DD240911A1

DD240911A1 - Verfahren zur herstellung von ernaehrungsphysiologisch verbesserten pflanzensamenproteinen

Info

Publication number: DD240911A1
Application number: DD25907583A
Authority: DD
Inventors: Klaus Muentz; Ronald Bassuener; Gerhard Saalbach; Rudolf Jung; Ulrich Wobus; Winfriede Weschke; Helmut Baeumlein
Original assignee: Adw Der Ddr Zi Fuer Genetik Un
Priority date: 1983-12-31
Filing date: 1983-12-31
Publication date: 1986-11-19

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ernaehrungsphysiologisch verbesserten Pflanzensamenproteinen. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Modifizierung der DNA-Sequenz von Reserveproteingenen, des Transfers dieser Gene in Pflanzenzellen und der nachfolgenden Gewinnung von Pflanzensamenproteinen zu entwickeln. Das erfindungsgemaesse Verfahren ist durch folgende Schritte gekennzeichnet: a) Gewinnung eines vollstaendigen Gens bzw. ein mindestens 80% der Sequenz enthaltenden Teilstuecks eines Pflanzensamenproteins und Verbinden mit einem Klonierungsvektorb)Hybridisierung der entstandenen Rekombinanten-DNA mit einem Oligonucleotidc)Transfer des Hybrids in Bakterienzellend)Selektion der transformierten Zellen und deren Vermehrunge)Konstruktion eines Vektors mit der erhaltenen rekombinierten DNAf)Transfer dieses Vektors in Pflanzenzellen und Gewinnung von Samenproteinen durch Vermehrung dieser Zellen.Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Landwirtschaft.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ernährungsphysiologisch verbesserten Pflanzensamenproteinen. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Landwirtschaft.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Verbesserung des ernährungsphysiologischen Wertes von Pflanzensamenproteinen setzt die Kenntnis der Nucleotidsequenz von entsprechenden pflanzensamenprotein-spezifischen Genen voraus, die dann durch Mutation oder auf gentechnischem Wege verändert werden kann. Genomische DNAmitsamenproteinspezifischen Sequenzen ist bisher für Mais, Weizen, Gartenbohne und Erbsen beschrieben worden (Pedersen et al. Cell 29,1 015-1 026 [1982]; Rafalski et al. EMBO J. 3, 1409-1416 [1984]; Lycettetal. Nucl. Acid Res. 12,4493-4506 [1984]).

Dabei wurde stets von der Etablierung einer genomischen DNA-Ban k ausgegangen, wozu reine DNA aus den Zellkernen der betreffenden Pflanze isoliert worden ist. Nach partieller Spaltung dieser DNA in Sequenzen von geeigneter Länge wurden die DNA-Fragmente in Phagen-DNA als Vektoren eingefügt und derartige rekombinante Phagen zur Klonierung der DNA-Fragmente in passenden Bakterienstämmen vermehrt. Aus der erhaltenen genomischen DNA-Bank selektierte man samenproteinspezifische Gene über Hybridisierung mit cDNA bekannter Spezifität.

