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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der Pflanzenmolekularbiologie
und Pflanzengentechnik und bezieht sich insbesondere auf Polynucleotidmoleküle, die
für die
Expression von Transgenen in Pflanzen geeignet sind. Die Erfindung
bezieht sich insbesondere auf Triosephosphat-Isomerase(TPI)-Promotormoleküle, die
aus Reis (Oryza sativa cv Nipponbare) isoliert werden und für die Expression
von Transgenen von landwirtschaftlicher Bedeutung in Kulturpflanzen
geeignet sind.
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Hintergrund der Erfindung
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Eines
der Ziele der Pflanzengentechnik besteht darin, Pflanzen mit landwirtschaftlich
wünschenswerten
Merkmalen oder Eigenschaften zu produzieren. Fortschritte in der
Gentechnik haben die erforderlichen Werkzeuge bereitgestellt, um
Pflanzen so zu transformieren, dass sie Fremd-Gene enthalten und
exprimieren. Die technologischen Fortschritte in der Pflanzentransformation
und -regeneration haben Forscher in die Lage versetzt, ein exogenes
Polynucleotidmolekül,
wie ein Gen aus einer heterologen oder nativen Quelle, zu nehmen
und dieses Polynucleotidmolekül
in ein Pflanzengenom einzubauen. Das Gen kann dann in einer Pflanzenzelle
so exprimiert werden, dass sich das hinzugefügte Merkmal manifestiert. Bei
einem Ansatz kann die Expression eines Gens in einer Pflanzenzelle
oder einem Pflanzengewebe, die bzw. das ein solches Gen normalerweise
nicht exprimiert, eine wünschenswerte
phänotypische
Wirkung haben. Bei einem anderen Ansatz kann die Transcription eines
Gens oder Teils eines Gens in einer Antisense-Orientierung eine
wünschenswerte Wirkung
erzeugen, indem die Expression eines endogenen Gens verhindert oder
gehemmt wird.
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Promotoren
sind Polynucleotidmoleküle,
die die 5'-regulatorischen
Elemente umfassen, die bei der Gesamtexpression von Genen in lebenden
Zellen eine integrale Rolle spielen. Isolierte Promotoren, die in Pflanzen
funktionieren, sind nützlich,
um Pflanzenphänotypen
durch die Verfahren der Gentechnik zu modifizieren. Der erste Schritt
in dem Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze beinhaltet
den Zusammenbau verschiedener genetischer Elemente zu einem Polynucleotidkonstrukt.
Das Konstrukt beinhaltet ein transcribierbares Polynucleotidmolekül (interessierendes
Gen), das einen wünschenswerten
Phänotyp
hervorruft, wenn es in den Pflanzenzellen durch einen Promotor,
der funktionell mit dem interessierenden Gen verknüpft ist,
exprimiert (transcribiert) wird. Ein Promotor in einem Konstrukt
kann homolog oder heterolog in Bezug auf das ebenfalls darin enthaltene
interessierende Gen sein. Dann wird das Konstrukt mit verschiedenen
Verfahren der Pflanzentransformation in eine Pflanzenzelle eingeführt, so
dass eine transformierte Pflanzenzelle entsteht, und die transformierte
Pflanzenzelle wird zu einer transgenen Pflanze regeneriert. Der
Promotor steuert die Expression des interessierenden Gens, mit dem
der Promotor funktionell verknüpft
ist, und beeinflusst so das Merkmal oder die Eigenschaft, die durch
die Expression des Transgens in Pflanzen hervorgerufen wird.
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Für die Produktion
von transgenen Pflanzen mit verschiedenen wünschenswerten Merkmalen wäre es vorteilhaft,
eine Vielzahl von Promotoren zu haben und dadurch eine Genexpression
zu erhalten, bei der ein Gen effizient in der zur Erreichung der
gewünschten
Wirkung notwendigen Menge transcribiert wird. Die kommerzielle Entwicklung
von genetisch verbessertem Keimplasma ist ebenfalls in das Stadium
der Einführung von
mehrfachen Merkmalen in Kulturpflanzen vorgedrungen, das häufig als
Gen-Stacking-Ansatz bezeichnet wird. Bei diesem Ansatz können mehrere
Gene, die verschiedene interessierende Merkmale hervorrufen, in eine
Pflanze eingeführt
werden. Bei der Einführung
von mehreren Genen in eine Pflanze ist es häufig wünschenswert, dass jedes Gen
für eine
optimale Expression moduliert oder gesteuert wird, was dazu führt, dass verschiedene
regulatorische Elemente erforderlich sind. Im Lichte dieser und
anderer Betrachtungen sieht man, dass eine optimale Steuerung der
Genexpres sion und eine Vielfalt von regulatorischen Elementen in
der Pflanzenbiotechnologie wichtig sind.
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Für die Pflanzengentechnik
kann eine Vielzahl von verschiedenen Typen oder Klassen von Promotoren
verwendet werden. Promotoren können
anhand von Merkmalen wie Zeit- und Entwicklungsbereich, Niveau der
Transgen-Expression oder Gewebespezifität klassifiziert werden. Zum
Beispiel exprimiert ein konstitutiver Promotor ein Gen kontinuierlich
mit minimaler Regulation. Daher können Promotoren, die als konstitutive
Promotoren bezeichnet werden, funktionell damit verknüpfte Gene
effizient transcribieren und diese Gene in mehreren Geweben exprimieren.
Verschiedene Arten von Promotoren können erhalten werden, indem
man die stromaufwärts
liegenden 5'-regulatorischen
Bereiche von Genen isoliert, die in der gewünschten Weise, zum Beispiel
konstitutiv, gewebeverstärkt
oder entwicklungsinduziert, transcribiert und exprimiert werden.
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In
der Literatur wurden mehrere Promotoren beschrieben, die in Pflanzenzellen
aktiv sind. Dazu gehören
unter anderem die Promotoren der Nopalin-Synthase (nos) und der
Octopin-Synthase (ocs), die auf tumorinduzierenden Plasmiden von
Agrobacterium tumefaciens vorhanden sind, und die Caulimovirus-Promotoren,
wie der 19S- und der 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaikvirus (CaMV)
(
US-Patent Nr. 5,352,605 ), der
CaMV-35S-Promotor mit einem duplizierten Enhancer (CaMVE35S,
US-Patente Nr. 5,164,316 ,
5,196,525 ,
5,322,938 ,
5,359,142 und
5,424,200 ) und der 35S-Promotor des
Figwort-Mosaic-Virus (FMV) (
US-Patent
Nr. 5,378,619 ). Diese Promotoren und zahlreiche andere
werden bei der Schaffung von Konstrukten für die Transgen-Expression in
Pflanzen verwendet. Weitere nützliche
Promotoren sind zum Beispiel in den
US-Patenten Nr.
5,391,725 ,
5,428,147 ,
5,447,858 ,
5,608,144 ,
5,614,399 ,
5,633,441 ,
6,232,526 und
5,633,435 beschrieben.
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Während frühere Arbeiten
bereits mehrere Promotoren ergeben haben, die geeignet sind, um
die Transcription in transgenen Pflanzen zu steuern, gibt es immer
noch ein großes
Bedürfnis
nach neuen Promotoren mit günstigen
Expres sionsmerkmalen. Insbesondere besteht ein Bedürfnis nach
Promotoren, die die Expression von exogenen Genen in transgenen
Kulturpflanzen auf hohem Niveau oder in bestimmten Geweben, Organen
oder während
spezieller Entwicklungsstadien des Pflanzenwachstums steuern können. Viele
früher identifizierte
Promotoren ergeben nicht die Expressionsmuster oder -niveaus, die
erforderlich sind, um die Vorteile der Expression von ausgewählten Genen
in transgenen Pflanzen vollständig
zu realisieren. Daher gibt es in der Pflanzengentechnik ein großes Bedürfnis nach
neuen Promotoren zur Verwendung in wirtschaftlich wichtigen Kulturpflanzen.
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Cytosolische
Triosephosphat-Isomerase (TPI) (eine plastidische Form wird bei
Reis von einem zweiten Zellkern-Gen codiert) wurde als in einer
einzigen Kopie vorliegendes Gen mit konstitutiver Expression charakterisiert
(Xu, Y. et al., Plant Physiol. 101: 683–687, 1993). Die Expression
von TPI durch ein einziges cytosolisch exprimiertes Gen und seine
Bedeutung als Enzym für
mehrere Stoffwechselwege (Miernyk, J. A. et al. 1990, In D. T. Dennis,
D. H. Turpin (Hrsg.), Plant Physiology, Biochemistry and Molecular
Biology, Longman Scientific & Technical,
Harlow, UK, S. 77–100)
ließ vermuten,
dass TPI ein konstitutives Muster haben könnte, dessen Promotor/regulatorische
Elemente die Expression von gewünschten
transcribierbaren Polynucleotidmolekülen steuern könnte, zum
Beispiel ein Promotor, der in einem DNA-Konstrukt geeignet ist,
um eine transgene Pflanze zu schaffen, die einen wünschenswerten
neuen Phänotyp
exprimiert, insbesondere ein DNA-Konstrukt, das ein Gen für glyphosatresistente
5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat-Synthase (EPSPS) beinhaltet, welches
zu einer glyphosattoleranten transgenen Pflanze führt.
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Kurzbeschreibung der Erfindung
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In
einer Ausführungsform
stellt die vorliegende Erfindung ein DNA-Konstrukt bereit, das einen
Promotor umfasst, der eine Polynucleotidsequenz umfasst, die eine
prozentuale Identität
von wenigstens 85% mit einer Polynucleotidsequenz aufweist, die
aus der Gruppe ausgewählt
ist, die aus SEQ ID Nr. 1, 4, 11 und Fragmenten von SEQ ID Nr. 1,
die SEQ ID Nr. 11 umfassen, besteht, wobei der Promotor funktionell
mit einem transcribierbaren Polynucleotidmolekül verknüpft ist, das funktionell mit
dem als SEQ ID Nr. 10 identifizierten GOS2-3'-UTR verknüpft ist.
