JP2947843B2 - 修飾２ｓ貯蔵アルブミンの表現を通しての、栄養価の増大した遺伝子導入植物の生産方法 - Google Patents

修飾２ｓ貯蔵アルブミンの表現を通しての、栄養価の増大した遺伝子導入植物の生産方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、植物貯蔵たん白質特に2Sアルブミンをコー
ド化する植物遺伝子の修飾を通して高い滋養特性をもつ
適当なアミノ酸の増大した含有量を伴う植物の生産方法
に関する。
さらに詳しくは、本発明は、遺伝的に修飾された植物
DNA及び植物物質の細胞で複製可能なこの遺伝的に修飾
されたDNAを含む生きた植物物質を提供することを目的
としている。なおここでこの遺伝的に修飾された植物の
DNAには、その表現が適当な植物プロモータの制御下に
ある前記適当なアミノ酸を含むポリペプチドについてコ
ード化する配列が含まれている。
本発明のもう１つの目的は、植物中にて大量に生産さ
れるという2Sアルブミンの能力を利用することにある。
本発明のもう１つの目的は、かかる2Sアルブミンをコ
ード化する遺伝子の超可変領域内の多くの前記適当なア
ミノ酸コドンの補充が植物のたんぱく粒中の前記生産さ
れた修飾貯蔵たん白質の正しい表現、処理及び輸送を妨
害しない、2Sアルブミンの超可変領域を利用することに
ある。
動物及び人間は、植物を食べることによりその必須ア
ミノ酸を直接又は間接的に摂取する。これらの必須アミ
ノ酸には、リジン、トリプトファン、トレオニン、メチ
オニン、フェニルアラニン、ロイシン、バリン及びイソ
ロイシンが含まれる。言語上の簡略化のため、これらの
アミノ酸を「適当なアミノ酸」と呼ぶ。かなり最近にな
ってから、世界の飢餓問題に取組む農学者達は、高栄養
価をもつ植物の開発にその研究努力を注ぎ込んだ。ほと
んどの場合において品種改良を通して得られたこれらの
新しい品種は、炭水化物が比較的豊富に含まれているも
のの、その必須蛋白質（アミノ酸）は普通それらが誘導
された元の野生品種に比べ少ない。一般に、動物の世界
に必須アミノ酸を供給する上での植物の役割が増々認識
されるにつれて、より優れたアミノ酸含有量をもつ新た
な食用植物の開発が強く求められることになった。しか
しながら、従来の品種改良はこの目的を達成する上で限
界がある。反対に、分子遺伝学はこれらの問題点を克服
する可能性を提供する。とうもろこしの種子貯蔵たん白
質（いわゆるゼイン）をコード化する遺伝子がリジンコ
ドンをコード化する配列を付加することによって修飾さ
れる1986年のBrown他の欧州特許出願明細書第80208418
号及び通信文書を参照したい。
種子貯蔵たん白質は、多くの植物の種子内で全種子た
ん白質の最高90％を占めている。これらは、発芽直後の
期間において若い実生苗のための栄養源として用いられ
る。これらをコードする遺伝子は厳密に調節され、組織
特異性及び発生期特異性のきわめて高いやり方で表現さ
れる（Walling他、1986年;Higgins、1984年）。従っ
て、これらはほとんど排他的に発育中の種子内でのみ表
現され、種子のさまざまな発育段階においてさまざまな
等級の種子貯蔵たん白質が表現されうる。これらは一般
に、たんぱく粒又はたん白質貯蔵液胞と呼ばれる膜結合
細胞器官（オルガネラ）の中に貯蔵されて、その細胞間
位置において制約されている。これらの細胞器官は、プ
ロテアーゼの無い環境を提供し、往々にしてプロテアー
ゼ（たん白質分解酵素）抑制物質も含んでいる。栄養貯
蔵たん白質であるたん白質の関連グループは、類似のア
ミノ酸組成をもち、同様に特殊な液胞の中に貯蔵されて
いるが、種子中ではなく葉の中に見られる（Staswick、
1988年）。これらのたん白質は、開花の時点で劣化し、
発育中の種子のための栄養源として役立つと考えられて
いる。
植物内の異種（外来）遺伝子の表現は、充分に立証さ
れている（De Blaere他、1987年）。いくつかのケース
において、種子貯蔵たん白質遺伝子がその他の植物に導
入された。これらのケースの大部分において、その新し
い環境内で導入された種子貯蔵たん白質遺伝子が組織特
異的かつ発育調節された形で表現されることが示された
（Beachy他、1985年;Sengupta−Gopalan他、1985年;Mar
ris他、1988年;Ellis他、1988年;Higgins他、1986年、O
kamura他、1986年）。同様に、少なくとも２つのケース
において、異種種子貯蔵たん白質は、宿主植物のたんぱ
く粒の中に見出されるということも示された（Greenwoo
d及びChrispeels、1985年;Hoffman他、1987年）。さら
に、イントロンを含む完全な遺伝子よりもむしろcDNAが
キメラ遺伝子のためのベースとして用いられる場合、安
定して機能的な伝令RNAを得ることができるということ
も立証された。（Chee他、1986年）。
貯蔵たん白質は一般に、可溶性とサイズを基準にして
分類される［さらに厳密に言うとSuedbergにより定義づ
けされているような沈降速度（Stryer,L.,「生化学」、
第２版、W.H Freeman、ニューヨーク、p599）］。特定
のクラスの種子貯蔵たん白質つまり水溶性アルブミンで
ある2S種子貯蔵たん白質が研究されてきた。これらは、
数多くの植物中で種子貯蔵たん白質の大きな割合を占め
（Youle and Huang、1981年）（表Ｉ）、そのサイズが
小さいこと従って構造がより単純であることから、これ
らは修飾のための魅力あるターゲットとなっている（特
許出願明細書EP87.402348.4号も参照のこと）。いくつ
かの2S貯蔵たん白質が、たん白質、cDNA又はゲノミック
クローンレベルのいずれかで特徴づけされた（Crouch
他、1983年;Sharief及びLi、1982年;Ampe他、1986年;Al
tenbach他、1987年;Ericson他、1986年;De Castro他、1
987年;Scofield及びCrouch、1987年;Josefsson他、1987
年;EP874023483号、Krebbers他、1988年）。2Sアルブミ
ンは、ジスルフィド架橋により結合されるそれぞれ６−
９及び３−４キロダルトン（kd）の２つのサブユニット
から細胞内で形成される。
上述の参考文献中の研究は、2Sアルブミンが、異なる
多くの種の2Sアルブミンの間で共有されている組織をも
つ複合プレポリペプチドとして合成され、これらの種の
うちの３つについて第１図のように図表に表わされる、
ということを示した。いくつかの完全配列は第２図に示
されている。
2Sアルブミンのたん白質配列に関しては、次のような
観察が行なわれる。B.napus（アブラナ科〜）、B.excel
sia（ブラジルナッツ）及びA.thalianaについては、た
ん白質及びDNA配列の両方が見極められ、R.communis
（ヒマノミ）については、たん白質配列のみが利用可能
である（B.napusは、Crouch他、1983年及びEricson他、
1986年から；B.excelsiaはAmpe他、1986年、De Castro
他、1987年及びAltenbach他、1987年から；R.communis
はSharief及びLi、1982年から）。ボックスは相同性を
示し、上方の点はシステインの位置を示す。
前駆物質の初めにおけるたん白質配列を、シグナルペ
プチドに対する標準的コンセンサス配列と比較すると、
前駆物質は、成熟たん白質内には存在しない１つではな
く２つのセグメント（染色体部分）をアミノ末端基に有
し、そのうちの第１のものはシグナル配列（Perlman及
びHalvorson、1983年）であり、第２のものはアミノ末
端処理フラグメント（断片）と呼ばれてきたものである
（いわゆるATPF）ことがわかる。シグナル配列は、小胞
体の膜を横切っての未完成ポリペプチドの共翻訳輸送を
確保するために役立ち（Blobel、1980年）、これまで検
査された全ての種子貯蔵たん白質を含む数多くのタイプ
のたん白質の中に発見されている（Herman他、1986
