DE69834637T2

DE69834637T2 - Verbesserungen der spezifität der genexpression

Info

Publication number: DE69834637T2
Application number: DE69834637T
Authority: DE
Inventors: David O'reilly; John Christopher Thomas
Original assignee: Advanced Technologies Cambridge Ltd
Current assignee: Advanced Technologies Cambridge Ltd
Priority date: 1997-03-27
Filing date: 1998-03-27
Publication date: 2006-10-05
Anticipated expiration: 2018-03-28
Also published as: BR9808430B1; JP2001517076A; JP2010029196A; CA2285221A1; ATE327337T1; CA2285221C; AR010410A1; ZA982568B; WO1998044138A1; GB9706381D0; HK1025792A1; DE69834637D1; AU750951B2; EP0977877A1; EP0977877B1; AU6845398A; ES2265660T3; BR9808430A; DK0977877T3; US6140554A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Steigern der Spezifität der Genexpression. Genauer bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung eines chimären Gens, um eine hoch spezifische Zielwirkung zu erzeugen als eine Art, zum Beispiel, jedoch nicht ausschließlich, eine gerichtete Resistenz gegen krankheitserregende Mittel in Pflanzen bereitzustellen.
Für den Zweck dieser Erfindung ist es nützlich, in einem vereinfachten Verfahren zu beschreiben, wie ein Gen aufgebaut ist und wie es funktioniert (siehe 1, die die Struktur eines Gens zeigt, welches Gen auch ein chimäres Gen sein kann). Ein Gen kann aus drei Bestandteilen bestehend angesehen werden (die Nummern beziehen sich auf die Nummern in 1): 1. Ein Promoter (P), der bestimmt, wenn und wo eine kodierende Sequenz transkribiert wird, eine kodierende Sequenz (CS) für die Produktion eines Proteins und eine 3'-Regulationssequenz (3'), die manchmal auch die Transkription der kodierenden Sequenz beeinflussen kann. Die 3'-Regulationssequenz ist allgemein als ein Terminator bekannt. 2. Ein Gen wird exprimiert, wenn der Promoter die Transkription und das Verarbeiten (10) einer Arbeitskopie der kodierenden Sequenz erlaubt, um eine Boten-RNS (mRNS) herzustellen. 3. Die mRNS wird dann translatiert (11), um ein Proteinprodukt zu ergeben. 4. Das Proteinprodukt kann dann mit einem Substrat oder einem anderen Protein oder einer Regulationssequenz in Wechselwirkung treten, um eine Wirkung (E) auszuüben.
Es sollte jedoch festgestellt werden, dass die Regulation der Expression eines Gens in jedem Stadium des oben beschriebenen Expressionsprozesses beeinflusst werden kann. Faktoren können auf den Promoter einwirken, auf die Transkriptionsmaschinerie, um die mRNS herzustellen, und auf Vorgänge, die die mRNS modifizieren oder ihre Stabilität beeinflussen. Faktoren können ebenfalls auf die Translation des Proteins und auf den Umsatz des Proteins innerhalb der Zelle wirken. Andere Faktoren können beeinflussen, wie das Protein mit anderen Bestandteilen in Wechselwirkung tritt und seine Wirkungen erziel.
Um das erfinderische Konzept zu erklären, werden die folgenden Gene, Gen 1 und Gen 2 in einer Pflanze, betrachtet. Gen 1 ist in den Geweben A und B einer Pflanze aktiv, während Gen 2 in den Regionen B und C einer Pflanze aktiv ist. Die Aktivitäten der beiden Gene überlappen sich in der Region B und dies kann visuell beschrieben werden, wie in 2, welche in der Form eines Venn-Diagramms vorliegt. Aus dieser Figur ist ersichtlich, dass die Stelle der gemeinsamen Expression stärker begrenzt ist oder, in anderen Worten, spezifischer ist als die Expressionsstellen jedes Gens selbst.
Folglich enthält in dieser Erfindung in Bezug auf Pflanzen das chimäre Gen einen Promoter, der in mehr als einer Region der Pflanze exprimiert. Der Promoter ist an ein Mittel gekoppelt. Das Mittel wird das Funktionieren eines endogenen Gens beeinflussen, das ebenfalls in mehr als einer Region der Pflanze exprimiert wird. Die Bereiche, in welchen der Promoter und das zu beeinflussende endogene Gen aktiv sind, sind nicht identisch, sie überlappen sich jedoch an einer oder mehreren gewünschten Örtlichkeiten. Wenn das chimäre Gen in eine Pflanze übertragen wird, wird das Mittel nur eine Wirkung auf das endogene Zielgen an der (den) Örtlichkeit(en) der Überlappung haben.