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In
einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die stabil mit
einem Konstrukt transformiert ist, das einen Promotor umfasst, der
eine Polynucleotidsequenz umfasst, die eine prozentuale Identität von wenigstens
85% mit einer Polynucleotidsequenz aufweist, die aus der Gruppe
ausgewählt
ist, die aus SEQ ID Nr. 1, 4, 11 und Fragmenten von SEQ ID Nr. 1,
die SEQ ID Nr. 11 umfassen, besteht, wobei der Promotor funktionell
mit einem transcribierbaren Polynucleotidmolekül verknüpft ist, das funktionell mit
dem als SEQ ID Nr. 10 identifizierten GOS2-3'-UTR verknüpft ist.
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In
noch einer anderen Ausführungsform
stellt die Erfindung einen Samen einer transgenen Pflanze bereit,
wobei der Samen einen Promotor umfasst, der eine Polynucleotidsequenz
umfasst, die eine prozentuale Identität von wenigstens 85% mit einer
Polynucleotidsequenz aufweist, die aus der Gruppe ausgewählt ist,
die aus SEQ ID Nr. 1, 4, 11 und Fragmenten von SEQ ID Nr. 1, die
SEQ ID Nr. 11 umfassen, besteht, wobei der Promotor funktionell
mit einem transcribierbaren Polynucleotidmolekül verknüpft ist, das funktionell mit
dem als SEQ ID Nr. 10 identifizierten GOS2-3'-UTR verknüpft ist. Besonders bevorzugt
ist das transcribierbare Polynucleotidmolekül ein Gen von agronomischem
Interesse.
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Die
obigen und andere Aspekte der Erfindung gehen besser aus der folgenden
ausführlichen
Beschreibung und den Begleitzeichnungen hervor.
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Kurzbeschreibung der Zeichnungen
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1: DNA-Sequenz des Reis-TPI-Promotors
(P-Os.TPI)
| Basenpaarnummern | Beschreibung |
| 2-2710 | Promotor-DNA-Fragment
(P-Os.TPI) |
| 2711-2820 | Os.TPI-Leader
5' des Introns |
| 2784
(doppelt unterstrichen) | mutiert
G zu A |
| 2817
(doppelt unterstrichen) | mutiert
A zu T |
| 2821-3927 | Intron
von P-Os.TPI |
| 3928-3936 | Os.TPI-Leader
von 3' des Introns |
| 3937-3939 | Startcodon |
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2 zeigt
eine Plasmidkarte von pMON68902.
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3 zeigt
eine Plasmidkarte von pMON78367.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die
folgenden Definitionen und Verfahren werden angegeben, um die vorliegende
Erfindung besser zu definieren und den Fachmann bei der praktischen
Durchführung
der vorliegenden Erfindung anzuleiten. Wenn nichts anderes gesagt
wird, sind die Ausdrücke
gemäß der herkömmlichen
Praxis des Fachmanns zu verstehen.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Polynucleotidmolekül" bezieht sich auf
einzel- oder doppelsträngige DNA
oder RNA genomischen oder synthetischen Ursprungs, d. h. ein Polymer
von Desoxyribonucleotid- bzw. Ribonucleotidbasen, das vom 5'-Ende (stromaufwärts) zum
3'-Ende (stromabwärts) gelesen
wird.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Polynucleotidsequenz" bezieht sich auf
die Sequenz eines Polynucleotidmoleküls. Die Nomenklatur für DNA-Basen,
wie sie in 37 CFR § 1.822
dargelegt ist, wird verwendet.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Promotor" bezieht sich auf
ein Polynucleotidmolekül,
das sich in seinem nativen Zustand stromaufwärts oder 5' von einem Translationsstartcodon eines
offenen Leserasters (oder eines proteincodierenden Bereichs) befindet
und an der Erkennung und Bindung von RNA-Polymerase II und anderer
Proteine (trans-wirkenden Transcriptionsfaktoren) zur Einleitung
der Transcription beteiligt ist. Ein "Pflanzenpromotor" ist ein nativer oder nichtnativer Promotor,
der in Pflanzenzellen funktioniert. Konstitutive Pflanzenpromotoren
funktionieren in den meisten oder allen Geweben einer Pflanze während der
gesamten Pflanzenentwicklung. Jeder Pflanzenpromotor kann als 5'-regulatorisches
Element für
die Modulierung der Expression eines oder mehrerer bestimmter Gene,
die funktionell damit assoziiert sind, verwendet werden. Wenn er
funktionell mit einem transcribierbaren Polynucleotidmolekül verknüpft ist,
bewirkt ein Promotor typischerweise, dass das transcribierbare Polynucleotidmolekül in einer ähnlichen
Weise transcribiert wird wie das Gen, mit dem der Promotor normalerweise
assoziiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Polynucleotidmolekül der vorliegenden
Erfindung, wie es in SEQ ID Nr. 1 und 4 gezeigt ist, oder ein Fragment
von SEQ ID Nr. 1, wie es oben definiert ist, so in ein Konstrukt
eingebaut, dass man einen Promotor erhält, der funktionell mit einem
transcribierbaren Polynucleotidmolekül verknüpft ist, bei dem es sich um
ein interessierendes Gen handelt. Dazu gehört ein Gen, das für ein wünschenswertes
Merkmal sorgt, welches mit der Pflanzenmorphologie, -physiologie,
Wachstum und Entwicklung, Ertrag, Ernährungsverbesserung, Resistenz
gegen Krankheiten oder Schädlinge
oder Umwelt- oder Chemikalientoleranz zusammenhängt.
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Pflanzenpromotoren
können
Promotoren umfassen, die durch die Manipulation von bekannten Promotoren
unter Bildung von künstlichen,
chimärischen
oder Hybridpromotoren erzeugt werden. Solche Promotoren können auch
cis-Elemente von einem oder mehreren Promotoren miteinander kombinieren,
indem sie zum Beispiel ein heterologes regulatorisches Element zu
einem aktiven Promotor mit seinen eigenen partiellen oder vollständigen regulatorischen
Elementen hinzufügen.
Die vorliegende Erfindung umfasst also die Gestaltung, Konstruktion
und Verwendung von chimärischen
oder Hybridpromotoren, die wenigstens ein cis- Element von SEQ ID Nr. 1 und 4 umfassen,
zum Modulieren der Expression von funktionell damit verknüpften Polynucleotidsequenzen.
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Der
hier verwendete Ausdruck "cis-Element" bezieht sich auf
ein cis-wirkendes Transcriptionsregulationselement, das einen Aspekt
der Gesamtsteuerung der Genexpression beiträgt. Ein cis-Element kann die Funktion
haben, Transcriptionsfaktoren, trans-wirkende Proteinfaktoren, die
die Transcription regulieren, zu binden. Einige cis-Elemente binden
mehr als einen Transcriptionsfaktor, und Transcriptionsfaktoren
können mit
unterschiedlichen Affinitäten
mit mehr als einem cis-Element Wechselwirken. Die Promotoren der
vorliegenden Erfindung enthalten wünschenswerterweise cis-Elemente,
die eine Gen-Expression hervorrufen oder modulieren können. Cis-Elemente
können
durch mehrere Techniken identifiziert werden, zu denen die folgenden
gehören:
Deletionsanalyse, d. h. Deletion von einem oder mehreren Nucleotiden
vom 5'-Ende oder
innerhalb eines Promotors; DNA-Bindungsproteinanalyse mit Hilfe
von DNase-I-Footprinting, Methylierungsinterferenz, Elektrophorese-Mobilitäts-Verschiebungsassays,
genomisches in-vivo-Footprinting
durch ligationsvermittelte PCR und andere herkömmliche Assays; oder durch
DNA-Sequenz-Ähnlichkeitsanalyse
mit bekannten cis-Element-Motiven durch herkömmliche DNA-Sequenz-Vergleichsverfahren.
Die Feinstruktur eines cis-Elements
kann weiterhin durch Mutagenese (oder Substitution) von einem oder
mehreren Nucleotiden oder durch andere herkömmliche Verfahren untersucht
werden. Cis-Elemente können
durch chemische Synthese oder durch Isolierung aus Promotoren, die
solche Elemente umfassen, erhalten werden, und sie können mit
zusätzlichen
flankierenden Nucleotiden synthetisiert werden, die geeignete Restriktionsenzymstellen
enthalten, um die Subsequenzmanipulation zu erleichtern.
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In
einer Ausführungsform
umfassen die Promotoren der vorliegenden Erfindung multiple cis-Elemente, von
denen jedes einen anderen Aspekt zur Gesamtsteuerung der Gen-Expression
beiträgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform
werden cis-Elemente aus den Polynucleotidmolekülen von SEQ ID Nr. 1, 4 und
11 mit Hilfe von Computerprogrammen identifiziert, die speziell
dafür vorgesehen
sind, cis-Elemente, Domänen
oder Motive innerhalb von Sequenzen zu identifizieren. Cis-Elemente
können
die Gen-Expression je nach den Bedingungen entweder positiv oder
negativ regulieren. Die vorliegende Erfindung umfasst daher cis-Elemente der
offenbarten Promotoren.
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Von
besonderem Interesse sind Polynucleotidmoleküle von SEQ ID Nr. 1, 4 und
11, die in Pflanzen die Funktion haben, die Transcription zu steuern,
und wenigstens etwa 85% Sequenzidentität, wenigstens etwa 90% Sequenzidentität oder eine
noch größere Sequenzidentität, wie 98%
oder 99% Sequenzidentität,
mit der jeweiligen Polynucleotidsequenz aufweisen. Polynucleotidmoleküle, die
die Transcription von funktionell damit verknüpften transcribierbaren Polynucleotidmolekülen regulieren
können
und im Wesentlichen homolog zu den Polynucleotidsequenzen der hier
bereitgestellten Promotoren sind, sind im Umfang dieser Erfindung
mit eingeschlossen.
