DE69731433T2

DE69731433T2 - Pflanzenpromotor und seine Verwendung

Info

Publication number: DE69731433T2
Application number: DE69731433T
Authority: DE
Inventors: Satomi Toyonaka-shi Torikai; Kenji Kyoto-shi Oeda
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-08-12
Filing date: 1997-08-12
Publication date: 2005-11-24
Anticipated expiration: 2017-08-13
Also published as: EP0824150A2; US5959176A; CA2212592A1; EP0824150A3; JP3791059B2; EP0824150B1; DE69731433D1; JPH1052273A; CA2212592C

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Pflanzenpromotor und seine Verwendung.
Der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (hier als der 35S-Promotor bezeichnet) ist als effektiver Promotor für die nicht-gewebespezifische Expression eines gewünschten Proteingens in Pflanzenzellen bekannt und wurde breit angewendet.
Wünschenswert wäre aber ein effektiver Promotor, der die gewebespezifische Expression, vor allem in der Wurzel, eines gewünschten Proteingens ermöglicht, um die gewünschten transformierten Pflanzen zu produzieren.
Dementsprechend ist die technische Aufgabenstellung, die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegt, die Bereitstellung eines Promotors, der in der Lage ist, in Pflanzenzellen zu funktionieren, der die gewebespezifische Expression eines Gens von Interesse in Leitbündeln, insbesondere in Leitbündeln in der Wurzel von Pflanzen, ermöglicht. Dieses technische Problem wird durch die Ausführungsformen gelöst, die in den Ansprüchen charakterisiert sind. Somit betrifft die vorliegende Erfindung

1. Einen Promotor, der in Pflanzenzellen funktionell ist und eine Nucleotidsequenz (etwa 250 bp) nach SEQ ID NR: 1 umfaßt,
2. ein Plasmid, das den Promotor nach SEQ ID NR: 1 umfaßt,
3. ein Gen, das ein Protein codiert, das ein Molekulargewicht von 16 kD hat, und das eine Nucleotidsequenz hat, die eine Aminosäuresequenz nach SEQ ID NR: 3 codiert,
4. ein Gen, das ein Protein codiert, das ein Molekulargewicht von 16 kD hat, und das eine Nucleotidsequenz nach SEQ ID NR: 4 hat, und
5. einen Terminator, der in der Lage ist, in Pflanzenzellen zu funktionieren und der eine Nucleotidsequenz nach SEQ ID NR: 5 umfaßt.

Die 1 zeigt pCR16G1/250-GUS, pCR16G1/EV-GUS und pCR16G1/H-GUS, welches die Plasmide der vorliegenden Erfindung sind.
Die 2 zeigt pCR16G1/Xb, welches ein Plasmid ist, das das Gen des Proteins der vorliegenden Erfindung enthält.
Die 3 zeigt einen Vergleich zwischen der Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung und Aminosäuresequenzen von verschiedenen Proteinen.
Die 4 zeigt pCR16G1/Xh, welches ein Plasmid der vorliegenden Erfindung ist (ein Plasmid, welches einen Teil des Gens des Proteins und den Promotor der vorliegenden Erfindung enthält).
Die 5 zeigt Schritte der Konstruktion von pCR16G1/250-GUS, welches ein Plasmid der vorliegenden Erfindung ist, aus pBI101.
Die 6 zeigt Schritte der Konstruktion von pCR16G1/EV-GUS, welches ein Plasmid der vorliegenden Erfindung ist, aus pBI101 und pCR16G1/250-GUS.
Die 7 zeigt Schritte der Konstruktion von pCR16G1/H-GUS, welches ein Plasmid der vorliegenden Erfindung ist, aus pBI101.
Die 8 zeigt einen Promotor der vorliegenden Erfindung, der eine Region hat (etwa 4 Kbp), die die Restriktionsstellen für XhoI (0 kb), XbaI (0,3 kb), EcoRV (2 kb), EcoRV (2,3 kb), EcoRI (3 kb), SmaI (3,6 kb) und HindIII (4 kb) hat.
Die 9 zeigt die Sichtbarmachung (zeigt die Morphologie eines Organismus) durch Anfärben, was die hohe Expression der gewünschten Proteins in den Leitbündeln einer Pflanze aufgrund des Promotors der vorliegenden Erfindung anzeigt. Die Leitbündel sind in dieser Darstellung als Ergebnis des Anfärbens weiß. In der Darstellung ist die schwarze Fläche die nicht angefärbte Region und die weiße Fläche die angefärbte Region.
Die 10 zeigt die Sichtbarmachung (zeigt die Morphologie eines Organismus) durch Anfärben, was die hohe Expression der gewünschten Proteins in den vaskulären Bündeln einer Pflanze aufgrund des Promotors der vorliegenden Erfindung anzeigt.
In der Darstellung ist die schwarze Fläche die nicht angefärbte Region und die weiße Fläche ist die angefärbte Region, die vaskulären Bündel sind in dieser Darstellung als Ergebnis des Anfärbens weiß.
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter beschrieben.
Bei der vorliegenden Erfindung können herkömmliche Verfahren der Gentechnik, wie sie zum Beispiel bei J. Sambrook, E. F. Frisch und T. Maniatis, Molecular Cloning, 2te Ausg., publiziert durch Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; D. M. Glober, DNA Cloning, publiziert durch IRL, 1985; beschrieben sind, und so weiter verwendet werden.
Zunächst wird der Promotor beschrieben, der in Pflanzenzellen funktionell ist und der eine Nucleotidsequenz umfaßt, wie sie in SEQ ID NR: 1 dargestellt ist.
Der Promotor kann eine Nucleotidsequenz umfassen, wie sie in SEQ ID NR: 2 dargestellt ist, welche eine Nucleotidsequenz umfaßt, wie sie in SEQ ID NR: 1 dargestellt ist.
Der Promotor kann auch eine Nucleotidsequenz (etwa 4 Kbp) umfassen, die die folgenden Charakteristika hat:

a. isoliert und/oder gereinigt aus Karotte;
b. hat Restriktionsenzymstellen für XhoI (0 kb), XbaI (0,3 kb), EcoRV (2 kb), EcoRV (2,3 kb), EcoRI (3 kb), SmaI (3,6 kb) und HindIII (4 kb); und
c. enthält eine Nucleotidsequenz umfaßt, wie sie in SEQ ID NR: 2 dargestellt ist.

Die Promotoren werden vorzugsweise für die wurzelspezifische Expression eines gewünschten Strukturgens verwendet.
Der "Promotor, der in Pflanzenzellen funktionell ist" bedeutet hier einen Promotor, der eine Fähigkeit hat, die Expression eines Proteins in Pflanzenzellen zu kontrollieren, wenn ein Strukturgen des gewünschten Proteins stromabwärts des besagten Promotors ligiert ist.
Die Promotoren der vorliegenden Erfindung, wie sie vorstehend beschrieben sind, können weiterhin modifiziert werden durch Ligieren an eine Nucleotidsequenz wie:
eine die Transkription-Translation aktivierende Sequenz, die durch Ligieren der Region –333 bis –116 des Octopin-Synthase-Gens von Agrobacterium mit der Region –318 bis –138 des Mannopin-Synthase-Gens gebildet wird,
eine die Transkription-Translation aktivierende Sequenz, die durch Ligieren der Region –318 bis –213 des Mannopin-Synthase-Gens mit der Region –333 bis –116 des Octopin-Synthase-Gens (The Plant Journal, 7(4), 661–676 (1995)) gebildet wird,
eine Nucleotidsequenz, die die Region –343 bis –91 des 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (Nature, 313, 810–812 (1985)) enthält,
eine Nucleotidsequenz, die die Region –1099 bis –205 des Gens der kleinen Untereinheit der Ribulose-1,5-diphosphat-Carboxylase/Oxygenase der Tomate (rbc-3A) (Plant Cell, 1, 217–227 (1990)) enthält,
eine Nucleotidsequenz, die die Region –902 bis –287 des PR1a-Gens von Tabak (Plant Cell, 2, 357–366 (1990)) enthält,
eine Nucleotidsequenz, die die Region –1300 bis –196 des Proteaseinhibitorgens der Kartoffel (PI-II) (Plant Cell, 2, 61–70 (1990)) enthält.
Das Plasmid, das irgendeinen der Promotoren der vorliegenden Erfindung hat, wird üblicherweise so konstruiert, daß es eine oder mehr Clonierungsstellen für die Inserierung oder das Ausschneiden eines gewünschten Strukturgens stromabwärts vom Promotor der vorliegenden Erfindung hat.
Die Clonierungsstelle bedeutet hier eine Stelle, die von einem Restriktionsenzym, das bei den Verfahren der Gentechnik verwendet wird, erkannt und gespalten werden kann.
Spezifischer umfaßt das Plasmid auch ein chimäres Gen, das durch Ligierung eines Strukturgens eines gewünschten Proteins stromabwärts vom Promotor (das Strukturgen kann bezüglich des Promotors heterolog sein) hergestellt wurde, um ein gewünschtes Protein in Pflanzenzellen zu exprimieren.
Solch ein chimäres Gen umfaßt zum Beispiel

(1) eine rekombinante DNA, die nur den Promotor der vorliegenden Erfindung und das gewünschte Strukturgen hat, und
(2) ein Plasmid wie ein extrachromosomales Gen, das das besagte rekombinante DNA-Gen enthält und das physikalisch unabhängig von den Chromosomen des Wirts autonom replizierend und stabil vererbbar ist, und dergleichen.

