 上述の方法の第3の例として、2つの成長ホルモン放出
因子(GHRF)の類似体の生成のための手順が与えら
れる。位置27におけるメチオニンがロイシンにより置
換され、カルボキシル末端基がさまざまな方法で変更さ
れているか又は4つのアミノ酸が短縮されてさえいるよ
うな当初分離された44のアミノ酸ペプチド(Guillemi
n他、1982年)の合成及び天然の類似体は、活性で
あることが示された(Kempe他、1986年;Rivier
他、1982年)。この場合、以下GHRFL及びGH
RFSと呼称される2つの類似体が生成される。両方の
場合共、位置27にメチオニンの代りにロイシンの置換
を取り込んでいる。GHRFLは、ペプチドの天然形態
においてみられるようにカルボキシル末端基がLeu−
NH2であるような形で生成される(Guillemin他、19
82年)。GHRFSはArg−Hse−NH2で終
る。ここでHseはホモセリンを意味する。この類似体
は、生物学的に活性であることがKempe他(1986
年)により示されている。両方の類似体は共に、2Sア
ルブミン内でメチオニンコドンを側面に有しており、そ
のためCnBrでの処理によって開裂されうる。このこ
とはいずれの類似体も内部メチオニンを含んでいないこ
とから可能なのである。HPLC技術を用いた2つのペ
プチドの分離の後、これらは化学的に修飾されて、その
結果Leu−NH2及びArg−Hse−NH2 カルボ
キシル末端が得られる。
因子(GHRF)の類似体の生成のための手順が与えら
れる。位置27におけるメチオニンがロイシンにより置
換され、カルボキシル末端基がさまざまな方法で変更さ
れているか又は4つのアミノ酸が短縮されてさえいるよ
うな当初分離された44のアミノ酸ペプチド(Guillemi
n他、1982年)の合成及び天然の類似体は、活性で
あることが示された(Kempe他、1986年;Rivier
他、1982年)。この場合、以下GHRFL及びGH
RFSと呼称される2つの類似体が生成される。両方の
場合共、位置27にメチオニンの代りにロイシンの置換
を取り込んでいる。GHRFLは、ペプチドの天然形態
においてみられるようにカルボキシル末端基がLeu−
NH2であるような形で生成される(Guillemin他、19
82年)。GHRFSはArg−Hse−NH2で終
る。ここでHseはホモセリンを意味する。この類似体
は、生物学的に活性であることがKempe他(1986
年)により示されている。両方の類似体は共に、2Sア
ルブミン内でメチオニンコドンを側面に有しており、そ
のためCnBrでの処理によって開裂されうる。このこ
とはいずれの類似体も内部メチオニンを含んでいないこ
とから可能なのである。HPLC技術を用いた2つのペ
プチドの分離の後、これらは化学的に修飾されて、その
結果Leu−NH2及びArg−Hse−NH2 カルボ
キシル末端が得られる。
【0152】2つのGHRF類似体及びCnBr開裂部
位をコード付けする1組の合成オリゴヌクレオチドは、
Arabidopsis thalianaの2Sアルブミンをコード付けす
るゲノミッククローン内の超可変領域全体について置換
される。6番目及び7番目のシステイン残基に隣接する
いくつかのアミノ酸のみが残った。このキメラ遺伝子
は、その天然のプロモータ及びシグナルペプチドの制御
下にある。そのプロセス及び構造は、図23及び図24
に図式的に示されている。構成全体を、アグロバクテリ
ウムを媒介とする形質転換システムを用いてタバコ、Ar
abidopsis thaliana及びBrassica napusへと移入(転
移)させる。植物を再生させ、開花後に種子を収集し
て、2Sアルブミンを精製する。GHRFペプチドを、
CnBrを用いて2Sアルブミンから開裂させ、(なお
この開裂部位はオリゴヌクレオチド内に組込まれてい
る)、次にHPLC技術を用いて回収する。
位をコード付けする1組の合成オリゴヌクレオチドは、
Arabidopsis thalianaの2Sアルブミンをコード付けす
るゲノミッククローン内の超可変領域全体について置換
される。6番目及び7番目のシステイン残基に隣接する
いくつかのアミノ酸のみが残った。このキメラ遺伝子
は、その天然のプロモータ及びシグナルペプチドの制御
下にある。そのプロセス及び構造は、図23及び図24
に図式的に示されている。構成全体を、アグロバクテリ
ウムを媒介とする形質転換システムを用いてタバコ、Ar
abidopsis thaliana及びBrassica napusへと移入(転
移)させる。植物を再生させ、開花後に種子を収集し
て、2Sアルブミンを精製する。GHRFペプチドを、
CnBrを用いて2Sアルブミンから開裂させ、(なお
この開裂部位はオリゴヌクレオチド内に組込まれてい
る)、次にHPLC技術を用いて回収する。
【0153】Arabidopsis thaliana2Sアルブミン遺伝
子のクローニング Arabidopsis thaliana 遺伝子は、例IIに示されている事
項に従ってクローニングされた(Krebbers他、1988
年も参照のこと)。すでに公式の記録に載っているよう
に、この遺伝子を含むプラスミドはpAT2S1と呼ば
れる。AT2S1と呼ばれる、この遺伝子を含む領域の
配列は、図15に示されている。
子のクローニング Arabidopsis thaliana 遺伝子は、例IIに示されている事
項に従ってクローニングされた(Krebbers他、1988
年も参照のこと)。すでに公式の記録に載っているよう
に、この遺伝子を含むプラスミドはpAT2S1と呼ば
れる。AT2S1と呼ばれる、この遺伝子を含む領域の
配列は、図15に示されている。
【0154】2.AT2S1遺伝子の超可変領域の欠失
及びAccI部位による置換 AT2S1の超可変領域の一部分は、以下のオリゴヌク
レオチドと置換される: 5′−CCA ACC TTG AAA GGT P T L K GATA C AC TTG CCC AAC−3′30−mer I H L P N
及びAccI部位による置換 AT2S1の超可変領域の一部分は、以下のオリゴヌク
レオチドと置換される: 5′−CCA ACC TTG AAA GGT P T L K GATA C AC TTG CCC AAC−3′30−mer I H L P N
【0155】なおここで下線の配列は、AccI部位を
表わし、周囲の配列は、保持されるべきArabidopsis2
Sアルブミン遺伝子の超可変領域のコード付け配列に対
し相補的な配列である。この結果、最終的に、オリゴヌ
クレオチドの下に記されているアミノ酸配列が得られ
る。
表わし、周囲の配列は、保持されるべきArabidopsis2
Sアルブミン遺伝子の超可変領域のコード付け配列に対
し相補的な配列である。この結果、最終的に、オリゴヌ
クレオチドの下に記されているアミノ酸配列が得られ
る。
【0156】AT2S1の超可変領域をコード付けする
配列の一部分の欠失及び置換は、プライマーとしてオリ
ゴヌレクオチドを用い、部位指向性突然変異誘発を使っ
て行なわれる。例Iに示されているように、Stanssens
他(1987年)のシステムが用いられる。