Es gibt etliche Wege, die Erfindung zu veranschaulichen, wovon eine gesteigerte Toleranz oder Resistenz für parasitische Pflanzennematoden ein praktisches Beispiel ist. Obwohl wir Zellzerstörung und männliche Sterilität als Beispiele verwendet haben, kann das System auch für die Steigerung eines Gens an einer bestimmten Stelle verwendet werden.
Es wurden etliche unterschiedliche Mechanismen vorgeschlagen, um eine zellspezifische Zerstörung zu erhalten. Das einfachste Verfahren nutzt ein chimäres Gen, das einen Promoter umfasst, welcher für das zum Ziel genommene Gewebe spezifisch ist, gekoppelt an ein Zerstörungssystem. Sogar spezifische Promotoren können jedoch zu einem geringeren Grad in anderen Geweben exprimieren als jene, die zum Ziel genommen worden sind, was manchmal nicht wünschenswert ist.
Andere Anwendungen versuchten, dieses Problem zu umgehen, indem sie zwei Konstrukte nutzen, wobei das erste Konstrukt ein chimäres Gen enthält, welches einen gewebespezifischen Promoter umfasst, gekoppelt an ein Zellnekrosesystem (z. B. Barnase), und wobei das zweite Konstrukt ein chimäres Gen enthält, welches einen Promoter umfasst, der in anderen Regionen aktiv ist als den zum Ziel genommenen, wobei der Promoter an einen Schutzstoff (z. B. Barstar) gekoppelt ist, welcher das Nekrosesystem inaktiviert. Die Nekrose in anderen als dem einen gewünschten Gewebe wird deshalb durch den Schutzstoff unterdrückt (siehe Internationale Patentanmeldungen Nummern WO 92/21757 (Plant Genetic Systems N.V.) und WO 93/10251 (Mogen International N.V.)).
Diese Erfindung kann zum Beispiel ein hochspezifisches Zellzerstörungssystem unter Verwendung eines einzelnen Konstruktes bereitstellen. Andere Zellregulationssysteme, für welche die Erfindung anwendbar ist, werden dem Fachmann bekannt sein.
Es ist ein Ziel der Erfindung, ein ortsspezifisches Expressionssystem oder Targeting-System bereitzustellen, das allgemein auf jeden Organismus anwendbar ist, welcher Gene hat, die in unterschiedlichen Regionen exprimiert werden, wo sich ihre Expressionssphären aber überlappen.
Es ist ebenfalls ein Ziel der Erfindung, eine gesteigerte Spezifität zu erzielen unter Verwendung von nur einem Konstrukt, das ein chimäres Gen umfasst, welches zwei oder mehr Nukleinsäuresequenzen umfasst, welches Konstrukt gestaltet ist, um mit einem endogenen Gen in einem Organismus in Wechselwirkung zu treten.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Verbessern der Spezifität von Genregulation in einer transformierten Pflanze bereit, umfassend:

(a) Einführen eines chimären Gens in eine Zelle einer Pflanze, worin das chimäre Gen einen gewebespezifischen Promoter und eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche die Expression eines Zielgens oder eines Produktes davon reguliert, und worin der gewebespezifische Promoter die Nukleinsäuresequenz an mehr als einer, jedoch nicht an allen Expressionsstellen in der Pflanze transkribiert, einschließend wenigstens eine der multiplen Expressionsstellen des endogenen Zielgens; und
(b) Regenerieren einer transformierten Pflanze, die das chimäre Gen aus den Zellen umfasst,

Bevorzugt ist die Nukleinsäuresequenz eine kodierende oder eine nicht-kodierende Sequenz.
Bevorzugt kann die Expression des Zielgens heraufreguliert oder herunterreguliert werden.
Bevorzugt ist der Organismus einer Pflanze, wobei die transformierte Pflanze oder Vermehrungseinheiten davon das chimäre Gen enthalten.
Der Mechanismus, durch welchen das Mittel auf ein Gen wirkt, könnte zu irgendeinem der Folgenden gehören. Die Liste sollte nicht als ausschließend betrachtet werden.

1. Gegensinn.
2. Co-Suppression.
3. Inhibition oder Aktivierung des Promoters eines Zielgens.
4. Inhibition oder Aktivierung der Transkription.
5. Änderung der Boten-RNS-Stabilität oder des Abbaus von mRNS.
6. Inhibition oder Aktivierung der Translation.
7. Inhibition oder Aktivierung eines Proteins.
8. Änderung des Proteinumsatzes.
9. Wirken als ein Co-Faktor.
10. Änderung von Protein-Protein-Wechselwirkungen.