Zur Erhöhung der Effizienz der Expression des gewünschten Proteins werden Pflanzenzellen vorzugsweise mit einem Plasmid transformiert, das den Promotor der vorliegenden Erfindung, das gewünschte Strukturgen und einen Terminator, der in Pflanzenzellen funktionell ist, hat.
Der "Terminator, der in Pflanzenzellen funktionell ist" bedeutet, daß der Terminator eine Fähigkeit hat, die Transkription des gewünschten Strukturgens in Pflanzenzellen effektiv zu beenden. Ein solcher Terminator existiert üblicherweise in einer genomischen DNA-Region, die stromabwärts einer poly A-Sequenz liegt, die üblicherweise stromabwärts eines Poly(A)-Additions-Signals (das zu einer Consensus-Sequenz mit AATAAA gemacht wurde) existiert, das in einer 3'-terminalen nicht translationalen Region vorhanden ist, die stromabwärts eines Terminationscodons in Strukturgenen verschiedener Proteine liegt.
Beispiele für den Terminator umfassen einen Terminator, der in Pflanzenzellen funktionell ist und der eine Nucleotidsequenz enthält, wie sie in SEQ ID NR: 6 dargestellt ist, einen Terminator (NOS) im Nopalinsynthasegen, das von einem Pflanzengen abgeleitet ist, einen Terminator der GV1- und GV2-Gene des Knoblauchvirus oder dergleichen.
Spezifische Beispiele des Plasmids der vorliegenden Erfindung, das eine Clonierungsstelle hat, umfassen das Plasmid, das in 1 gezeigt ist: pCR16G1/250-GUS, pCR16G1/EV-GUS und pCR16G1/H-GUS oder dergleichen.
Das Plasmid der vorliegenden Erfindung kann zum Beispiel durch das folgende Verfahren hergestellt werden.
Zunächst wird der Promotor, der eine Nucleotidsequenz umfaßt, wie sie in SEQ ID NR: 1 dargestellt ist, in eine Vielfachclonierungsstelle eines Plasmids inseriert, das einen Terminator enthält, der in Pflanzenzellen funktionell ist, zum Beispiel pBI101 (hergestellt von Clontech) (Jefferson et al., EMBO J., 6, 3901–3907 (1987)).
Dann wird ein Exogenotes wie ein existierendes Markergen, zum Beispiel das β-Glucuronidasegen (hier im weiteren als GUS-Gen bezeichnet), ausgeschnitten und das besagte Exogenote wird durch ein gewünschtes Strukturgen ersetzt.
Alternativ werden der Promotor der vorliegenden Erfindung, ein gewünschtes Strukturgen und ein Terminator, die in Pflanzenzellen funktionell sind, in dieser Reihenfolge in eine Vielfachclonierungsstelle eines binären Vektors inseriert, zum Beispiel pBIN19 (Nuc. Acid Res., 12, 8711–8721 (1984)).
Bevorzugte Beispiele von gewünschten Strukturgenen, die im chimären Gen der vorliegenden Erfindung enthalten sind, umfassen nützliche Gene, die in der Lage sind, die Resistenz gegen Schaden durch Krankheit und Schädlinge zu erhöhen.
Beispiele für solch ein nützliches Gen umfassen Pflanzenschutzgene wie das Phenylalanin-Ammoniak-Lyasegen (PAL), das Chalconsynthasegen (CHS), das Chitinasegen (CHT), das Lysozymgen, das PR-Proteingen und dergleichen und Krankheitsresistenzgene wie das Pto-Gen, das virale Mantelproteingen und dergleichen.
Der Kampf gegen pathogene Pilze, die im Leitbündel der Pflanze lokalisiert sind, und Schädlinge, die Nährstoffe aus der Region des Leitbündels entnehmen, oder dergleichen kann durch wirkungsvolle Expression von Proteinen, die durch diese nützlichen Gene im vaskulären Bündel einer Pflanze codiert werden, unter Verwendung des Promotors der vorliegenden Erfindung wirkungsvoll durchgeführt werden.
Da der Promotor der vorliegenden Erfindung weiterhin die Expression eines gewünschten Proteins insbesondere in den vaskulären Bündeln der Wurzel ermöglicht, ist er von Nutzen bei

(1) dem Kampf gegen pathogene Bodenpilze und Schädlinge, die durch Chemikalien schwer abzutöten sind, und bei der Schaffung einer funktionellen Nutzpflanze, bei der die der Krankheit zugängliche Wurzel mit einer Immunität oder Resistenz gegen pathogene Pilze und Schädlinge versehen wird; und
(2) der Verbesserung des Nährwerts von eßbaren Wurzelpflanzen oder bei der Erzeugung von Nutzpflanzen, die einen erhöhten Gehalt an Nährstoffen wie Proteine haben.

Gewünschte Strukturgene, die für einen solchen Zweck verwendet werden, umfassen zum Beispiel das BT (Bacillus thuringiensis)-Toxinproteingen,
Gene, die in der Lage sind, die Resistenz gegen Schaden durch Krankheit und Schädlinge zu erhöhen, wie vorstehend beschrieben,
Gene, die in der Lage sind, den Gehalt an verschiedenen Proteinen in Futterpflanzen zu erhöhen, wie Vorratsproteine, einschließlich des Conglycicingens, des β-Conglycicingens der Sojabohne, und dergleichen,
Gene, die in der Lage sind, den Methioningehalt oder den Lysingehalt in Futterpflanzen zu erhöhen, wie das 2S Albumingen von Bertholletia excelsa Humb., die Gene für das 10 kDa- und 15 kDa-Protein von Mais und Reis und dergleichen,
Gene, die mit der Biotin-Biosynthese assoziiert sind und die in der Lage sind, den Biotingehalt in Futterpflanzen zu erhöhen, wie die Enzymgene für bioA, bioB, bioC, bioD, bioF oder bioH von Mikroorganismen, einschließlich Escherichia coli und dergleichen,
Gene, die in der Lage sind, die Oxidationsstabilität von Lipiden zu erhöhen und durch Verminderung von Phospholipiden und Erhöhung von Oleinsäure und Linolensäure Lipide zu verbessern, wie Gene für die Stearoyl-ACP-Desaturase, die Acyl-ACP-Thioesterase, die 3-Phosphatacyltransferase und dergleichen,
Gene, die in der Lage sind, die Resistenz gegen niedrige Temperatur durch Erhöhung des Anteils von ungesättigten Fettsäuren zu erhöhen, wie das Acyltransferasegen,
ebenso wie Gene, die mit Herbizidresistenz assoziierte Gene sind und in der Lage sind, gegen Herbizid resistente Nutzpflanzen zu schaffen, wie Gene für die L-Phosphonothrisinacetylase, (EPSP)-Synthase, PPO und dergleichen.
Verfahren zur Einbringung des chimären Gens oder des Plasmids der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel bekannte Verfahren wie das Agrobacterium-Verfahren (ein Verfahren, bei dem ein Pflanzengewebe mit Agrobacterium, einem Bodenbakterium, infiziert wird), das Verfahren der elektrischen Einbringung (ein Verfahren der elektrischen Einbringung in Protoplasten: Elektroporation), das Verfahren der direkten Einbringung durch die Teilchenpistole (ein Verfahren der direkten Einbringung in Pflanzengewebe oder kultivierte Zellen: das Verfahren der Teilchenpistole) und dergleichen. Die Pflanzenzellen, die mit dem Promotor, dem chimären Gen oder dem Plasmid der vorliegenden Erfindung transformiert sind, können mittels herkömmlicher Verfahren der Pflanzengewebekultur regeneriert werden, wie sie zum Beispiel bei S. B. Gelvin, R. S. Schilperoot und D. P. S. Verma, Plant Molecular Biology, Handbuch, Kluwer Academic Publishers Press (1988); Valvekens et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 5536–5540 (1988) beschrieben sind, um eine Pflanze oder einen Teil davon zu ergeben, die der von den besagten Pflanzenzellen abstammt.
Pflanzen, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen zum Beispiel Monocotyledone wie Reis, Mais, Gerste, Weizen, Zwiebel und dergleichen,
Dicotyledone einschließlich Leguminosae-Pflanzen wie Sojabohne, Erbse, Bohne, Alfalfa und dergleichen,
Solanaceae-Pflanzen wie Tabak, Tomate, Kartoffel und dergleichen,
Cruciferae-Pflanzen wie Kohl, Raps, Senf und dergleichen,
Cucurbitaceae-Pflanzen wie Melone, Kürbis, Gurke und dergleichen,
Umbelliferae-Pflanzen wie Karotte, Sellerie und dergleichen,
und Compositae-Pflanzen wie Salat und dergleichen.
Pflanzenzellen und Pflanzen, in die ein gewünschtes Strukturgen eingebracht wurde und die ein Protein exprimieren, das von dem gewünschten Strukturgen unter der Kontrolle eines Promotors der vorliegenden Erfindung codiert wird, können in der vorstehend beschriebenen Weise erhalten werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt weiterhin ein Protein, das aus der Wurzel von Karotte (Daucus carota L.) isoliert und/oder gereinigt wurde, wie Kuroda Gosun ( EP 0 659 884 A2 ). Das Protein hat ein Molekulargewicht von 16 kD, seine Aminosäuresequenz ist in SEQ ID NR: 3 gezeigt. Die Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NR: 4 gezeigt ist, stellt eine Nucleotidsequenz von genomischer DNA dar, die die beiden Intron-Regionen und die cDNA-Sequenz, die die in SEQ ID NR: 3 gezeigte Aminosäuresequenz codiert, enthält.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird durch Einbringung und Expression eines Gens, das das Protein codiert, in die Wurzel mittels zum Beispiel des Verfahrens, das vorstehend beschrieben wird, unter Verwendung des Promotors der vorliegenden Erfindung die Schaffung einer Karotte möglich, die reich an gewissen Proteinnährstoffen von Interesse ist.
In ähnlicher Weise kann der Nährwert von Wurzelnutzpflanzen durch Einbringung und Expression eines Gens, das ein Nährprotein codiert, in die bzw. der Wurzel verbessert werden. Beispiele für Wurzelnutzpflanzen umfassen zum Beispiel Rettich, Rübe, Zuckerrübe, Klette und dergleichen.
Wenn weiterhin ein nützliches Protein oder seine Nucleotidsequenz, das die eine hohe Homologie mit dem Protein oder der Nucleotidsequenz hat, die das in der vorliegenden Erfindung beschriebene Protein codiert, in einer Nucleotiddatenbank wie EMBL, NBRF und so weiter gefunden werden kann, kann die Nucleotidsequenz, die für das nützliche Protein codiert, mittels herkömmlicher Hybridisierungs- und Clonierungsverfahren unter Verwendung des Gens des erfindungsgemäßen Proteins leicht erhalten werden, und somit kann das so erhaltene Gen durch die vorliegenden Promotoren eingebracht und wirksam exprimiert werden.
Beispiele für solche nützlichen Proteine umfassen:

(1) ein Protein, das zur Resistenz gegen Pathogene beiträgt, welches einer Pflanze Resistenz gegen Pathogene verleihen kann und bei der Aufklärung des Mechanismus der Resistenz gegen Pathogene von Nutzen ist;
(2) ein Protein, das als Pflanzenhormon wirkt und das unter dem Einfluß von Streß von außerhalb oder dergleichen in verschiedenen Mengen exprimiert oder induziert wird, wobei die Kontrolle der Expression verschiedene Verbesserungen in der Kulturvarietät ermöglicht; wobei die Antwort auf Stress oder Hormon ausgenützt wird;
(3) ein Protein, das mit Pollenallergie assoziiert ist; die kontrollierte Expression des Proteins ermöglicht Verbesserungen in der Kulturvarietät, so daß sie verbesserte Pollen oder eine kontrollierte Expressionsmenge an Pollen bildet, was in keiner oder einer geringen Allergie resultieren kann; und
(4) ein Protein, das mit dem Hitzeschock assoziiert ist, welches die Verbesserung bei der Lagerung oder dem Transport von Pflanzen durch Beihilfe beim Erhalt von nützlichen Proteinen ermöglicht.

Verfahren für die Isolierung des Promotors und des Terminators und des Proteins, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, werden nachstehend dargestellt.
Zuerst wird genomische DNA von Blättern hergestellt, die partiell mit einem geeigneten Enzym hydrolysiert wird und mit einem Vektorarm ligiert wird, der von einem λ-Phagen abgeleitet ist. Dieser wird in vitro verpackt, um einen Phagenpartikel zu bilden, mit dem Escherichia coli infiziert wird, was in einem Plaque auf einem Agar-Medium resultiert. Dieser wird gewonnen und eine genomische Bibliothek davon wird für die Gendurchmusterung verwendet. Verfahren für die Herstellung von genomischer DNA umfassen zum Beispiel das CTAB-Verfahren, das von M. Shure et al., Cell, 35, 325 (1983), beschrieben wurde, das Harnstoff-Phenol-Verfahren, das von S. O. Rogers und A. J. Bendich, Plant. Mol. Biol., 5, 69 (1985) beschrieben wurde, und dergleichen. Als λ-Vektor können zum Beispiel λ FIX II, λ EMBL3, λ EMBL4, λDASH II, verfügbar bei Stratagene, und dergleichen verwendet werden.
Für die in vitro-Verpackung kann zum Beispiel der Gigapack Packaging Extract, verfügbar bei Stratagene, verwendet werden.
Zur Auswahl eines genomischen Clons, der die Nucleotidsequenz des Promotors, des Teminators oder des Proteins enthält, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, aus einer genomischen Bibliothek ist zum Beispiel die Plaque-Hybridisierung unter Verwendung einer Sonde, die durch Markierung einer cDNA, die dem gewünschten Gen entspricht, oder einer cDNA, die dem gewünschten Gen ähnlich ist, mit RI oder einem fluoreszierenden Reagens oder dergleichen erzeugt wird, ein effektives Verfahren. Die Markierung mit RI kann zum Beispiel unter Verwendung des Random Labelling Kits, der bei Boehringer oder Takara Shuzo oder dergleichen verfügbar ist, durchgeführt werden.
Die Fluoreszenzmarkierung kann zum Beispiel unter Verwendung des ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems, das bei Amersham verfügbar ist, oder dergleichen durchgeführt werden.
Der genomische Clon, der die Nucleotidsequenz des Promotors der vorliegenden Erfindung, den Teminator der vorliegenden Erfindung oder das Protein enthält, das in der vorliegenden Erfindung beschrieben wird, und durch Durchmusterung erhalten wurde, kann durch Subclonierung in einen Plasmidvektor sequenziert werden, wobei eine DNA-Präparation oder -Analyse mit herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden kann, wobei kommerziell verfügbares pUC18, pUC19, pBluescript KS+, pBluescript KS– oder dergleichen um Plasmid-DNA zu bilden, und das Zyklus-Sequenzierungsverfahren verwendet werden, bei dem das Sanger-Verfahren, das in Sanger et al., J. Mol. Biol., 94, 441 (1975) und Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463 (1977) beschrieben ist, und PCR, die bei Saiki et al., Science, 230, 1350 (1985) beschrieben ist, verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung wird nun mittels Beispielen detaillierter beschrieben, die nicht als Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung aufgefaßt werden sollten.
Beispiel 1: Isolierung des Gens für das Protein
Es wurde unter Verwendung von genomischer DNA, die aus Karottenblättern gewonnen worden war, eine genomische Bibliothek hergestellt. Die genomische Bibliothek wurde unter Verwendung eines bereits erhaltenen cDNA-Fragments als Sonde durchmustert und es wurden zwei positive Clone erhalten. Das Durchmusterungsverfahren wird nachstehend dargestellt:
Schritt 1: Herstellung einer genomischen Bibliothek der Karotte
(1) Herstellung von genomischer DNA der Karotte
10 g Karottenblätter wurden 6 Wochen nach dem Aussähen in flüssigem Stickstoff zerrieben. Das Pulver wurde in 5 ml 2 × CTAB-Lösung (2% Cetyltrimethylammoniumbromid, 100 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 20 mM EDTA, pH 8,0, 1,4 M NaCl, 1% Polyvinylpyrrolidon)) suspendiert und bei 55°C 10 Minuten inkubiert. Dieselbe Menge an Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) wurde zugegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur vorsichtig gemischt, gefolgt von Zentrifugation, um die obere und untere Schicht zu trennen.

(a) Zu der oberen Schicht wurde dieselbe Menge an Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) zugegeben, und
(b) zu der unteren Schicht wurde dieselbe Menge an 1 × CTAB-Lösung zugegeben (eine doppelte Verdünnung von 2 × CTAB-Lösung mit sterilisiertem distilliertem Wasser), 10 Minuten bei Raumtemperatur vorsichtig gemischt, erneut gefolgt von Zentrifugation, wonach die obere Schicht von (a) und (b) entnommen und gemischt wurden. Zu dem Gemisch wurden 1/10 der Menge an 10%-iger CTAB-Lösung (10% Cetyltrimethylammoniumbromid, 0,7 M NaCl) und dieselbe Menge an Ausfällpuffer (2% Cetyltrimethylammoniumbromid, 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 10 mM EDTA, pH 8,0) zugegeben und vorsichtig gemischt, gefolgt von Zentrifugation. Der erhaltene Niederschlag wurde in 1 M NaCl-TE (1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 1 mM EDTA, pH 8,0) suspendiert. Dieselbe Menge an Isopropanol wurde zugegeben und vorsichtig gemischt, gefolgt von Zentrifugation. Der erhaltene Niederschlag wurde mit 70%-igem Ethanol gespült, kurze Zeit getrocknet und in TE suspendiert. Dazu wurde RNase mit einer Endkonzentration von 10 μg/ml zugegeben und 30 Minuten bei 37°C reagieren lassen, wonach ¼ der Menge an 4 M Ammoniumacetat und die 2-fache Menge an 100%-igem Ethanol zugegeben und gemischt wurden, um die DNA auszufällen. Die erhaltene DNA wurde mit 70%-igem Ethanol gespült, kurze Zeit getrocknet und in TE (10 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 1 mM EDTA) suspendiert. Die DNA-Lösung wurde in geeigneter Weise verdünnt, auf Absorption getestet und in einem Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um die Produktion von etwa 350 μg genomischer DNA zu bestätigen.