配列の一部分の欠失及び置換は、プライマーとしてオリ
ゴヌレクオチドを用い、部位指向性突然変異誘発を使っ
て行なわれる。例Iに示されているように、Stanssens
他(1987年)のシステムが用いられる。
【0157】このプロセスの個々の段階は、以下のとお
りである。 − AT2S1遺伝子のコード付け領域を含むpAT2
S1のHindIIIフラグメントのpMa5−8へのクロー
ニング(I)。このベクターはCmR遺伝子内でアンバ
ー突然変異を続行し、アンピシリン耐性を規定する。こ
の結果得られるプラスミドは、pMacAT2S1と呼
称される(図23、ステップ1を参照); − 偽ウイルス粒子からのこの組換え体の一本鎖DNA
の調製(II); − 相補性pMc型プラスミドからのHindIII制限フラ
グメントの調製(III)。pMc型のベクターは、Ap
耐性標識内にアンバー突然変異が取り込まれている一方
で、野生型CmR遺伝子を含んでいる; − 試験管内DNA/DNA交雑による間隙二本鎖DN
A(以下gdDNAと呼ぶ)の構成(IV)。gdDNA
において、標的配列は一本鎖DNAとして露出されてい
る。交雑混合物のその他の構成成分からのgdDNAの
予備的な精製は不要である; − gdDNAへの30−mer合成オリゴヌクレオチ
ドのアニーリング(V)。 − 同時試験管内klenowDNAポリメラーゼI/DNA
リガーゼ反応による、残りの一本鎖間隙の充てんとニッ
クのシーリング(VI); − Cm耐性について選択する、mutS宿主すなわち
ミスマッチ修復における欠失菌株の形質転換;この結
果、混合プラスミド後代が生成される(VII)。 − アンバー突然変異を抑制することのできない宿主の
再形質転換による鋳型ストランド(pMa−型)から誘
導される後代の除去(VIII)。Cm耐性に関する選択の
結果、間隙あるストランドすなわちその中に突然変異誘
発オリゴヌクレオチドが取り込まれているストランドか
ら誘導された後代が豊富になる; − 望ましい突然変異の存在に関する、再形質転換の結
果として得られたクローンのスクリーニング。結果とし
て得られるAT2S1の欠失した超可変領域を含むプラ
スミドはpMacAT2S1C40と呼ばれる(図23
ステップ2を参照)。
りである。 − AT2S1遺伝子のコード付け領域を含むpAT2
S1のHindIIIフラグメントのpMa5−8へのクロー
ニング(I)。このベクターはCmR遺伝子内でアンバ
ー突然変異を続行し、アンピシリン耐性を規定する。こ
の結果得られるプラスミドは、pMacAT2S1と呼
称される(図23、ステップ1を参照); − 偽ウイルス粒子からのこの組換え体の一本鎖DNA
の調製(II); − 相補性pMc型プラスミドからのHindIII制限フラ
グメントの調製(III)。pMc型のベクターは、Ap
耐性標識内にアンバー突然変異が取り込まれている一方
で、野生型CmR遺伝子を含んでいる; − 試験管内DNA/DNA交雑による間隙二本鎖DN
A(以下gdDNAと呼ぶ)の構成(IV)。gdDNA
において、標的配列は一本鎖DNAとして露出されてい
る。交雑混合物のその他の構成成分からのgdDNAの
予備的な精製は不要である; − gdDNAへの30−mer合成オリゴヌクレオチ
ドのアニーリング(V)。 − 同時試験管内klenowDNAポリメラーゼI/DNA
リガーゼ反応による、残りの一本鎖間隙の充てんとニッ
クのシーリング(VI); − Cm耐性について選択する、mutS宿主すなわち
ミスマッチ修復における欠失菌株の形質転換;この結
果、混合プラスミド後代が生成される(VII)。 − アンバー突然変異を抑制することのできない宿主の
再形質転換による鋳型ストランド(pMa−型)から誘
導される後代の除去(VIII)。Cm耐性に関する選択の
結果、間隙あるストランドすなわちその中に突然変異誘
発オリゴヌクレオチドが取り込まれているストランドか
ら誘導された後代が豊富になる; − 望ましい突然変異の存在に関する、再形質転換の結
果として得られたクローンのスクリーニング。結果とし
て得られるAT2S1の欠失した超可変領域を含むプラ
スミドはpMacAT2S1C40と呼ばれる(図23
ステップ2を参照)。
【0158】3.超可変領域をコード付けする配列が欠
失したAT2S1遺伝子内へのGHRFをコード付けす
る配列の挿入 上述のように、超可変ループのほとんどをコード付けす
る配列が除去されたとき、AccI部位がその代りに挿
入された。問題の配列はこのAccI部位内に挿入され
るが、第2のAccI部位も又、変更された遺伝子を含
むHindIIIフラグメント内に存在する。従って、変更さ
れた遺伝子を含むNdeI−HindIIIフラグメントは、
同様にNdeI及びHindIIIで切断されたクローニング
ベクターpBR(322)(Boliver、1977年)に
サブクローニングされる。2Sアルブミン遺伝子内のN
deI部位の位置は、図6に示されている。結果として
得られるサブクローンはpBRAT2S1と呼ばれる
(図23、ステップ3)。成長ホルモンの2つのバージ
ョンをコード付けする配列は、アニーリングされたとき
GHRFの完全な配列を形成するような一連の相補的合
成オリゴヌクレオチドを構成することによりpBRAT
2S1のAccI部位内に挿入される。AT2S1のも
のとほぼ一致するようにコドン使用が選択され、診断目
的で用いられるべき制限部位(StyI)が含み入れら
れ、GHRFコード付け配列の末端にはBamHI及び
PstI部位に対し相補的な付着末端が、上述のステッ
プの後2Sアルブミン遺伝子の読取り枠が維持されるよ
うにするための追加の塩基と合わせて含み入れられた。
2つの構成において用いられた8つのオリゴヌクレオチ
ドが図24に示されている。図24のA図において、オ
リゴヌクレオチドの限界は垂直線により示されており、
配列の上下の数字はその番号を表している。オリゴヌク
レオチド(4及び8)において、囲み内に入っている塩
基は除外され、その結果、この構成のGHRFSバージ
ョンが得られる。図24のA図中*印が付いている塩基
は、GHRFLをさらに構成するために用いられるクロ
ーン(pEK7)内でTに突然変異させられたというこ
とがわかったが、これらの変化はアミノ酸配列に影響を
及ぼさなかったため、補正されなかった。GHRFペプ
チドのペプチド配列及びCnBr部位を与えるために含
まれているメチオニンは、DNA配列の上に示されてい
る。各末端の張出し塩基は、フラグメントをBamHI
及びPstI部位に結紮するのに役立つ。これらはS1
消化により除去される。次に、図24のB図に示されて
いるように、平滑末端フラグメントがpBRAT2S1
のKlenow処理されたAccI部位へと結紮される。Ac
cI部位の読取り枠コンテクストは、図の上部に示され
ており、開裂部位は▼で表わされている。処理の結果は
下にあり、AccI部位及びその充てんの結果得られた
塩基は、太字で示されている。
失したAT2S1遺伝子内へのGHRFをコード付けす
る配列の挿入 上述のように、超可変ループのほとんどをコード付けす
る配列が除去されたとき、AccI部位がその代りに挿
入された。問題の配列はこのAccI部位内に挿入され