11. Änderung des Flusses durch einen biochemischen Weg.

Gewisse Beispiele dieser Mechanismen werden unten kurz diskutiert. Es sollte im Gedächtnis behalten werden, dass die besonderen auszuwählenden Mechanismen, um die Genregulation zu erzielen, ebenfalls ein gewisses Maß an ortsspezifischer Expression erfordern, um bei dem erfinderischen Konzept wirksam zu sein.
Herunterregulation kann vorteilhafterweise dadurch erzielt werden, dass das Mittel des chimären Gens eine Nukleinsäuresequenz ist, welche die Gegensinnorientierung des gesamten oder eines Teils des Promoters oder einer kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz des Zielgens ist. Alternativ kann Herunterregulation durch Co-Suppression des Promoters oder der kodierenden oder nicht-kodierenden Sequenz des Zielgens erzielt werden.
Heraufregulation des Zielgens kann zum Beispiel durch Einführen eines Aktivators des Promoters des Zielgens erzielt werden.
Kombinationen dieser Techniken können ebenfalls verwendet werden.
Andere geeignete Verfahren zum Regulieren der Genexpression des Zielgens werden Fachleuten bekannt sein.
Das Mittel des chimären Gens kann eine oder mehrere Nukleinsäuresequenzen umfassen, wobei jede Sequenz, wenn sie exprimiert wird, eine bestimmt Funktion durchführt. Es kann folglich Spezifität der Expression von mehr als einem endogenen Gen unter Verwendung von nur einem Promoter erreicht werden.
Ein Konstrukt kann zwei gesonderte chimäre Gene als Expressionskassetten enthalten, wobei jedes chimäre Gen einen Promoter, eine kodierende Sequenz für ein Mittel und einen Terminator umfasst. Jedes chimäre Gen wirkt auf ein anderes endogenes Gen, welches Gen an derselben Zielstelle oder an einer anderen Stelle exprimiert sein kann. Es besteht folglich die Möglichkeit, etliche Bestandteile oder Zielgene in einer Folge von Ereignissen, wie eine bestimmte Biosynthesekette, über einen Zeitraum auszuschalten oder zu steigern. In anderen Worten, es kann eine zeitliche Kette aus Ereignissen bewirkt werden. Alternativ könnte jedes chimäre Gen in den Organismus in zwei gesonderten Konstrukten übertragen werden, wobei jedes Konstrukt eine Expressionskassette enthält, d. h. ein chimäres Gen.
Die Nukleinsäuresequenz kann eine DNS-Sequenz oder eine RNS-Sequenz sein.
Der Promoter des chimären Gens kann in mehr als einer überlappenden Expressionsstelle des endogenen Gens exprimiert sein.
Vorteilhafterweise ist der Promoter ein durch Nematoden induzierbarer Promoter, wie der Promoter, der hierin bekannt ist als der KNT1-Promoter oder der RB7-Promoter. Andere Promotoren, die von anderen Mitteln dazu gebracht werden, zu exprimieren, wobei die Mittel auf diese an anderen befallenen oder Wachstumsstellen wirken, können genutzt werden in Abhängigkeit von der zu erzielenden ortsspezifischen Expressionsregulation.
Vorteilhafterweise ist die Nukleinsäuresequenz die Gegensinnsequenz des RB7- oder KNT1-Promoters oder der kodierenden Sequenz davon oder ein Teil davon.
Alternativ kann die Nukleinsäuresequenz ein Ribozym oder eine gezielte RNase sein, um eine Boten-RNS abzubauen, um zum Beispiel den Mechanismus 5 der obigen Liste an Mechanismen zu bewirken. Ebenfalls können spezifische RNS stabilisiert oder destabilisiert werden durch spezifische Nährstoffe, z. B. Eisen in dem Falle der mRNS für den Zelloberflächen-Proteinrezeptor zum Transferieren; oder durch Liganden, Hormone und Translationsprodukte, z. B. die Wirkung des Tubulinproteindimers auf Tubulin-mRNS. Die Selektion von Nährstoffen, Liganden, Hormonen oder Translationsprodukten, die exprimiert werden oder an gewissen Örtlichkeiten erforderlich sind, ist für das erfinderische Konzept wünschenswert.
Ein Beispiel eines Aktivators der Transkription ist der Hitzeschockfaktor von Drosophila, welcher ein Protein kodiert, das in der Zelle löslich ist. Nach Hitzeschock bindet der Hitzeschockgenfaktor an den Promoter des Hitzeschockproteins HSP70 und führt zu einer gesteigerten Transkription. Hitzeschockproteine werden in Bakterien, Tieren und Pflanzen gefunden. Aktivatoren, die für die Verwendung bei dem erfinderischen Konzept geeignet sind, die ortsspezifisch sind, können durch den Fachmann selektiert werden, um den Mechanismus 4 zu erzielen.