年）。これは、たん白質の適当な区画化のために非常に
重要である。たん白質はさらに、適切なジスルフィドブ
リッジが形成されるような形でひだ形成される。このプ
ロセスは；酵素ジスルフィドイソメラーゼが局在させら
れている小胞体の管腔部位に局在させられる可能性が高
い（Roden他、1982年;Bergman及びKuehl、1979年）。小
胞体膜を横切っての転座の後、ほとんどの貯蔵たん白質
は前記小胞体を通してゴルジ体へ、そしてゴルジ体から
小さな膜結合小胞（「密性小胞」）内をたんぱく粒まで
輸送されると考えられている（Chrispeels、1983年;Cra
ig及びGoodchild、1984年;Lord、1985年）。シグナルペ
プチドが共翻訳的に除去されるということは、種子貯蔵
たん白質をさらにたんぱく粒まで輸送することを指示す
るシグナルが、存在するたん白質配列の残りの部分の中
に滞留しなければならない、ということを暗に意味す
る。ゼイン及びおそらくはその他のいくつかのプロラミ
ニンはこの通路から逸脱する：実際、たんぱく粒は小胞
体、直接的分芽により形成される（Larkins及びHurkma
n、1978年）。すでに記録されているように、2Sアルブ
ミンは、成熟ポリペプチドの中には存在しないシグナル
配列以外の配列を前駆物質のアミノ末端に含んでいる。
これは全ての貯蔵たん白質に一般的なことではない。こ
のアミノ末端基処理されたフラグメントは、第１図でAT
PFと標識づけされている。
さらに、第１図に示されているように、前駆物質内の
小さなサブユニットと大きなサブユニットの間に位置づ
けされたいくつかのアミノ酸が除去される（図中、内部
処理済みフラグメントを意味するIPFという標識が付け
られているもの）。さらに、前駆物質のカルボキシル末
端からいくつかの残基が除去される（図中、カルボキシ
ル末端基処理済みフラグメントを意味するCTPFという標
識が付けられているもの）。これら後者の処理段階の細
胞位置づけは不確定であるが、たんぱく粒である可能性
が最も高い（Chrispeels他、1983年;Lord、1985年）。
これらの処理段階の結果として、小さなサブユニット及
び大きいサブユニットが残る。これらは、以下で述べる
ようにジスルフィドブリッジにより結合される。
異なる植物の2Sアルブミンのたん白質配列を比較する
と、構造上の大きな類似性が見うけられる。このこと
は、次のような異なる植物の代表的2S貯蔵種子アルブミ
ンたん白質のそれぞれ小サブユニット及び大サブユニッ
トのアミノ酸配列を提供する第２図により、さらに限定
的に示されている： R.comm.:Ricinus communis（ヒマノミ） A.thali:Arabidopsis thaliana B.napus:Brassica napus（アブラナ科） B.exces:Bertholletia excelsia（ブラジルナッツ） 第２図において、次のことを留意しなくてはならな
い： − 前記サブユニットのアミノ酸配列は、複数のライン
上に拡がっている；例示されている貯蔵たん白質のアミ
ノ酸配列のシステイン基及びかかるたん白質のいくつか
の中の同一のアミノ酸は、垂直に整列させられた；これ
らの配列のいくつかの中に現われるハイフン符号は欠落
したアミノ酸、換言すると、それらをとり囲む最も近い
アミノ酸の間の直接結合を表わしている： − 異なるたん白質内で保存されているアミノ酸配列は
枠組みされている。
全ての配列には、Arabidopsis thalianaの2Sアルブミ
ンの真の構造の表示よりもむしろ仮定的モデル（本論述
のための）を表わす、第３図に図表的に示されているよ
うなジスルフィドブリッジに関与しうる８つのシステイ
ン残基（第１のものと第２のものは小サブユニット内、
残りは大サブユニット内）が含まれていることがわかる
だろう。
かかる仮定的モデルは、相似の一定のＣ−Ｃ二重じま
とＣ−Ｘ−C3重じまが観察されたビタミンＤ結合たん白
質（Yang他、1985年）、α−胎児たん白質（フェトプロ
テイン）（Jagodzinski他、1987年;Morinaga他、1983
年）及び血清アルブミン（Brown、1976年）といった動
物性アルブミンのジスルフィドブリッジを媒介としたル
ープ形成にヒントを得たものである。
第２図をみればわかるように、成熟たん白質の第１の
システインと第２のシステインの間、第５のシステイン
と第６のシステインの間、及び第７のシステインと第８
のシステインの間に差し込まれている領域は、かなりの
程度の保存又は類似性を示している。従って、これらの
領域は、或る意味で、植物の中で合成されたときのたん
白質の適切なひだ形成及び／又は安定性にとって非常に
重要であると思われる。この保存に対する１つの例外
は、第６及び第７のシステイン残基の間の距離にある。
このことはすなわち、これらの配置が構造的に重要であ
るが、大サブユニット内で前記第６のシステインと第７
のシステインの間のわずかなアミノ酸保存しかみられな
いところでは幾分かの変化が許されるということを示唆
している。類似の示唆は、エンドウからのビシリンタイ
プの種子貯蔵たん白質を比較したSlightom及びChee（19
87年）によっても行なわれている。これらの著者は実
際、含硫アミノ酸の数を増大させるよう設計されたアミ
ノ酸置換変異は、アミノ酸配列の保存をほとんど又は全
く示していない領域の中に置かれるべきであるというこ
とを示唆している。しかしながら当該著者は、このよう
な修飾が許容されうるという証拠は、遺伝子導入植物の
種子内でテストされる必要があるだろうという結論を下
している。さらに、欠失により修飾された貯蔵たん白質
の特性に関する彼らの論文中に与えられている教示は、
表示レベルに対する影響のみに関するものであり、かか
る貯蔵たん白質の処理に関するものではない。
本発明の実施態様は、2Sアルブミンのうまく選択され
た領域は、遺伝子導入植物の植物細胞内の修飾貯蔵たん
白質の特性及び適切な処理を変えることなく、変異を可
能にする、ということの実証である。
この領域（第３図に拡大して斜線部で図表的に示され
ているところ）は、以下の例において、「超可変領域」
と呼ぶことにする。第３図はまた、前駆物質の小サブユ
ニットと大サブユニットを分離する「IPF」セクション
を含む前駆物質配列のその他の部分のそれぞれの位置な
らびに、たん白質サブユニットシステイン残基のほぼ保
存された部分中のアミノ酸の数（aa）も示している。処
理中の開裂部位（Krebbers他、1988年により決定されて
いるようなもの）は、記号により示されている。
数多くの植物の種子が、上述の貯蔵たん白質とほぼ同
じサイズのアルブミンを含んでいる。しかしながら、言
語上の簡略化のため、本書では、第１図に示されている
全体的構成を伴うペプチド前駆物質をコード化する遺伝
子を有し、ジスルフィドブリッジにより結合された２つ
のサブユニットから成る最終的形状にまで処理される種
子たん白質を指して、「2Sアルブミン」という語を用い
ることにする。適当なアミノ酸の含有量が増大した植物
を生産するための本発明に基づく方法は、再生植物細胞
から又は一世代又は数世代にわたりかかる再生植物細胞
から得られた植物の種子から得られた植物を栽培するこ
と［なおここでかかる植物内で複製可能なかかる植物細
胞の遺伝的財産又は情報には、前記植物のシグナルペプ
チドを含む2Sアルブミンの前駆物質の少なくとも一部分
をコード化するmRNAの転写されうる、植物プロモータの
制御下に置かれた核酸配列が含まれ、かかる核酸を以下
「前駆物質コード化核酸と呼ぶ］を含み、 ・ 前記核酸には、ヌクレオチド配列（以下「関連配
列」と呼ぶ）が含まれ、この関連配列には、この配列内
でインサートをとり囲む未変更部分と共にリーディング
段階にてオープンリーディングフレームを形成するこの
異種核酸インサートにより修飾された可欠領域が含まれ
ていること、 ・ 前記インサートには、適当なアミノ酸を含むポリペ
プチドをコード化するヌクレオチドセグメントが含まれ
ていること、 を特徴とする。
前述の条件の下で、栽培された植物の各々全ての細胞
には変更された核酸が含まれることになる、ということ