Die für die Selektion erforderliche cDNA bekannter Spezifität wurde über die Etablierung einer cDNA-Bank und die nachfolgende Charakterisierung der cDNA-Klone durch Translation der damit jeweils spezifisch hybridisierenden mRNA von Pflanzensamenproteinen ausgeführt. Dazu wurde poly(A)-haltigemRNA aus solchen Entwicklungsstadien der Samen isoliert, in denen die größte Rate der Biosynthese des betreffenden Samenproteins ermittelt worden war, und in der deshalb ein besonders hoher Anteil der entsprechenden spezifischen mRNA erwartet werden konnte. Die poly(A)-haltige RNA oder daraus durch zusätzliche Schritte gewonnene Fraktionen reiner Samenprotein-mRNA diente als Matrize für die Herstellung einsträngiger copy-DNA (cDNA) durch Umkehrtranskription. Nach Synthese des komplementären Stranges zur einsträngigen cDNA konnte die erhaltene doppelsträngige cDNA (ds-cDNA) über Konnektoren in einen günstigen Restriktionsort von geeigneten Plasmidvektoren eingefügt und als Bestandteil des dadurch erzeugten rekombinanten Plasmids in damit transformierten Bakterienstämmen kloniertwerden. Auf diesem Wege wurde in allen Fällen eine cDNA-Bank etabliert, von der jeder cDNA-Kion einer spezifischen mRNA aus der poly(A)-haltigen mRNA der betreffenden Samen komplementär ist und deshalb mit dieser komplementären mRNA spezifisch hybridisiert. Durch Isolierung der mRNA aus den spezifischen cDNA/mRNA-Hybriden, nachfolgende in vitro-Translation der isolierten mRNA und immunologische oder andersartige chemische Analyse des jeweils gebildeten Proteins konnten samenproteinspezifische cDNA-Klone selektiert werden. Die mit Hilfe der samenproteinspezifischen cDNA selektierten genomischen DNA-Sequenzen wurden nach einer geeigneten Strategie mitteis Restriktionsendonukleasen in solche überlappende Fragmente zerlegt, die nach radioaktiver Markierung eine Bestimmung der Nucleotidsequenz zuließen. Dabei wurden gewöhnlich nicht nur die Nukleotidsequenz des protein-codierenden Strukturgens, sondern auch von 5'- bzw. 3'-seitig davon flankierenden Regionen mit regulatorischen Sequenzabschnitten bestimmt. Ein auf diese Weise in seiner Struktur aufgeklärtes Samenproteingen wurde mit Hilfe der DNA-Rekombination in die T-DNA-Region eines Ti-Plasmid-Vektors von Agrobacterium tumefaciens derart eingefügt, daß es hinter dem Octopinsynthetasegen des Plasmids und in gleichem Leserahmen damit vom Octopinsynthetasegen-Promotor reguliert transkribiert werden kann. Durch Rekombination zwischen der das Pflanzensamenprotein tragenden T-DNA-Region des auf die oben genannte Weise konstruierten Ti-Plasmids mit der homologen Region des Wildtyp-Ti-Plasmids in Zellen eines geeigneten Stammes von A. tumefaciens wurden Bakterien erzeugt, mit denen sich Stengel von Sonnenblumenkeimlingen oder Sonnenblumenstengelabschnitte in Gewebekultur infizieren ließen. Infolge der Infektion entwickelten sich Tumoren, was den Einbau der T-DNA in die DNA der ZeIIkerne der Pflanzengewebe zur Voraussetzung hat. Die Expression des auf diese Weise in die Pflanzen-DNA übertragenen Fusionsgens aus Octopinsynthetase- und Samenproteingen konnte durch Hybridisierung der mRNA aus den Tumoren mit spezifischen DNA-Proben für die beiden Gene und durch immunologischen Nachweis des gebildeten Samenproteins bewiesen werden (Murai et al. Science 222,476-482 [1984]). Modifikationen von Samenproteingenen auf gentechnischem Wege sind bisher noch nicht durchgeführt worden.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ernährungsphysiologisch verbesserte Pflanzensamenproteine bereitzustellen. Dieses Ziel soll durch Abwandlung der DNA-Sequenz von Pflanzensamenproteingenen mit Hilfe gentechnischer Methoden erreicht werden, damit in der Aminosäuresequenz der Genprodukte ein erhöhter Anteil essentieller limitierender Aminosäuren enthalten ist und damit eine erhöhte biologische Wertigkeit des betreffenden Proteins erreicht wird. Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Modifizierung der DNA-Sequenz von Reserveproteingenen, des Transfers dieser Gene in Pflanzenzellen und der nachfolgenden Gewinnung von Pflanzensamenproteinen zu entwickeln.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von ernährungsphysiologisch verbesserten Pflanzensamenproteinen ist durch folgende Schritte gekennzeichnet:

a) Das vollständige Gen eines Pflanzensamenproteins oder ein mindestens 80% der DNA-Sequenz des Gens umfassendes Teilstück wird mit einem Klonierungsvektorverbunden.

b) Die entstandene Rekombinanten-DNAwird im geeigneten Bereich des Pflanzensamenproteingens mit einem Oligonucleotid (vorzugswweise mindestens 15 Nucleotide lang) hybridisiert oder ergänzt. Die Hybridisierung erfolgt in an sich bekannter Weise an einsträngiger DNA. Die Ergänzung erfolgt in doppelsträngiger DNA unter Nutzung eines geeigneten Restriktions-Spaltorts, wobei ggf. die Möglichkeiten einer Rasterverschiebung ausgenutzt werden.

Man setzt dabei ein Oligonucleotid ein, das ein oder mehrere Kodonsfür die betreffende limitierende essentielle Aminosäure enthält. Es wird entweder durch Herausschneiden aus Genen oder durch Oligonucleotidsynthese gewonnen. Eine Mindestgröße wird durch die Erfordernisse der sequenzspezifischen Hybridisierung und des genetischen Codes hinsichtlich der Einfügung essentieller Aminosäuren bestimmt.

c) Der erhaltene Hybrid wird ggf. nach dem Prinzip der in vitro-Mutagenese mittels DNA-Polymerase und DNA-Ligase zur doppelsträngigen DNA ergänzt und anschließend in Bakterienzellen transferiert.

d) Aus den vermehrten Kolonien transformierter Bakterienzellen werden jene selektiert, welche die in vitro-mutierte Pflanzensamenprotein-spezifische DNA-Sequenz mit zusätzlichen Kodons für die betreffende limitierende essentielle Aminosäure enthalten. Zur Selektion wird die Hybridisierung mit sequenzspezifischen radioaktiv markierten Oligonucleotidsonden verwendet.

e) Anschließend wird eine ausreichende Menge von der rekombinanten DNA aus transformierten Bakterienzellen des betreffenden selektierten Stammes gewonnen, um damit einen Vektor für die Transformation von Pflanzenzellen zu konstruieren, beispielsweise ein entsprechend modifiziertes Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens. Die Wahl der Ti-Plasmid-Modifikation wird vom experimentellen Ziel bestimmt und betrifft wirtsspezifische Eigenschaften, Sproßbildungs- und Bewurzelungsfähigkeit, Unterdrückung der Tumorentwicklung, Nutzung bestimmter Promotoren, Selektionsmarker o.a. ·

f) Mit dem solcherart gewonnenen Vektor werden Pflanzenzellen transformiert, aus denen man nach Vermehrung in an sich üblicher Weise die in den Pflanzenzellen gebildeten Samenproteine nachweist oder gewinnt.