るが、第2のAccI部位も又、変更された遺伝子を含
むHindIIIフラグメント内に存在する。従って、変更さ
れた遺伝子を含むNdeI−HindIIIフラグメントは、
同様にNdeI及びHindIIIで切断されたクローニング
ベクターpBR(322)(Boliver、1977年)に
サブクローニングされる。2Sアルブミン遺伝子内のN
deI部位の位置は、図6に示されている。結果として
得られるサブクローンはpBRAT2S1と呼ばれる
(図23、ステップ3)。成長ホルモンの2つのバージ
ョンをコード付けする配列は、アニーリングされたとき
GHRFの完全な配列を形成するような一連の相補的合
成オリゴヌクレオチドを構成することによりpBRAT
2S1のAccI部位内に挿入される。AT2S1のも
のとほぼ一致するようにコドン使用が選択され、診断目
的で用いられるべき制限部位(StyI)が含み入れら
れ、GHRFコード付け配列の末端にはBamHI及び
PstI部位に対し相補的な付着末端が、上述のステッ
プの後2Sアルブミン遺伝子の読取り枠が維持されるよ
うにするための追加の塩基と合わせて含み入れられた。
2つの構成において用いられた8つのオリゴヌクレオチ
ドが図24に示されている。図24のA図において、オ
リゴヌクレオチドの限界は垂直線により示されており、
配列の上下の数字はその番号を表している。オリゴヌク
レオチド(4及び8)において、囲み内に入っている塩
基は除外され、その結果、この構成のGHRFSバージ
ョンが得られる。図24のA図中*印が付いている塩基
は、GHRFLをさらに構成するために用いられるクロ
ーン(pEK7)内でTに突然変異させられたというこ
とがわかったが、これらの変化はアミノ酸配列に影響を
及ぼさなかったため、補正されなかった。GHRFペプ
チドのペプチド配列及びCnBr部位を与えるために含
まれているメチオニンは、DNA配列の上に示されてい
る。各末端の張出し塩基は、フラグメントをBamHI
及びPstI部位に結紮するのに役立つ。これらはS1
消化により除去される。次に、図24のB図に示されて
いるように、平滑末端フラグメントがpBRAT2S1
のKlenow処理されたAccI部位へと結紮される。Ac
cI部位の読取り枠コンテクストは、図の上部に示され
ており、開裂部位は▼で表わされている。処理の結果は
下にあり、AccI部位及びその充てんの結果得られた
塩基は、太字で示されている。
【0159】各々の構成において用いられている6つの
オリゴヌクレオチドは全て、キナーゼ化された。アニー
リング反応のためには、各々のオリゴヌクレオチド2p
モルを合計12μlの体積になるよう組合わせた。混合
物を10分間90℃で保温し、10分間約65〜70℃
の温度へと移行させ、それから35〜45分にわたって
30〜35℃まで漸進的に冷却させた。この時間の終了
時点で、リガーゼバッファ(Maniatis他、1982年)
及び1.5ユニットのT4−リガーゼを付加し、体積を
15μlに調整し、混合物を16℃で一晩保温した。次
に混合物を5分間65℃に保温し、その後、100mM
NaCl制限エンドヌクレアーゼバッファ2.5μl(M
aniatis他、1982年)、BamHI及びPatIの
各々を5〜10ユニット付加し、体積を25μlに調整
した。この消化物は、結紮段階中に形成したコンカテマ
ーを開裂するためのものである。45分間の消化の後、
反応物をフェノール/クロロホルムで抽出し、沈降さ
せ、BamHI及びPstIで消化され細菌アルカリフ
ォスファターゼで処理されたpUC18(Yanisch-Perr
on他、1985年)と結紮されたもの5μlを含む10
μl中に再度懸濁させた。標準的な技術による細菌細胞
の形質転換の後(Maniatis他、1982年)、3 2Pとい
う標識のついたオリゴヌクレオチドNo.1末端を用いてG
runstein(1975年)の方法により組換え体コロニー
をスクリーニングした。GHRF遺伝子の各バージョン
からのクローンを配列決定し、pEK7(GHRFLを
含む)及びpEK8(GHRFSを含む)と呼ばれる各
バージョンについて1つずつのクローンを、その後のス
テップで用いた(図23のステップ4参照)。
オリゴヌクレオチドは全て、キナーゼ化された。アニー
リング反応のためには、各々のオリゴヌクレオチド2p
モルを合計12μlの体積になるよう組合わせた。混合
物を10分間90℃で保温し、10分間約65〜70℃
の温度へと移行させ、それから35〜45分にわたって
30〜35℃まで漸進的に冷却させた。この時間の終了
時点で、リガーゼバッファ(Maniatis他、1982年)
及び1.5ユニットのT4−リガーゼを付加し、体積を
15μlに調整し、混合物を16℃で一晩保温した。次
に混合物を5分間65℃に保温し、その後、100mM
NaCl制限エンドヌクレアーゼバッファ2.5μl(M
aniatis他、1982年)、BamHI及びPatIの
各々を5〜10ユニット付加し、体積を25μlに調整
した。この消化物は、結紮段階中に形成したコンカテマ
ーを開裂するためのものである。45分間の消化の後、
反応物をフェノール/クロロホルムで抽出し、沈降さ
せ、BamHI及びPstIで消化され細菌アルカリフ
ォスファターゼで処理されたpUC18(Yanisch-Perr
on他、1985年)と結紮されたもの5μlを含む10
μl中に再度懸濁させた。標準的な技術による細菌細胞
の形質転換の後(Maniatis他、1982年)、3 2Pとい
う標識のついたオリゴヌクレオチドNo.1末端を用いてG
runstein(1975年)の方法により組換え体コロニー
をスクリーニングした。GHRF遺伝子の各バージョン
からのクローンを配列決定し、pEK7(GHRFLを
含む)及びpEK8(GHRFSを含む)と呼ばれる各
バージョンについて1つずつのクローンを、その後のス
テップで用いた(図23のステップ4参照)。
【0160】pEK7及びpEK8のBamHI−Ps
tIフラグメントをpBRAT2S1のAccI部位内
に挿入した(図23、ステップ5)。オープンリーディ
ングフレームを維持するために行なわれた処理の詳細
は、図24に示されている。pEK7及びpEK8を各
々BaHI及びPstIの両方で切断し、S1ヌクレア
ーゼで処理し、GHRFコード付け配列を含むフラグメ
ントを、ゲル電気泳動の後分離させた。次にこれらのフ
ラグメントを、AccIで切断されDNAポリメラーゼ
IのKlenowフラグネントで処理されたpBRAT2S1
と個別に結紮した。結果として得られたクローンを、こ
の目的のための合成配列が含み入れられた部位であるS
tyI及びHindIIIとの消化によりGHRFコード付け
配列の適切な方向性についてチェックした。正しい方向
性でインサートを含んでいることがわかったいくつかの
クローンを配列決定した。これは、S1ヌクレアーゼ消
化がつねに厳密に制御できないことから、必要となるこ
とである。2つのGHRF構成の各々について正しい配
列をもつことの確認された1つのクローンを、その後の
ステップで用いた。これらは、それぞれGHRFL及び
GHRFSについてpEK100及びpEK200と呼
称された。