がわかるだろう。それでも前述の組変え型又は雑種配列
は、その表現がどの植物プロモータ上で行なうべきもの
として選ばれたかによって栽培された植物の唯一又はほ
とんど一定の定められた器官内で或は又構成的に、高い
レベルで表現されることになる。種子特異性のプロモー
タの場合、雑種貯蔵たん白質はほとんど種子内で生産さ
れる。
前記「異種核酸インサート」は、少なくとも部分的
に、関係する植物細胞の2Sアルブミンの前駆物質をコー
ド化する天然核酸とは異種（外来性）のものであり適当
なアミノ酸をコード化する可能性のあるヌクレオチド配
列を含む１つのインサートから成るということが理解で
きるであろう。最も一般的には、前記適当なアミノ酸を
含むポリペプチドをコード化するセグメントはそれ自
体、前記貯蔵たん白質の前駆物質をコード化する天然核
酸とは異種（外来性）のものである。それでも「異種核
酸インサート」という語は、前記植物細胞の遺伝的財産
又は情報内に通常存在する前述のようなセグメントを含
むインサートにも拡大され、このときこのインサートの
「異種」性は、このインサートをとり囲むさまざまな遺
伝的環境に対して向けられる。
本発明に従った方法の前述の定義中において、前駆物
質をコード化する前記核酸の関連配列のいわゆる「可欠
領域」は、その中に前記インサートを挿入すること又は
かかるインサートによりこの可決領域の少なくとも１部
分を置換すること（しかもかかる雑種貯蔵たん白質の安
定性及び適切な処理ならびに前述のたんぱく粒内へのそ
の輸送を妨害しない）によって変更されうるヌクレオチ
ド配列をもつ領域から成る。かかるインサート又は置換
から成り適当なアミノ酸を含むポリペプチドに対するコ
ード化領域を表わす配列は、合成オリゴマーとして或は
又Brown、1986が考えたようにその他の遺伝子から分離
された制限フラグメントとして入れられる可能性があ
る。雑種貯蔵たん白質の全長は、未修飾2Sアルブミンの
全長よりも長くても短くてもよい。
修飾されるべき領域の選択に関しては、本発明は、こ
の分野において行なわれてきたその他の研究から明らか
に区別することができるものである。Vicia faba（ソラ
マメ）からのレグミン遺伝子（グルテン及びプロラミ
ン）を生体外でメチオニンをコード化する配列で変更し
たAkademie der Wissenschaftender DDRからのDD−Ａ−
240911の特許を参照されたい。インサートの場所として
は、天然に発生するPst I部位（サイト）が選ばれた。E
MBO研究集会「植物貯蔵たん白質遺伝子」（Breisach,FR
G、1986年９月）において、著者はその研究を発表し、
聴衆に対し、植物の形質転換の実験は修飾遺伝子を用い
て開始されたばかりであることを報告した。それ以上の
結果はまだ発表されていない。
Radke他、1988年の特許出願明細書第WO−Ａ−8710729
9号及び相応する公示も同様に参照されたい。これらの
論文は、５つの連続したメチオニンを含む９つのアミノ
酸残基をコード化するヌクレオチド配列による、Brassi
ca napusの2Sアルブミンをコード化するナピン遺伝子の
変更について記述している。修飾領域は、成熟たん白質
をコード化する領域内の天然に発生するSst I部位（サ
イト）である。このような変更は、システイン残基に直
ぐ隣接する挿入、さらには２つのシステイン即ちその長
さが強力に保存されている大サブユニットの第２及び第
３のシステインに相当する成熟たん白質の第４及び第５
のシステインの間の領域内での挿入を結果として導く
（前述部参照）。我々は、かかる変更が2Sアルブミンの
正常なひだ形成及び安定性を混乱させる可能性があると
考えている（EP87402348.4も参照のこと）。その上、上
述の参考文献は、望まれる変更された2Sアルブミンがう
まく合成され、適切に処理又はターゲディングされたと
いう証拠を全く提供していない。
本発明においては、上述の前記物質コード化核酸は、
当然のことながら、本発明を目的として栽培されるもの
と同じ植物種に由来するものであってもよい。しかしな
がら、これは、すでに記録されているBeachey他、1985
年及びOkamuro他、1986年の教示に従って、別の植物種
から来るものであってもよい。
同様に、植物プロモータは同じ植物種からのものであ
っても別の植物種からのものであってもよいが、後者の
場合、それを認識する宿主植物のポリメラーゼの能力を
条件とする。これは、構成的に作用してもよいし、或は
又種子特異プロモータといったような（ただしこれに限
られているわけではない）組織特異的な形で作用しても
よい。
小サブユニットの終り、大サブユニットの初め又は終
りにある領域といった領域は、たん白質の最終的特性に
対し大きな影響を全くもたないと仮定できるものとして
保ちうるような規模の相違しか示さない。しかしながら
小サブユニットの極端のカルボキシル末端基及び大サブ
ユニットのアミノ末端基は、内部処理フラグメントの処
理に関与する。不可欠と思われない領域は、天然たん白
質の第６及び第７のシステインの間、但しこれらのシス
テインに直ぐ隣接せずこれらから少なくとも３アミノ酸
分離された大サブユニットの中にある領域の中央位置か
ら成る。従って、アミノ酸残基のレベルでの類似性の欠
如に加えて、長さの相違が現われ、これがこの領域を最
長の2Sアルブミン内の置換及び最短の2Sアルブミン内の
アミノ酸の付加又は両方の伸長にとって好適な領域にし
ている。このことは、前記第６及び第７のシステインの
間の同じ領域の最初の第３部分の終りにほぼ近いところ
でも適用可能でなくてはならない：その他の例示された
2Sたん白質の相応する領域に比べこの領域においてはる
かに短いR.communisの配列を参照のこと。
当然のことながら、他のところでは著しい相違を示す
たん白質の類似の部分の整列に関するような任意の選択
に基づく仮定に対し用心しなくてはならないということ
がわかる。それでもこのような比較は、遺伝学のその他
の分野においては、異なる供給源の類似したたん白質中
で、外来性の又は異種の配列によりなお局所的に修飾さ
れた同じたん白質内の未修飾たん白質のいくつかの基本
的特性を保存しようとする場合に、かかるたん白質のど
の部分を修飾することができどの部分が修飾できないか
を、一方では局所的構造上の相違又は他方では局所的類
似性から合理的に推論するための適切なガイダンスを当
業者に提供するものであることが立証されている。
本発明に基づく方法中で用いるべき適切な可欠領域の
選択は同様に、適当なアミノ酸を含むポリペプチドの長
さにも左右される。基本的には、本発明に基づく方法
は、最高100のアミノ酸をコード化する配列を前駆物質
核酸の中に挿入及び／又は部分的に置換することによ
り、かかる2Sアルブミンの修飾を可能にする。
2Sアルブミン内に挿入すべき領域の完全なたん白質配
列が決定されている場合、かかるたん白質配列をコード
化するためのヌクレオチド配列が決定されなくてはなら
ない。おそらく絶対に必要なことではないものの、コー
ド化核酸のコドン使用法はできるかぎり修飾される遺伝
子のものと類似したものでなくてはならない、というこ
とがわかるだろう。
当業者は、かかるコドン使用法を決定するため適当な
コンピュータ解析手段を用いることができよう。
選択された前駆物質コード化核酸の一部分に対しイン
サートを置換するため又は、それをこの前駆物質コード
化核酸の適当な領域内に挿入するため、適当ないかなる
遺伝子工学技法でも用いることができる。キメラ遺伝子
を作るためには、一般的な生体外組換え技法及びそれに
続く細菌内クローニングを用いることができる。以下に
さらに例示されているように同じ目的のために、部位指
向突然変異誘発を用いることができる。植物細胞の形質
転換に適したプラスミドのような組換えDNAは同様に、
一般技術文献内に開示されている技術に従って生成する
こともできる。最後に、選択された前駆物質コード化核
酸の関連部分によりコード化された雑種貯蔵たん白質を
表現させることのできる形質転換された植物細胞の生産
に対しても同様のことが言える。一例を挙げると、この