(2) Partielle Hydrolyse und Insertion der genomischen DNA in λ-Vektor
Ein Gemisch einer Portion von 50 μg der genomischen DNA, die wie vorstehend erhalten worden war, und Sau3AI mit einer Endkonzentration von 0,08 U/μl wurde bei 37°C 50 Minuten inkubiert, um die DNA partiell zu hydrolysieren. Ein Teil der Lösung wurde mittels Elektrophorese auf einem 0,5%-igen Agarosegel fraktioniert und es wurde bestätigt, daß sie hauptsächlich aus DNA-Fragmenten von 20–50 kb bestand. Zu dieser DNA-Lösung wurde eine gleiche Menge an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) zugegeben und ausreichend gemischt, gefolgt von Zentrifugation und Abtrennung der oberen Schicht. Die Behandlung mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) wurde einmal wiederholt und die erhalten Lösung wurde mir 1/10 der Menge an 3 M Natriumacetat und der doppelten Menge an 100%-igem Ethanol kombiniert, gut gemischt und das Gemisch wurde nach Abkühlen auf –80°C 10 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde mit 70%-igem Ethanol gespült, für kurze Zeit getrocknet und in TE suspendiert. Zu dieser DNA-Lösung wurden 167 μM dATP, 167 μM dGTP und Klenow (Takara Shuzo) mit einer Endkonzentration von 0,05 U/μl zugegeben und man ließ das Gemisch bei Raumtemperatur 15 Minuten reagieren. Dazu wurden 1/10 der Menge an 10 × STE und dieselbe Menge an 1 × STE zugegeben und gemischt. Zu der Lösung wurde dieselbe Menge an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) zugegeben und es wurde ausreichend gemischt, gefolgt von Zentrifugation und Abtrennung der oberen Schicht. Die Behandlung mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) wurde einmal wiederholt und die erhaltene Lösung wurde mit 1/10 der Menge an 3 M Natriumacetat und der doppelten Menge an 100%-igem Ethanol kombiniert, gut gemischt und das Gemisch wurde nach Abkühlen auf –80°C 10 Minuten zentrifugiert. Der Niederschlag wurde mit 70%-igem Ethanol gespült, für kurze Zeit getrocknet und in TE suspendiert. Es wurde ein Reaktionsgemisch (50 mM Tris-Hcl-Puffer, pH 7,5, 70 mM MgCl₂, 10 mM DDT) hergestellt, das einen Teil dieser Lösung und 1 μg λ/FIXII-Vektor (Stratagene) enthielt. Dazu wurde T₄ DNA-Ligase (Takara Shuzo) zugegeben und man ließ das Gemisch über Nacht bei 16°C reagieren.
(3) Verpacken und Amplifikation der Bibliothek
Die Reaktionslösung von (2) wurde unter Verwendung des Gigapack II Gold Packaging Extract (Stratagene) verpackt und es wurde eine genomische Bibliothek mit einer Größe von 6 × 10⁴ erhalten. Der Wirt, Escherichia coli XL1-Blue MRA (P2), unter Schütteln übernacht bei 37°C kultiviert, wurde mit einer Zellkonzentration: OD₆₀₀ = 0,5 in 10 mM Magnesiumsulfat suspendiert. Zu 200 μl der Zellsuspension wurden 10 000 PBE Phage zugegeben und das Gemisch wurde zusammen mit Top-Agar, auf einer NZY-Platte auf 50°C vorgeheizt, durchmischt, 8 Stunden bei 37°C inkubiert und der vermehrte Phage wurde in SM-Puffer (50 mM Tris-Hcl-Puffer, pH 7,5, 0,1 NaCl, 7 mM MgSO₄, 0,01% Gelatine) suspendiert. Die Phagensuspension wurde geerntet und für die folgende Durchmusterung verwendet.
Schritt 2: Durchmusterung der genomischen Bibliothek der Karotte
(1) Herstellung eines Filters für die Durchmusterung
Auf einer NZY-Platte wurden 50 000 PBE Phage verteilt und bei 37°C 8 Stunden inkubiert. Über diese Platte wurde ein Nylon-Filter Hybond-N (Amersham) gelegt und eine Minute belassen, um den Phagen zu adsorbieren. Dann wurde der Filter mit Alkali behandelt, um die Phagen zu lysieren, wobei DNA an den Filter gebunden wurde, gefolgt von einer Behandlung zur Neutralisation (1,5 N NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0, 3 Minuten × 2 mal). Nach 5 Minuten Waschen mit 2 × SSC (300 mM NaCl, 30 mM Zitronensäure) wurde der Filter an der Luft getrocknet und mit 2 Minuten mit UV bestrahlt, um die DNA an den Filter zu fixieren. Die folgende Hybridisierungsreaktion wurde unter Verwendung von 12 Filtern durchgeführt, die auf diese Weise hergestellt worden waren.
(2) Plaque-Hybridisierung
Die vorstehend hergestellten Filter wurden in Hybripack platziert, mit einer Hybridisierungslösung (6 × SSC/1% SDS/100 μg/ml Kalbsthymus-DNA) in Kontakt gebracht und bei 45°C 2 Stunden inkubiert, um Hybridisierung zu erreichen. Unter Verwendung eines Random Labelling Kits (Boeringer Mannheim) wurden 20–50 ng cDNA-Fragment des Proteins der vorliegenden Erfindung mit [α-³²P.dDNA] (0,74 MBq, Amersham) markiert, um eine Sonde herzustellen. In Hybripack wurden unter Versiegelung 3 000 000 CpM der Sonde, 10 ml Hybridisierungslösung und der Filter platziert, und es wurde übernacht bei 45°C inkubiert. Nach der Hybridisierungsreaktion wurde bei 45°C 10 Minuten mit 2 × SSC/1% SDS gewaschen. Das Waschen wurde zweimal wiederholt und es wurde für kurze Zeit mit 2 × SSC gespült und dann wurde der Filter 4 Stunden einer Abbildungsplatte ausgesetzt, gefolgt von Analyse unter Verwendung von BAS 2,000 (Fuji Film). Teile von 5 Quadratmillimetern der Platte, entsprechend den Stellen, wo Signal nachzuweisen war, wurden ausgeschnitten und in 500 μl SM-Puffer getaucht, um den Phagen herauszulösen. Unter Verwendung dieser Phagensuspension wurden mehrere Hundert PBE des Phagen pro Platte verteilt und diese wurden 8 Stunden bei 37°C inkubiert. Pro einem Signal wurden wie vorstehend von 2 Platten Filter hergestellt und die Hybridisierung wurde unter Verwendung des cDNA-Fragments für das Protein der vorliegenden Erfindung, das mit [α-³²P.dDNA] markiert war, als Sonde durchgeführt. Aus den Regionen, wo Signale mit einem Bildanalysator nachgewiesen wurden, wurden Phagen gewonnen, und in der gleichen Weise wie vorstehend wurde eine dritte Durchmusterung durchgeführt, um zwei Phagenclone zu isolieren, von denen erwartet wurde, daß sie das Gen für das Protein enthalten. Mit einem der zwei vorstehenden wurde die folgende Analyse durchgeführt.
Schritt 3: Subclonierung und Sequenzierung des Gens für das Protein
(1) Herstellung der Phagen-DNA
In einen Erlenmeyerkolben von 1 Liter wurde NZYM-Medium gegeben (zu NZY-Medium wurden 0,2% Maltose zugegeben). Dazu wurde Escherichia coli XL1-Blue MRA (P2) (Hergestellt von Stratagene), unter Schütteln übernacht bei 37°C kultiviert, zugegeben und das Gemisch wurde übernacht unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Wenn die OD₆₀₀ 0,1 war, wurden 5 × 10¹⁰ Phagen zugegeben und die Kultur wurde weitergeführt. Der Wert der OD₆₀₀ wurde jede Stunde gemessen und nachdem die Lyse von Escherichia coli als Wirt bestätigt war, wurden 1,7 ml Chloroform zugegeben und das Gemisch wurde 10 Minuten gerührt. Die Phagen-DNA wurde aus 360 ml Phagenlösung gewonnen, die unter Verwendung von Lambda-trap (Clontech) auf diese Weise hergestellt worden war, um etwa 21 g Phagen-DNA zu ergeben.
(2) Charakterisierung des Genfragments für das Protein mittels Southern-Hybridisierung
Mit jeweils 0,5 U der Restriktionsenzyme NotI, XbaI und SalI wurde ein Teil von 50 ng der Phagen-DNA, die bei (1) erhalten wurde, verdaut und das Produkt wurde auf einem 0,8%-igen Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, um die DNA-Fraktionen zu fraktionieren. Nach der Überprüfung der Wanderungsstrecke der DNA in dem Gel mittels Färbung mit Ethidiumbromid wurde das Gel kurze Zeit gespült und in 0,25 N HCl 15 Minuten geschüttelt. Das Gel wurde erneut kurze Zeit mit Wasser gespült und 30 Minuten in 1,5 N NaCl/0,5 N NaOH geschüttelt. Das Gel wurde unter Verwendung von Vacugene (Pharmacia) auf ein Nylonfilter Hybond-N geblotted (Amersham) (1 Stunde bei 55 atm, in 1,5 N NaCl/0,5 N NaOH). Der geblottete Filter wurde 5 Minuten mit 2 × SSC gewaschen, an der Luft getrocknet und 2 Minuten bestrahlt, um die DNA auf dem Filter zu fixieren. Der Filter wurde unter Versiegelung zusammen mit der Hybridisierungslösung in Hybripack verpackt und bei 45°C 2 Stunden inkubiert. In Hybripack wurden unter Versiegelung 3 000 000 CpM der cDNA-Sonde für das Protein der vorliegenden Erfindung, die wie in Schritt 2, (2) hergestellt worden war, 10 ml Hybridisierungslösung und der Filter verpackt und übernacht bei 45°C inkubiert. Nach der Hybridisierungsreaktion wurde der Filter zweimal mit 2 × SSC/1% SDS 10 Minuten bei 45°C gewaschen, kurze Zeit mit 2 × SSC gespült, 2 Stunden einer Abbildungsplatte ausgesetzt und mit BAS 2,000 (Fuji Film) analysiert. Als Ergebnis wurde gezeigt, daß das DNA-Fragment von 1,5 kb, das mit XbaI erhalten wurde, das Gen für das Protein enthielt.