tIフラグメントをpBRAT2S1のAccI部位内
に挿入した(図23、ステップ5)。オープンリーディ
ングフレームを維持するために行なわれた処理の詳細
は、図24に示されている。pEK7及びpEK8を各
々BaHI及びPstIの両方で切断し、S1ヌクレア
ーゼで処理し、GHRFコード付け配列を含むフラグメ
ントを、ゲル電気泳動の後分離させた。次にこれらのフ
ラグメントを、AccIで切断されDNAポリメラーゼ
IのKlenowフラグネントで処理されたpBRAT2S1
と個別に結紮した。結果として得られたクローンを、こ
の目的のための合成配列が含み入れられた部位であるS
tyI及びHindIIIとの消化によりGHRFコード付け
配列の適切な方向性についてチェックした。正しい方向
性でインサートを含んでいることがわかったいくつかの
クローンを配列決定した。これは、S1ヌクレアーゼ消
化がつねに厳密に制御できないことから、必要となるこ
とである。2つのGHRF構成の各々について正しい配
列をもつことの確認された1つのクローンを、その後の
ステップで用いた。これらは、それぞれGHRFL及び
GHRFSについてpEK100及びpEK200と呼
称された。
【0161】4.修飾された完全なAT2S1遺伝子の
その天然プロモータによる再構成 完全なキメラ遺伝子は、以下のように再構成される(図
23参照):クローンpAT2S1Bgは、遺伝子AT
2S1のコード付け領域を含む1.0kbのHindIIIフラ
グメントのみならず、遺伝子の適切な表現にとって充分
な配列をこのフラグメントの上流及び下流にて包含して
いるクローニングベクターpJB65(Botterman他、
1987年)内に挿入された3.6kbのBglIIフラグ
メントを含んでいる。このプラスミドはHindIIIで切断
され、5.2kbのフラグメント(すなわちAT2S1の
コード付け領域を含んでいないプラスミドの一部分)が
分離される。クローンpAT2S1はHindIII及びNd
eIで切断され、結果として得られる320bpHindII
I−NdeIフラグメントが分離される。このフラグメ
ントは、追加のAccI部位の複雑さ無く図23のステ
ップ5のオリゴヌクレオチドの挿入が進められうるよう
に、pBRAT2S1の構成中に変更された2Sアルブ
ミンから除去されたもの(図23のステップ3)を表わ
す。次にこれら2つの分離されたフラグメントを、3方
向結紮にて、修飾されたコード付け配列を含むそれぞれ
pEK100及びpEK(200)からのNdeI−Hi
ndIIIフラグメントと結紮させる。数多くの部位のうち
のいずれかを用いて、BalIIフラグメント内の再構成
されたHindIIIフラグメントの適当な方向性についてチ
ェックするため、個々の形質転換体をスクリーニングす
ることができる。結果として得られるプラスミドpEK
502及びpEK6011は、全体的にBalIIフラグ
メント上に含まれている、未修飾遺伝子と同じフランキ
ング配列ひいては同じプロモータによりとり囲まれた、
超可変領域内のみにおいて修飾された2Sアルブミン遺
伝子で構成されている。
その天然プロモータによる再構成 完全なキメラ遺伝子は、以下のように再構成される(図
23参照):クローンpAT2S1Bgは、遺伝子AT
2S1のコード付け領域を含む1.0kbのHindIIIフラ
グメントのみならず、遺伝子の適切な表現にとって充分
な配列をこのフラグメントの上流及び下流にて包含して
いるクローニングベクターpJB65(Botterman他、
1987年)内に挿入された3.6kbのBglIIフラグ
メントを含んでいる。このプラスミドはHindIIIで切断
され、5.2kbのフラグメント(すなわちAT2S1の
コード付け領域を含んでいないプラスミドの一部分)が
分離される。クローンpAT2S1はHindIII及びNd
eIで切断され、結果として得られる320bpHindII
I−NdeIフラグメントが分離される。このフラグメ
ントは、追加のAccI部位の複雑さ無く図23のステ
ップ5のオリゴヌクレオチドの挿入が進められうるよう
に、pBRAT2S1の構成中に変更された2Sアルブ
ミンから除去されたもの(図23のステップ3)を表わ
す。次にこれら2つの分離されたフラグメントを、3方
向結紮にて、修飾されたコード付け配列を含むそれぞれ
pEK100及びpEK(200)からのNdeI−Hi
ndIIIフラグメントと結紮させる。数多くの部位のうち
のいずれかを用いて、BalIIフラグメント内の再構成
されたHindIIIフラグメントの適当な方向性についてチ
ェックするため、個々の形質転換体をスクリーニングす
ることができる。結果として得られるプラスミドpEK
502及びpEK6011は、全体的にBalIIフラグ
メント上に含まれている、未修飾遺伝子と同じフランキ
ング配列ひいては同じプロモータによりとり囲まれた、
超可変領域内のみにおいて修飾された2Sアルブミン遺
伝子で構成されている。
【0162】5.植物の形質転換 キメラ遺伝子を含むBalIIフラグメントを、例2の第
3節で用いられ説明されている二元性ベクターpGSC
1703AのBglII内に挿入する(図23、ステップ
6も参照のこと)。結果として得られたプラスミドはp
TAD12と呼ばれる。標準的な手順を用いて(Deblae
re他、1987年)、pTAD12を、同様に例IIの第
3節で用いられているプラスミドpMP90を有するア
グロバクテリウム菌株C58C1Rifに移入する。こ
のアグロバクテリウムを次に植物の形質転換のために用
いる。SR1株のタバコを、標準的な手順を用いて形質
転換する(Deblaere他、1987年)。100μg/mlの
カナマイシン上でカルスを選択し、耐性あるカルスを植
物の再生に用いる。
3節で用いられ説明されている二元性ベクターpGSC
1703AのBglII内に挿入する(図23、ステップ
6も参照のこと)。結果として得られたプラスミドはp
TAD12と呼ばれる。標準的な手順を用いて(Deblae
re他、1987年)、pTAD12を、同様に例IIの第
3節で用いられているプラスミドpMP90を有するア
グロバクテリウム菌株C58C1Rifに移入する。こ
のアグロバクテリウムを次に植物の形質転換のために用
いる。SR1株のタバコを、標準的な手順を用いて形質
転換する(Deblaere他、1987年)。100μg/mlの
カナマイシン上でカルスを選択し、耐性あるカルスを植
物の再生に用いる。
【0163】Arabidopsis thaliana及びBrassica napus
の形質転換のための技法は、同じベクター内で全く同じ
構成を用いることができるようなものである。上述のよ
うなアグロバクテリウム・ツメファシエンスに対する授
動の後、それぞれArabidopsis及びBrassicaの形質転換
のために、Lloyd他(1986年)及びklimaszewska他
(1985年)の手順を使用する。各々のケースについ
て、タバコの場合と同様に、カルスを100μg/mlのカ
ナマイシン上で選択し、耐性あるカルスを植物の再生に
用いることができる。
の形質転換のための技法は、同じベクター内で全く同じ
構成を用いることができるようなものである。上述のよ