Als Gen eines Pflanzensamenproteins werden die Gene des Legumins oder des Vicilins der Ackerbohne bzw. entsprechend geeignete Gene von Samenproteinen anderer Leguminosen oder der Getreide, z. B. Glutaline oder Prolamine, eingesetzt. Es können erfindungsgemäß auch Teilstücke eingesetzt werden, die mindestens 80% der DNA-Sequenz des betreffenden Pflanzensamenprotein-spezifischen Gens umfassen und am 5'-Ende vollständig sind.

Ais Klonierungsvektorwird bevorzugt einsträngige Phagen-DNA, insbesondere Derivate von M 13-Phagen-DNA eingesetzt. Für die Hybridisierung bzw. Ergänzung wird ein solches wenigstens 15gliedriges Oligonucleotid aus einem geeigneten Gen, beispielsweise dem Gen für methioninhaltiges Legumin, verwendet, das sich durch Restriktionsenzyme herausschneiden läßt, im Vergleich zum Rezeptorgan zusätzliche Kodons für die betreffende limitierende essentielle Aminosäure, beispielsweise Methionin bei Leguminosenglobulinen oder Lysin bei Getreideprolaminen, enthält und (bei Hybridisierung) einem DNA-Sequenzabschnitt des Rezeptorgens soweit homolog ist, daß die Hybridisierung dorthin gesichert ist.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Oligonucleotid kann auch durch chemische Synthese gewonnen werden. Dabei muß es (bei Hybridisierung) einem DNA-Sequenzabschnitt des Rezeptorgens hinreichend homolog sein, um die Hybridisierung dorthin zu sichern, und im Vergleich zu diesem DNA-Sequenzabschnitt des Rezeptorgens zusätzliche Kodons der betreffenden limitierenden essentiellen Aminosäure enthalten, beispielsweise Methionin für Leguminosenglobuline oder Lysin für Getreideprolamine. Das gewonnene oder synthetisierte Oligonucleotid wird auf der Basis seiner partiellen Sequenzhomoiogie mit dem entsprechenden Abschnitt des Pflanzensamenproteingens in an sich üblicher Weise hybridisiert und durch DNA-Polymerase zum komplementären Strang eines doppelsträngigen DNA-Moleküls ergänzt. Die andere Möglichkeit besteht darin, das Oligonucleotid unter Nutzung eines geeigneten Restriktionsspaltorts einzufügen und dabei ggf. die Möglichkeiten einer Rasterverschiebung auszunutzen, wobei durch geeignete Gestaltung der Oligonucleotidsequenz das Leseraster der nachfolgenden Kodonen abgeändert und eine erhöhte Zahl von Kodonen für die erwünschte AS induziert wird. Die so erzeugte rekombinante in vitro mutierte doppelsträngige DNA wird für die Transformation von in üblicherweise kompetent gemachten Bakterienzellen benutzt, in diesen vermehrt und dadurch auf der Basis der semikonservativen DNA-Replikation in das elterliche und das in vitro mutierte Pflanzensamenproteingen segregiert.

Kolonien von mit dem Phagen- oder Plasmidvektor, der das in vitro mutierte Pflanzensamenproteingen enthält, transformierten Bakterienstämmen werden selektiert, indem man die erhaltenen Oligonucleotide radioaktiv markiert und als Sonde für Koloniehybridisierungen verwendet, oder indem man ggf. die Expression des in vitro mutierten Pflanzensamenproteingens im Wirtsbakterium am synthetisierten Protein mittels immunologischer oder chemischer Methoden nachweist. Die DNA des in vitro mutierten Pflanzensamenproteingens wird dann in an sich üblicher Weise aus dem Vektor isoliert und zur Einfügung in einen weiteren Vektor verwendet, beispielsweise eines vom Ti-Plasmid des Agrobacterium tumefaciens abgeleiteten Vektors, mit dem Pflanzenzellen, beispielsweise Protoplasten geeigneter Leguminosen, transformiert werden. Die DNA des in vitro mutierten Pflanzensamenproteingens kann mit Hilfe eines vektorabhängigen Verfahrens, beispielsweise mit Hilfe der Cokultivierung von Pflanzenprotoplasten und von Agrobakterium tumefaciens-Zellen mit dem konstruierten Vektor, der das in vitro mutierte Pflanzensamenprotein tragende Ti-Plasmid enthält, zur Transformation von Pflanzenzellen der gewählten Rezeptorpflanze verwendet werden. Gleichermaßen möglich ist auch ein vektorfreies Verfahren, z.B. mittels Mikroinjektion oder Liposomentechnik.