(3) Clonierung des DNA-Fragments, das das Gen für das Protein enthält
Nach dem vollständigen Verdau von 2 μg pBluescript KS-Vektor (Stratagene) mit 10 U XbaI wurde das Ende des Produkts mit CIAP (Takara Shuzo) dephosphoryliert. Zu der Reaktionslösung wurde eine gleiche Menge an Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) zugegeben und es wurde ausreichend gemischt, gefolgt von Zentrifugation. Die obere Schicht wurde abgetrennt, mit 1/10 der Menge an 3 M Natriumacetat und der doppelten Menge an 100%-igem Ethanol kombiniert und gut gemischt. Das Gemisch wurde nach Abkühlen auf –80°C 10 Minuten zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag wurde mit 70%-igem Ethanol gespült, für kurze Zeit getrocknet und in TE suspendiert. Ein Teil von 1 μg der in (1) erhaltenen Phagen-DNA wurde mit 100 U XbaI vollständig verdaut und das Produkt wurde unter Verwendung eines Ligierungs-Kits (Takara Shuzo) mit einem Teil von 50 ng des wie vorstehend hergestellten pBluescript KS-Vektors ligiert. Ein Teilvolumen der Reaktionslösung wurde zu kompetenten Zellen von Escherichia coli JM109 (Toyobo) zugegeben, es wurde transformiert und die Lösung wurde auf einer LB-Platte ausgebracht, die 50 μg/ml Ampicillin enthielt. Nach Inkubation bei 37°C übernacht wurde eine Koloniehybridisierung durchgeführt. Die Herstellung eines Filters, die Herstellung einer Sonde, die Hybridisierung und das Waschen wurden mit ähnlichen Verfahren wie in (1) und (2) durchgeführt, mit der Ausnahme, daß die Hybridisierungs- und Waschtemperatur 65°C war. Als Ergebnis der Analyse mit einem Bildanalysator wurde viele positive Clone erhalten. Von 18 Clonen davon wurden unter Verwendung einer QIA-prep-spin-Säule (Qiagen) Plasmid-DNAs gewonnen. Die Plasmid-DNAs wurden mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut, das geeignet ist, die clonierten DNA-Fragmente auszuschneiden und das Produkt wurde mir einem 0,8%-igen Agarosegel fraktioniert, analysiert und ein Clon pCR16G1/Xb (vgl. 2), der ein Genfragment (1,5 kb) des Proteins der vorliegenden Erfindung enthielt, wurde ausgewählt. Der ausgewählte Clon wurde unter Verwendung des Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kits (ABI) und eines Fluoreszenz-Sequenzierungsgeräts (ABI) über die gesamte Nucleotidsequenz sequenziert (vgl. SEQ ID NRs: 1, 4 und 5). Als Ergebnis wurde gezeigt, daß der Clon eine Promotorregion von 247 bp (der Promotor der vorliegenden Erfindung), eine codierende Region von 592 bp (das Gen des Proteins) und eine Terminatorregion von 836 (der Terminator der vorliegenden Erfindung) enthielt.
Beispiel 2: Homologie des Proteins der vorliegenden Erfindung
Die Nucleotidsequenz des Gens des Proteins der vorliegenden Erfindung, wie sie in Beispiel 1 bestimmt wurde (vgl. SEQ ID NR: 4), und die Aminosäuresequenz des Proteins der vorliegenden Erfindung, die von ihr codiert wird (vgl. SEQ ID NR: 3), wurden in den Datenbanken EMBL und NBRF recherchiert. Als Ergebnis wurde offenbar, daß das Gen des Proteins der vorliegenden Erfindung und die davon codierte Aminosäuresequenz eine hohe Homologie mit Pollenallergieproteinen in Sellerie, weißer Birke und dergleichen, mit PR-Proteinen, die mit Resistenz gegen Pathogene in Petersilie, Kartoffel und dergleichen assoziiert sind, und mit Proteinen in Erbse, Sojabohne und dergleichen hatten, die durch Streß von außen induziert werden (vgl. 3). Die höchste Homologie wurde mit APIg1 in Sellerie, mit PR1-3 und PR1-1 gesehen, die PR-Proteine in Petersilie sind, welche in Umbelliferae-Pflanzen enthalten sind, die Karotte einschließen. Es wurde auch eine relativ hohe Homologie mit der mRNA von HSP60 beobachtet, welches ein Hitzschockprotein der Maus ist.
Beispiel 3: Analyse des Expressionsmusters des Gens des Proteins mittels Northern-Hybridisierung
Von je 2 g Blüte, Blatt und Wurzel von Karotte wurden unter Verwendung von Isogen (Nippon Gene) die gesamten RNAs extrahiert, und weiterhin wurden unter Verwendung von Oligotex-dT30 (Takara Shuzo) etwa 40 μg mRNA gewonnen. Ein Anteil von 5 μg an mRNA wurde mittels 1,2%-iger modifizierter Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert und mittels des Kapillar-Blotverfahrens auf einen Nylonfilter Hybond-N (Amersham) in 10 × SSC geblotted. Nach dem Blotten wurde der Filter an der Luft getrocknet und bei 80°C 2 Stunden gebacken, um die DNA zu fixieren. Der Filter wurde in Prähybridisierungslösung getaucht und bei 45°C 2 Stunden inkubiert. Unter Verwendung von pCR16G1/Xb als Matrize und einem Primer, der die nicht-codierende 3'-Region amplifiziert, und der die folgende Sequenz hat:
5'-GCTGA ACTTT CCACC GTGTT-3' und
5'-GACAT CTCAT AGTTG AGACT C-3',
wurde die PCR-Reaktion durchgeführt (30 Zyklen, wobei 1 Zyklus aus den folgenden Behandlungen bestand: 94°C, 1 Minute; 55°C, 1 Minute; 72°C, 1 Minute). Bei dieser Reaktion wurde unter Hinzufügung von [α-³²P.dCTP] eine Markierung eingeführt und unter Verwendung des Produkts als Sonde wurde die Hybridisierung in ähnlicher Weise wie in Schritt 3, (2) durchgeführt. Das Produkt wurde mittels eines Bildanalysators analysiert und es wurde bestätigt, daß das Gen für das Protein der vorliegenden Erfindung in der Wurzel in hohem Maß transkribiert wurde.
Beispiel 4: Gewinnung des Promotors der vorliegenden Erfindung
Unter Verwendung eines Ligierungskits (Takara Shuzo) wurden 50 ng pBluescript KS-Vektor vollständig mit XhoI verdaut und am Ende dephosphoryliert, mit 1 μg DNA eines genomischen Phagenclons ligiert, der vollständig mit XhoI verdaut war. Ein Teilvolumen der Reaktionslösung wurde zu 100 μl kompetenten Zellen von Escherichia coli JM109 (Toyobo) zugegeben, es wurde transformiert und die Lösung wurde auf einer LB-Platte ausgebracht, die 100 μg/ml Ampicillin enthielt. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht wurde unter Verwendung von QIA-prep spin (Qiagen) aus dem wachsenden Clon ein Plasmid gewonnen und eine Region von mehreren hundert bp am Ende der enthaltenen, inserierten DNA wurde sequenziert. Als Ergebnis wurde pCR16G1/Xb (vgl. 4) erhalten, welches ein Clon ist, der einen Teil der codierenden Region des Gens des Proteins der vorliegenden Erfindung 13 kb enthält und eine Region stromaufwärts mit. Die Promotorregion (2 kb) des Gens des Proteins der vorliegenden Erfindung, die darin enthalten ist, wurde unter Verwendung des Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit (ABI) und eines Fluoreszenz-Sequenzierungsgeräts (ABI) sequenziert (vgl. SEQ ID NR: 1).
Beispiel 5: Konstruktion des Plasmids der vorliegenden Erfindung
(1) Herstellung des Promotors (247 bp) der vorliegenden Erfindung
Unter Verwendung einer Sequenz, die innerhalb des Vektors liegt, und einer Sequenz, die mehrere Zehn bp stromaufwärts des ATG des Gens des Proteins der vorliegenden Erfindung liegt, als Primer, die die folgenden Sequenzen haben:
5'-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3' (hergestellt von Takara Shuzo), und
5'-GGGCT AGCGA CCTTT AGAAT GTTTT TGC-3'