Geeignete Co-Faktoren zum Bewirken des Mechanismus 9 in einem Organismus schließen Vitamine wie Pantothensäure und Vitamin B6 ein.
Schließlich könnte Mechanismus 10 durch das Einführen von zum Beispiel dem Protein cAMP-abhängige Proteinkinase in einem Organismus bewirkt werden. Die cAMP-abhängige Proteinkinase wirkt auf das Enzym Glykogensynthase, indem es phosphoryliert wird. Die Glykogensynthase wird in eine weniger aktive Form umgewandelt und die Glykogensynthese ist inhibiert.
Die Erfindung kann ebenfalls eine Anzahl von Konstrukten nutzen, wobei jedes Promoter-Gen-Fragment des chimären Gens jedes Konstruktes eine Überlappung an derselben Zielexpressionsstelle hat wie jedes der anderen Promoter-Gen-Fragmente, so dass eine mehrfache Überlappung an der ausgewählten einzelnen Expressionsstelle bereitgestellt wird, um die Spezifität des Systems weiter zu steigern. Die andere Expressionsstelle des chimären Gens kann dieselbe sein wie die anderen Expressionsstellen der anderen Promoter-Gen-Fragmente oder kann davon verschieden sein.
Damit die Erfindung leicht verstanden werden kann und leicht durchgeführt werden kann, wird nun im Wege des Beispiels Bezug genommen werden auf die folgenden Figuren und Beispiele, in welchen:
2 die Überlappung der Expressionsstellen der beiden gesonderten Gene zeigt, wenn sie sich in derselben Pflanze befinden,
3 die Karte für den Vektor pATC37010 zeigt, der verwendet worden ist in Übereinstimmung mit der Erfindung, um Pflanzen zu transformieren,
4 die Karte für den Vektor pATC37003 zeigt, ein für die Transformation von Pflanzen verwendeter Kontrollvektor, und
5 die Karte für pATC zeigt, in welchen SEQ. ID. Nr. 5 und SEQ. ID. Nr. 6 ligiert worden sind, um die Vektoren pATC37010 und pATC37003 der 3 bzw. 4 herzustellen.
Zellspezifische Zerstörung an der Stelle B in 2 kann wie folgt erzielt werden. Der Promoter, der die Spezifität der Expression von Gen 1 reguliert, kann mit einer Region gekoppelt werden, welche die Aktivität des Gens 2 in einem Konstrukt zerstören wird. Wenn das Konstrukt in Pflanzen eingeführt wird, wird das für Gen 2 zerstörende Mittel in den Regionen A und B exprimiert werden. Es wird keine Wirkung an der Stelle A geben, da das Gen 2 dort nicht aktiv ist. Es wird keine Wirkung an der Stelle C geben, da der Promoter des Konstruktes dort nicht aktiv ist und folglich kein zerstörendes Mittel für das Gen 2 hergestellt wird. Es wird Zerstörung des Gens 2 an der Stelle B geben, da das zerstörende Mittel für Gen 2 vorhanden ist und Gen 2 auch aktiv ist.
BEISPIEL 1
Konstruieren einer gesteigerten Toleranz oder Resistenz gegen pflanzenparasitische Nematoden unter Verwendung von Venn-Konstrukten
Pflanzenparasitische Nematoden wie die Wurzelgallennematoden und Zystennematoden bewirken 7 bis 14% Verluste in der Feldfruchternte weltweit. Die Nematoden wirken durch das Durchdringen von Pflanzenwurzeln und Erzeugen einzigartiger Ernährungsstellen, durch welche sie ihre Nährstoffe gewinnen. Die Ernährungsstellen sind geänderte Pflanzenzellen, entweder große vielkernige Zellen in dem Falle der Wurzelgallennematoden oder sind Synzyitien etlicher miteinander verschmolzener Zellen in dem Falle von Zystennematoden. Die Nematoden werden sessil und sind vollständig abhängig von den Ernährungsstellen für Nährstoffe. Unser US-Patent Nr. 5,589,622 beschreibt einen allgemeinen Weg, um Pflanzen resistent zu machen, indem ernährungszellspezifische Promotoren an Zelltod- oder Zellzerstörungssysteme gekoppelt werden, um die Ernährungszellen zu zerstören. Die Ernährungszellen sind in ihrer Funktion beeinträchtigt, so dass der Nematode verhungert oder eine reduzierte Futterversorgung hat und nicht in der Lage ist oder weniger in der Lage ist, zu wachsen und Nachfahren zu erzeugen. Dieses Verfahren ist ein Beispiel des einfachsten Verfahrens von oben beschriebener zellspezifischer Zerstörung. Andere Patente, die dieses Prinzip nutzen, sind jene, die Sterilität in einer Pflanze schaffen, zum Beispiel Internationale Patentanmeldung Nr. WO 89/10396 (Plant Genetic Systems N.V.).