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Der
hier verwendete Ausdruck "prozentuale
Sequenzidentität" bezieht sich auf
den Prozentsatz von identischen Nucleotiden in einer linearen Polynucleotidsequenz
eines Bezugspolynucleotidmoleküls
(oder seines komplementären
Stranges) im Vergleich zu einem Testpolynucleotidmolekül (oder
seinem komplementären
Strang), wenn die zwei Sequenzen optimal abgeglichen sind (mit geeigneten
Nucleotidinsertionen, -deletionen oder Lücken, die über das Vergleichsfenster insgesamt
weniger als 20 Prozent der Bezugssequenz ausmachen). Die optimale
Abgleichung von Sequenzen zum Abgleichen eines Vergleichsfensters
ist dem Fachmann wohlbekannt und kann mit Hilfsmitteln wie dem lokalen
Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, dem Homologieabgleichalgorithmus
von Needleman und Wunsch, dem Ähnlichkeitssuchverfahren
von Pearson und Lipman und vorzugsweise durch computerisierte Ausführungen
dieser Algorithmen, wie GAP, BESTFIT, FASTA und TFASTA, die als
Bestandteil des GCG® Wisconsin Package® (Accelrys
Inc., Burlington, MA) verfügbar
sind, durchgeführt
werden. Eine "Identitätsfraktion" für abgeglichene
Segmente einer Testsequenz und einer Bezugssequenz ist die Zahl
der identischen Komponenten, die die zwei abgeglichenen Sequenzen gemeinsam
haben, geteilt durch die Gesamtzahl von Komponenten in dem Bezugssequenzsegment,
d. h. der gesamten Bezugssequenz oder einem kleineren definierten
Teil der Bezugssequenz. Die prozentuale Sequenzidentität wird als
Identitätsfraktion
mal 100 dargestellt. Der Vergleich von einer oder mehreren Polynucleotidsequenzen
kann mit einer Polynucleotidsequenz der vollen Länge oder einem Teil davon oder
mit einer längeren
Polynucleotidsequenz erfolgen.
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Der
hier verwendete Ausdruck "Homologie" bezieht sich auf
den Grad der Ähnlichkeit
oder prozentualen Identität
zwischen Polynucleotidsequenzen als prozentuale Nucleotidpositionsidentität, d. h.
Sequenzähnlichkeit
oder -identität.
Der hier verwendete Ausdruck "Homologie" bezieht sich auch
auf das Konzept der ähnlichen
funktionellen Eigenschaften unter verschiedenen Polynucleotidmolekülen, zum
Beispiel können Promotoren,
die eine ähnliche
Funktion haben, homologe cis-Elemente
aufweisen. Polynucleotidmoleküle
sind homolog, wenn sie unter bestimmten Bedingungen spezifisch unter
Bildung eines Duplexmoleküls
hybridisieren. Unter diesen Bedingungen, die als Stringenzbedingungen
bezeichnet werden, kann das eine Polynucleotidmolekül als Sonde
oder Primer verwendet werden, um andere Polynucleotidmoleküle, die
dazu homolog sind, zu identifizieren. Der Ausdruck "stringente Bedingungen" ist funktionell
in Bezug auf die Hybridisierung einer Nucleinsäuresonde mit einer Zielnucleinsäure (d.
h. mit einer bestimmten interessierenden Nucleinsäuresequenz)
nach dem spezifischen Hybridisierungsverfahren definiert, das diskutiert
ist in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage, Band
1, 2 und 3, J. F. Sambrook, D. W. Russell und N. Irwin, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 2000 (kurz Sambrook et al.). Dementsprechend können die
Nucleotidsequenzen der Erfindung aufgrund ihrer Fähigkeit
verwendet werden, selektiv Duplexmoleküle mit komplementären Abschnitten
von Polynucleotidmolekülfragmenten
zu bilden. Je nach der ins Auge gefassten Anwendung würde man wünschen,
unterschiedliche Hybridisierungsbedingungen einzusetzen, um verschiedene
Grade der Selektivität
der Sonde gegenüber
der Zielsequenz zu erreichen. Für
Anwendungen, die eine hohe Selektivität erfordern, möchte man
typischerweise relativ hochstringente Bedingungen einsetzen, um
die Hybride zu bilden, zum Beispiel wird man Bedingungen mit relativ
niedriger Salzkonzentration und/oder hoher Temperatur auswählen, wie
etwa 0,02 M bis etwa 0,15 M NaCl bei Temperaturen von etwa 50°C bis etwa
70°C. Eine
hochstringente Bedingung besteht zum Beispiel darin, den Hybridisierungs filter
wenigstens zweimal mit hochstringentem Waschpuffer (0,2 × SSC, 0,1%
SDS, 65°C)
zu waschen. Geeignete mäßig stringente
Bedingungen, die die DNA-Hybridisierung
fördern,
zum Beispiel 6,0 × Natriumchlorid/Natriumcitrat
(SSC) bei etwa 45°C,
gefolgt von einem Waschvorgang mit 2,0 × SSC bei 50°C, sind dem
Fachmann bekannt. Außerdem
kann die Salzkonzentration im Waschschritt aus niedriger Stringenz
mit etwa 2,0 × SSC
bei 50°C
bis zu einer hohen Stringenz mit etwa 0,2 × SSC bei 50°C ausgewählt werden.
Außerdem
kann die Temperatur im Waschschritt von niedrigstringenten Bedingungen
bei Raumtemperatur, etwa 22°C,
auf hochstringente Bedingungen bei etwa 65°C erhöht werden. Sowohl Temperatur
als auch Salz können
variiert werden, oder es kann entweder die Temperatur oder die Salzkonzentration
konstant gehalten werden, während
die jeweils andere Variable verändert
wird. Solche selektiven Bedingungen tolerieren eine geringfügige Fehlpaarung
zwischen der Sonde und dem Matrizen- oder Zielstrang. Ein Nachweis
von Polynucleotidmolekülen
durch Hybridisierung ist dem Fachmann wohlbekannt, und die Lehren
von
US-Patent Nr. 4,965,188 und
US-Patent Nr. 5,176,995 sind
beispielhaft für
die Verfahren der Hybridisierungsanalyse.
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Homologie
kann auch mit Computerprogrammen bestimmt werden, die Polynucleotidsequenzen
abgleichen und die Fähigkeit
von Polynucleotidmolekülen
zur Bildung von Duplexmolekülen
unter bestimmten Stringenzbedingungen einschätzen. Polynucleotidmoleküle aus verschiedenen
Quellen, die einen hohen Grad der Homologie aufweisen, werden als "Homologe" bezeichnet.
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Verfahren,
die dem Fachmann wohlbekannt sind, können verwendet werden, um interessierende
Promotoren zu identifizieren, die eine ähnliche Aktivität wie die
hier beschriebenen Promotoren haben. Zum Beispiel können mit
Hilfe von interessierenden Zellen oder Geweben cDNA-Bibliotheken
aufgebaut und durchmustert werden, um Gene zu identifizieren, die
ein ähnliches
Expressionsmuster wie die hier beschriebenen Promotoren aufweisen.
Dann kann die cDNA-Sequenz für
das identifizierte Gen verwendet werden, um den Promotor des Gens
für eine
nähere
Charakterisierung zu isolieren. Siehe zum Beispiel
US-Patent Nr. 6,096,950 ,
US-Patent Nr. 5,589,583 und
US-Patent Nr. 5,898,096 .
Alternativ dazu können
auch Transcriptions-Profiling- oder elektronische Northern-Techniken verwendet
werden, um Gene zu identifizieren, die ein ähnliches Expressionsmuster
wie die hier beschriebenen Promotoren aufweisen. Sobald diese Gene
identifiziert wurden, können
ihre Promotoren für
eine nähere
Charakterisierung isoliert werden. Siehe zum Beispiel
US-Patent Nr. 6,506,565 und
US-Patent Nr. 6,448,387 .
Die elektronische Northern-Technik bezieht sich auf eine computergestützte Sequenzanalyse,
die es ermöglicht,
Sequenzen aus mehreren cDNA-Bibliotheken auf der Basis von Parametern,
die der Forscher identifiziert, einschließlich der Häufigkeit von exprimierten Sequenz-Tag(EST)-Populationen in mehreren
cDNA-Bibliotheken, oder ausschließlich mit EST-Mengen aus einer
oder aus Kombinationen von Bibliotheken elektronisch miteinander
zu vergleichen. Die Transcriptions-Profiling-Technik ist ein Hochdurchsatzverfahren,
das für
die systematische Überwachung
von Gen-Expressions-Profilen
für Tausende
von Genen verwendet wird. Bei dieser auf einem DNA-Chip beruhenden
Technologie werden Tausende von cDNA-Sequenzen in einem Feld auf
einer Trägeroberfläche angeordnet.
Diese Felder werden gleichzeitig mit einem Vielfachen von markierten
cDNA-Sonden, die aus RNA-Proben von verschiedenen Zell- oder Gewebetypen
hergestellt werden, hybridisiert, was eine direkte vergleichende
Analyse der Expression ermöglicht.
Dieser Ansatz kann für
die Isolierung von regulatorischen Sequenzen, wie mit diesen Genen
assoziierten Promotoren, verwendet werden.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann der hier offenbarte Promotor modifiziert sein. Der Fachmann kann
Promotoren schaffen, die Variationen in der Polynucleotidsequenz
aufweisen. Die Polynucleotidsequenzen der Promotoren der vorliegenden
Erfindung, wie sie in SEQ ID Nr. 1 und 4 gezeigt sind, können modifiziert oder
verändert
werden, um ihre Kontrollmerkmale zu verstärken. Ein bevorzugtes Verfahren
zur Veränderung einer
Polynucleotidsequenz besteht darin, PCR zu verwenden, um ausgewählte Nucleotide
oder Bereiche von Sequenzen zu modifizieren. Diese Verfahren sind
dem Fachmann wohlbekannt. Sequenzen können zum Beispiel durch Insertion,
Deletion oder Ersatz von Matrizensequenzen in einem auf PCR beruhenden
Ansatz zur DNA-Modifikation modifiziert werden. Eine "Variante" ist ein Promotor,
der Änderungen
enthält,
bei denen ein oder mehrere Nucleotide eines ursprünglichen
Promotors deletiert, addiert und/oder substituiert sind, während die
Promotorfunktion vorzugsweise im Wesentlichen beibehalten wird.
Zum Beispiel können
ein oder mehrere Basenpaare vom 5'- oder 3'-Ende eines Promotors deletiert sein,
wobei ein "verkürzter" Promotor entsteht.