Die transformierten Pflanzenzellen werden anschließend in an sich üblicherweise in flüssigen oder auf festen Medien mit geeigneten Nährlösungen vermehrt und ggf. zur Kallusbildung mit nachfolgender Regeneration genetisch stabiler und vererbungsfähiger ganzer Pflanzen benutzt. Diese Pflanzen dienen als Ausgangslinien für die Züchtung von Sorten mit ernährungsphysiologisch verbesserten Pflanzensamenproteinen. Die Bildung der ernährungsphysiologisch verbesserten Pflanzensamenproteine in den Zellen, Geweben oder Organen aus transformierten Pflanzenzellen wird anhand der Produkte der Genexpression, z. B. mRNA oder Pflanzensamenprotein, mit Hilfe von Verfahren der Nucleinsäurehybridisierung oder der chemischen und/oder immunologischen Proteinidentifizierung nachgewiesen.

Das ernährungsphysiologisch verbesserte Pflanzensamenprotein wird auf an sich übliche Weise extrahiert oder durch direkte Nutzung der Gewebe oder Organe z. B. der Samen aus transformierten Pflanzen für den Gebrauch gewonnen. Die Erfindung wird anschließend durch ein Ausführungsbeispiel näher erläutert.

Ausführungsbeispiele

1. Strukturermittlung des vollständigen Legumin-Gens

Der aus der Genbank (siehe WP C 12 N/2590752) isolierte Phage VfLEB4 mit Gensequenzen für methioninfreies Legumin wird durch Restriktionsanalyse und Southern hybridisierung (1 Isoweit charakterisiert, daß ein 1948 bp la ngesSphl-Frag ment definiert werden kann, welches das vollständige Gen für Legumin enthält. Dieses DNA-Fragment wird mit dem vom Phagen M13 abgeleiteten Klonierungsvektor mp18ligiert (2,3)

Der Ligationsansatz enthält:

1 /LtI mp 18 DNA, Sphl gespalten δΟΟμρ/μΙ

2μ\ Sphl-Genfragment 120ng/7tl

5/xl 10 χ Ligationspuffer

ΙμΙΙ-igase 41 μ\ Wasser

Die Ligationsprodukte werden durch Transformation (4) in E.coli-Zellen (JM 109) eingeführt und die gesuchten Klone durch Plaquehybridisierung (1) identifiziert. Der resultierende Klon wird für die Sequenzanalyse verwendet und liefert gleichzeitig die für eine in vitro Mutagenese notwendige einzelsträngige Form des Gens. Unter Verwendung der Methode von Anderson (5) wird die Nukleotidsequenz des Gens bestimmt (siehe Abb. 1). Auf der Basis der Nukleotidsequenz läßt sich die Feinstruktur des Gens genau definieren

Das betrifft z. B.:

— die Regulationssequenzen (TATA box 32 bp vor dem Transkriptionsstart, multiple Signale für die Anfügung des polyA-Stranges);

— die Aminosäuresequenz (aus der Nukleotidsequenz läßt sich die Aminosäuresequenz ableiten);

— die Definition eines 21 Aminosäuren langen Signalpeptids;

— dieExon-lntron-Struktur (das Gen enthält 2 Intronen von 96bp bzw. 100bp Länge);

— die Verteilung von Restriktionsorten (z. B. die Lage für die in vitro Mutagenese benutzten Pstl-Ortes). Die Nukleotidsequenz und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des Gens lautet (Abb.1):

Abb. 1 Nukleotidsequenz des KlonsVfLEB4 mit dem Samenproteingen für Viciafaba-Legumin Typ B und die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz des Proteins (siehe Anlage 1!).

2. Modifizierung des Samenprotein-Gens

2.1. Das Legumin Gen vom Typ B (6) aus Viciafaba wird mit der RestriktionsendonucleasePst I am Ort Nucleotid Nr. 1535 gespalten;

2.2. Oligonucleotide von 16 Nucleotiden Länge der Struktur 3' 5'

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werden an die durch die Wirkung der Restriktionsendonuclease erzeugten 3'-überstehenden einzelsträngigen DNA-Enden anhybridisiert und anschließend kovafent ligiert;

2.3. Es folgt komplementäre Auffüllung der durch die anligierten Oligonucleotide neu erhaltenen 5'-überstehenden einzelsträngigen DNA-Enden durch „end-filling"· nach Maniatis (1), wobei glatte Enden der doppelsträngigen DNA entstehen;

2.4. Im weiteren werden die glatten Enden der doppelsträngigen DNA wieder zu einem vollständigen, aber modifizierten Gen ligiert. Demnach ist die Nucleotidsequenzdes Legumin-Gens vom Typ B von Vicia faba zwischen den Nukleotiden Nr. 1540 und 1650 sowie die daraus abgeleitete Aminosäuresequenz in folgender Weise verändert (Abb. 2):

Abb.2 Nucleotidsequenzdes durch in vitro-Mutagenese ab Nucleotid 1540 abgeänderten Gens für Viciafaba-Legumin Typ B (siehe Anlage 2!)