目的のための適当な技術を開示する公示済みの欧州特許
出願明細書第116,718号又は国際特許出願明細書を参照
することができる。
適当なアミノ酸が豊富な配列を設計するにあたって
は、かかる適当なアミノ酸を含む結果として得られたペ
プチドが修飾2Sアルブミンの安定性に影響を及ぼすこと
がないよう注意を払わなくてはならない。実際、或る種
の挿入はたん白質の構造を混乱させる。例えば、メチオ
ニンの長い伸張の結果、棒状のらせんが現われ、これが
正常なひだ形成パターンの混乱による不安定性を導くこ
とになる可能性もある。従って、このような配列には場
合によって、らせん構造を遮断するアミノ酸を含んでい
なくてはならない。
以上に開示した手順は、栄養特性を伴う適当なアミノ
酸を含むペプチドをコード化するDNA配列を含む異種イ
ンサートによる2Sアルブミンのうちのいずれかの可欠領
域の適切な修飾、そして次に、関連植物の細胞内での前
記ペプチドの配列を含む雑種たん白質の生産のための得
られたキメラ遺伝子での関連植物の形質転換に適用され
る。言うまでもないことであるが、当業者はあらゆる場
合において、前記雑種貯蔵たん白質の最高の生産収量を
達成するため、既存の技法のうちのいずれかがかかる修
飾済植物の生産の各段階のレベルでその必要性を最も良
く全うするかを選択することができるであろう。
例えば、相応する前駆物質コード化核酸が配列づけさ
れた場合にメニオニン及び／又はリジン及び／又はトリ
プトファン及び／又はトレオニン及び／又はフェニルア
ラニン及び／又はロイシン及び／又はバリン及び／又は
イソロイシンをコード化するヌクレオチドコドンを前記
2Sアルブミンの中に挿入することにより、栄養価の増大
した植物を生産するための適切なベクターとして使用す
べく2Sアルブミンの能力を月用するために、以下の方法
を用いることができる。かかる方法には、このとき、次
のような段階が含まれている： １）部分的にインサートで置換するかかかるインサート
をその中に挿入することにより変更されうるペプチド配
列をコード化する可欠領域を含む前駆物質コード化核酸
の前記関連配列の１つを位置決定し選定する段階。なお
かかる変更は前記2Sアルブミンの立体配置の保存と相溶
性があり、しかもこれは好ましくは、前記2Sアルブミン
の成熟たん白質又はたん白質サブユニット内の連続する
システイン残基をコード化するコドンの相対的位置を見
極め、前記物質コード化核酸の前記サブ配列内で前記コ
ドンの上流、間及び下流にある相応する連続した核酸領
域を識別し、これらの連続した領域の中で、複数の植物
種内のアミノ酸配列の大部分の保存を正に示しているそ
の他の領域に比べて植物種に応じたアミノ酸配列又は長
さのいずれか又はその両方における可変性を受けている
ような部分を識別することによって行なわれ、かかるヌ
クレオチド領域の１つは次に、以下に記述するようにそ
の中に核酸インサートを挿入するために選定される。
１つの変形態様は、将来利用可能になる可能性のある
何らかの３−Ｄ構造の研究から成るものである。
２）前記適当なアミノ酸の全て又は一部分を含むペプチ
ドをコード化する決定されたセグメントを含む核酸イン
サートを、前記関連配列の未修飾部分と適当なリーディ
ングフレーム関係を成して前記前駆物質核酸の選定され
た領域内に挿入する段階。
３）完全種子形成植物に再生されうる植物細胞の形質転
換に適したプラスミド内に得られた修飾済前駆物質コー
ド化核酸を挿入する段階。なおここでかかる挿入は、制
御要素特に前記植物内でそれと結びつけられたオープン
リーディングフレームの表現を提供することのできる植
物プロモータの制御下にある。
４）かかる修飾済プラスミドでかかる植物細胞の培養を
形質転換する段階。
５）雑種貯蔵たん白質をコード下するキメラ遺伝子の表
現を分析する段階。そしてこれが達成された時点で ６）得られた形質転換済植物細胞から前記植物を再生
し、かかる植物を成熟するまで育てる段階。
キメラ遺伝子が種子特異性プロモータの制御下にある
場合、形質転換された植物の種子に至るまでの成育は、
ステップ51の前に行なわれなくてはならない。
したがって、上述の本発明の１）に記述されている実
施態様は、雑種2Sアルブミンを植物内に入れる時点でこ
れは、膜の転座中植物たん白質のジスルフィドイソメラ
ーゼを通過しこうして、一方ではその正常な前駆物質状
態におけるように雑種前駆物質内で適正なジスルフィド
ブリッジが形成される確率が高くなる。
本発明はさらに、本発明に基づく方法において使用す
るための組換え型核酸自体、特に以下のものに関する： − 当該方法の流れの中で構成された核酸をコード化す
る組換え型前駆物質。
− それが核酸をコード化する前記前駆物質のものと同
じDNAからくるものであれ、この前駆物質コード化核酸
が誘導される同一植物のもう一つのDNAからくるもので
あれ或は又、もう一つの植物のDNA、又は植物内での遺
伝子生産を導くことができることを条件として非植物生
体からくるものであれ、植物プロモータの制御下で前記
変更済前駆物質コード化核酸を含む、組換え型核酸。
− ベクター、さらに詳細に言うと植物プラスミド、例
えば、前記植物細胞の形質転換において用いるため前述
の組換え型核酸のいずれかにより修飾されたTi誘導プラ
スミド。
本発明は同様に、種子形成植物の完全な植物又は種子
へと再生されうる種子形成植物の細胞内に形成される雑
種2Sアルブミンの再生可能な供給源において、前記植物
又は種子は前記植物細胞の再生の結果として得られた植
物の単数又は複数の世代の結果として得られたものであ
り、さらにかかる植物細胞又は種子の遺伝的情報を支持
するDNAには、植物特異プロモータの制御下にありこの
植物の2Sアルブミンの前駆物質に相当するmRNA内に転写
されうるシグナルペプチドをコード化する配列を含む核
酸又はその一部分が含まれていること。
・ 前記核酸配列には、成熟2S貯蔵たん白質をコード化
する関連修飾配列又はかかる成熟2Sアルブミンの単数又
は複数のサブユニットについてコード化する複数のサブ
配列のうちの１つが含まれていること、 ・ さらに、かかる関連配列の修飾はその可欠領域のう
ちの１つの中で起こり、関連配列内でそのインサートを
とり囲む未修飾部分と共にリーディング段階でオープン
リーディングフレームを形成する異種核酸から成るこ
と、 ・ 前記インサートは、メチオニン及び／又はリジン及
び／又はトリプトファン及び／又はトレオニン及び／又
はフェニルアラニン及び／又はロイシン及び／又はバリ
ン及び／又はイソロイシンを含むペプチドをコード化す
るヌクレオチドセグメントで構成されていること を特徴とする供給源にも関する。
本発明がそれに限定されるものとみなされてはならな
いものの、前述の適切なアミノ酸をコード化する核酸イ
ンサートはほとんどの場合において人工的な合成オリゴ
ヌクレオチド又は原核生物又は真核生物遺伝子から又は
原核生物又は真核生物RNAから誘導されたcDNAから誘導
されたオリゴヌクレオチドであり、これらは全て通常そ
の内容の如何に関わらず生物学的方法を通して本発明の
植物細胞又は種子の適当な場所に挿入されうるあらゆる
可能性から免れる、ということを考慮すべきである。換
言すると、これらのインサートは、特にそれが、遺伝的
に完全に無関係であり従って天然交雑方法を含む標準的
生物学方法によりいかなる遺伝物質も交換することので
きない異なる種類の植物の中に挿入されうるという点
で、「非植物品種特異性」のインサートである。
従って、本発明はさらに、前記形質転換された植物細
胞又は種子から得られた種子形成植物自体にも関する。
ここでかかる植物は、それらがその細胞内に植物プロモ
ータと結びつけられた前記雑種前駆物質コード化核酸を
有していること、ただしかかる植物の細胞内で前記イン
サートが表現され、相応する雑種たん白質が生成される
こと、を特徴とする。
以下では、2Sアルブミン遺伝子の修飾及び遺伝子導入
植物から得られた種子内でその表現のために用いること
のできる好ましい方法の概要を示す。ここに示されてい
る方法の概要の後には、特定の例が挙げられている。当
業者であれば、この方法をその他の2Sアルブミン遺伝子