Es können
auch ein oder mehrere Basenpaare innerhalb eines Promotors inseriert,
deletiert oder substituiert werden. Im Falle eines Promotorfragments
können
variante Promotoren Veränderungen
beinhalten, die die Transcription eines minimalen Promotors, mit
dem er funktionell verknüpft
ist, beeinflussen. Ein minimaler oder basaler Promotor ist ein Polynucleotidmolekül, das die
basale Transcriptionsmaschinerie rekrutieren und binden kann. Ein
Beispiel für
eine basale Transcriptionsmaschinerie in eukaryontischen Zellen
ist der RNA-Polymerase-II-Komplex und seine Hilfsproteine. Variante
Promotoren können
zum Beispiel durch Standard-DNA-Mutagenesetechniken oder durch chemisches
Synthetisieren des varianten Promotors oder eines Teils davon produziert
werden.
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Neue
chimärische
Promotoren können
durch mehrere Verfahren gestaltet oder hergestellt werden. Viele
Promotoren enthalten cis-Elemente, die den Promotor aktivieren,
verstärken
oder seine Stärke
und/oder Spezifität
definieren. Zum Beispiel können
Promotoren "TATA"-Boxen, die die Transcriptionsstartstelle
definieren, und andere cis-Elemente, die sich stromaufwärts der
Transcriptionsstartstelle befinden und die Transcriptionsniveaus
modulieren, enthalten. Zum Beispiel kann ein chimärischer
Promotor hergestellt werden, indem man ein erstes Promotorfragment,
das das Aktivator-cis-Element von einem Promotor enthält, mit
einem zweiten Promotorfragment, das das Aktivator-cis-Element von
einem anderen Promotor enthält,
fusioniert; der resultierende chimärische Promotor kann eine Erhöhung der
Expression eines funktionell verknüpften transcribierbaren Polynucleotidmoleküls verursachen.
Promotoren können
so aufgebaut sein, dass Promotorfragmente oder -elemente funktionell
miteinander verknüpft
sind, indem man zum Beispiel ein solches Fragment stromaufwärts eines
minimalen Promotors platziert. Die cis-Elemente und Fragmente können für die Konstruktion solcher
chimärischer
Promotoren verwendet werden. Zu den Verfahren zur Konstruktion von
chimärischen
und varianten Promotoren der vorliegenden Erfindung gehören unter
anderem die Kombination von Kontrollelementen verschiedener Promotoren
oder das Duplizieren von Teilen oder Bereichen eines Promotors (siehe zum
Beispiel
US-Patent Nr. 4,990,607 ,
US-Patent Nr. 5,110,732 und
US-Patent Nr. 5,097,025 ).
Der Fachmann ist mit der Standardliteratur vertraut, die spezifische
Bedingungen und Verfahren für
den Aufbau, die Manipulation und Isolierung von Makromolekülen (z.
B. Polynucleotidmolekülen
und Plasmiden) sowie die Erzeugung von rekombinanten Organismen
und die Suche nach Polynucleotidmolekülen durch Screening und deren
Isolierung beschreibt.
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In
einer anderen Ausführungsform
umfasst ein Promotor, der die in SEQ ID Nr. 1 und 4 gezeigte Polynucleotidsequenz
umfasst, einen beliebigen Abschnitt der Polynucleotidsequenz, der
ein funktionell damit verknüpftes
transcribierbares Polynucleotidmolekül regulieren kann. Zum Beispiel
können
die in SEQ ID Nr. 1 und 4 offenbarten Promotoren verkürzt oder
Teile davon deletiert sein, und sie können dennoch die Transcription
eines funktionell damit verknüpften
Polynucleotidmoleküls
regulieren. In einer verwandten Ausführungsform kann ein cis-Element der offenbarten
Promotoren eine besondere Spezifität, wie eine verstärkte Expression
von funktionell damit verknüpften
Polynucleotidmolekülen
in bestimmten Geweben, hervorrufen und kann daher auch die Transcription
von funktionell damit verknüpften
Polynucleotidmolekülen
regulieren. Folglich können
alle Fragmente, Teile oder Bereiche der Promotoren, die die in SEQ
ID Nr. 1 und 4 gezeigte Polynucleotidsequenz umfassen, als regulatorische
Polynucleotidmoleküle
verwendet werden, einschließlich
unter anderem cis-Elementen oder Motiven der offenbarten Polynucleotidmoleküle. Substitutionen,
Deletionen, Insertionen oder eine beliebige Kombination davon können miteinander
kombiniert werden, um ein endgültiges Konstrukt
herzustellen.
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Polynucleotidkonstrukte
-
Der
hier verwendete Ausdruck "Konstrukt" bezieht sich auf
irgendein rekombinantes Polynucleotidmolekül, wie ein Plasmid, Cosmid,
Virus, autonom replizierendes Molekül, einen Phagen oder ein lineares
oder zirkuläres
einzelsträngiges oder
doppelsträngiges
DNA- oder RNA-Polynucleotidmolekül,
das aus einer beliebigen Quelle stammt und zur genomischen Integration
oder autonomen Replikation befähigt
ist und ein Polynucleotidmolekül
umfasst, bei dem ein oder mehrere Polynucleotidmoleküle in einer
funktionell geeigneten Weise miteinander verknüpft sind.
-
Der
hier verwendete Ausdruck "funktionell
verknüpft" bezieht sich auf
ein erstes Polynucleotidmolekül, wie
einen Promotor, der mit einem zweiten transcribierbaren Polynucleotidmolekül, wie einem
interessierenden Gen, verbunden ist, wobei die Polynucleotidmoleküle so angeordnet
sind, dass das erste Polynucleotidmolekül die Funktion des zweiten
Polynucleotidmoleküls
beeinflusst. Vorzugsweise sind die beiden Polynucleotidmoleküle Bestandteil
eines einzigen zusammenhängenden
Polynucleotidmoleküls
und liegen besonders bevorzugt direkt nebeneinander. Zum Beispiel
ist ein Promotor funktionell mit einem interessierenden Gen verknüpft, wenn
der Promotor die Transcription des interessierenden Gens in einer
Zelle reguliert oder vermittelt.
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Der
hier verwendete Ausdruck "transcribierbares
Polynucleotidmolekül" bezieht sich auf
irgendein Polynucleotidmolekül,
das zu einem RNA-Molekül
transcribiert werden kann. Es sind Verfahren bekannt, um Konstrukte
in einer solchen Weise in eine Zelle einzuführen, dass das transcribierbare
Polynucleotidmolekül
zu einem funktionellen mRNA-Molekül transcribiert wird, das translatiert
und daher als Proteinprodukt exprimiert wird. Konstrukte können auch
so konstruiert werden, dass sie Antisense-RNA-Moleküle exprimieren
können, um
die Translation eines spezifischen interessierenden RNA-Moleküls zu hemmen.
Für die
praktische Durchführung
der vorliegenden Erfindung sind dem Fachmann herkömmliche
Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung und Verwendung von
Konstrukten und Wirtszellen wohlbekannt, siehe zum Beispiel Sambrook et
al.
-
Konstrukte
der vorliegenden Erfindung enthalten typischerweise einen Promotor,
der funktionell mit einem transcribierbaren Polynucleotidmolekül verknüpft ist,
welches funktionell mit einem 3'-Transcriptionsterminations-Polynucleotidmolekül verknüpft ist.
Die gezeigten Plasmidkarten der vorliegenden Erfindung enthalten
verschiedene genetische Elemente, einschließlich unter anderem: P = Promotor;
I = Intron; L = 5'-untranslatierter
Bereich (5'-UTR);
TP = Transitpeptid, T = 3'-untranslatierter
Bereich (3'-UTR)
plus Downstream-Sequenz; SPC/STR = aad für die mikrobielle Selektion;
ori-V- und ORI-322-Sequenz für
die Replikation des Plasmids in Agrobacterium tumefaciens bzw. Escherichia
coli; linker T-DNA-Border (LB) und rechter T-DNA-Border (RB), isoliert
aus dem Ti-Plasmid
von Agrobacterium tumefaciens.
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Zu
den genetischen Elementen des DNA-Konstrukts, die eine Expression
eines neuen Phänotyps
in transgenen Pflanzenzellen ermöglichen,
gehört
die DNA-codierende
Sequenz von Chloroplasten-Transitpeptiden (CTP). CTPs werden so
gestaltet, dass sie mit der codierenden Sequenz des N-Terminus eines
Proteins fusioniert werden, zum Beispiel mit einem Prokaryonten-EPSPS,
um die glyphosatresistenten Enzyme in den Chlorplasten der Pflanze
zu lenken. In einigen nativen Pflanzengenen, zum Beispiel EPSPS,
sind Chloroplasten-Transitpeptidbereiche in der nativen codierenden
Sequenz enthalten (z. B. CTP2, Klee et al., Mol. Gen. Genet. 210:
47–442,
1987). Das native CTP kann bei der Konstruktion einer Transgen-Pflanzenexpressionscassette
durch ein heterologes CTP substituiert werden. Viele in Chloroplasten
lokalisierte Proteine einschließlich
EPSPS werden ausgehend von Zellkern-Genen als Vorläufern exprimiert
und durch ein Chloroplasten-Transitpeptid (CTP), das während der
Importschritte wieder entfernt wird, zum Chloroplasten gelenkt.
Beispiele für
andere solche Chloroplasten-Proteine
sind die kleine Untereinheit (SSU) von Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase (Rubisco),
Ferredoxin, Ferredoxin-Oxidoreductase, Protein I und II des Lichtsammelkomplexes
und Thioredoxin F. Es wurde in vivo und in vitro nachgewiesen, dass
Nicht-Chloroplasten-Proteine durch Verwendung von Proteinfusionen
mit einem CTP in den Chloroplasten gelenkt werden können und
dass eine CTP-Sequenz ausreicht, um ein Protein zum Chloroplasten
zu lenken. Es zeigte sich, dass durch den Einbau eines geeigneten
Chloroplasten-Transitpeptids,
wie des Arabidopsis-thaliana-EPSPS-CTP (Klee et al., Mol. Gen. Genet.