Die derartig veränderte Aminosäuresequenz enthält damit im Vergleich zur nichtmodifizierten Sequenz zusätzlich vier Reste der limitierenden essentiellen Aminosäure Methionin, vier Cystein- und drei Tryptophanreste, wobei das modifizierte Gen um 28 Nucleotide bzw. um 8 Aminosäuren verlängert wurde.

3. Transformation des Gens in Pflanzenzellen

Das Gen wird in Form eines in dem E. coli Vektorplasmid pKC7 (1) Monierten 4kb Bglll-Fragmentes auf einen vom Ti-Plasmid des Agrobacterium tumefaciens abgeleiteten Vektor übertragen. Die konjugative Übertragung des Legumingens von E. coli auf Agrobacterium wird durch die im E. coli Stamm GJ23 enthaltenen Hilfsplasmide pGJ28 und R64drd11 bewirkt (Abb.3) (7):

Abb.3 Fließschema zum Gentransfer (siehe Anlage 3!)

Durch Selektion auf Agarplatten mit den Antibiotika Rifampicin (100y/ml), Ampicilin (50y/ml) und Kanamycin (25y/ml) werden die Konjugationsprodukte selektiert, bei denen das Fremdgen durch homologe Rekombination in den Ti-Plasmidvektor integriert ist. Als Ti-Plasmidvektoren werden die Plasmide pGV 3850 und pGV 3851 benutzt (8). Die Struktur der konstruierten rekombinantenTi-Plasmidewird durch Southernhybridisierung bestätigt (1). Die konstruierten Agrobacterium-Stämme werden für die Infektion von Pflanzen benutzt.

pGV 3850 ist ein Vektor, dem sämtliche für das Tumorwachstum notwendigen Gene fehlen, ohne daß die Übertragung der T-DNA zusammen mit dem Legumin-Gen in das pflanzliche Genom beeinträchtigt wird. Durch Fehlen der tumorerzeugenden Gene ist eine Regeneration der mit dem Legumin-Gen transformierten Zellen zu ganzen Pflanzen möglich.

pGV 3851 ist ein sproßinduzierender Ti-Plasmidvektor.

Auf dem von diesem Vektor induzierten Wundkallus entstehen zunächst teratomartige Sprosse, die durch mehrmalige Subkultivierung auf wuchsstofffreien Medien normalisiert und letztlich bewurzelt werden. Die Übertragung und Expression des Legumin-Gens in die Rezeptorpflanze wird durch Southern-, Northern-bzw. Westernblotting nachgewiesen (1).

Literatur

1 Maniatis, T., E. F. Fritsch, J.Sambrock:

Molecular Cloning-Α Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

2 Messing, J.: Recombinant DNA Technical Bulletin 2,43-44(1979).

3 Messing, J., R.Crea, P. H. Seeburg: Nucleic Acids Res. 9,309 (1981).

4 Hanahan, D., M.Meselson: Gene 10, 63 (1980).

5. Anderson, S.: Nucleic Acids Res. 9,3015(1981).

6. Horstmann, C: Phytochemistry 22,1861 (1983).

7. van Haute et al.: EMBO J. 2,411-417 (1983).

8. Zambryski et al. Vol. Vl „Genetic Engineering, Principles and Methods" Plenum Press, Eds.: A.Hollaenderand J.Setlow.

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CAA AAC TiMi GTG GTG GOG GAA CAA GCT GGA GAG GAA GAA GGA TTA GAG TAT CTT GTG TTC GEJi ASH Hffi VAL VAL ALA GLU GLM ALA GLY GLU GLU GLU GLY LSU GLU TYR LEU VAL PHE QHPVVAEQAGEBEGLEYLVi"

1480 1490 1500 1510 1520 1530

AAG ACA AAT OAC AGA GCT GCT GTT AGC CAC GTA CAG CAG GTG TTT AGG GCC ACT CCT GCA LYS THR ASM ASP ARG ALA ALA VAL SER HIS VAL GLN GLIi VAL PHE ARG ALA THR PRO ALA KTNDRAAVSHVQQVPRATPA

1540 1550 1560 1570 1580 1590

(JAT GTT CTT GCA AAT GCT TTT GGT CTT CGT CAG CGC CAA GTC ACA GAG TTA AAG CTC AGT

ASP VAL LSD ALA ASN ALA PHE GLY LEU ARG GIuT ARG GLlJ VAL THR GLU LEU LYS LEU SBR DVLAHAPG L -RQRQVTIaLKLS

1600 1610 1620 1630 1640 1650

GCA AAC CGT GGC CCT CTG GTT CAC CCT CAG TCT CAA TCT CAA TCT AAT TGA GAT CAT GCT GLY ASJI ARG GLY PRO LEU VAL HIS PRO GLIi SER GLN SER GLiI SSR ASIi _— GNRGPLVHPQSQSQSN-