Der Promoter KNT1, der in Ernährungszellen, Wurzelspitzen und zu einem geringeren Grad in anderen Meristemen exprimiert wird, wurde identifiziert. Andere Arbeiter identifizierten ein Gen, RB7, das in Wurzeln und Riesenzellen exprimiert wird (Conkling et al., 1990, Opperman et al., 1993). Unsere Untersuchungen mit dem RB7-Promoter, gekoppelt an das Markergen GUS, legten nahe, dass das RB7-Gen in dem Körper der Wurzel und nicht an der Wurzelspitze exprimiert wird. Ein Venn-Konstrukt, enthaltend den Promoter KNT1, gekoppelt an eine Gegensinnteilsequenz der RB7-Kodiersequenz, und einen nos-Terminator in einem von pBIN19 (Bevan, M., 1984) gewonnen Pflanzentransformationsvektor, enthaltend Agrobacterium tumefaciens C58, wurde hergestellt. Das Konstrukt wurde pBIN05002 genannt und wurde von Advanced Technologies (Cambridge) Ltd., 210 Cambridge Science Park, Cambridge CB4 4WA, England, unter dem Budapester Vertrag über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke des Patentbegehrens bei der National Collection of Industrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23 St. Machar Street, Aberdeen, Schottland, am 20. März 1997 unter der Zugangsnummer NCIMB 40871 hinterlegt. Tabakpflanzen cv Heavy Western wurden mit diesem Konstrukt unter Verwendung von Agrobacterium-vermittelter Pflanzentransformation in Übereinstimmung mit dem Verfahren nach Horsch et al. (1985) transformiert.
Regenerierte transgene Pflanzen wurden in das Gewächshaus versetzt. Transgene Pflanzen und nicht-transgene Kontrollen wurden jeweils mit ungefähr 100 Individuen des Wurzelgallennematoden Meloidogyne javanica infiziert. Acht Wochen nach der Infektion wurde die Anzahl sichtbarer Wurzelgallen und ihre Größe bestimmt. Während dieses Zeitraums hatte das anfängliche Inocolum die Gelegenheit, eine zweite Generation an Nematoden zu infizieren, zu reifen und herzustellen, welche wiederum die Pflanzenwurzeln infizieren und reifen konnten.
Acht der transgenen pBIN05002-Pflanzen mit der geringsten Bewertung wurden wachsen gelassen bis zum Samen. Nachfahren der elterlichen Pflanzen wurden wiederum für eine erhöhte Toleranz oder Resistenz gegen M. javanica getestet, wie oben beschrieben. Zusätzlich zu den pBIN05002-Pflanzen wurden Nachfahren von Pflanzen, die mit pBIN05101, enthaltend den KNT1-Promoter, gekoppelt an das Glucuronidase-Marker-Gen (GUS) (Jefferson, R.A. et al., 1987), transformiert worden sind und Nachfahren aus untransformierten Pflanzen als Kontrollen zum Vergleich eingeschlossen. pBIN05101 wurde ebenfalls bei der NCIMB am 20. März 1997 unter der Zugangsnummer NCIMB 40870 hinterlegt. Nachfahren aus der pBIN05002-Pflanzenlinie 32 zeigten eine signifikante Zunahme in der Anzahl an Pflanzen mit niedrigen Gallenbewertungen, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die Ergebnisse sind signifikant in einer Chi-Quadrat-Analyse.
Tabelle 1
Anzahl an Pflanzen in Kategorien mit niedrigen und hohen Gallenbewertungen für untransformierte Kontrollpflanzen, pBIN05101-Kontrollpflanzen und pBIN05002-Testpflanzen.

Niedrige Gallenbewertung = 0 bis 50 Gallen pro Pflanze.
Hohe Gallenbewertung = 51 + Gallen pro Pflanze.

BEISPIEL 2
Das in dem obigen Beispiel erläuterte Überlappungsprinzip unter Verwendung eines Zellzerstörungssystems für eine gesteigerte Spezifität bei der Nematodenzerstörung kann gleich gut in der Blüte von Arabidopsis durchgeführt werden, zum Beispiel, oder an anderen Pflanzen, um Blüten mit einem geänderten Blütenmuster oder einer geänderten Blütenstruktur, zum Beispiel männliche Sterilität, bereitzustellen. Dieses Beispiel nutzt in Arabidopsis identifizierte DNS-Sequenzen.