210: 437–442
(1987)) und des Petunia-hybrida-EPSPS-CTP (della-Cioppa et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 6873–6877 (1986)) heterologe EPSPS-Proteinsequenzen
zu Chloroplasten in transgenen Pflanzen gelenkt werden. Die Herstellung
von glyphosattoleranten Pflanzen durch Expression eines Fusionsproteins,
das ein aminoterminales CTP umfasst, mit einem glyphosatresistenten
EPSPS-Enzym ist dem Fachmann wohlbekannt (
US-Patent Nr. 5,627,061 ,
US-Patent
Nr. 5,633,435 ,
US-Patent
Nr. 5,312,910 ,
EP 0
218 571 ,
EP 189 707 ,
EP 508 909 und
EP 924 299 ). Der Fachmann wird erkennen,
dass verschiedene chimärische Konstrukte
hergestellt werden können,
die sich die Funktionalität
eines bestimmten CTP zu Nutze machen, um glyphosatresistente EPSPS-Enzyme
in den Chloroplasten der Pflanzenzelle zu importieren.
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Außerdem können die
Konstrukte unter anderem zusätzliche
regulatorische Polynucleotidmoleküle aus dem 3'-UTR von Pflanzengenen
(z. B. ein 3'-UTR
zur Erhöhung
der mRNA-Stabilität
der mRNA, wie der PI-II-Terminationsbereich der Kartoffel oder der
Octopin- oder Nopalin-Synthase-3'-Terminationsbereich)
umfassen. Konstrukte können
unter anderem den 5'-UTR
eines mRNA-Polynucleotidmoleküls umfassen,
das eine wichtige Rolle beim Translationsstart spielen kann und
auch eine genetisch Komponente in einem Pflanzenexpressionskonstrukt
sein kann. Zum Beispiel wurde nachgewiesen, dass nichttranslatierte
5'-Leader-Polynucleotidmoleküle, die
von Hitzeschockprotein-Genen abgeleitet sind, die Genexpression
in Pflanzen verstärken
(siehe zum Beispiel
US-Patent Nr. 5,659,122 ,
US-Patent Nr. 5,362,865 und
US-Patentanmeldung Nr. 20020192812). Diese zusätzlichen stromaufwärts und
stromabwärts
gelegenen regulatorischen Polynucleotidmoleküle können aus einer Quelle stammen,
die in Bezug auf die anderen Elemente, die auf dem Promotorkonstrukt
vorhanden sind, nativ oder heterolog ist.
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Konstrukte
der vorliegenden Erfindung umfassen also Promotoren, wie sie in
SEQ ID Nr. 1 und 4 bereitgestellt werden oder die gemäß der obigen
Beschreibung modifiziert sind und die funktionell mit einem transcribierbaren
Polynucleotidmolekül
verknüpft
sind, so dass die Transcription des transcribierbaren Polynucleotidmoleküls nach
Einführung
des Konstrukts in eine Pflanzenzelle auf einem gewünschten
Niveau oder in einem gewünschten
Gewebe oder Entwicklungsmuster gesteuert wird. In einigen Fällen umfasst
das transcribierbare Polynucleotidmolekül einen proteincodierenden
Bereich eines Gens, und der Promotor sorgt für die Transcription eines funktionellen
mRNA-Moleküls,
das als Proteinprodukt translatiert und exprimiert wird. Es können auch
Konstrukte für
die Transcription von Antisense-RNA-Molekülen oder anderer ähnlicher
inhibitorischer RNA konstruiert werden, um die Expression eines
spezifischen interessierenden RNA-Moleküls in einer Zielwirtszelle
zu hemmen.
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Beispielhafte
transcribierbare Polynucleotidmoleküle für den Einbau in Konstrukte
der vorliegenden Erfindung umfassen zum Beispiel DNA-Moleküle oder
Gene aus einer anderen Spezies als die Spezies des Ziel-Gens oder
sogar Gene, die aus derselben Spezies stammen oder in dieser vorhanden
sind, aber durch Verfahren der Gentechnik und nicht durch klassische
Reproduktions- oder Zuchttechniken in die Empfängerzellen eingebaut wurden.
Der Ausdruck "exogenes
Gen oder genetisches Element" soll
sich auf ein beliebiges Gen oder DNA-Molekül beziehen, das in eine Empfängerzelle
eingebaut wird. Die Art von DNA, die in die exogene DNA eingebaut
wird, kann DNA, die in der Pflanzenzelle bereits vorhanden ist,
DNA aus einer anderen Pflanze, DNA aus einem anderen Organismus
oder eine extern erzeugte DNA, wie ein DNA-Molekül, das eine Antisense-Sequenz
eines Gens enthält,
oder ein DNA-Molekül,
das eine künstliche
oder modifizierte Version eines Gens enthält, umfassen.
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Die
Promotoren der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von Marker-Genen
gemäß der Beschreibung
in ein Konstrukt eingebaut und in transienten Analysen, die einen
Hinweis auf eine Genexpression in stabilen Pflanzensystemen geben,
getestet werden. Verfahren zum Testen der Expression von Marker-Genen
in transienten Assays sind dem Fachmann bekannt. Die transiente
Expression von Marker-Genen wurde unter Verwendung einer Vielzahl
von Pflanzen, Geweben und DNA-Abgabesystemen beschrieben. Arten
von transienten Analysen können
zum Beispiel unter anderem die direkte Genabgabe durch Elektroporation
oder Teilchenbeschuss von Geweben in irgendeinem transienten Pflanzenassays
mit Hilfe irgendeiner interessierenden Pflanzenspezies umfassen.
Zu diesen transienten Systemen gehören unter anderem die Elektroporation
von Protoplasten aus einer Vielzahl von Gewebequellen oder der Teilchenbeschuss
von spezifischen interessierenden Geweben. Die vorliegende Erfindung
umfasst die Verwendung irgendeines transienten Expressionssystems
zur Bewertung von Promotoren oder Promotorfragmenten, die funktionell
mit irgendwelchen transcribierbaren Polynucleotidmolekülen verknüpft sind;
dazu gehören
unter anderem ausgewählte
Reporter-Gene, Marker-Gene oder Gene von agronomischem Interesse.
Beispiele für
Pflanzengewebe, die ins Auge gefasst werden, um in transienten Assays über ein
geeignetes Abgabesystem getestet zu werden, sind unter anderem Blattbasisgewebe,
Kallus, Keimblätter,
Wurzeln, Endosperm, Embryonen, Blütengewebe, Pollen und Epidermisgewebe.
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Jedes
bewertbare oder screeningfähige
Marker-Gen kann in einem transienten Assay verwendet werden. Zu
den bevorzugten Marker-Genen für
transiente Analysen der Promotoren oder Promotorfragmente der vorliegenden
Erfindung gehört
ein GUS-Gen (
US-Patent Nr. 5,599,670 )
oder ein GFP-Gen (
US-Patent Nr. 5,491,084 ).
Die Konstrukte, die die funktionell mit einem Marker-Gen verknüpften Promotoren
oder Promotorfragmente enthalten, werden an die Gewebe abgegeben,
und die Gewebe werden in Abhängigkeit
von dem Marker mit einem geeigneten Mechanismus analysiert. Die
quantitativen oder qualitativen Analysen werden als Methode verwendet,
um das potentielle Expressionsprofil der Promotoren oder Promotorfragmente
zu bewerten, wenn sie in stabilen Pflanzen funktionell mit Genen
von agronomischem Interesse verknüpft sind.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird also ein Polynucleotidmolekül
der vorliegenden Erfindung, wie es in SEQ ID Nr. 1, 4 und 11 gezeigt
ist, oder ein Fragment von SEQ ID Nr. 1, wie es oben definiert ist,
in ein Konstrukt eingebaut, so dass ein Promotor der vorliegenden
Erfindung funktionell mit einem transcribierbaren Polynucleotidmolekül verknüpft ist,
das für
einen selektierbaren, screeningfähigen
oder bewertbaren Marker sorgt. Zu den Markern zur Verwendung bei
der praktischen Durchführung
der vorliegenden Erfindung gehören
unter anderem transcribierbare Polynucleotidmoleküle, die β-Glucuronidase
(GUS), grünes
fluoreszierendes Protein (GFP), Luciferase (LUC), Proteine, die
Antibiotikum-Resistenz verleihen, oder Proteine, die Herbizidtoleranz
verleihen, codieren. Geeignete Antibiotikum-Resistenz-Marker einschließlich solcher,
die Proteine codieren, die Resistenz gegen Kanamycin (nptII), Hygromycin
B (aph IV), Streptomycin oder Spectinomycin (aad, spec/strep) und
Gentamicin (aac3 und aacC4) verleihen, sind in der Technik bekannt.
Zu den Herbiziden, bei denen eine Toleranz der transgenen Pflanze
nachgewiesen wurde und auf die das Verfahren der vorliegenden Erfindung
angewendet werden kann, gehören
unter anderem: Glyphosat, Glufosinat, Sulfonylharnstoffe, Imidazolinone,
Bromoxynil, Delapon, Cyclohexandion, Protoporphyrionogen-Oxidase-Inhibitoren
und Isoxasflutol-Herbizide. Polynucleotidmoleküle, die Proteine codieren,
die an der Herbizid-Toleranz beteiligt sind, sind in der Technik
bekannt und umfassen unter anderem ein Polynucleotidmolekül, das EPSPS codiert
und das im
US-Patent Nr. 5,627,061 ,
US-Patent Nr. 5,633,435 und
US-Patent Nr. 6,040,497 beschrieben
ist, und aroA, das im
US-Patent
Nr. 5,094,945 beschrieben ist, für die Glyphosattoleranz; ein
Polynucleotidmolekül,
das Bromoxynil-Nitrilase (Bxn) codiert und das im
US-Patent Nr. 4,810,648 beschrieben
ist, für
die Bromoxynil-Toleranz;
ein Polynucleotidmolekül,
das Phytoen-Desaturase codiert (crtI) und das in Misawa et al. (1993)
Plant J. 4: 833–840,
und Misawa et al. (1994) Plant J. 6: 481–489, beschrieben ist, für die Norflurazon-Toleranz;
ein Polynucleotidmolekül,
das Acetohydroxysäure-Synthase
(AHAS oder ALS) codiert und das in Sathasiivan et al. (1990) Nucl.