の修飾のために適合させることも可能であることが理解
されるであろう。
1.栄養特性を有する適当なアミノ酸を含むペプチドをコ
ード化する配列による、2Sアルブミン遺伝子の超可変領
域の置換又は補足。
2SアルブミンのcDNA又はゲノミッククローンのいずれ
を用いることも可能である。第２図内の遺伝子の超可変
領域の配列の比較は、これらの配列の長さが変化するこ
とを示している。従って、適当なアミノ酸を含むペプチ
ドをコート化する配列が短く、比較的短い超可変領域を
もつ2Sアルブミンが用いられる場合、前記該当配列を挿
入することができる。そうでなければ、適当なアミノ酸
を含むペプチドをコード化するより大きいセグメント又
は配列を含むインサートにより置換されるべく、超可変
領域の一部分が除去される。いずれの場合でも、修飾さ
れた雑種2Sアルブミンは天然のものよりも長い可能性が
ある。いずれの場合でも、２つの標準的な技術を適用す
ることができる：すなわち、適切な制限部位を活用する
ことができるし、又は突然変異誘発ベクター（例えばSt
anssens他、1987年）を用いることもできる。両方の場
合において、メッセージのリーディングフレームを維持
するよう注意を払わなくてはならない。
使用される貯蔵たん白質の前駆物質のシグナルペプチ
ドをコード化する配列は、この前駆物質に属するか、又
は異種貯蔵たん白質の単数又は複数のシグナルペプチド
についてコード化する代理配列でありうるかのいずれか
である。
2.変性2Sアルブミンコード化領域は、植物プロモータの
制御下に置かれる。好ましいプロモータとしては、35S
プロモータとも呼ばれる35Sトランスクリプトを導くカ
リフラワモザイクウイルスからのプロモータ（Odell,J.
T.他、1985年）;35S3プロモータとも呼ばれる、CAMV分
離株Cabb−JIからの35Sプロモータ（Hull及びHowell、1
987年）;T−DNAの１′及び２′の両遺伝子の表現を駆動
する両方向TRプロモータ（Velten他、1984年）などの、
強い構成性外生植物プロモータが含まれる。
代替的には、構成性ではなく、植物の１つ又は複数の
組織又は器官に対し特異性のあるプロモータを用いるこ
とができる。例を挙げると、この種のプロモータは、光
合成活性を伴う組織内での表現が望まれる場合には、リ
ブロース−１、５−ジーリン酸カルボキシラーゼの小サ
ブユニット遺伝子の光誘発性プロモータであってもよい
し（米国特許出願明細書821,582号）又は、種子特異性
プロモータであってもよい。
種子特異性プロモータは、その後種子のみの中で表現
させるために用いられる。種子は重要な食料又は飼料源
を成すため、これは特に有用でありうる。その上、この
特異的表現により、植物のその他の部分に対する考えら
れるストレスを避けることができる。原則として、修飾
された2Sアルブミンのプロモータを使用することができ
る。しかしこれは必要なことではない。同じ目的に役立
つその他のいかなるプロモータでも使用可能である。プ
ロモータは、形質転換すべき植物種内でのその効率レベ
ルに従って選ぶことができる。以下の例では、Arabidop
sisからの2Sアルブミン遺伝子からの2Sアルブミンが用
いられており、これは、これらの例において変更される
2Sアルブミン遺伝子の天然プロモータである。言うまで
もないことではあるが、大豆からのコングリシニンプロ
モータといったその他の種子特異性プロモータを用いる
こともできる。キメラ遺伝子がそのように構築される場
合には、修飾された遺伝子又は使用中のプロモータをも
つ遺伝子から、シグナルペプチドコード化領域も含まれ
ていなくてはならない。キメラ遺伝子の実際の構築は、
Maniatis他、1982年の中で記述されている標準的な分子
生物学的技法を用いて行なわれる。（例参照）。
3.キメラ遺伝子の構成は適当な宿主植物内に伝達され
る。
キメラ遺伝子又は修飾遺伝子が完全である場合、これ
は全体が植物形質転換ベクター内に伝達される。Agroba
cterium tumefaciens（アグロバクテリウム・ツメファ
シエンス）から誘導された無力化された（非発ガン性）
Ti−プラスミドに基づき、二元性及び共組込みの両方の
形で、これらの広範な種類のものが利用可能である（De
Blaere他、1987年）。通常抗生物質抵抗性（耐性）で
ある形質転換用の選択可能な標識を含むベクターが選択
されるべきである。同様に、植物形質転換方法も数多く
あり、個々の植物に適合させられている。大部分は、成
体植物からの小さな組織片の形成（Horsch他、1985年）
又は原形質体（プロトプラスト）形質転換（Marton他、
1979年）のいずれかに基づくものである、以下の例で
は、ベクターは、二元性無力化Ti−プラスミドベクター
であり、標識はカナマイシン抵抗性（耐性）であり、リ
ーフディスク式形質転換方法が用いられる。
形質転換手順からの仮骨（Calli）は、選択可能な標
識に基づいて選択され、適当なホルモン誘導により成体
植物へと再生される。これも同様に、使用中の植物種に
より変化する。再生された植物は次に、種子を収穫する
元となる安定した系統を組立てるのに用いられる。
本発明のその他の特徴は、特に以下のものを含む図面
に基づき、特定の（実施例を制限的意味なく開示するに
つれて明らかとなることだろう。
− 第１図、第２図及び第３図は、すべに述べたような
2S−アルブミンの全体的特徴に関するものである。数字
は、たん白質前駆物質のさまざまなフラグメント内に見
られたアミノ酸の数である。
− 第４図は、Arabidopsis thaliana2Sアルブミン遺伝
子を含む1kbフラグメントの配列を表わし、関連する元
素を示している。
Nde I部位に下線がほどこされている。
− 第５図は、関連するオリゴヌクレオチド配列と共に
上述のArabidopsis2Sアルブミンの大サブユニットのた
ん白質配列を与えている。
− 第６図は、超可変領域のほぼ全ての部分の欠失及び
Acc I部位によるその置換、特に部位指向突然変異誘発
を通したAcc I部位内への、以下の開示中例を用いて与
えられているメチオニンコドンが豊富なDNA配列の挿入
及び植物形質転換に適した植物ベクター内での前記キメ
ラ遺伝子のクローニングを含む、キメラ2SアルブミンAr
abidopsis thaliania遺伝子の構築の連続した段階を図
式的に示している。
− 第６図Ｂは、複数のArabidopsis2Sアルブミンの大
サブユニットのたん白質配列を図式的に示し、かかる2S
アルブミンをコード化する遺伝子から除去された領域を
指示している。また、この図は、Acc I部位がどこで作
り出されたか及びオープンリーディングフレームが維持
されるような形でメチオニンコドンの豊富なオリゴヌク
レオチドがこのAcc I部位内にいかに挿入されるかを、
図式的に示している。
− 第７図は、大部分の超可変領域が欠失されている未
修飾2Sアルブミンならびに修飾2Sアルブミンの大サブユ
ニットのたん白質配列を図式的に比較している。結果と
して得られるメチオニン残基の数が示されている。
− 第８図は、前記部位指向突然変異誘発の実行に適し
たプラスミドの制限部位及び遺伝地図を示している。
− 第９図は、適当な場所での核酸の変更に対し一般に
適用可能であるようなStanssens他（1987年）の部位指
向突然変異誘発手順のさまざまな段階を図式的に示して
いる。
− 第10図は、pGSC1703Aの制限地図を与えている。
例I: 記述されている方法の第１の例として、その超可変領
域を欠失させ例えばIMMMMRMという配列もつ７つのアミ
ノ酸を有するメチオニンの豊富なペプチドにより置換さ
せたArabidopsis thalianaからの修飾2Sアルブミンたん
白質をそのゲノム内に挿入された形で有することによ
り、栄養価の増大した遺伝子導入植物種子を生産するた
めの１つの手順が与えられている。かかるペプチドをコ
ード化するオリゴマーが、Arabidopsis thalianaの2Sア
ルブミンをコード化するゲノミッククローン内の超可変
領域のほぼ全ての部分に置換させられる。第６及び第７