1660 1670 1680 1690 1700 1710

AAG GAG TGC AAT AAT GAG ATG GCC ATC TTA TCA TAA ATA ATA AAT TTT GAA TGT ATT GTA

1720 1730 1740 1750 1760 1770

GTA AAG AAC TTC AGT TCC GAT AAT AAA ACA ATA AAG TAT GGC CTT ATT ATC CCA ATC TTA

1780 1790 1800 1810 1820 1830

ATC TAA ATT TGC ATG CAT TTA TAA GTG GCG AAT AAC AAT ATC TTG AAT CAC CTA CAA TTG

1840 1850 1860 1870 1880 1890

CCA TAA TAA AAT GCA TAC ACT TTT TAC TAT AGC TTA TAT GTT TGT TTG AAT CAT ATA AAA

1900 1910 1920 1930 1940 1950

AAC ACA ACT AGA AAT CTG CA? TTT TTC CAT CGG ATT CTT CTT CTT CTA ACT TTC AGA AAC

1960 1970 1980 1990 2000 2010

TCA AAG AAA ATC TGA CAG AAG GTA TTA ACT AAT TTC CCA TGT CAA ATG TGT ATT TGA AAT

2020 2030 2040 2050 2060 2070

AAA AAA AGA AAA CGG TAC CCT AAA AAA CTT TCT CTC CTT AAA TTT TCT ACA AAT TAT ACC

2080 2090 2100

ATG TAA TTA ATT GGA ACA AT

TRASSLA.TED IN 3 SEGMSNTSt SEGMENT SIART STOP

1 746 1294

2 1390 1917

3 2018 2395

SBQtJENCE PRINTED SROM MSE NO. 1 TO BASE NO.2844 3BQUENCE NUMBERED BEGEHUNG WITH BASE NO. 746

BUIlBER Ο? CODONSa 485

NUMBER OP START (ATG) CODONS =» 1 HDMBER OF TERMINATION CODONS» 1 NUMBKR OP UNIDKIiTIPIED CODOIiS= O

TABLE OP CODOlI USAGE AS TRANSLATED ABOVE	PHE PHE LEU LEU	8 6 8 8	1.65% 1.24% 1.65% 1.65%	IJi V-FABA-^LL	SER 8BR SER SER	11 6 6 1	2.27% 1.24% 1.24% .21%	TAT TAC TAA TAG	TYR TYR	7 6 O O	1.44% 1.24%	TGT TGC TGA TGG	CYS CYS TRP	4 1 1 3	.82% .21% .62%
TTT TTC TTA TTG	LGU LEU LEU LEU	17 10 2 3	3.51% 2.06% .41% .62%	TCT TCC TCA	PRO PRO PRO PRO	12 2 13 2	2.47% .41% 2.68% .41%	CAT CAC CAA CAG	HIS HIS GLIi GLti	2 8 20 19	.41% 1.65% 4.12% 3.92%	CGT CGC CGA CGG	AEG ARG ARG ARG	10 7 1 2	2.06% 1.44% .21% .41%
CTT CTC CTA CTG	TTVF. TT₁R ΤΤ,Κ HET	13 10 3 1	2.68% 2.06% .62% .21%	CCT CCC CCA CCG	THR THR THR OHR	1 10 O	1.03% 1.24% 2.06% .00%	AAT AAC AAA AAG	ASN ASH LYS LYS	11 20 4 10	2.27% 4.12% 2^06%	AGT AGC AGA AGG	SER SER ARG ARG	12 5 13 7	2.47% 1.03% 2.68% 1.44%
ATT ATC ATA ATG	VAL VAL VAL VAL	10 1 4 13	2.06% .21% .82% 2.68%	ACT ACC ACA ACG	ALA ALA ALA ALA	8 6 11 .1	1.65% 1.24% 2.27% .21%	GAT GAC GAA GAG	ASP ASP GLU GLU	5 11 22 23	1.03% 2.27% 4.54% 4.74%	GGT GGC GGA GGG	GLY GLY GLY GLY	13 4 15 2	2.68% .82% 3.09% .41%
GTT GTC GTA GTG	GCT GCC GCA GCG

TABLE OP AMIIiO ACID USAGE IH V-J¹ABA-ALL AS TRANSLATED ABOVE

	KO	H0%	UOLA%	iäOLR%	LEU	HO	no% :	MOLA%	UOLR%	ILE	HO	5.37	KOLA%	MOLR%
PHE	14	2.89	3.66	3.78	VAL	48	9.92	9.97	9.98	SER	26	8.47	5.40	5.40
MET	1	.21	.24	.24	THR	28	5.79	5.19	5.10	ALA	41	5.37	6.82	6.56
PRO	29	5.99	5.29	5.17	HIS	21	4.34	3.96	3.90	GLIi	26	8.06	3.67	3.39
TYR	13	2.69	3.73	3.90	LYS	10	2.07	2,46	2.52	ASP	39	3.31	9.03	9.18
ASH	31	6.40	6.49	6.50	CYS	14	2.89	3.24	3.30	TRP	16	.62	3.37	3.38
GLU	45	9.30	10.48	10.67	GLY	5	1.03	.96	.95	???	3	.00	.97	1.03
ARG	40	8.26	11.03	11.47	APPROXIMATE MOLECULAR WEIGHTS»	34	7.02	4.04	3.56	54451.93	O		.00	.00
		63155	.59