Acids Res. 18: 2188–2193,
beschrieben ist, für
die Toleranz gegenüber
Sulfonylharnstoff-Herbiziden; und das bar-Gen, das in DeBlock et
al. (1987) EMBO J. 6: 2513–2519,
beschrieben ist, für
Glufosinat- und
Bialaphos-Toleranz.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird ein Polynucleotidmolekül
der vorliegenden Erfindung, wie es in SEQ ID Nr. 1, 4 und 11 gezeigt
ist, oder ein Fragment von SEQ ID Nr. 1, wie es oben definiert ist,
in ein Konstrukt eingebaut, so dass ein Promotor der vorliegenden
Erfindung funktionell mit einem transcribierbaren Polynucleotidmolekül verknüpft ist,
bei dem es sich um ein Gen von agronomischem Interesse handelt.
Der hier verwendete Ausdruck "Gen
von agronomischem Interesse" bezieht
sich auf ein transcribierbares Polynucleotidmolekül, das unter
anderem ein Gen umfasst, das für
ein wünschenswertes
Merkmal sorgt, welches mit der Pflanzenmorphologie, -physiologie,
Wachstum und Entwicklung, Ertrag, Ernährungsverbesserung, Resistenz
gegen Krankheiten oder Schädlinge
oder Umwelt- oder Chemikalientoleranz zusammenhängt. Die Expressi on eines Gens
von agronomischem Interesse ist wünschenswert, um ein agronomisch
wichtiges Merkmal hervorzurufen. Bei dem Gen von agronomischem Interesse,
das Kulturpflanzen ein günstiges
agronomisches Merkmal verleiht, kann es sich zum Beispiel unter
anderem um genetische Elemente handeln, die Folgendes umfassen:
Herbizid-Resistenz (
US-Patent
Nr. 5,633,435 und
US-Patent Nr. 5,463,175 ),
erhöhter
Ertrag (
US-Patent Nr. 5,716,837 ),
Insektenbekämpfung
(
US-Patent Nr. 6,063,597 ;
US-Patent Nr. 6,063,756 ;
US-Patent Nr. 6,093,695 ;
US-Patent Nr. 5,942,664 und
US-Patent Nr. 6,110,464 ),
Resistenz gegen Pilzkrankheiten (
US-Patent
Nr. 5,516,671 ;
US-Patent
Nr. 5,773,696 ;
US-Patent Nr. 6,121,436 ;
US-Patent Nr. 6,316,407 und
US-Patent Nr. 6,506,962 ),
Virusresistenz (
US-Patent Nr.
5,304,730 und
US-Patent
Nr. 6,013,864 ), Nematodenresistenz (
US-Patent Nr. 6,228,992 ), Resistenz
gegen bakterielle Krankheiten (
US-Patent
Nr. 5,516,671 ), Stärkeproduktion
(
US-Patent Nr. 5,750,876 und
US-Patent Nr. 6,476,295 ),
Produktion modifizierter Öle
(
US-Patent Nr. 6,444,876 ),
hohe Ölproduktion
(
US-Patent Nr. 5,608,149 und
US-Patent Nr. 6,476,295 ), modifizierter
Fettsäuregehalt
(
US-Patent Nr. 6,537,750 ),
Hohe Proteinproduktion (
US-Patent
Nr. 6,380,466 ), Fruchtreifung (
US-Patent Nr. 5,512,466 ), verbesserte
Ernährung
von Mensch und Tier (
US-Patent
Nr. 5,985,605 und
US-Patent
Nr. 6,171,640 ), Biopolymere (
US-Patent
Nr. 5,958,745 und US-Patent Veröffentlichungs-Nr.
US20030028917 ), Resistenz gegen
Umweltstress (
US-Patent Nr. 6,072,103 ),
pharmazeutische Peptide (
US-Patent
Nr. 6,080,560 ), Verbesserte Verarbeitungsmerkmale (
US-Patent Nr. 6,476,295 ),
verbesserte Verdaulichkeit (
US-Patent
Nr. 6,531,648 ) geringer Raffinose-Gehalt (
US-Patent Nr. 6,166,292 ), industrielle
Enzymproduktion (
US-Patent Nr.
5,543,576 ), Verbessertes Aroma (
US-Patent Nr. 6,011,199 ), Stickstofffixierung
(
US-Patent Nr. 5,229,114 ),
Hybridsamenproduktion (
US-Patent
Nr. 5,689,041 ) und Biokraftstoffproduktion (
US-Patent Nr. 5,998,700 ).
-
Alternativ
dazu kann ein transcribierbares Polynucleotidmolekül auch die
oben genannten Phänotypen bewirken,
indem es ein nichttranslatierbares RNA-Molekül codiert, welches die zielgerichtete
Hemmung der Expression eines endogenen Gens bewirkt, zum Beispiel über Antisense-
und inhibitorische RNA oder durch cosuppressionsvermittelte Mechanismen.
Bei der RNA könnte
es sich auch um ein katalytisches RNA-Molekül (d. h. ein Ribozym) handeln,
das so gestaltet wurde, dass es ein gewünschtes endogenes mRNA-Produkt
spaltet. Also ist jedes Polynucleotidmolekül, das ein Protein oder eine
mRNA codiert, das bzw. die eine interessierende Veränderung
des Phänotyps
oder der Morphologie exprimiert, für die praktische Durchführung der
vorliegenden Erfindung geeignet.
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Die
Konstrukte der vorliegenden Erfindung sind im Allgemeinen DNA-Konstrukte
mit doppeltem Ti-Plasmid-Border, die den rechten Border-Bereich
(hier als RB oder AGRtu.RB bezeichnet) und linken Border-Bereich
(hier als LB oder AGRtu.LB bezeichnet) des aus Agrobacterium tumefaciens
isolierten Ti-Plasmids aufweisen, das eine T-DNA umfasst, die zusammen
mit von den Agrobacterium-Zellen
bereitgestellten Transfermolekülen
die Integration der T-DNA in das Genom einer Pflanzenzelle erlaubt.
Die Konstrukte enthalten auch die Plasmidgerüst-DNA-Segmente, die in Bakterienzellen
für eine
Replikationsfunktion und Antibiotikum-Selektion sorgen, zum Beispiel
einen E.-coli-Replikationsstartpunkt, wie ori322, einen Replikationsstartpunkt
mit breitem Wirtsspektrum, wie oriV oder oriRi, und einen codierenden
Bereich für
einen Selektionsmarker, wie Spec/Strp, der Tn7-Aminoglycosid-Adenyltransferase
(aadA) codiert, die Resistenz gegen Spectinomycin oder Streptomycin
verleiht, oder ein Gentamicin(Gm, Gent)-Selektionsmarker-Gen. Für die Pflanzentransformation
handelt es sich bei dem Wirtsbakterienstamm häufig um Agrobacterium tumefaciens
ABI, C58 oder LBA4404, doch können
in der vorliegenden Erfindung auch andere Stämme, die dem Fachmann auf dem Gebiet
der Pflanzentransformation bekannt sind, funktionieren.
-
Transformierte Pflanzen und
Pflanzenzellen
-
Der
hier verwendete Ausdruck "transformiert" bezieht sich auf
eine Zelle, ein Gewebe, Organ oder einen Organismus, in den ein
Fremd-Polynucleotidmolekül,
wie ein Konstrukt, eingeführt
wurde. Vorzugsweise wird das eingeführte Polynucleotidmolekül in die
genomische DNA der aufnehmenden Zelle, des Gewebes, Organs oder
Organismus integriert, so dass das eingeführte Polynucleotidmolekül von der
Nachkommenschaft geerbt wird. Eine als "transgen" oder "transformiert" bezeichnete Zelle oder Organismus umfasst
also auch Nachkommen der Zelle oder des Organismus und Nachkommen
aus einem Zuchtprogramm, bei dem eine solche transgene Pflanze als
Stammpflanze in einer Kreuzung eingesetzt wurde, wobei diese einen
veränderten Phänotyp aufweisen,
der aus der Gegenwart eines Fremd-Polynucleotidmoleküls resultiert.
Ein Pflanzentransformationskonstrukt, das einen Promotor enthält, wie
er oben definiert ist, kann nach irgendeinem Pflanzentransformationsverfahren
in Pflanzen eingeführt
werden. Verfahren und Materialien zur Transformation von Pflanzen
durch Einführung
eines Pflanzenexpressionskonstrukts in ein Pflanzengenom bei der
praktischen Durchführung
dieser Erfindung können
irgendwelche der wohlbekannten und bewährten Verfahren umfassen; dazu
gehören:
Elektroporation, wie sie im
US-Patent
Nr. 5,384,253 erläutert
ist, Mikroprojektil-Beschuss, wie er im
US-Patent Nr. 5,015,580 ,
US-Patent Nr. 5,550,318 ,
US-Patent Nr. 5,538,880 ,
US-Patent Nr. 6,160,208 ,
US-Patent Nr. 6,399,861 und
US-Patent Nr. 6,403,865 erläutert ist,
Agrobacterium-vermittelte Transformation, wie sie im
US-Patent Nr. 5,635,055 ,
US-Patent Nr. 5,824,877 ,
US-Patent Nr. 5,591,616 ,
US-Patent Nr. 5,981,840 und
US-Patent Nr. 6,384,301 erläutert ist,
und Protoplastentransformation, wie sie im
US-Patent Nr. 5,508,184 erläutert ist.
-
Verfahren
zum spezifischen Transformieren von Zweikeimblättrigen sind dem Fachmann wohlbekannt.
Die Transformation und Pflanzenregeneration mit Hilfe dieser Verfahren
wurde für
mehrere Kulturpflanzen beschrieben, einschließlich unter anderem Baumwolle
(Gossypium hirsutum), Sojabohne (Glycine max), Erdnuss (Arachis
hypogaea), Tabak (Nicotiana tabacum), Tomate (Lycopersicon esculentum),
Kartoffel (Solanum tuberosum), Sonneblume (Helianthus sp.), Luzerne
(Medicago sativa) und Vertreter der Gattung Brassica.
-
Verfahren
zum spezifischen Transformieren von Einkeimblättrigen sind dem Fachmann wohlbekannt. Die
Transformation und Pflanzenregeneration mit Hilfe dieser Verfahren
wurde für
mehrere Kulturpflanzen beschrieben, einschließlich unter anderem Gerste
(Hordeum vulgare), Mais (Zea mays), Hafer (Avena sativa), Gewöhnliches
Knäuelgras
(Dactylis glomerata), Reis (Oryza sativa, einschließlich der
Sorten Indica und Japonica), Sorghumhirse (Sorghum bicolor), Zuckerrohr
(Saccharum sp.), Rohrschwingel (Festuca arundinacea), Straußgräser (Agrostis),
Weizen (Triticum aestivum), Hirse (Eleusine sp.) und Roggen (Secale
cereale). Der Fachmann ist sich darüber im Klaren, dass mehrere
Transformationsmethoden verwendet und für die Produktion von stabilen
transgenen Pflanzen aus einer beliebigen Zahl von interessierenden
Zielkulturpflanzen modifiziert werden können.