のシステイン残基に隣接するわずかなアミノ酸のみが残
った。このキメラ遺伝子は、その天然プロモータ及びシ
グナルペプチドの制御下にある。このプロセス及び構成
は、第6A図、6B図及び第７図に図式的に示されている。
構成概念全体は、Agrobacteriumを媒介とする形質転換
系を用いて、タバコ、Arabidopsis thaliana及びBrassc
ica napus植物に伝達される。Brassica napusは、この
作物が動物の飼料用のたん白質源として広く用いられて
いることから特に有利である。
植物は再生され、開花の後種子が収集され、メチオニ
ン含有量が未形質転換植物と比較される。
1.Arabidopsis thaliana2Sアルブミン遺伝子のクローニ
ング Arabidopsis thaliana遺伝子は、Krebbers他（1988
年）に記述されていることに従ってクローニングされ
た。かかる遺伝子を含むプラスミドはpAT2S1と呼ばれ
る。AT2S1と呼ばれる遺伝子を含む領域の配列は、第４
図に示されている。
2.AT2S1遺伝子の超可変領域の欠失及びAcc I部位による
置換 AT2S1の超可変領域の一部分は、以下のオリゴヌクレ
オチドにより置換される： なおここで下線のほどこされた配列はAcc I部位を表
わし、周囲の配列は、保持すべきArabidopsis2Sアルブ
ミン遺伝子の超可変領域のコード化配列に対する相補的
配列を表わす。この結果最終的に、オリゴヌクレオチド
の下に示されているアミノ酸配列が得られる。
AT2S1の超可変領域をコード化する配列の一部分の欠
失及び置換は、オリゴヌクレオチドをプライマとして部
位指向突然変異誘発を用いて行なわれる。Stanssens等
（1987年）のシステムが用いられる。
Stanssens等の方法は、欧州特許EP87402384.4号に記
されている。これは、第８図にその制限及び遺伝地図な
らびに関連する遺伝子座が示されているようなプラスミ
ドpMac5−８を使用する。矢印はその機能的方向づけを
示している。
fdT:ファージfDの中央転写ターミネータ（終了暗
号）:F1−ORI:繊維状ファージf1の複製原点;ORI:ColE1
タイプの複製原点;BLA/ApR:ペニシリナーゼについてコ
ード化する領域;CAT/CmR:クロラムフェニコールアセチ
ルトランスフェラーゼについてコード化する領域。
pMc5−８（bla−am遺伝子はSca I部位を含んでいな
い）及びpMc5−８（cat−am；突然変異は唯一のPvu II
部位を削除する）内に存在するアンバー突然変異の位置
が示されている。supE及びsupE宿主の両方内のcat（ネ
コ）アンバー突然変異の抑圧は、少なくとも25μg/mlの
Cmに対する抵抗性（耐圧）を結果としてもたらす。pMc5
−８は、それぞれsuPE及びsupF株内のアンバー抑圧時点
で、±20μg/ml及びμg/mlのApに対する抵抗性（耐圧）
を与える。野生型のネコ遺伝子内に存在するEcoR I、Ba
l I及びNco Iの部位（星印で示されている）は、突然変
異誘発技術を用いて除去された。
上述の置換のために広く用いられる突然変異誘発は基
本的に、以下のとおりに行なわれる、Ap及びCm選択可能
標識内のアンバー突然変異が閉じた円により示されてい
る第９図を参照する。▲という記号は、突然変異誘発性
のオリゴヌクレオチドを表わしている。突然変異自体
は、矢印の頭で示されている。
プロセスの個々の段階は以下のとおりである： − pMa5−８へのAT2S1遺伝子のコード化領域を含むPAT
2S1のHind IIIフラグメントのクローニング（Ｉ）。こ
のベクターはCmR遺伝子内でアンバー突然変異を行な
い、アンピシリンに対する抵抗性（耐性）を特定する。
結果として得られたプラスミドはpMacAT2S1と呼ばれる
（第6A図ステップ１参照）。
− 偽ウイルス粒子からのこの組換え体の一本鎖DNAの
調製（II）。
− 相補的pMCタイププラスミド（III）からのHind III
制限フラグメントの調製。pMCタイプのベクターは、Ap
抵抗性（耐性）標識内にアンバー突然変異が取り込まれ
る一方で、野生型CmR遺伝子を含む。
− 生体外DNA/DNA交雑によるギャップ二重鎖DNA（以下
gdDNAと呼ぶ）gdDNAの構築（IV）。gdDNAの中で、標的
配列は一本鎖DNAとして露呈されている。交雑混合物の
その他の構成成分からのgdDNAの予備純化は必要でな
い。
− gdDNAへの30−mer合成オリゴヌクレオチドのアニー
リング（Ｖ）。
− 残りの一本鎖ギャップ内の充てん及び、同時の生体
外KlenowDNAポリメラーゼI/DNAリガーゼ反応によるニッ
クの密封（VI）。
− mutS宿主すなわち、Cm抵抗性（耐性）について選定
するミス対合修正が欠乏した株である、 、の形
質転換。この結果、混合プラスミド後代が生産される
（VII）。
− アンバー突然変移を抑圧できない宿主の再形質転換
による鋳型鎖（pMaタイプ）から誘導される後代の除去
（VIII）。Cm抵抗性（耐性）についての選択の結果、ギ
ャップのある鎖つまり突然変異誘発性のオリゴヌクレオ
チドがその中にとり込まれた鎖である、 、から誘導
された後代は豊富になる。
− 望ましい突然変異の存在についての再形質転換の結
果得られたクローンのスクリーニング、AT2S1の欠失し
た超可変領域を含む、結果として得られたプラスミドは
pMacAT2S1C40と呼ばれる（第6A図ステップ２参照）。
3.超可変領域をコード化する配列が欠失したAT2S1遺伝
子内への、メチオニンコドンが豊富な配列の挿入。
上述のとおり、超可変ループの大部分をコード化する
配列が除去された時点で、Acc I部位が所定の位置に挿
入された。問題の配列は、このAcc I部位内に挿入され
ることになるが、第２のAcc I部位も同様に、変更され
た遺伝子を含むHind IIIフラグメント内に存在する。従
って、変更された遺伝子を含むNde I−Hind IIIフラグ
メントは、Mde I及びHind IIIで同様に切断されたクロ
ーニングベクターpBR322へとサブクローニングされる
（Bolivar、1977年）。2Sアルブミン遺伝子内のNde I部
位の位置は、第４図中に示されている。結果として得ら
れるサブクローンはpBRAT2S1と呼ばれる（第6A図、ステ
ップ３）。
基本的に、pBRAT2S1内のAcc I部位内に、望ましいい
かなるインサートでも挿入することができる。この例に
おいては、前記インサートは、I.M.M.M.M.R.M.という配
列をコード化する。従って、かかるペプチドをコード化
する相補性オリゴヌクレオチドは、AT2S1のコドン用途
を考慮に入れ、以下に示されているとおり２つの相補的
オリゴヌクレオチドの末端がAcc I部位の千鳥末端に対
し相補的であるように、合成される（オリゴヌクレオチ
ドは太字で示されている）： リーディングフレームがいかにして維持されているか
を示すこの挿入の詳細は、第6B図に示されている。２つ
のオリゴヌクレオチドはアニーリングされ、Acc Iで消
化されたpBRAT2S1で結紮される（第6A図、ステップ
４）。結果として得られたプラスミドは、pAD4と呼ばれ
る。
4.完全な修飾済AT2S1遺伝子のその天然プロモータによ
る再構築 完全なキメラ遺伝子は以下のようにして再構築される
（第6A図参照）：クローンPAT2S1Bgは、遺伝子AT2S1の
コード化領域を含む1.0kbのHind IIIフラグメントのみ
ならず、遺伝子の適切な表現のため全ての必要な調節要
素を含むべく充分な配列をこのフラグメントの上流及び
下流に包含するクローニングベクターpJB65（Botterman
他、1987年）内に挿入された3.6kbのBgl IIフラグメン
トを含んでいる。このプラスミドは、Hind IIIで切断さ
れ、5.2kbフラグメント（すなわち、プラスミドの内AT2
S1のコード化領域を含まない部分）が分離される。クロ
ーンpAT2S1はHind III及びNde Iで切断され、結果とし
て得られる320bpHind III−Nde Iフラグメントが分離さ