Es gibt vier Elemente der Blüte (Kelchblatt, Fruchtblatt, Kronblatt und Staubblatt), von denen postuliert wird, dass sie sich unter der Kontrolle von drei Genen befinden (Coen, E.S., und Meyerowitz, E.M., 1991).
Das Ändern der Balance dieser Gene verursacht eine Variation im Blütenmuster. Zum Beispiel müssen die beiden Gene agamous und apetala3 in demselben Teil der Blüte exprimiert sein, um den männlichen Teil der Pflanze, das Staubblatt, hervorzurufen. Agamous wird sowohl in den Fruchtblättern als auch den Staubblättern exprimiert, während apetala3 sowohl in Staubblättern als auch Kronblättern exprimiert wird.
Um ein Konstrukt nach dem Überlappungsprinzip, welches Gegenstand dieser Erfindung ist, herzustellen, benötigen wir den Promoter aus einem Gen (z. B. agamous, aktiv in Fruchtblättern und Staubblättern), gekoppelt an einen Zerstörer eines zweiten Gens (z. B. apetala3, aktiv in Kronblättern und Staubblättern), um die Zerstörung nur in den Staubblättern zu bewirken.
Ein 435 Basenpaar großes Fragment des agamous-Promoters wurde aus Arabidopsis-thaliana-DNS unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion mit Taq und Taq-Extender unter Verwendung der folgenden zwei Primer nach veröffentlichtem Vorgehen (Thomas, C., 1996) isoliert:
Primer 1 (SEQ. ID. Nr. 1)
ATCGAAGCTT CTAAATGTAC TGAAAAGAAA CA
Primer 2 (SEQ. ID. Nr. 2)
ACTGGGATCC GAAAATGGAA GGTAAGGTTG TGC
Die Primer wurden auf der Sequenz basiert, die für die genomische agamous-Sequenz in dem Genbank-DNS-Sequenzeintrag ATAGAMSG gegeben ist. Primer 1 enthält eine hinzugefügte HindIII-Restriktionsstelle an seinem 5'-Ende. Primer 2 enthält eine hinzugefügte BamHI-Restriktionsstelle an seinem 5'-Ende.
Die folgenden Primer wurden aus dem Genbank-Sequenzeintrag ATHAPETALA gestaltet, um einen Teil der apetala3-Gensequenz herauszuamplifizieren.
Primer 3 (SEQ. ID. Nr. 3)
ATCGGGATCC ATGGGCTCAC GGTTTTGTGT GA
Primer 4 (SEQ. ID. Nr. 4)
ATCGGAGCTC TTATTCAAGA AGATGGAAGG TAATGA
Primer 3 wurde spezifisch gestaltet, um die Amplifikation an der Position 992 der veröffentlichten apetala3-Sequenz zu starten, welche ein Startkodon in dem falschen Leseraster ist, um ein aktives Produkt herzustellen, und die den Eingangsteil der Sequenz vermeidet, welche starke Homologien mit anderen MADS-Box-Genen in derselben Genfamilie hat. Primer 3 enthält auch eine Ein-Basenpaar-Änderung von der veröffentlichten Sequenz, um eine ungewollte SacI-Restriktionsstelle zu entfernen. Primer 3 hat eine BamHI-Restriktionsstelle an seinem 5'-Ende. Primer 4 hat eine SacI-Stelle an seinem 5'-Ende. Ein 1586 bp großes Fragment wurde aus Arabidopsis-DNS unter Verwendung der Primer 3 und 4 unter Verwendung von PCR amplifiziert.
Die folgenden Klonierverfahren sind jedem Fachmann vertraut, und die Ergebnisse können erhalten werden, indem dem Verfahren in Sambrook et al. (1989) gefolgt wird. Das agamous-Promoterfragment wurde in einen von pBluescript abgeleiteten Vektor (Stratagene Ltd., Cambridge, UK) als ein HindIII-BamHI-Fragment ligiert. Das geänderte apetala-Genfragment wurde stromabwärts des agamous-Promoters als ein BamHI-SacI-Fragment in denselben Vektor ligiert. Der Vektor enthielt ebenfalls eine nos-Terminatorsequenz stromabwärts der geänderten apetala3-Sequenz als ein SacI-EcoRI-Fragment. Der Vektor wurde pDVM37010 genannt. Ein zweites Plasmid, enthaltend den agamous-Promoter vor dem m-gfp-ER-Reportergen, erhalten von Jim Haselhoff, MRC, wurde als eine Kontrolle gemacht und wurde pDVM37003 genannt.