-
Die
transformierten Pflanzen werden auf die Anwesenheit der interessierenden
Gene und das von den oben genannten Promotoren hervorgerufene Expressionsniveau
und/oder -profil analysiert. Der Fachmann kennt die zahlreichen
Verfahren, die für
die Analyse von transformierten Pflanzen zur Verfügung stehen.
Zu den Verfahren für
die Pflanzenanalyse gehören
zum Beispiel unter anderem Southern-Blots oder Northern-Blots, Ansätze auf
PCR-Basis, biochemische Analysen, Phänotyp-Screening-Verfahren,
Feldbewertungen und immundiagnostische Assays.
-
Die
Samen dieser Erfindung können
von fruchtbaren transgenen Pflanzen geerntet und verwendet werden,
um Nachkommengenerationen von transformierten Pflanzen dieser Erfindung
einschließlich
Hybridpflanzenlinien, die das Konstrukt dieser Erfindung umfassen
und ein Gen von agronomischem Interesse exprimieren, zu züchten.
-
Die
folgenden Beispiele sollen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
aufzeigen.
-
Beispiele
-
Beispiel 1: Promotorisolierung und DNA-Konstrukte
-
Cytosolische
Triosephosphat-Isomerase (TPI) wurde als in einer einzigen Kopie
vorliegendes Gen mit konstitutiver Expression charakterisiert. Die
vorliegende Erfindung umfasst Elemente des Reis-TPI-Gens einschließlich Promotor,
Introns und Leadern für
den Einbau in Pflanzenexpressionscassetten. Die Untersuchung von
3'-UTRs aus Reis-EST-Bibliotheken
wies darauf hin, dass die meisten dieser Bibliotheken wenigstens
eine repräsentative
TPI-Sequenz enthalten, und stützte
somit die Hypothese eines breiten Expressionsprofils (Tabelle 1).
Außerdem
hat Reis-Act1 (
US-Patent Nr.
5,461,876 ), ein bekannter konstitutiver Promotor mit einem breiten
Expressionsprofil, ein Profil, bei dem die meisten der Bibliotheken
wenigstens eine repräsentative Act1-Sequenz
enthalten. Dann wurde TPI-mRNA zum BLAST gegen zusammengebaute Reis-BAC-Sequenzen
verwendet, um die entsprechenden genomischen Sequenzen zu identifizieren.
Zwei BACs, OSM19526 und OSM19525, die den 5'- bzw. den 3'-Teil des TPI-Gens enthalten, wurden
gefunden. Tabelle 1: Vorkommen der jeweiligen 3'-UTRs in Reis-EST-Bibliotheken
| Bibliothek | 5'- und 3'-Ablesungen | Act1 | TPI |
| Rispe,
rissbildend – 3/4 geöffnete Blüte | 20227 | 7 | 5 |
| sich
entwickelnde Rispe | 7909 | 5 | 4 |
| spätes Antherenstadium | 5956 | 14 | 0 |
| sich
entwickelnder Samen | 7453 | 1 | 2 |
| trockener
Samen | 9362 | 0 | 0 |
| keimender
Samen | 9743 | 0 | 1 |
| vegetativer
Sprossscheitel | 7672 | 2 | 0 |
| Blatt,
3–5 Blätter | 10040 | 0 | 3 |
| Blatt,
3–4 Sprosse | 9209 | 1 | 4 |
| Blatt,
verlängerte
Fahnenblattscheide | 7897 | 1 | 1 |
| Wurzel,
3–5 Blätter | 10524 | 2 | 3 |
| Wurzel,
3–4 Sprosse | 10624 | 1 | 9 |
| Wurzel,
dritter Spross – Milchreife | 7481 | 1 | 5 |
-
Die
Primer OsTPI5-9 (SEQ ID Nr. 2) und JY2130 (SEQ ID Nr. 3) wurden
verwendet, um den 5'-Bereich des
TPI-Gens einschließlich
des Promotors, des Introns und der Leader-Segmente aus genomischer
DNA (cv Nipponbare) (SEQ ID Nr. 1) zu isolieren. Die Amplifikation
wurde unmittelbar stromaufwärts
des Translati onsstartcodons gestartet (das Startcodon selbst wurde
so modifiziert, dass es im Kontext einer NcoI-Restriktionsstelle
lag) und endete ungefähr
1,5 bis 2 kb unmittelbar stromaufwärts des Beginns der Transcriptionsstartstelle
(daraus abgeleitet, dass man den längsten 5'-UTR betrachtet, der in ESTs vorhanden
ist). Diese Amplifikation wird mit Hilfe von DNA-Amplifikationsverfahren,
zum Beispiel Techniken der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), durchgeführt. In
der Technik ist eine Vielzahl von Amplifikationsverfahren bekannt;
sie sind unter anderem beschrieben in den
US-Patenten Nr. 4,683,195 und
4,683,202 und in PCR Protocols:
A Guide to Methods and Applications, Hrsg. Innis et al., Academic
Press, San Diego, 1990. Bei der PCR bezieht sich der Ausdruck "Primer" auf ein kurzes Oligonucleotid
mit einer definierten Sequenz, das mit einer DNA-Matrize assoziiert wird,
um die Polymerase-Kettenreaktion einzuleiten. Die Primer und die
DNA wurden 2 Minuten lang bei 94°C inkubiert,
und dann folgten 10 Zyklen von: 94°C während 15 Sekunden, 55°C während 30
Sekunden, 68°C während 4
Minuten, dann 20 Zyklen von: 94°C
während
15 Sekunden, 55°C
während
30 Sekunden, 68°C
während
4 Minuten und 5 Sekunden pro Zyklus, dann ein Zyklus von 68°C während 7
min. Der Expand Long Template PCR Kit (Roche, Indianapolis, IN)
wurde für
die Amplifikation verwendet.
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Die
Promotorsequenz ist in SEQ ID Nr. 4 (1 bei
2–2710)
und in einer verkürzten
Version in SEQ ID Nr. 11 (1408–2657
von 1) angegeben. Das erste Intron
(SEQ ID Nr. 5, 1 bei Basenpaar 2821–3927) des
TPI-Gens, das sich innerhalb der codierenden Sequenz in der Nähe des Translationsstarts
befindet, ist für hohe
Expressionsniveaus in Einkeimblättrigen
notwendig, wenn es in Form einer translationalen Fusion mit dem
zweiten Exon verwendet wird (Snowden et al., Plant Mol. Biol. 31:
689–692,
1996; Xu et al., Plant Physiol. 106: 459–467, 1994.) Der klonierte
5'-Bereich wurde
mit den Oligonucleotiden JY2132 (SEQ ID Nr. 6) und JY2133 (SEQ ID
Nr. 7) mutagenisiert, die das native Translationsstartcodon von
ATG zu ATA umwandeln (1 bei Basenpaar
2784). Eine zweite ATG-Sequenz stromaufwärts des ersten Introns wurde
ebenfalls mit den Oligonucleotiden JY2135 (SEQ ID Nr. 8) und JY2136
(SEQ ID Nr. 9) ebenfalls mutagenisiert, wodurch sie zu TTG umgewandelt
wurde (1 bei Basenpaar 2817). Infolgedessen
wurde das Potential zur Einleitung der Translation im dem kurzen
codierenden Bereich stromaufwärts
des ersten Introns entfernt, wodurch die Einleitung der Transcription
stromabwärts
des Introns zu dem künstlich
eingefügten
ATG im Kontext einer NcoI-Stelle verschoben wurde (1 bei
Basenpaar 3935–3940).
Das 5'-Leader-Segment
ist in 1 bei Basenpaar 2711–2820 identifiziert.
Das 3'-Leader-Segment
ist in 1 bei Basenpaar 3928–3936 identifiziert.
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Dann
wurde ein DNA-Konstrukt geschaffen, indem man den TPI-5'-Bereich mit HindIII
(
1 bei Basenpaar 1–6)/partielles NcoI verdaute,
um ihn in ein mit HindIII/NcoI geschnittenes pMON52244-Gerüst zu klonieren.
Ein 3'-Transcriptionsterminationsbereich
aus einem Reis-GOS2-Gensegment (SEQ ID Nr. 10) wurde zu dem DNA-Konstrukt
hinzugefügt.
Das GOS2-3'-UTR
wurde an das 3' Ende
des gewünschten
Transgens ligiert (Sambrook et al.). Für die Charakterisierung der
Glyphosattoleranz enthält
der Pflanzentransformationsvektor pMON68902, wie er in
2 gezeigt
ist, das CTP2/CP4-EPSPS-Gen (
US-Patent
Nr. 5,633,435 ) als interessierendes Transgen.
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Beispiel 2: Promotorcharakterisierung
in transienten Systemen
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Für die Charakterisierung
der GUS-Aktivität
enthält
der Pflanzentransformationsvektor pMON78367, wie er in 3 gezeigt
ist, das GUS-Reporter-Gen (Jefferson et al., Biochem. Soc. Trans.
15: 17–19,
1987) als interessierendes Transgen.
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Der
Pflanzenexpressionsvektor pMON78367 wurde mit Hilfe von Teilchenbeschuss
verwendet, um Maiskallus zu transformieren. Dann wurde die GUS-Aktivität durch
das Mug-Verfahren für
die in-planta-Promotor-Charakterisierung quantitativ bewertet. Das
Verfahren sorgt für
eine quantitative Analyse der GUS-Expression in den transgenen Pflanzenzellen.
Gesamtprotein wird aus jeder Probe extrahiert, gemessen, und die Konzentration
so eingestellt, dass jede Probe dieselbe Menge an Gesamtprotein
enthält.
Das Gesamtprotein wird mit Hilfe eines Bio-Rad Protein Assay Kit
bestimmt. Eine Verdünnungsreihe
von BSA-Protein
von 0,05 mg/ml bis 0,5 mg/ml wird für die Standardkurve verwendet.