うなアグロバクテリウム・ツメファシエンスに対する授
動の後、それぞれArabidopsis及びBrassicaの形質転換
のために、Lloyd他(1986年)及びklimaszewska他
(1985年)の手順を使用する。各々のケースについ
て、タバコの場合と同様に、カルスを100μg/mlのカ
ナマイシン上で選択し、耐性あるカルスを植物の再生に
用いることができる。
【0164】全三種の場合、再生の初期段階において、
カナマイシンを補足した媒質上で葉からカルスを導き出
すことにより、形質転換について再生体をチェックす
る。(第6項も参照のこと)。
カナマイシンを補足した媒質上で葉からカルスを導き出
すことにより、形質転換について再生体をチェックす
る。(第6項も参照のこと)。
【0165】6.形質転換された植物のスクリーニング
及び分析 全三種の場合において、再生された植物を種子をつける
よう育てる。形質転換されたさまざまな植物は、異なる
発現レベルをもつと予想されうるため(「位置効果」Jo
nes他、1985年)、当初複数の形質転換体を分析し
なくてはならない。これは原則として、RNA又はタン
パク質のいずれかのレベルで行なうことができる。この
場合、Beachy他(1985年)に記されているように種
子RNAを調製し、標準的な技法を用いて(Thomas他、
1980年)、ノーザン・ブロット法を行なった。Bras
sica及びArabidopsisの両方の場合においては、キメラ
遺伝子全体は内因性遺伝子との交差交雑という結果をも
たらすため、2Sアルブミン内の挿入に対し相補性のオ
リゴヌクレオチドプローブを用いた。すなわち構成を作
るのに用いたようなオリゴヌクレオチドの1つを用いる
ことができる、各々の種について、1つ又は2つの個々
の植物を選択し、以下に開示するようなさらに詳しい分
析に用いた。
及び分析 全三種の場合において、再生された植物を種子をつける
よう育てる。形質転換されたさまざまな植物は、異なる
発現レベルをもつと予想されうるため(「位置効果」Jo
nes他、1985年)、当初複数の形質転換体を分析し
なくてはならない。これは原則として、RNA又はタン
パク質のいずれかのレベルで行なうことができる。この
場合、Beachy他(1985年)に記されているように種
子RNAを調製し、標準的な技法を用いて(Thomas他、
1980年)、ノーザン・ブロット法を行なった。Bras
sica及びArabidopsisの両方の場合においては、キメラ
遺伝子全体は内因性遺伝子との交差交雑という結果をも
たらすため、2Sアルブミン内の挿入に対し相補性のオ
リゴヌクレオチドプローブを用いた。すなわち構成を作
るのに用いたようなオリゴヌクレオチドの1つを用いる
ことができる、各々の種について、1つ又は2つの個々
の植物を選択し、以下に開示するようなさらに詳しい分
析に用いた。
【0166】まず、キメラ遺伝子のコピー番号を、形質
転換された植物の葉の組織からDNAを調製し(Dellap
orta他、1983年)、上で用いられているオリゴヌク
レオチドでプローピングすることによって決定する。
転換された植物の葉の組織からDNAを調製し(Dellap
orta他、1983年)、上で用いられているオリゴヌク
レオチドでプローピングすることによって決定する。
【0167】7.GHRF類似体の分離 A)キメラ2Sアルブミンの精製 例IIに説明されているように、高塩分抽出、ゲルろ過及
び逆相HPLCによって、2Sアルブミンを精製する。
び逆相HPLCによって、2Sアルブミンを精製する。
【0168】天然GHRFに対する市販の抗体(UCB
−Bioproducts, Drogenbos、ベルギー)を用いた免疫学
的技法により、キメラ2Sアルブミンの正しい溶離回数
(時間)を測定する。
−Bioproducts, Drogenbos、ベルギー)を用いた免疫学
的技法により、キメラ2Sアルブミンの正しい溶離回数
(時間)を測定する。
【0169】B)キメラ2Sアルブミンの開裂及びGH
RF類似体の分離 2Sアルブミンを含む脱塩、HPLC精製されたGHR
Fを次にCNBr(Gross & Witkop、1961年)で
処理する。CnBrは、なおCOOH末端基に付いてい
る余分なホモセリン/ホモセリン−ラクトンでGHRF
類似体を遊離させる。GHRF類似体を、例IIに示され
ているように、古典的な逆相HPLC技法を用いて精製
し、例IIに示されている方法を用いて、そのアミノ酸配
列を決定する。Kempe他(1986年)が記しているよ
うにアンモニア、n−ブチルアミン及びn−ドデシルア
ミンを用いて、分離されたGHRFS類似体をアミド化
する。この結果が、説明されるArg−Hse−NH2
末端である。
RF類似体の分離 2Sアルブミンを含む脱塩、HPLC精製されたGHR
Fを次にCNBr(Gross & Witkop、1961年)で
処理する。CnBrは、なおCOOH末端基に付いてい
る余分なホモセリン/ホモセリン−ラクトンでGHRF
類似体を遊離させる。GHRF類似体を、例IIに示され
ているように、古典的な逆相HPLC技法を用いて精製
し、例IIに示されている方法を用いて、そのアミノ酸配
列を決定する。Kempe他(1986年)が記しているよ
うにアンモニア、n−ブチルアミン及びn−ドデシルア
ミンを用いて、分離されたGHRFS類似体をアミド化
する。この結果が、説明されるArg−Hse−NH2
末端である。
【0170】カルボキシル末端になお余分なメチオニン
を有する第2の類似体GHRFLをまずカルボキシペプ
チダーゼBで処理し、カルボキシル末端ホモセリン残基
を除去する(Ambler、1972年)。その結果、Leu
−Gly−COOH末端が得られる。Kreil(1984
年)に記されているように、カタラーゼ及びアスコルビ
ン酸塩の存在する中でD−アミノ酸オキシダーゼで処理
することにより、グリシン−COOH末端は、アミド−
CONH2及びグリオキシル酸末端に変換される。この
一組の酵素段階の結果、最終的なアミド化されたGHR
FL類似体が得られる。
を有する第2の類似体GHRFLをまずカルボキシペプ
チダーゼBで処理し、カルボキシル末端ホモセリン残基
を除去する(Ambler、1972年)。その結果、Leu
−Gly−COOH末端が得られる。Kreil(1984
年)に記されているように、カタラーゼ及びアスコルビ
ン酸塩の存在する中でD−アミノ酸オキシダーゼで処理
することにより、グリシン−COOH末端は、アミド−
CONH2及びグリオキシル酸末端に変換される。この
一組の酵素段階の結果、最終的なアミド化されたGHR
FL類似体が得られる。
【0171】従って、前記諸例は、Leu−エンケファ
リン又は成長ホルモン放出因子をコード付けするインサ
ートを中にとり込むよう2Sアルブミン貯蔵タンパク質
をいかに変更するか、そしてそれに続く相応する変更さ
れた前駆体核酸を含む適切なプラスミドを用いたタバ
コ、Arabidopsis及びBrassica細胞の形質転換、形質転
換された植物細胞の相応する植物への再生、種子形成段
階に至るまでのその栽培、種子の回収、そこからの雑種
2Sアルブミンの分離そして最終的に純粋な形でのかか