れる。このフラグメントは、追加のAcc I部位の複雑さ
無く第6A図のステップ４におけるオリゴヌクレオチドの
挿入が進行できるようにするためpBRAT2S1の構築に際し
（第6A図のステップ３）修飾2Sアルブミンから除去され
たものを表わす。これら２つの分離フラグメントは次
に、３方向結紮において、修飾済コード化配列を含むpA
D4からのNde I−Hind IIIフラグメント（第６図、ステ
ップ５）と結紮される。個々の形質転換体は、数多くの
部位のうちいずれかを用いてBgl IIフラグメント内で再
構築されたHind IIIフラグメントの適当な方向づけをチ
ェックするためスクリーニングすることができる。結果
として得られるプラスミドpAD17は、全体としてBgl II
フラグメント上に含まれ、未修飾遺伝子と同じ側面配列
ひいては同じプロモータによりとり囲まれた超可変領域
でのみ修飾された2Sアルブミン遺伝子から成る。
5.植物の形質転換 キメラ遺伝子を含むBgl IIフラグメントは二元性ベク
ターpGSC1703AのBgl II部位内に挿入される（第10図）
（第6A図ステップ６も参照のこと）、結果として得られ
るプラスミドはpTAD12と呼ばれる。ベクターpGSC1703A
は、E.coli（大腸菌）及びA.tumefaciens（アグロバク
テリウム・ツメファシエンス）の両方における安定性及
び選択のための官能基ならびに外来性DNAの植物ゲノム
内への伝達のためのＴ−DNAフラグメントを含んでいる
（Deblaere他、1987年）。さらにこれは、形質転換され
た植物がカナマイシン及びハイグロマイシンの両方に対
し抵抗性（耐性）をもつように、一方にはcos遺伝子の
３′末端とネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ
たん白質コード化領域（neo）そしてもう一方の側には
ハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子を伴う、２
方向性TRプロモータ（Velten他、1984年）が含まれてい
る。このプラスミドは、アンピシリン抵抗性（耐性）遺
伝子を運んでおらず、従って、感染段階の後にAgrobact
eriumを殺すため、カルベリシエンならびにクラフォラ
ンを用いることができる、標準的な手順（Deblaere他、
1987年）を用いて、pTAD12を、プラスミドpMP90を運ぶ
アグロバクテリウム株C58C1Rifに伝達する（Koncz及びS
chell、1986年）。後者は、植物ゲノムへのＴ−DNA領域
の伝達の成功にとって必要とされるvir遺伝子機能をト
ランスにおいて提供する。このAgrobacteriumは次に、
植物を形質転換するために用いられる。SRI株のタバコ
植物は、標準的手順を用いて形質転換される（Deblaere
他、1987年）。100μg/mlのカナマイシン上で仮骨が選
定され、抵抗性（耐性）ある仮骨が植物再生のために用
いられる。
Arabidopsis thaliana及びBrassica napusの形質転換
のための技法は、同じベクター内で全く同じ構成を用い
ることができるようなものである。上述のようにAgroba
cterium tumefaciensの可動化（授動）の後、Lyoyd他
（1986年）及びKlimaszewska他（1985年）、の手順が、
それぞれArabidopsis及びBrassicaの形質転換のために
用いられる。各々のケースにおいて、タバコの場合と同
様に、100μg/mlのカナマイシン上で仮骨を選定するこ
とができ、抵抗性ある仮骨が植物再生用に用いられる。
３つの種全ての場合において、再生の早期段階で、カ
ナマイシンで補足された培地上の葉から仮骨を誘導する
ことにより、形質転換について再生体をチェックする
（項目６も参照のこと）。
6.形質転換された植物のスクリーニングと分析 ３つの種全ての場合において、再生された植物は、種
を生ずるまで育てられる。さまざまな形質転換済植物は
異なる表現レベルを有するものと予想されるため［「位
置効果」、Jones他、1985年）、最初１つ以上の形質転
換体を分析しなくてはならない。これは原則的にRNAレ
ベル又はたん白質レベルのいずれかで行なわれる：この
場合、種子RNAは記述されているとおりに調製されたも
のであり（Beachy他、1985年）標準的な技術を用いてノ
ーザンブロット法が行なわれた（Thomas他、1980年）。
Brassicaa及びArabidopsisの両方の場合において、キメ
ラ遺伝子全体を用いるとその結果、内生遺伝子との交差
交雑が起こる。2Sアルブミン内の挿入と相補的なオリゴ
ヌクレオチドプローブが用いられた；構築を行なうのに
用いられたものと同じプローブを用いることができる。
各々の種について、１つ又は２つの個々の植物が以下に
記述するようにさらに分析を行なうために選択された。
まず最初に、形質転換された植物の葉の組織からDNA
を調製し（Dellaporta他、1983年）上で用いたオリゴヌ
クレオチドでプローブ検査を行なうことにより、キメラ
遺伝子のコピー数を見極める。
既知の方法を用いて種子のメチオニン含有量を分析す
る（Joseph及びMarsden、1986年）;Gehrke他、1985年;E
lkin及びGriffith、1985年（ａ）及び（ｂ））。
例II 上述の方法の第２の例としては、その超可変領域を欠
失し、例えば IMMMQPRGDMMMIMMMQPRGMMMという配列をもつ24のアミ
ノ酸を有するメチオニンの豊富なペプチドにより置換し
たArabidopsis thalianaからの変更2Sアルブミンたん
白質をそのゲノムに挿入させた形で有することにより、
栄養価の増大した遺伝子導入植物種子を生産するため
に、同じ手順に従った。
例Ｉについて開示された構成概念から形質転換体に至
るまでの異なるステップの全てが実行されるが、唯一の
違いは、ステップ３において以下のオリゴヌクレオチド
が合成されpBrAT2S1内に挿入されたという点にある（オ
リゴヌクレオチドは太字で示されている）： 関連するプラスミドは第6A図に、挿入の詳細は第6B図
にそして結果として得られた雑種サブユニットのアミノ
酸配列は第７図に示されている。第6A図に示されている
ような関連するプラスミドは、pAD3、pAD7及びpTAD10で
ある。
従って以上の例は、メチオニンが豊富なポリペプチド
をコード化するインサートを中にとり込むための2Sアル
ブミン貯蔵たん白質の変更方法つまり相応する変更され
た前駆物質核酸を含む適当なプラスミドでのタバコ細
胞、Arabidopsis細胞及びBrassica napus細胞といった
植物細胞の形質転換、形質転換された植物細胞の相応す
る植物への再生、種子形成段階に至るまでのその栽培、
種子の回収そして最後に相応する未形質転換植物の種子
に比べてのかかる種子のメニオニン含有量の分析といっ
た形で行なう方法を完全に例示している。
当然のことながら、本発明は上述の例に限られている
わけではない。当業者は各々の場合において、その栄養
価に関して改良したいと考える植物及び修飾された植物
の望ましい適用分野に応じて、2S貯蔵たん白質の超可変
領域内に挿入すべき適当なアミノ酸の望ましい組合せを
選ぶことができることだろう。
以下には、本書で言及されているプロセスのステップ
のいくつかを達成するための既知の方法ならびに本発明
の実行以前に立証された一般的知識に対する参照指示が
なされているかぎりにおいて本開示内で言及されている
参考文献のリストが示されている。かかる論文は全て本
書中に参考として組み入れられているものである。
なおここで、その全てが当業者ならば何らかの発明力
ある作業を行なうことなく利用可能な遺伝物質からそれ
らを再生することができるという構成概念から成るとい
う事実にもかかわらず、 − プラスミドpAT2S1が、1988年10月７日4879としてDS
Mに寄託されていること − プラスミドpMa5−８は、1988年５月３日に4567とし