Bei dem MUG-Assay werden 500 μl
GUS-Extraktionspuffer verwendet, der zu den Geweben gegeben wird,
und die Gewebe werden mit einem Teflon-Pistill in einem 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen gemahlen
und 5 Minuten lang bei 4°C
mit 10 000 U/min zentrifugiert (Beckman GS-15R). 400 μl Überstand
werden in eine frische 96er Tiefnapfplatte übergeführt. Die Extrakte werden auf
Trockeneis eingefroren und dann bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
Der MUG-Assay bestand aus der Erzeugung einer Standardaktivitätskurve
mit einer Verdünnungsreihe
von 4-Methylumbelliferon (Sigma Chemical Co. Kat.-Nr. M1381, St
Louis, MO) von 31,2 pmol bis 2000 pmol. In eine Flachboden-96-Napf-Platte (Falcon
Nr. 3872, BD Biosciences) werden 5 μl von jedem Extrakt in doppelten
Ansätzen
gegeben, nachdem die Platte abgelesen wurde, um den Hintergrund
zu berücksichtigen.
200 μl GUS-Assaylösung (0,1
M KPO4, pH 7,8, 1,0 mM EDTA, 5% Glycerin,
10,0 mM DTT, 2 mM 4-Methylumbelliferylglucuronid, Fluka Nr. 69602)
werden in jeden Napf gegeben und durch Pipettieren mit den Proben
gemischt. Die Platte wird kinetisch an einem F-max (Molecular Devices,
Sunnyvale, CA) bei 37°C
mit dem Filterpaar Anregung 355/Emission 460 abgelesen. Eine typische
Ablesung besteht aus 21 Ablesungen in Abständen von 3 Minuten. Die GUS-Aktivität (pmol/min/mg
Protein) wird auf der Basis von MUG-Ergebnissen und Proteinergebnissen
für jede
Probe berechnet. 1,5 μl
Extrakte werden in doppelten Ansätzen
in eine Flachboden-96-Napf-Platte (Falcon) gegeben. 200 μl verdünntes Farbstoffreagens
werden hinzugefügt
und mit den Proben gemischt. Die Extinktion bei 595 nm wird mit
einem Spectromax 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) bei Raumtemperatur
gemessen, nachdem 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert worden
war.
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Die
Ergebnisse, wie sie in Tabelle 2 gezeigt sind, zeigen in diesem
transienten System ein akzeptables Niveau der GUS-Expression für P-Os.TPI
im Vergleich zu dem Kontrollvektor und einem anderen Promotor (CaMVE35S). Tabelle 2: Quantitative Analyse der GUS-Aktivität in Maiskallus
| Konstrukt | GUS-Aktivität (pmol/μg Protein/Stunde) |
| Os.TPI
pMON 78367 | 19,06
+ 4,88 |
| CaMV
E35S pMON 77952 | 33,53
+ 11,28 |
| Kontrollvektor
pMON 77951 | 1,67
+ 0,502 |
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Beispiel 3: Promotorcharakterisierung
in transgenen Pflanzen
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Das
Konstrukt pMON68902 wurde verwendet, um Mais unter Verwendung von
Agrobacterium tumefaciens zu transformieren (
US-Patent Nr. 6,603,061 ). Ungefähr 25 transformierte
Maispflanzen (Ereignisse) pro Konstrukt wurden erzeugt. Die Maisereignisse
wurden auf glyphosathaltigem Medium selektiert, auf Erde übertragen
und anschließend
ins Treibhaus gebracht. Die Maisereignisse wurden mit Glyphosat
(0,84 kg Säureäquivalente
pro ha) besprüht,
wobei man die Zubereitung Roundup
® Ultra
(Monsanto Company, St. Louis, MO) ungefähr im V4-Blattstadium verwendete.
Die Maisereignisse, die ohne Verletzung überlebten (< 10% Chlorose und Missbildung) wurden
behalten und in große
Töpfe übergeführt. Ungefähr im V8-Stadium
wurde eine zweite ähnliche
Glyphosatanwendung durchgeführt.
Mit dieser zweiten Besprühung
sollte die männliche reproduktive
Toleranz bewertet werden. Die Maisereignisse aus pMON68902 wurden
nach der Reifung der männlichen
Blütenstände in Bezug
auf die männliche
Fruchtbarkeit bewertet. Die Bewertung der männlichen Fruchtbarkeit (MFR;
male fertility rating) erfolgt auf einer Skala von 1 bis 5 Punkten,
wobei 1 verwendet wird, wenn die männlichen Blütenstände keine entwickelten Blüten hatten
(vollständig
steril), und 5 verwendet wird, wenn es vollentwickelte Staubbeutel
mit Pollenverstäubung
gibt (fruchtbar; MFR = 4–5
gilt als kommerziell lebensfähig).
Eine Kombination von Taqman
® (Applied Biosystems,
Foster City, CA) und Southern-Analyse (Sambrook
et al.) wurde verwendet, um die Kopienzahl des Transgens in den
Ereignissen, die ins Treibhaus gebracht wurden, zu bewerten. Die
Southern-Analyse unter Verwendung der neuen Elemente zeigte auch, dass
diese heterologen Sequenzen keine Kreuzhybridisierung mit endogenen
Maissequenzen aufweisen, eine bedeutende Eigenschaft für die Charakterisierung
von Ereignissen. Diese frühen
Bewertungen sind Bestandteil eines Verfahrens zum Auswählen von
Konstrukten, die zu dem doppelten Expressionscassettenkonstrukt pMON30167 äquivalent
sind (
WO 02/27004 ).
Zu den wichtigen Kriterien für
ein erfolgreiches Konstrukt gehören
eine gute Transformationseffizienz (Zahl der erzeugten Ereignisse/Zahl
der geimpften Explantate) und die Fähigkeit, reproduzierbar für vegetativ
und reproduktiv tolerante Transformanten, die eine einzige Kopie
des Transgens tragen, zu sorgen. Eine Zusammenfassung des gegenwärtigen Konstruktstatus
ist in Tabelle 3 gezeigt. Im Vergleich zu P-Os.ActI/P-CaMVE35S (pMON30167),
der positiven Kontrolle, zeigen die Ergebnisse von P-Os.TPI eine überraschende
Fähigkeit,
Glyphosattoleranz zu verleihen, was sich an der starken vegetativen
und reproduktiven Toleranz zeigt. Diejenigen Ein-Kopien-Ereignisse,
die die Treibhausbewertungen bestanden, wurden zu Feldbewertungen
weitergegeben. Tabelle 3: Bewertungen der Transformation
und der vegetativen Toleranz und männlichen Fruchtbarkeit im Treibhaus
| Konstrukt | Transformationshäufigkeit (%) | Zahl
der Ereignisse | Einzelne
Kopie (%) | Einzelne
Kopie, vegetativ tolerant (%) | Einzelne
Kopie, vegetativ tolerant und MFR = 4–5 (%) |
| P-Os.Act1/P-CaMVE35S pMON30167 | 5,1 | 24 | 33 | 21 | 21 |
| P-Os.TPI pMON68902 | 3,0 | 32 | 53 | 53 | 53 |
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Die
Feldbewertungen wurden mit Maispflanzen der Generation F2 durchgeführt. Die
Pflanzen wurden mit zwei Anwendungen von 3,36 kg Glyphosat-Säureäquivalenten
in der Zubereitung Roundup
® UltraMax (dem Vierfachen
der derzeitigen, auf dem Feld verwendeten Menge) im Stadium V4 und
V8 behandelt. Zehn Tage nach jeder Behandlung wurden Bewertungen
der Chlorose und der Missbildung vorgenommen. Die Bewertung der
männlichen
Fruchtbarkeit wurde bei der Reife der männlichen Blütenstände vorgenommen. Das kommerzielle
Ereignis nk603 (pMON25496, das P-Os.Act1/CP4-EPSPS:P-CaMVE35S/CP4-EPSPS,
enthält;
EP 1 167 531 ) wurde als
Kontrollstandard verwendet, um die Leistungsfähigkeit des Expressionscassette,
die den Reis-TPI(Os.TPI)-Promotor enthielt, zu bewerten. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 4 gezeigt und beweisen, dass der in pMON38902 verwendete
Os.TPI-Promotor Ereignisse mit Glyphosattoleranz liefert, die dem
kommerziellen Standardereignis nk603 wenigstens gleich sind. Das
nk603-Ereignis enthält
zwei Pflanzenexpressionscassetten, und daher verleiht die Expressionscassette
mit einem einzigen P-Os-TPI transgenen Maispflanzen ein unerwartet
hohes Maß der
Glyphosattoleranz. Tabelle 4: Feldbewertung der vegetativen
und männlichen
Fruchtbarkeit
| Konstrukt | Zahl
der Ereignisse | Ereignisse,
die die Bewertung der V8-Missbildung bestehen | Ereignisse,
die die Bewertung der V8-Chlorose bestehen | Ereignisse,
die die Bewertung der vegetativen Toleranz bestehen, und MFR = 4–5 |
| P-Os.Act1
+ CaMVE35S pMON25496 | nk603 | nk603 | nk603 | nk603 |
| P-Os.TPI pMON68902 | 7 | 4 | 4 | 4 |
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Es
wurde zusätzlich
gezeigt, dass der Reis-TPI-Promotor die Expression der CP4-EPSPS-codierenden
Sequenz in Tabakpflanzen steuert und Tabakpflanzen ergibt, die gegenüber Glyphosat
tolerant sind. Eine verkürzte
Version des Promotormoleküls
(etwa Nucleotidposition 1408–2657
von 1) wurde funktionell mit einem
Zweikeimblättrigen-Intron
und mit der CP4-EPSPS-codierenden Sequenz und einem 3'-Terminationsbereich
verknüpft.
Die Transformation von Tabakzellen mit dieser Expressionscassette
und der Assay auf regenerierte Pflanzen zeigten, dass 100% der transgenen
Pflanzen, die den Reis-TPI-Promotor enthielten, der die Expression
eines glyphosatresistenten EPSPS steuerte, vegetativ tolerant waren
und 57% der Pflanzen reproduktiv tolerant waren.
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