und von pCR16G1/Xb als Matrize wurde eine PCR-Reaktion (40 Zyklen, bei denen ein Zyklus aus den folgenden Behandlungen bestand: 94°C, 1 Minute; 40°C, 2 Minuten; 72°C, 3 Minuten) durchgeführt, um das DNA-Fragment zu amplifizieren, das den Promotor der vorliegenden Erfindung (247 bp) enthält. Als zum ATG des Gens des Proteins der vorliegenden Erfindung stromaufwärts gelegener Primer wurde ein synthetisierter Primer verwendet, der eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym NheI am 5'-Ende hat. Zu dem Reaktionsprodukt wurde eine gleiche Menge an Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) zugegeben, die erhaltene Lösung wurde zentrifugiert und die obere Schicht abgetrennt. Dazu wurden 1/10 der Menge an 3 M Ammoniumacetat und die doppelte Menge von 100%-igem Ethanol zugegeben und gemischt. Das Gemisch wurde zentrifugiert, um einen Niederschlag zu ergeben, der mit den Restriktionsenzymen XbaI und NheI vollständig hydrolysiert wurde und dann mittels 4%-iger Polyacrylamid-Elektrophorese fraktioniert wurde. Das Gel wurde so ausgeschnitten, daß ein DNA-Fragment enthalten war, das die gewünschte Länge hatte, und das DNA-Fragment wurde gemäß dem Verfahren gewonnen, das in Sambrook vorstehend beschrieben ist. Dabei wurde das Gel fein geschnitten und die Schnitte wurden in Extraktionspuffer getaucht, bei 37°C 5 Stunden inkubiert und die Gelabschnitte wurden mittels Zentrifugation entfernt. Die Lösung wurde mit der doppelten Menge an 100%-igem Ethanol kombiniert und das Gemisch wurde auf Eis gekühlt. Die nach Zentrifugation erhaltenen Niederschläge wurden in TE suspendiert. Dazu wurde 1/10 der Menge an 3 M Ammoniumacetat und die doppelte Menge von 100%-igem Ethanol zugegeben und und es wurde wie vorstehend eine Ethanolfällung durchgeführt. Der erhaltene Niederschlag wurde in TE resuspendiert und einer 4%-igen Polyacrylamid-Elektrophorese unterworfen, um die Konzentration des DNA-Fragments zu überprüfen, das zur Konstruktion des Plasmids der vorliegenden Erfindung verwendet wurde.
(2) Konstruktion des Plasmids (pCR16G1/250-GUS) der vorliegenden Erfindung
Der Promotor der vorliegenden Erfindung (247 bp), der, wie im Beispiel beschrieben, hergestellt wurde, wurde mit einem binären Vektor pBI101 (Clontech) ligiert, der mit XbaI geschnitten und mit CIAP behandelt worden war, und das Ergebnis wurde verwendet, um kompetente Escherichia coli JM109-Zellen zu infizieren, um Transformanten zu erhalten. Es wurde Clone ausgewählt, die auf einer LB-Platte gewachsen waren, die 50 μg/ml Kanamycin enthielt. Daraus wurde Plasmid-DNA gewonnen und mit einem Restriktionsenzym geschnitten, um einen möglichen Clon zu ergeben, der den Promotor der vorliegenden Erfindung (247 bp) enthält. Der Clon wurde unter Verwendung eines synthetischen Primers sequenziert, dessen Sequenz dieselbe ist wie diejenige, die innerhalb der codierenden Region des GUS-Gens liegt, wobei die Sequenz folgende ist:
5'-TCACG GGTTG GGGTT TCTAC-3'.
Es wurde mit Taq-Polymerase bestätigt, daß in der Region von 247 bp des Promotors keine Nucleotidsubstitution eingetreten war (vgl. 5).
(3) Konstruktion des (Expressions)-Plasmids (pCR16G1/EV-GUS) der vorliegenden Erfindung
pCR16G1/XhoI wurde mit EcoRV geschnitten und das resultierende Fragment wurde mit 0,8%-iger Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. Eine Bande, die einem DNA-Fragment entsprach, das den Promotor der vorliegenden Erfindung (247 bp) enthielt, wurde ausgeschnitten und das DNA-Fragment wurde unter Verwendung von Glaskügelchen (Bio-Rad) gewonnen. Die Konzentration an DNA in dem erhaltenen DNA-Fragment wurde mittels 0,8%-iger Agarose-Gelelektrophorese überprüft und die DNA wurde mit einem binären Vektor pBI101 ligiert, der mit dem Restriktionsenzym SmaI verdaut worden war. Kompetente Escherichia coli JM109-Zellen wurden mit dem Fragment infiziert, um die Zellen zu transformieren. Es wurden Clone ausgewählt, die auf einer LB-Platte gewachsen waren, die 50 μg/ml Kanamycin enthielt. Von den gewachsenen Clonen wurde Plasmid-DNA gewonnen und die Orientierung der Insertion wurde mittels Verdau mit Restriktionsenzym untersucht. Es wurde ein Clon genommen, der eine Insertion in der normalen Orientierung hatte. Dieser Clon wurde in Massen gezüchtet und die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung einer Qiagen Tip- 500-Säule (Qiagen) in Massen gewonnen. Die Plasmid-DNA wurde mit XbaI verdaut, mit 0,8%-iger Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert und ein DNA-Fragment von 1,75 kb (das die Stromaufwärts-Region des 247 bp-Promotors enthielt) wurde in ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben, gewonnen. Dieses wurde mit CIAP behandelt und mit pCR16G1/250-GUS ligiert, das mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut war (die Verknüpfungsstelle von NheI und XbaI wurde unspaltbar). Das resultierende Fragment wurde verwendet, um kompetente Escherichia coli JM109-Zellen zu transformieren und aus einem Kanamycin-resistenten Clon wurde ein Plasmid gewonnen. Mittels Restriktionsverdau wurde bestätigt, daß der Clon den Promotor der vorliegenden Erfindung (2 kb) enthielt. Weiterhin wurde unter Verwendung eines synthetischen Primers, der dieselbe Sequenz hat wie die, die innerhalb der codierenden Region des GUS-Gens liegt und der die folgende Sequenz hat:
5'-TCACG GGTTG GGGTT TCTAC-3',
die Promotorregion sequenziert und es wurde die Struktur von etwa 500 bp stromaufwärts von ATG im GUS-Gen charakterisiert (SEQ ID NR: 2, vgl. 6).
(4) Konstruktion des Plasmids (pCR16G1/H-GUS) der vorliegenden Erfindung
pCR16G1/XhoI wurde mit XbaI geschnitten und auf dieselbe Weise wie vorstehend bei (3) wurde ein DNA-Fragment gewonnen, das die Sequenz von 5 kb enthielt, die stromaufwärts vom ATG des Gens des Proteins der vorliegenden Erfindung liegt. Das resultierende Fragment wurde mit einem binären Vektor pBI101 ligiert, der mit dem Restriktionsenzym XbaI verdaut worden war. Das Produkt wurde verwendet, um kompetente Zellen zu transformieren. Es wurde ein Clon erhalten, der die Insertion in der normalen Orientierung enthielt. Dieser Clon wurde mit HindIII weiter verdaut, selbst-ligiert, transformiert und es wurde bestätigt, daß der erhaltene Clon nur eine HindIII-Restriktionsstelle hatte. Die Plasmid-DNA wurde mit XbaI verdaut und, wie vorstehend beschrieben, mit dem Promotor der vorliegenden Erfindung (247 bp) ligiert. Es wurde unter Verwendung dieses Clons ein Plasmid hergestellt, das den Promotor der vorliegenden Erfindung (247 bp) in der normalen Orientierung inseriert hatte. Unter Verwendung eines synthetischen Primers, der dieselbe Sequenz hat wie diejenige, die innerhalb der codierenden Region des GUS-Gens liegt, wobei die Sequenz folgende ist:
5'-TCACG GGTTG GGGTT TCTAC-3',
wurde das Plasmid in derselben Weise wie vorstehend sequenziert und es wurde die Struktur von etwa 500 bp stromaufwärts von ATG im GUS-Gen charakterisiert (vgl. 7 und 8).
Dies ermöglichte die Bestätigung, daß die Struktur an der und um die Ligierungsstelle nicht verändert war.
Beispiel 6: Produktion von Zellen und Pflanzen der vorliegenden Erfindung
Die Produktion von transgenen Pflanzen wurde gemäß dem bei S. B. Gelvin, R. A. Schileroort und D. P. S. Verma, Plant Molecular Biology/Manual (1988) (Kliwer Academic Publishers; Valvekens et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 5536–5540 (1988)) beschriebenen Verfahren durchgeführt.