IABLS OP BASE COMPOSITION HI V-PABA-ALL AS TRAHSLATED ABOVE

TOT OfG

76 15.7% 117 24.1% 193 19.9% 148 30.5% 341 23.4% 6S3 46.9%

130 26.8% 100 20.6% 230 23.7% 109 22.5% 339 23.3%

130 26.8% 168 34.6% 298 30.7% 133 27.4% 431 29.6%

149	30.7%	O	.0%	O	.0%	O	• 0%
100	20.6%	O	.0%	O	.0%	O	.0%
249	25.7%
95	19. 6%
344	23.6%

Anlage 2

Abb. 2: Nucleotidsequenz des durch in vitro-Mutagenese ab Nucleotid 1540 abgeänderten Gens für Vicia faba-Legumin Typ B 1540 bzw. 1650 im nicht-modifiziertem Gen

ATG	ATG	ATG	ATG	CAT	CAT	CAT	CAT
M	M	M	M	H	H	H	H
TGC	AGA	TGT	TCT	TGC	AAA	TGC	TTT
C	R	C	S	C	K	C	F
TGG	TCT	TCG	TCA	GCG	CCA	AGT	CAC
W	S	S	S	A	P	S	H
AGA	GTT	AAA	GCT	CAG	TGG	AAA	CCG
R	V	K	A	Q	W	K	P
TGG	CCC	TCT	GGT	TCA	CCC	TCA	GTC
W	P	S	G	S	P	S	V
TCA	ATC	TCA	ATC	TAA	TTGA
S	I	S	I '	Stop

Anlage 3

Abb.3 Fließschema zum Gentransfer

E.COÜHB101

pKC7-Legumin-Gen

Amp^RKan^R

E.COÜGJ23 pGJ28Km^R R64drd11Tc^RSm^R

Konjugation und Selektion auf Ampicilin, Kanamycin, Tetrazyklin, Streptomycin enthaltenden Platten

E. coli Stamm mit den Plasmiden

pKC7-Legumin-Gen pGJ28

R64drd11

Agrobacterium tumefaciens pG V 3850 bzw. pGV3851 Rif^R

Konjugation und Selektion auf Rifampicin, Ampicilin, Kanamycin enthaltenden Platten

Agrobacterium-Stämme pGV3850-Legumin-Gen pGV3851-Legumin-Gen

Claims

Erfindungsanspruch:

1. Verfahren zur Herstellung von ernährungsphysiologisch verbesserten Pflanzensamenproteinen, dadurch gekennzeichnet, daß

a) das vollständige Gen eines Pflanzensamenproteins oder ein mindestens 80% der DNA-Sequenz des Gens umfassendes Teilstück mit einem Klonierungsvektor verbunden wird,

b) die entstandene Rekombinanten-DNA im geeigneten Bereich des Pflanzensamenproteingens mit einem mindestens 15 Nucleotide langen Oligonucleotid hybridisiert wird, das ein oder mehrere Kodonsfürdie betreffende limitierende essentielle Aminosäure enthält und das entweder durch Herausschneiden aus Genen oder durch Oligonucleotidsynthese gewonnen wird,

c) der Hybrid ggf. nachdem Prinzip der in vitro-Mutagenese mittels DNA-Polymerase und DNA-Ligase zur doppelsträngigen DNA ergänzt und anschließend in Bakterienzellen transferiert wird,

d) aus den vermehrten Kolonien transformierter Bakterienzellen jene selektiert werden, welche die in vitro-mutierte Pflanzensamenprotein-spezifische DNA-Sequenz mit zusätzlichen Kondons für die betreffende limitierende essentielle Aminosäure enthalten,

e) anschließend eine ausreichende Menge von der rekombinanten DNA aus transformierten Bakterienzellen des betreffenden selektierten Stammes gewonnen wird, um damit einen Vektor für die Transformation von Pflanzenzellen zu konstruieren, beispielsweise ein entsprechend modifiziertes Ti-Plasmid von Agrobacterium tumefaciens,