る雑種タンパク質からのLeu−エンケファリン又はG
HRFの回収についての完全な例示を与えている。
リン又は成長ホルモン放出因子をコード付けするインサ
ートを中にとり込むよう2Sアルブミン貯蔵タンパク質
をいかに変更するか、そしてそれに続く相応する変更さ
れた前駆体核酸を含む適切なプラスミドを用いたタバ
コ、Arabidopsis及びBrassica細胞の形質転換、形質転
換された植物細胞の相応する植物への再生、種子形成段
階に至るまでのその栽培、種子の回収、そこからの雑種
2Sアルブミンの分離そして最終的に純粋な形でのかか
る雑種タンパク質からのLeu−エンケファリン又はG
HRFの回収についての完全な例示を与えている。
【0172】従って本発明が、タンパク質又はポリペプ
チドの遺伝的処理技術及びその天然の形態に近い形態で
それらを生み出す条件の下で大量にこれらを生産する技
術を提供するものであるということは直ちに明白であ
る。
チドの遺伝的処理技術及びその天然の形態に近い形態で
それらを生み出す条件の下で大量にこれらを生産する技
術を提供するものであるということは直ちに明白であ
る。
【0173】又当然のことながら、本発明は上述の例に
限られているわけではない。当業者は、各々のケースに
おいて、問題となっているいずれかの一定のポリペプチ
ド又はペプチドの生産に用いるべき貯蔵タンパク質、そ
の性質(例えば、相応するDNAインサートを最もうま
く収納するためそれが含んでいる適切な制限部位に応じ
て)を選択し、問題のペプチドが究極的に開裂、回収及
び精製されうるもとである相応する雑種タンパク質を生
成するための、形質転換されるべき種子形成植物の性質
に基づく最適な種子特異的プロモータの選択を適切に行
なうことになる。
限られているわけではない。当業者は、各々のケースに
おいて、問題となっているいずれかの一定のポリペプチ
ド又はペプチドの生産に用いるべき貯蔵タンパク質、そ
の性質(例えば、相応するDNAインサートを最もうま
く収納するためそれが含んでいる適切な制限部位に応じ
て)を選択し、問題のペプチドが究極的に開裂、回収及
び精製されうるもとである相応する雑種タンパク質を生
成するための、形質転換されるべき種子形成植物の性質
に基づく最適な種子特異的プロモータの選択を適切に行
なうことになる。
【0174】以下に、本書に記されているプロセスの段
階のいくつかを達成するための既知の方法又は本発明の
実施に先立って立証された一般的知識に対し参照指示が
なされた範囲内で本開示全体を通して基準とされてきた
参考文献を、記す。
階のいくつかを達成するための既知の方法又は本発明の
実施に先立って立証された一般的知識に対し参照指示が
なされた範囲内で本開示全体を通して基準とされてきた
参考文献を、記す。
【0175】なお、以下のことをさらに確認しておく: − プラスミドpGV2260は、1983年12月に
DSMに2799にて寄託されたこと、 − プラスミドpSOYLEAは、1987年8月3日
付で、DSMに4205にて寄託されたこと、 − プラスミドpBN2S1は、1987年8月3日付
でDSMに4205にて寄託されたこと、 − プラスミドpMa5−8は、1988年5月3日付
で4567にて、又pMcは同日4566にてDSMに
寄託されたこと、 − プラスミドpAT2S1は、1988年10月7日
付で、DSMに4879にて寄託されたこと、 − プラスミドpAT2S1Bgは、1988年10月
7日付でDSMに4878にて寄託されたこと、 − プラスミドpGSC1703Aは、1988年10
月7日付でDSMに4880にて寄託されたこと、 − プラスミドpEK7は、1988年10月7日付で
DSMに4876にて寄託されたこと、 − プラスミドpEK8は、1988年10月7日付で
DSMに4877にて寄託されたこと。
DSMに2799にて寄託されたこと、 − プラスミドpSOYLEAは、1987年8月3日
付で、DSMに4205にて寄託されたこと、 − プラスミドpBN2S1は、1987年8月3日付
でDSMに4205にて寄託されたこと、 − プラスミドpMa5−8は、1988年5月3日付
で4567にて、又pMcは同日4566にてDSMに
寄託されたこと、 − プラスミドpAT2S1は、1988年10月7日
付で、DSMに4879にて寄託されたこと、 − プラスミドpAT2S1Bgは、1988年10月
7日付でDSMに4878にて寄託されたこと、 − プラスミドpGSC1703Aは、1988年10
月7日付でDSMに4880にて寄託されたこと、 − プラスミドpEK7は、1988年10月7日付で
DSMに4876にて寄託されたこと、 − プラスミドpEK8は、1988年10月7日付で
DSMに4877にて寄託されたこと。
【0176】ただし、これらは全て、当業者がいかなる
発明性の作業を実施しなくても入手可能な遺伝材料から
再生することのできるような構成である。
発明性の作業を実施しなくても入手可能な遺伝材料から
再生することのできるような構成である。
【0177】参考文献 − Altenback, S.B., Pearson, K.W., Leung, F.W., S
un, S.S.M共著(1987年)Plant. Mol. Biol(植物
分子生物学)、8、239−250。 − Ambler, R.P.著(1972年)。「Method in Enzy
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paio, M.J.A.M., Van Montagu, M.及びVande kerckhov
e, J. 共著(1986年)、「Eur. J. Bichem(欧州生
物学ジャーナル)」159、597−604。 − Bassβuβner, R., Huth, A., Manteuffel, R., Ra
paport, T.A.共著(1983年)、「Eur. J. Bioche
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L.共著(1984年)「J. of Chromatography(クロマ
トグラフィジャーナル」、336、93−104。 − Blobel著(1980年)Proc. Natl, Acad Sci(国
立科学アカデミー会報」77、1496−1500。 − Bolivar, F., Rodriguez, R.L., Greene, P.J., Be
tlach, M.C., Heynecker, H.L., Boyer, H.W., Crosa,
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(理学博士論文)ゲント大学。 − Botterman, J. 及びZabeau, M.共著(1987年)
「DNA」6,583〜591。 − Brown, J.W.S., Wandelt, Ch., Maier, U., Dietri
ch, G., Schwall, N.,及びFeix, G.共著(1986年)
EMBO研究集会(ワークショップ)「植物貯蔵タンパ
ク質遺伝子」プログラム及び要約ページ17、Eds. J.