Der Agrobacterium-Stamm LBA4404, der unter Schütteln bei 30°C über Nacht in YEB-Medium gezüchtet wurde, wurde in frischem YEB-Medium subkultiviert und die Kultivierung wurde fortgeführt, bis die OD₆₀₀ 0,6 war. Das folgende Verfahren wurde in einem gekühlten Raum durchgeführt. Durch Zentrifugation wurden aus der Kultur Zellen gesammelt, in gekühltem, destilliertem, sterilem Wasser suspendiert und erneut durch Zentrifugation gesammelt. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt und ein ähnliches Verfahren wurde bei Ersatz des destillierten, sterilen Wassers durch eine 10%-ige Glycerin-Lösung durchgeführt. Die erhaltenen Zellen wurden in 10%-igem Glycerin suspendiert, um letztlich eine 400-fache Konzentration zu erhalten. In diese kompetenten Zellen wurden die drei Ti-Plasmid-Expressionsvektoren (hier nachstehend als pCR16G1/250-GUS, pCR16G1/EV-GUS und pCR16G1/H-GUS bezeichnet), die, wie vorstehend beschrieben, hergestellt wurden, mittels des Elektroporation-Verfahrens eingebracht und auf einer YEB-Platte selektioniert, die 50 μg/ml Kanamycin enthielt. Aus den gewachsenen Kanamycin-resistenten Clonen wurden mittels des Alkali-SDS-Verfahrens Plamid-DNAs gewonnen und mittels 0,8%-iger Agarose-Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Färbung wurde bestätigt, daß die Ti-Plasmid-Expressionsvektoren eingebracht worden waren. Die Agrobacterium-Stämme (pCR16G1/250-GUS/LBA4404, pCR16G1/EV-GUS/LBA4404 und pCR16G1/H-GUS/LBA4404) wurden unter Schütteln bei 30°C in flüssigem YEB-Medium über 2 Nächte gezüchtet.
Nach nicht-symbiotischem Aussähen wurden Wurzeln von Arabidopsis, die 2–3 Wochen bei 23°C gewachsen waren und in Stücke von etwa 1 cm zerschnitten waren, 2 Tage auf CIM-Platten inkubiert, in eine Kultur von Agrobacterium (pCR16G1/250-GUS/LBA4404, pCR16G1/EV-GUS/LBA4404 oder pCR16G1/H-GUS/LBA4404) getaucht, unter Schütteln über 2 Nächte bei 30°C kultiviert und erneut auf CIM-Platten inkubiert. Nach zwei Tagen wurden die Wurzelschnitte in SIMC-Medium überführt und 2 Tage später wurden sie weiter in SIMCK-Medium subkultiviert. Etwa 1 Monat später wurde regenerierte Sprosse abgeschnitten und in RIM-Medium übertragen, um die Wurzelbildung zu bewirken. Individuen mit Wurzeln wurden in Erde oder Steinwolle gepflanzt und in einem klimatisierten Raum wachsen gelassen, um selbst gebildete Samen zu erhalten.
Schnitte von aseptisch inkubierten Tabakblättern wurden in MS-Medium getaucht. Teilmengen von Übernachtkulturen bei 30°C von den Agrobacterium-Stämmen (pCR16G1/250-GUS/LBA4404, pCR16G1/EV-GUS/LBA4404, pCR16G1/H-GUS/LBA4404) wurden zu dem Medium zugegeben und die gemeinsame Inkubation wurde 2 Tage bei 25°C im Dunkeln fortgesetzt. Danach wurde die Blattschnitte mit flüssigem MS-Medium gewaschen und auf MS-NBCK-Medium platziert. Sie wurden 1 Monat bei 25°C stationär im Licht kultiviert, ein regenerierter Sproß wurde von dem Blattschnitt abgeschnitten und in MS-CK-Medium übertragen. Etwa 1 Monat später wurden Individuen mit Wurzeln in Erde gepflanzt, im Gewächshaus wachsen gelassen und es wurden selbst gebildete Samen erhalten.
Beispiel 7: Nachweis der Anwesenheit des eingebrachten Gens in der Pflanze der vorliegenden Erfindung
Die Samen der transgenen Arabidopsis, die in Beispiel 6 erhalten wurden, wurden mit 1%-iger hypochloriger Säure 5 Minuten sterilisiert, 3–5 mal mit sterilisiertem destilliertem Wasser gewaschen und dann nicht-symbiotisch in MS-Medium gekeimt, das 20 μg/ml Kanamycin enthielt. Von einem Individuum, das Kanamycin-Resistenz zeigte, wurden 4–5 Rosettenblätter entnommen und mit dem CTAB-Verfahren wurde genomische DNA daraus gewonnen.
Unter Verwendung von 50 ng dieser DNA als Matrize und einer Sequenz, die innerhalb des GUS-Gens liegt, das ein Reportergen ist, und einer Sequenz, die etwa 250 bp stromaufwärts vom ATG im GUS-Gen liegt (innerhalb des Promotors der vorliegenden Erfindung), als Primer, die die folgenden Sequenzen haben:
5'-TCTGC ATCGG CGAAC TGATC-3' und
5'-ACAAA CACAG CACTA ACTTT TC-3'
und weiterhin unter Verwendung einer Sequenz, die innerhalb des GUS-Gens liegt, und einer Sequenz, die innerhalb des NOS-Terminators liegt, als Primer, die die folgenden Sequenzen haben:
5'-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C-3' und
5'-CATGC TTAAC GTAAT TCAAC AG-3',
wurden PCR-Reaktionen durchgeführt (40 Zyklen, bei denen ein Zyklus aus den folgenden Behandlungen bestand: 94°C, 1 Minute; 55°C, 2 Minuten; 72°C, 3 Minuten), dann wurde ein Teil des PCR-Produkts mittels 0,8%-iger Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert. Somit wurde die Anwesenheit des eingebrachten Gens durch Amplifikation des gewünschten DNA-Fragments bestätigt.
Auch bei dem transgenen Tabak wurden die Samen mit 2,5% hypochloriger Säure/0,002% Triton X-100 5 Minuten sterilisiert und 4–5 mal mit sterilisiertem Wasser gewaschen. Die Samen wurden nicht-symbiotisch in MS-Medium gekeimt, das 100 μg/ml Kanamycin enthielt. Unter Verwendung eines Individuums, das Kanamycin-Resistenz zeigte, wurde mit dem CTAB-Verfahren genomische DNA gewonnen: mit demselben Verfahren wie dem für Arabidopsis, d. h. unter Verwendung eines Individuums, das Kanamycin-Resistenz zeigte, wurde mit dem CTAB-Verfahren genomische DNA gewonnen. Unter Verwendung von 50 ng dieses DNA-Fragments als Matrize und einer Sequenz, die innerhalb des GUS-Gens liegt, und einer Sequenz, die etwa 250 bp stromaufwärts von ATG im GUS-Gen liegt (innerhalb des Promotors der vorliegenden Erfindung), die die folgenden Sequenzen haben:
5'-TCTGC ATCGG CGAAC TGATC-3' und
5'-ACAAA CACAG CACTA ACTTT TC-3'
und weiterhin unter Verwendung einer Sequenz, die innerhalb des GUS-Gens liegt, und einer Sequenz, die innerhalb des NOS-Terminators liegt, als Primer, die die folgenden Sequenzen haben:
5'-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C-3' und
5'-CATGC TTAAC GTAAT TCAAC AG-3',
wurden PCR-Reaktionen durchgeführt (40 Zyklen, bei denen ein Zyklus aus den folgenden Behandlungen bestand: 94°C, 1 Minute; 55°C, 2 Minuten; 72°C, 3 Minuten), dann wurde ein Teil des PCR-Produkts mittels 0,8%-iger Agarose-Gelelektrophorese fraktioniert und die Anwesenheit des eingebrachten Gens wurde durch Amplifikation des gewünschten DNA-Fragments bestätigt.
Beispiel 8: Bestätigung des Expressionsmusters des eingebrachten Gens
Die Messung der GUS-Färbung und der GUS-Aktivität im Blatt und in der Wurzel des Keimlings von der Pflanze der vorliegenden Erfindung (die die Plasmide der vorliegenden Erfindung enthalten: pCR16G1/250-GUS, pCR16G1/EV-GUS, pCR16G1/H-GUS und, als Kontrollen, pBI121 (hergestellt von Clontech) und pBI101), die in Beispiel 6 erhalten worden waren, wurde gemäß dem Verfahren durchgeführt, das in Plant Mol. Bio. Rep., 5, 387–405 (1987) beschrieben ist.
Die Messung der GUS-Aktivität wurde mit dem Fluoreszenzverfahren unter Verwendung von 4-Methylumbelliferylglucuronsäure als Substrat und die der Aktivitätsfärbung wurde durch die Bestimmung der Ablagerung eines blauen Farbstoffs (Indigotin) unter Verwendung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure (X-Gluc) als Substrat durchgeführt.
(1) GUS-Färbung
Die Samen von transgener Arabidopsis wurden nicht-symbiotisch in MS-Medium gekeimt, das 20 μg/ml Kanamycin enthielt, und Individuen, die Kanamycin-Resistenz zeigten, wurden 3 Wochen wachsen gelassen. Die Pflanzen wurden herausgezogen, wobei darauf geachtet wurde, daß die Wurzeln nicht beschädigt wurden, in GUS-Färbelösung (1 mM X-Gluc, 0,5 mM K₃Fe(CN)₆, 0,5 mM Fe₄Fe(CN)₆, 0,3% Triton X-100) getaucht und über Nacht bei 37°C inkubiert. Nachdem die Reaktion abgeschlossen war, wurden sie durch mehrfaches Waschen mit 100%-igem Ethanol entfärbt und das Färbemuster wurde betrachtet. Die Ergebnisse bestätigten, daß in allen Pflanzen der vorliegenden Erfindung das Produkt des eingebrachten Gens in den Leitbündeln hoch exprimiert wurde, insbesondere in den Leitbündeln der Wurzel (vgl. 9 und 10). Die Intensität der Expression war in der Pflanze der vorliegenden Erfindung am stärksten, in die pCR16G1/H-GUS eingebracht worden war (vgl. Tabelle 1).
Die Samen von transgenem Tabak wurden nicht-symbiotisch in MS-Medium gekeimt, das 100 μg/ml Kanamycin enthielt, und Individuen, die Kanamycin-Resistenz zeigten, wurden nach 1 oder 3 Wochen oder einem Monat herausgezogen. Sie wurden in GUS-Färbelösung getaucht und über Nacht bei 37°C inkubiert. Dann wurden sie mit 100%-igem Ethanol entfärbt und das Färbemuster wurde betrachtet. Die Ergebnisse bestätigten eine ähnliche Tendenz wie bei der Expression in transgener Arabidopsis. Es wurde ebenfalls bestätigt, daß die Färbung mit dem Fortschreiten des Wachstumsstadiums stärker wurde.