f) mit dem solcherart gewonnenen Vektor Pflanzenzellen transformiert werden, aus denen man nach Vermehrung in an sich üblicherweise die in den Pflanzenzellen gebildeten Samenproteine gewinnt.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Gen eines Pflanzensamenproteins die Gene des Legumins oder des Vicilins der Ackerbohne bzw. entsprechend geeignete Gene von Samenproteinen der Getreide, z. B. Gluteline oder Prolamine, eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß das mindestens 80% der DNA-Sequenz des betreffenden Pflanzensamenprotein-spezifischen Gens umfassende Teilstück am 5'-Ende vollständig ist.
4. Verfahren nach Punkt 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß als Klonierungsvektor einsträngige Phagen-DNA, insbesondere Derivate von M 13-Phagen-DNA, eingesetzt werden.
5. Verfahren nach Punkt 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß für die in vitro-Mutagenese ein solches wenigstens 15gliedriges Oligonucleotid aus einem geeigneten Gen, beispielsweise dem Gen für methioninhaltiges Legumin, verwendet wird, das sich durch Restriktionsenzyme herausschneiden läßt, im Vergleich zum Rezeptorgen zusätzliche Kodonsfürdie betreffende limitierende essentielle Aminosäure, beispielsweise Methionin bei Leguminosenglobulinen oder Lysin bei Getreideprolaminen, enthält und einem DNA-Sequenzabschnitt des Rezeptorgens soweit homolog ist, daß die Hybridisierung dorthin gesichert ist.
6. Verfahren nach Punkt 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß für die in vitro-Mutagenese ein wenigstens 15gliedriges Oligonucleotid durch chemische Synthese gewonnen wird, das einem DNA-Sequenzabschnitt des Rezeptorgens hinreichend homolog ist, um die Hybridisierung dorthin zu sichern, und das im Vergleich zu diesem DNA-Sequenzabschnitt des Rezeptorgens zusätzlichen Kodons der betreffenden limitierenden essentiellen Aminosäure enthält, beispielsweise Methionin für Leguminosenglobuline oder Lysin für Getreideprolamine.
7. Verfahren nach Punkt 1-6, dadurch gekennzeichnet, daß das gewonnene oder synthetisierte Oligonucleotid auf der Basis seiner partiellen Sequenzhomologie mit dem entsprechenden Abschnitt des Pflanzensamenproteingens in an sich üblicher Weise hybridisiert und durch DNA-Polymerase zum komplementären Strang eines doppelsträngigen DNA-Moleküls ergänztwird.
8. Verfahren nach Punkt 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß die nach Punkt 7 erzeugte rekombinante in vitro mutierte doppelsträngigeDNAfür die Transformation von in üblicherweise kompetent gemachten Bakterienzellen benutzt, in diesen vermehrt und dadurch auf der Basis der semikonservativen DNA-Replikation in das elterliche und das in vitro mutierte Pflanzensamenproteingen segregiert wird.
9. Verfahren nach Punkt 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß Kolonien von transformierten Bakterienstämmen mit dem Phagen- oder Plasmidvektor, der das in vitro mutierte Pflanzensamenproteingen enthält, selektiert werden, indem man nach Punkt 5 oder 6 gewonnene Oligonucleotide radioaktiv markiert und als Sonde für Koloniehybridisierungen verwendet, oder indem man ggf. die Expression des in vitro mutierten Pflanzensamenproteingens im Wirtsbakterium am synthetisierten Protein mittels immunologischer oder chemischer Methoden nachweist.
10. Verfahren nach Punkt 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA des in vitro mutierten Pflanzensamenproteingens in an sich üblicherweise aus dem Vektor isoliert und zur Einfügung in einen weiteren Vektor verwendet wird, beispielsweise eines vom Ti-Plasmid des Agrobacterium tumefaciens abgeleiteten Vektors, mit dem Pflanzenzellen, beispielsweise Protoplasten geeigneter Leguminosen, transformiert werden.
11. Verfahren nach Punkt 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA des in vitro mutierten Pflanzensamenproteingens mit Hilfe eines vektorabhängigen Verfahrens, beispielsweise mit Hilfe der Cokultivierung von Pflanzenprotoplasten und von Agrobakterium tumefaciens-Zellen mit dem nach Punkt 10 konstruierten Vektor, der das in vitro mutierte Pflanzensamenprotein tragende Ti-Plasmid enthält, oder mit Hilfe eines vektorfreien Verfahrens, beispielsweise mittels Mikroinjektion oder Liposomentechnik, zur Transformation von Pflanzenzellen der gewählten Rezeptorpflanze verwendet wird.
12. Verfahren nach Punkt 1-11, dadurch gekennzeichnet, daß die transformierten Pflanzenzellen in an sich üblicherweise in flüssigen oder auf festen Medien mit geeigneten Nährlösungen vermehrt und ggf. zur Kallusbildung mit nachfolgender Regeneration ganzer Pflanzen benutzt werden.
13. Verfahren nach Punkt 1-12, dadurch gekennzeichnet, daß die Bildung der ernährungsphysiologisch verbesserten Pflanzensamenproteine in den Zellen, Geweben oder Organen aus transformierten Pflanzenzellen anhand der Produkte der Genexpression, z. B. mRNA oder Pflanzensamenprotein, mit Hilfe von Verfahren der Nucleinsäurehybridisierung oder der chemischen und/oder immunologischen Proteinidentifizierung nachgewiesen wird.
14. Verfahren nach Punkt 1-13, dadurch gekennzeichnet, daß das ernährungsphysiologisch verbesserte Pflanzensamenprotein auf an sich übliche Weise extrahiert oder durch direkte Nutzung der Gewebe oder Organe aus transformierten Pflanzenzellen für den Gebrauch gewonnen wird.