Die Promoter-Genfragment-Terminator-Kassetten wurden aus pDVM37010 (SEQ. ID. Nr. 5) und pDVM37003 (SEQ. ID. Nr. 6) als NotI-Restriktionsfragmente ausgeschnitten und in einen von pBIN19 (Bevan, M. (1984)) abgeleiteten Vektor pATC ligiert, um die Plasmide pATC37010 (Karte in 3 gezeigt) und pATC37003 (Karte in 4 gezeigt) zu ergeben. Diese Sequenzen könnten in jeden anderen äquivalenten Vektor kloniert werden, der darin geeignete Restriktionsstellen hat, d. h. NotI an jedem Ende der Kassette. Die Karte für pATC ist in 5 gezeigt. Er hat modifizierte Restriktionsstellen im Vergleich mit pBIN19. pATC37010 erzeugt ein Co-Suppressionsprodukt unter der Kontrolle des agamous-Promoters, um apetala3-Funktion in den sich entwickelnden Staubblättern der Blüte zu inaktivieren.
Die Plasmide wurden in den Agrobacterium-tumefaciens-Wirt LBA4404 übertragen und wurden verwendet, um Arabidopsis thaliana nach dem Verfahren von Bechtold et al. (1993) und Nicotiana tabacum cv K326 unter Verwendung des Verfahrens von Horsch et al. (1985) zu transformieren. Acht für pATC37010 transgene Arabidopsis-Pflänzchen und 6 für pATC37003 transgene Arabidopsis-Pflänzchen wurden erhalten. Drei Sätze aus hundert Blattscheiben wurden für die Nicotiana-Transformation für jedes Konstrukt verwendet. Transgenes Kalluswachstum wurde bei allen drei Sätzen beobachtet.
Die Arabidopsis-Pflänzchen wurden 10 bis 14 Tage nach der Keimung in Erde übertragen und wurden bis zum Blühen wachsen gelassen. Die Blüten zeigten keine Staubblätter und doppelte Rosenfruchtblätter.
Die gegen Kanamycin resistenten pATC37010-transgenen Pflanzen wurden weiter für die Anwesenheit der gewünschten Inserts durch PCR mit Taq-Polymerase unter Verwendung der Primer 1 und 4 nach den Fachleuten bekannten Vorgängen untersucht. Die PCR wurde für 40 Inkubationszyklen durchgeführt, einschließend die Schritte der Inkubation bei 94°C für 60 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 140 Sekunden. PCR-positive Proben wurden durch Sichtbarmachung der PCR-Produkte auf Agarosegel-Elektrophorese unter Befolgung von Fachleuten bekannten Vorgängen identifiziert.
Die pATC37003-transgenen Kontrollpflanzen wurden weiter für die Anwesenheit der gewünschten Inserts durch PCR mit Taq-Polymerase unter Verwendung der Primer 1 und Primer 7 nach den Fachleuten bekannten Vorgängen untersucht. Die PCR wurde für 40 Inkubationszyklen durchgeführt, einschließend die Schritte der Inkubation bei 94°C für 40 Sekunden, 60°C für 30 Sekunden und 72°C für 140 Sekunden. PCR-positive Proben wur den durch Sichtbarmachung der PCR-Produkte auf Agarosegel-Elektrophorese nach Fachleuten bekannten Vorgängen identifiziert.
Primer 7 (SEQ. ID. Nr. 7)
GAACTGGGAC CACTCCAGTG
In beiden Fällen wurden passende, das Konstrukt enthaltende transgene Pflanzen identifiziert.
LITERATURVERZEICHNIS

Bechtold, N., Ellis, J., und Pelletier, G. (1993). In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C.R. Acad., Sci: Paris 316: 1194–1199.
Bevan, M. (1984) Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nuc. Acids Res. 12: 8711–8721.
Coen, E.S. und Meyerowitz, E.M. (1991). The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development. Nature 353, 31–37.
Conkling, M.A., Cheng, C-L., Yamamoto, Y.T., und Goodman, H.M. (1990). Isolation of transcriptionally regulated root-specific genes from tobacco. Plant Physiology 93, 1203–1211.
Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., und Fraley, R.T. (1985). A simple and general method for transferring genes into plants. Science 22, 1229–1231.
Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A., und Bevan, M.W. (1987). GUS fusions: β-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO, 6, 3901–3907.
Opperman, C.H., Taylor, C.G., und Conkling, M.A. (1994). Rootknot nematode-directed expression of a plant root specific gene. Science 263, 221–223.
Sambrook, J., Fritsch, E.F., und Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning – A Laboratory Manual. 2. Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York.