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中E.K.?) − De Castro, L.A.B., Lacerada, Z., Aramayo, R.
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bouwhogeschool Wogeningen,オランダ、p72−85。 − Ellis, J.R., Shirsat, A.H., Hepher, A., Yarwoo
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びSpencer, D.共著(EK? シンポジウム参照資料+日
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載書:「タンパク質の配列及び構造地図」。編集者:Da
yhoff, M.O., National Biochemical Research Foundat
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びSpencer, D.共著(EK? シンポジウム参照資料+日
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ck, J., Leemans, J., Vandamme, J., Segura, M., Ghe
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78。 − Roden, L.T., Miflin, B.J., Freedman, R.B.共著
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(1986年)、Proc. Natl. Acad. Sci.83、212
3−2127。 − Yang, F., Luna, V.G., McAnelly, R.D., Noberhau
s, K.H., Cupples, R.L., Bowman, B.H.共著(1985
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7−8017。 − Yanisch-Perron, C., Vieira, J.及びMessing, J.
共著(1985年)「Gene(遺伝子)」、33、103
−119。 − Youle, R. 及びHuang, A.H.C.共著(1981年)
「American J. Bot.(米国植物学ジャーナル)」68、
44−48。
【0178】合計種子タンパク質の百分率で表わした2Sアルブミン 表1 科種 % (一般名) CompositaeHelianthus annuus (ヒマワリ) 62% CruciferaeBrassica spp. (アブラナ) 62% LinaceaeLinum usitatissimum (アマニ) 42% LeguminosaeLupinus polyphyllus (ハウチワマメ) 38%Arachis hypogaea (ピーナッツ) 20% LecythidaceaeBertholletia excelsa (ブラジルナッツ)30% LiliaceaeYucca spp.(ユッカ) 27% EuphorbiacaeRicinus communis (トウゴマの実) 44% (出典 Youle & Huang, 1981年)
【図1】2S−貯蔵タンパク質の全体的特長を示す。
【図2】2S−貯蔵タンパク質の全体的特長を示す。
【図3】2S−貯蔵タンパク質の全体的特長を示す。
【図4】2S−貯蔵タンパク質の全体的特長を示す。
【図5】2S−貯蔵タンパク質の全体的特長を示す。
【図6】pBN2S1プラスミドから得たブラジルナッ
ツの2S−アルブミンの配列の一部分とその関連要素を
示す。
ツの2S−アルブミンの配列の一部分とその関連要素を
示す。
【図7】制限部位を示す。
【図8】1つの前駆体をコードする核酸を含む制限フラ
グメントを含むキメラプラスミドの構成の連続的段階を
示す。
グメントを含むキメラプラスミドの構成の連続的段階を
示す。
【図9】1つの前駆体をコードする核酸を含む制限フラ
グメントを含むキメラプラスミドの構成の連続的段階を
示す。
グメントを含むキメラプラスミドの構成の連続的段階を
示す。
【図10】部位指向性の突然変異誘発の実施に適したプ
ラスミドの制限部位及び遺伝地図を示す。
ラスミドの制限部位及び遺伝地図を示す。
【図11】部位指向性突然変異誘発手順のさまざまな段
階を示す。
階を示す。
【図12】キメラプラスミドを変更する諸段階を示す。
【図13】キメラプラスミドを変更する諸段階を示す。
【図14】キメラプラスミドを変更する諸段階を示す。
【図15】Arabidopsis thaliana 2Sアルブミン遺伝
子を含む1kbフラグメントの配列を示す。
子を含む1kbフラグメントの配列を示す。
【図16】Arabidopsis2Sタンパク質の大きなサブユ
ニットのタンパク質配列を、関連するオリゴヌクレオチ
ド配列と共に示す。
ニットのタンパク質配列を、関連するオリゴヌクレオチ
ド配列と共に示す。
【図17】pGSC1703の制限地図を示す。
【図18】pGSC1703Aの制限地図を示す。
【図19】C4カラム上での、標識として用いられた合
成ペプチドYGGFLKのアリコートのクロマトグラム
(図19のA図)、及び酸化された2S上のトリプシン
消化のクロマトグラム(図19のB図)を示す。
成ペプチドYGGFLKのアリコートのクロマトグラム
(図19のA図)、及び酸化された2S上のトリプシン
消化のクロマトグラム(図19のB図)を示す。
【図20】C18カラム上での、標識として用いられた
合成ペプチドYGGFLKのアリコートのクロマトグラ
ム(図20のA図)、及びC4カラム上でHPLCから
得られたピークを含むYGGFLKのC18カラム上で
の再クロマトグラフィ(図20のB図)を示す。
合成ペプチドYGGFLKのアリコートのクロマトグラ
ム(図20のA図)、及びC4カラム上でHPLCから
得られたピークを含むYGGFLKのC18カラム上で
の再クロマトグラフィ(図20のB図)を示す。
【図21】YGGFLK上のアミノ酸配列の決定の結果
を表す。
を表す。
【図22】マーカーとして用いられるYGGFLペプチ
ドを示すクロマトグラム(図22のA図)、及び植物材
料から分離されたYGGFLKペプチドに対するカルボ
キシペプチダーゼB消化の後のIGGFLぺプチドの分
離(図22のB図)を示す。
ドを示すクロマトグラム(図22のA図)、及び植物材
料から分離されたYGGFLKペプチドに対するカルボ
キシペプチダーゼB消化の後のIGGFLぺプチドの分
離(図22のB図)を示す。
【図23】キメラ2SアルブミンのArabidopsis thalia
na 遺伝子の構成の連続的段階を示す。
na 遺伝子の構成の連続的段階を示す。
【図24】GHRFS及びGHRFL遺伝子の構成に用
いられる8つのオリゴヌクレオチド(図24のA図)、
並びに修飾されたAT2S1遺伝子のAccI部位、及
びオープンリーディングフレームが維持されるようにす
るこのAccI部位内へのGHRFの挿入(図24のB
図)を示す。
いられる8つのオリゴヌクレオチド(図24のA図)、
並びに修飾されたAT2S1遺伝子のAccI部位、及
びオープンリーディングフレームが維持されるようにす
るこのAccI部位内へのGHRFの挿入(図24のB
図)を示す。
フロントページの続き (72)発明者 クレッバース,エンノ アメリカ合衆国、カリフォルニア 91803、アルハンブラ、グレンビュー 1724 (72)発明者 ボッテルマン,ヨハン ベルギー国、9721 シェバーゲン−デ・ ピンテ、ヘット・ヴィンガールデッケ 5 (72)発明者 レーマンズ,ジャン ベルギー国、9831 デュアレ、ピー・ デ・デンテルゲムラーン 2 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/09 BIOSIS(DIALOG) GenBank/EMBL/DDBJ WPI(DIALOG)