てまたpMCは4566としてDSMに寄託されていること − プラスミドpAT2S1Bgは1988年10月７日に4878として
DSMに寄託されていること、 − プラスミドpGSC1703aは1988年10月７日に4880とし
てDSMに寄託されていること、 を確認しておきたい。
合計種子たん白質の百分率として表わした2Sアルブミ
ン
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クレッバース，エンノ アメリカ合衆国、カリフォルニア 91803、アルハンブラ、グレンビュー 1724 (72)発明者 ファンデケルクホーフェ，イェール ベルギー国、8021 ロッペン、ロデ・ベ ウケンドリーフ 27 (72)発明者 バレート・デ・カストロ，ルイス ブラジル国、71500、ブラジリア デー エフェ、カーサ 17、エセアガーイエ ネ・ケーイ・14・コンジュント 05 (72)発明者 ガンデール，エウジェン ブラジル国、70258、ブラジリア デー エフェ、エントラーダ・ベー・アパルタ メント・202、エセケーエセ・409・ブロ コ・ベー （番地なし) (72)発明者 ファン・モンターグ，マルク ベルギー国、1050 ブリュッセル、デ・ ストラッサルトシュトラート 120 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 14/415 A01H 1/00 A01H 5/00 C12N 5/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (23)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】栄養価の増大した修飾2Sアルブミンをコー
    ドする組換えDNAであって、植物由来の2Sアルブミンの
    前駆体をコードする第１の核酸配列を含み、ここで該第
    １の核酸配列に対して異種の第２の核酸配列が、該第１
    の核酸配列の該2Sアルブミンの大サブユニットの第４の
    システイン残基をコードするコドンと第５のシステイン
    残基をコードするコドンとの間に位置する領域に挿入さ
    れているかもしくは部分置換し、そして該第２の核酸配
    列が、少なくとも１つの必須アミノ酸を含むポリペプチ
    ドをコードし、それにより非修飾2Sアルブミンと比べて
    少なくとも１つの必須アミノ酸が多くなっている修飾キ
    メラ2Sアルブミンの前駆体をコードする組換えDNA配列
    を提供する、組換えDNA。
  2. 【請求項２】前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配
    列の、前記第４のシステイン残基をコードするコドンの
    下流の３番目のコドンと、前記第５のシステイン残基を
    コードするコドンの上流の３番目のコドンとの間に位置
    する領域に挿入されているかもしくは部分置換してい
    る、請求項１に記載の組換えDNA。
  3. 【請求項３】前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配
    列の、前記第４のシステイン残基をコードするコドンの
    下流の４番目のコドンと、前記第５のシステイン残基を
    コードするコドンの上流の６番目のコドンとの間に位置
    する領域に挿入されているかもしくは部分置換してい
    る、請求項１に記載の組換えDNA。
  4. 【請求項４】前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配
    列の、前記第４のシステイン残基をコードするコドンの
    下流の６番目のコドンと、前記第５のシステイン残基を
    コードするコドンの上流の６番目のコドンとの間に位置
    する領域に挿入されているかもしくは部分置換してい
    る、請求項１に記載の組換えDNA。
  5. 【請求項５】前記第１の核酸が、Arabidopsis種、Brass
    ica種、Ricinis communis、若しくはBertholletia exce
    lsia由来の2Sアルブミンの前駆体をコードする、請求項
    １〜４のいずれか１項に記載の組換えDNA。
  6. 【請求項６】前記第１の核酸が、Arabidopsis thallian
    a若しくはBrassica napus由来の2Sアルブミンの前駆体
    をコードする、請求項５に記載の組換えDNA。
  7. 【請求項７】前記第２の核酸配列が、前記第１の核酸配
    列のArabidopsis thallianaの2Sアルブミンの大サブユ
    ニットのコドン31とコドン57との間に位置する領域に挿
    入されているかもしくは部分置換している、請求項６に
    記載の組換えDNA。
  8. 【請求項８】前記2SアルブミンがAT2S1である、請求項
    ６に記載の組換えDNA。
  9. 【請求項９】前記必須アミノ酸が、リジン、メチオニ
    ン、トリプトファン、スレオニン、フェニルアラニン、
    ロイシン、バリン、アルギニン、およびイソロイシンか
    らなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項
    に記載の組換えDNA。
  10. 【請求項１０】前記第２の核酸配列が、複数の前記必須
    アミノ酸をコードする、請求項９に記載の組換えDNA。
  11. 【請求項１１】前記第２の核酸配列が、GIMMMRMIの配列
    を有するポリペプチドか、若しくはGIMMMQPRGDMMMIMMMQ
    PRGDMMMIの配列を有するポリペプチドをコードする、請
    求項10に記載の組換えDNA。
  12. 【請求項１２】植物の発現可能なプロモーター領域を含
    む作動可能に連結したDNA配列をさらに含む、請求項１
    〜11のいずれか１項に記載の組換えDNA。
  13. 【請求項１３】前記プロモーター領域が前記第１の核酸
    配列に対して異種である、請求項12に記載の組換えDN
    A。
  14. 【請求項１４】前記プロモーター領域が前記第１の核酸
    配列と天然で関連している、請求項12に記載の組換えDN
    A。
  15. 【請求項１５】前記プロモーター領域が種子特異的プロ
    モーター領域である、請求項12〜14のいずれか１項に記
    載の組換えDNA。
  16. 【請求項１６】前記プロモーター領域が、図４の配列表
    のヌクレオチド−431位からヌクレオチド１位までの配
    列を含む、請求項15に記載の組換えDNA。
  17. 【請求項１７】請求項１〜16のいずれか１項に記載の組
    換えDNAによってコードされるキメラ2Sアルブミン。
  18. 【請求項１８】種子形成双子葉植物であって、該植物の
    ゲノムに請求項１〜16のいずれか１項に記載の組換えDN
    Aを含む、種子形成双子葉植物。
  19. 【請求項１９】ArabidopsisまたはBrassicaである、請
    求項18に記載の種子形成双子葉植物。
  20. 【請求項２０】Brassica napusである、請求項19に記載
    の種子形成双子葉植物。
  21. 【請求項２１】請求項１〜16のいずれか１項に記載の組
    換えDNAを含む双子葉植物由来の種子。
  22. 【請求項２２】栄養価の増大した双子葉植物を生産する
    方法であって、 ａ）請求項12〜14のいずれか１項に記載の組換えDNAに
    よって植物のゲノムを形質転換する工程；および任意に ｂ）内部で前記キメラ2Sアルブミンの前駆体が発現して
    いる該植物を栽培する工程、を包含する方法。
  23. 【請求項２３】植物細胞であって、該細胞のゲノムが請
    求項１〜16のいずれか１項に記載の組換えDNAを含んで
    いる、双子葉植物細胞。
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