Thomas, C. (1996). 'PCR Techniques' in 'Plant Gene Isolation: Principles and Practice'. G.D. Foster & D. Twell, Herausgeber. John Wiley & Sons Ltd., S. 331–368.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Verbesserung der Spezifität der Genregulation in einer transformierten Pflanze, umfassend: a) Einführen eines chimären Gens in eine Zelle einer Pflanze, worin das chimäre Gen einen gewebespezifischen Promotor und eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche die Expression eines Zielgens oder eines Produktes davon reguliert, und worin der gewebespezifische Promotor die Nukleinsäuresequenz an mehr als einer, jedoch nicht an allen Expressionsstellen in der Pflanze, einschließlich wenigstens einer der multiplen Expressionsstellen des endogenen Zielgens, transkribiert; und b) Regenerieren einer transformierten Pflanze, die das chimäre Gen aus den Zellen enthält, worin die gewebespezifische Expression des chimären Gens die Expression des Zielgens oder die Aktivität des Zielgenproduktes in der transformierten Pflanze an Expressionsstellen reguliert, wo sowohl das chimäre Gen als auch das Zielgen exprimiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin diese Nukleinsäuresequenz eine kodierende oder eine nicht-kodierende Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Expression dieses Zielgens heraufreguliert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Expression dieses Zielgens herunterreguliert ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1, 2 oder 4, worin sich diese Nukleinsäuresequenz in Gegensinnorientierung befindet.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, worin sich diese Nukleinsäure in Sinnorientierung befindet.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, worin die Nukleinsäuresequenz einen Aktivator der Expression des Zielgens kodiert.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, worin das chimäre Gen mehr als eine Nukleinsäuresequenz umfasst, wodurch Spezifität von mehr als einem zu gewinnenden Zielgen ermöglicht wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, worin der Promotor des chimären Gens die Expression in mehr als einer überlappenden Expressionsstelle des Zielgens lenkt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 9, worin dieser Promotor der KNT1-Promotor oder der RB7-Promotor ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin diese Nukleinsäuresequenz die Sequenz dieses RB7- oder KNT1-Promotors in Gegensinnorientierung ist oder ein Teil davon ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 11, worin der Promotor induzierbar ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 12, worin die Nukleinsäuresequenz einen Aktivator der Transkription kodiert.
Verfahren nach Anspruch 13, worin dieser Aktivator der Transkription ein Hitzeschockfaktor ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 14, worin der Mechanismus, durch welchen die Nukleinsäuresequenz die Expression des Zielgens oder die Aktivität des Zielgenproduktes reguliert, einer ist, der ausgewählt wird aus der Gruppe, bestehend aus: Gegensinnregulation; Co-Suppression; Inhibition des Promotors eines Zielgens; Inhibition von Transkription; Änderung der Boten-RNS-Stabilität oder Abbau von mRNS; Inhibition von Translation; Inhibition eines Proteins, Änderung des Proteinumsatzes; Wirken als ein Cofaktor; Änderung von Protein-Protein-Wechselwirkungen; und Änderung des Flusses durch einen biochemischen Weg.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Nukleinsäuresequenz ein Ribozym kodiert.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Nukleinsäuresequenz eine Sequenz umfasst, die eine RNase kodiert, welche spezifisch mRNS des Zielgens abbaut.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Nukleinsäuresequenz eine Sequenz umfasst, die ein Stabilisierungsmittel der mRNS des Zielgens kodiert.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Nukleinsäuresequenz eine Sequenz umfasst, die ein Destabilisierungsmittel der mRNS des Zielgens kodiert.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Nukleinsäuresequenz eine Sequenz umfasst, die ein Protein kodiert, welches die Transkription des Zielgens unterdrückt.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Nukleinsäuresequenz eine Sequenz umfasst, die ein Protein kodiert, welches die Translation des Zielgens unterdrückt.
Verfahren nach Anspruch 15, worin die Nukleinsäuresequenz eine Sequenz umfasst, welche einen Inhibitor des Zielgenproduktes kodiert.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 22, worin dieser Promotor durch andere Induziermittel als eine Nematode dazu gebracht wird, zu exprimieren.
Zelle, die den Transformationsvektor pBIN05002 und die Zugangsnummer NCIMB 40871 hat.
Der in der Zelle nach Anspruch 24 enthaltene Transformationsvektor pBIN05002.
Konstrukt, das eine Promotor-Genfragment-Terminator-Kassette umfasst, wie enthalten in dem Plasmid pATC 37010.
Konstrukt, das das Plasmid pATC 37010 umfasst.
Pflanze und Vermehrungseinheiten davon, die das Ergebnis der Durchführung des Verfahrens nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 23 ist, wodurch die Pflanze und die Vermehrungseinheiten davon dieses chimäre Gen enthalten.