Claims (3)
- 【請求項1】 2Sアルブミンの前駆体をコードするAr
abidopsis thaliana遺伝子の種子特異的プロモーター領
域を含む単離されたDNAフラグメントであって、該2
Sアルブミンが、以下のAT2S1のアミノ酸配列を含む、
DNAフラグメント。 Met Ala Asn Lys Leu Phe Leu Val Cys Ala Ala Leu Ala Leu Cys Phe 1 5 10 15 Leu Leu Thr Asn Ala Ser Ile Tyr Arg Thr Val Val Glu Phe Glu Glu 20 25 30 Asp Asp Ala Thr Asn Pro Ile Gly Pro Lys Met Arg Lys Cys Arg Lys 35 40 45 Glu Phe Gln Lys Glu Gln His Leu Arg Ala Cys Gln Gln Leu Met Leu 50 55 60 Gln Gln Ala Arg Gln Gly Arg Ser Asp Glu Phe Asp Phe Glu Asp Asp 65 70 75 80 Met Glu Asn Pro Gln Gly Gln Gln Gln Glu Gln Gln Leu Phe Gln Gln 85 90 95 Cys Cys Asn Glu Leu Arg Gln Glu Glu Pro Asp Cys Val Cys Pro Thr 100 105 110 Leu Lys Gln Ala Ala Lys Ala Val Arg Leu Gln Gly Gln His Gln Pro 115 120 125 Met Gln Val Arg Lys Ile Tyr Gln Thr Ala Lys His Leu Pro Asn Val 130 135 140 Cys Asp Ile Pro Gln Val Asp Val Cys Pro Phe Asn Ile Pro Ser Phe 145 150 155 160 Pro Ser Phe Tyr (SEQ ID No.3) - 【請求項2】 前記プロモーター領域が、以下のヌクレ
オチド配列の1のヌクレオチド位〜431のヌクレオチ
ド位の配列を含む、請求項1に記載の単離されたDNA
フラグメント。 atctttatcc atatattgtc ttaccatcaa tagacaatat ccaatggacc ggtgacctgc 60 gtgtataagt aatttttcaa gatgctaaaa cttttatgta tttcagaatt aacctccaaa 120 aacatttatt gacacactac tactctttcc gtattgactc tcaactagtc atttcaaaat 180 aattgacatg tcagaacatg agttacacat ggttgcatat tgcaagtaga cgcggaaact 240 tgtcacttcc tttacatttg agtttccaac acctaatcac gacaacaatc atatagctct 300 cgcatacaaa caaacatatg catgtattct tacacgtgaa ctccatgcaa gtctcttttc 360 tcacctataa ataccaacca caccttcacc acattcttca ctcgaaccaa aacatacaca 420 catagcaaaa aatggcaaac aagttgttcc tcgtctgcgc agctctcgct ctctgcttcc 480 tcctcaccaa cgcttccatc taccgcaccg tcgttgagtt cgaagaagat gacgccacta 540 accccatagg cccaaaaatg aggaaatgcc gcaaggagtt tcagaaagaa caacacctaa 600 gagcttgcca gcaattgatg ctccagcaag caaggcaagg ccgtagcgat gagtttgatt 660 tcgaagacga catggagaac ccacagggac aacagcagga acaacagcta ttccagcagt 720 gctgcaacga gcttcgccag gaagagccag attgtgtttg ccccaccttg aaacaagctg 780 ccaaggccgt tagactccag ggacagcacc aaccaatgca agtcaggaaa atttaccaga 840 cagccaagca cttgcccaac gtttgcgaca tcccgcaagt tgatgtttgt cccttcaaca 900 tcccttcatt cccttctttc tactaaatct caaacaaacc ctcaaagcgt atgagagtgt 960 ggttgttgat atatacatgt tgacacttga cacataccac acctcatcgt gtgttttatg 1020 ataaatgt 1028 (SEQ ID No.15) - 【請求項3】 以下のヌクレオチド配列の1のヌクレオ
チド位〜431のヌクレオチド位の配列を含む、DSM N
o.4878として寄託されている、プラスミドpAT2S1Bg由来
の単離されたDNAフラグメント。 atctttatcc atatattgtc ttaccatcaa tagacaatat ccaatggacc ggtgacctgc 60 gtgtataagt aatttttcaa gatgctaaaa cttttatgta tttcagaatt aacctccaaa 120 aacatttatt gacacactac tactctttcc gtattgactc tcaactagtc atttcaaaat 180 aattgacatg tcagaacatg agttacacat ggttgcatat tgcaagtaga cgcggaaact 240 tgtcacttcc tttacatttg agtttccaac acctaatcac gacaacaatc atatagctct 300 cgcatacaaa caaacatatg catgtattct tacacgtgaa ctccatgcaa gtctcttttc 360 tcacctataa ataccaacca caccttcacc acattcttca ctcgaaccaa aacatacaca 420 catagcaaaa aatggcaaac aagttgttcc tcgtctgcgc agctctcgct ctctgcttcc 480 tcctcaccaa cgcttccatc taccgcaccg tcgttgagtt cgaagaagat gacgccacta 540 accccatagg cccaaaaatg aggaaatgcc gcaaggagtt tcagaaagaa caacacctaa 600 gagcttgcca gcaattgatg ctccagcaag caaggcaagg ccgtagcgat gagtttgatt 660 tcgaagacga catggagaac ccacagggac aacagcagga acaacagcta ttccagcagt 720 gctgcaacga gcttcgccag gaagagccag attgtgtttg ccccaccttg aaacaagctg 780 ccaaggccgt tagactccag ggacagcacc aaccaatgca agtcaggaaa atttaccaga 840 cagccaagca cttgcccaac gtttgcgaca tcccgcaagt tgatgtttgt cccttcaaca 900 tcccttcatt cccttctttc tactaaatct caaacaaacc ctcaaagcgt atgagagtgt 960 ggttgttgat atatacatgt tgacacttga cacataccac acctcatcgt gtgttttatg 1020 ataaatgt 1028 (SEQ ID No.15)
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