(2) Messung der GUS-Aktivität
Die Samen von transgenem Tabak wurden nicht-symbiotisch in MS-Medium gekeimt, das 100 μg/ml Kanamycin enthielt, und 1 Monat bei 25°C inkubiert. Zu 0,8 g Wurzel und 0,5 g Blättern, die in einem Mörser platziert wurden, wurden 1 ml bzw. 0,5 ml eines Extraktionspuffers (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% Sarcosyl, 10 mM Mercaptoethanol) zugegeben und mit einer geeigneten Menge an Seesand zerrieben. Das zerriebene Material wurde in ein Eppendorf-Röhrchen gegeben, zentrifugiert und der Überstand wurde entnommen. Teilmengen von 10–70 μl wurden zu 500 ml einer Reaktionssubstratlösung (50 mM Phosphatpuffer, pH 7,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% Sarcosyl, 10 mM Mercaptoethanol, 1 mM 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid) zugegeben und bei 37°C zur Reaktion gebracht. Nach der Reaktion wurden Probenteilmengen von 100 μl entnommen und unmittelbar mit 900 μl Quencher-Reaktionslösung (0,2 M Natriumcarbonatlösung) gemischt. Die behandelten Proben wurden mittels eines Spektrophotofluorometers (Modell F-2000, Hitachi Seisakusho) getestet. Aus den Ergebnissen der Messung und der Proteinkonzentration in den Extrakten von Blättern und Wurzel wurde die GUS-Aktivität berechnet. Die Bestimmung der Proteinkonzentration wurde mittels eines Verfahrens unter Verwendung des bei Bio-Rad erhältlichen Protein Assay Reagent durchgeführt. Als Ergebnis wurde die höchste Aktivität in der Wurzel der Pflanze der vorliegenden Erfindung nachgewiesen (vgl. Tabelle 2).
Tabelle 1 Vergleich der GUS-Aktivität in der Wurzel von transgenen Tabakpflanzen, in die verschiedene Promotoren eingebracht wurden
Tabelle 2 Vergleich der GUS-Aktivität in verschiedenen Geweben von transgenen Tabakpflanzen, in die verschiedene Promotoren eingebracht wurden:
Die Zusammensetzung der Medien, die in den Beispielen verwendet wurden, ist nachstehend gezeigt
(1) Medien für Tabakpflanzen
a) MS-Agarmedium
In 1 Liter destilliertem Wasser wurden 4,4 g Murashige und Skoog (Flow Laboratories) und 30 g Zucker gelöst. Die Lösung wurde mit 1 M KOH auf pH 5,8 eingestellt, mit 3 g Gellangummi (Wako Pure Chemical) vereinigt und in einem Autoklaven sterilisiert.
b) MS-NBCK-Agarmedium
Dieses Medium wurde durch Zugabe von 0,1 μl/mg 1-Naphthalinessigsäure (NAA), 1,0 μg/ml 6-Benzylaminopurin (BA), 20 μg/ml Kanamycin und 300 μg/ml Claforan zu MS-Agarmedium hergestellt.
c) MS-CK-Agarmedium
Dieses Medium wurde durch Zugabe von 100 μg/ml Kanamycin und 300 μg/ml Claforan zu MS-Agarmedium hergestellt.
(2) Medien für Arabidopsis
a) MS-Agarmedium
In 1 Liter destilliertem Wasser wurden 4,4 g Murashige und Skoog (Flow Laboratories) und 20 g Zucker gelöst. Die Lösung wurde mit 1 M KOH auf pH 6,3 eingestellt, mit 2 g Gellangummi (Wako Pure Chemical) vereinigt und in einem Autoklaven sterilisiert.
b) CIM-Agarmedium
Dieses Medium wurde durch Zugabe von 0,5 μg/ml 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (2,4-D) und 0,05 μg/ml Kinetin zu MS-Agarmedium hergestellt
c) SIMC-Agarmedium
Dieses Medium wurde durch Zugabe von 5 μl/mg [2-Isopentenyladenin (2-Pi), 0,15 μg/ml Indolessigsäure (IAA) und 300 μg/ml Claforan zu MS-Agarmedium hergestellt.
d) SIMCK-Agarmedium
Dieses Medium wurde durch Zugabe von 20 μl/mg Kanamycin zu SIMC-Medium hergestellt.
(3) Medien für Bakterien und Phagen
a) L-Medium
In 1 Liter destilliertem Wasser wurden 10 g Bactotrypton (Difco), 5 g Bacto-Hefeextrakt (Difco) und 10 g NaCl gelöst. Die Lösung wurde mit 5 M KOH auf pH 7,0 eingestellt und in einem Autoklaven sterilisiert. Für Plattenmedium werden 15 g Agar zugegeben.
b) YEB-Medium
In 1 Liter destilliertem Wasser wurden 5 g Bacto-Fleischextrakt, (Difco), 1 g Bacto-Hefeextrakt (Difco), 5 g Polypepton, 5 g Zucker und 0,2 ml 10 M NaOH gelöst. Die Lösung wird in einem Autoklaven sterilisiert. Danach werden bei Verwendung 0,2 ml filter-sterilisiertes 1 M MgSO₄ zugegeben. Für Plattenmedium wurden 15 g Agar zugegeben.
c) NZY-Medium
In 1 Liter destilliertem Wasser wurden 5 g Hefeextrakt, 10 g NZ-Amin, 5 g NaCl und 2 g MgSO₄·7H₂O gelöst. Die Lösung wurde mit 5 M NaOH auf pH 7,5 eingestellt und in einem Autoklaven sterilisiert. Für Plattenmedium wurden 15 g Agar (Difco) zugegeben.
d) Top-Agar
Dieses Medium wurde durch Zugabe von 0,7 g Agarose-II (Dojin) zu 100 ml NZY-Medium hergestellt.
WIRKUNG DER ERFINDUNG
Unter Verwendung des Promotors der vorliegenden Erfindung wurde die hohe Expression eines gewünschten Proteins in den Leitbündeln einer Pflanze (insbesondere in den Leitbündeln der Wurzel) möglich.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Promotor, der in Pflanzenzellen funktionell ist, umfassend eine Nucleotidsequenz ausgewählt aus: (i) einer Nucleotidsequenz nach SEQ ID Nr. 1; (ii) einer Nucleotidsequenz nach SEQ ID Nr. 2; und (iii) einer Nucleotidsequenz, die die folgenden Merkmale hat: (a) aus Karotten isoliert und/oder gereinigt; (b) Restriktionsenzymstellen aufweisend für XhoI (0 kb), XbaI (0,3 kb), EcoRV (2 kb), EcoRV (2,3 kb), EcoRI (3 kb), SmaI (3,6 kb) und HindIII (4 kb); und (c) eine Nucleotidsequenz nach SEQ ID Nr. 2 enthaltend.
Promotor nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz die Nucleotidsequenz nach SEQ ID Nr. 1 ist.
Promotor nach Anspruch 2, der eine Nucleotidsequenz nach SEQ ID Nr. 2 umfasst.
Promotor nach Anspruch 3, der eine Nucleotidsequenz umfasst, die die folgenden Merkmale hat: (a) aus Karotten isoliert und/oder gereinigt; (b) Restriktionsenzymstellen aufweisend für XhoI (0 kb), XbaI (0,3 kb), EcoRV (2 kb), EcoRV (2,3 kb), EcoRI (3 kb), SmaI (3,6 kb) und HindIII (4 kb); und (c) enthaltend eine Nucleotidsequenz nach SEQ ID Nr. 2.
Plasmid, umfassend einen Promotor gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 4.
Chimäres Gen, umfassend einen Promotor gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 4, und ein gewünschtes Strukturgen, wobei das Strukturgen heterolog in Bezug auf den Promotor ist und der Promotor die Expression des Strukturgens reguliert.
Plasmid, umfassend ein chimäres Gen, gemäß der Definition in Anspruch 6.
Plasmid nach Anspruch 7, wobei das Plasmid ferner einen Terminator umfasst, der in Pflanzenzellen funktionell ist.
Plasmid nach Anspruch 7 oder 8, wobei das gewünschte Strukturgen ein β-Glucuronidasegen ist.
Mikroorganismus, enthaltend das Plasmid nach Anspruch 5.
Mikroorganismus, enthaltend das chimäre Gen nach Anspruch 6.
Pflanzenzelle, wobei die Expression eines gewünschten Proteins sich unter der Kontrolle eines Promotors nach einem der Ansprüche 1 bis 4 befindet und wobei das gewünschte Protein heterolog in Bezug auf den Promotor ist.
Pflanzenzelle, enthaltend das chimäre Gen nach Anspruch 6.
Pflanze, in die der Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 4 eingebracht wurde, wobei ein gewünschtes Protein exprimiert wird und wobei das gewünschte Protein heterolog in Bezug auf den Promotor ist und der Promotor die Expression des gewünschten Proteins reguliert.
Pflanze, enthaltend das chimäre Gen nach Anspruch 6.
Verfahren zur Herstellung eines chimären Gens, umfassend das Ligieren eines gewünschten Strukturgens stromabwärts vom Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Strukturgen heterolog in Bezug auf den Promotor ist und der Promotor die Expression des Strukturgens reguliert.
Plasmid nach Anspruch 8, wobei der Terminator ein Terminator im Nopalinsynthasegen, abgeleitet von einem Pflanzengen, ist.
Plasmid nach Anspruch 8, wobei der Terminator eine Nucleotidsequenz nach SEQ ID Nr. 5 umfasst.