JPH1052273A - 植物プロモーターおよびその利用 - Google Patents

植物プロモーターおよびその利用

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JPH1052273A
JPH1052273A JP8212680A JP21268096A JPH1052273A JP H1052273 A JPH1052273 A JP H1052273A JP 8212680 A JP8212680 A JP 8212680A JP 21268096 A JP21268096 A JP 21268096A JP H1052273 A JPH1052273 A JP H1052273A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】植物を改良する場合、例えば、目的とするタン
パク質を局所的に発現させることにより効果的な改良が
行えることがあり、このような改良により新しいタイプ
の高機能性植物を開発する一環として、組織特異的な発
現をもたらす各種の植物プロモーターの探索が望まれて
いる。 【解決手段】配列番号１で示される塩基配列である領域
（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモ
ーター、配列番号２で示される塩基配列である領域（約
２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター
及びXhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),
EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイ
トを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を
含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該
領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配
列が配列番号２で示されるプロモーター等の植物プロモ
ーターおよびその利用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、植物プロモーター
およびその利用等に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、植物を遺伝子工学的技術を用いて
改良する場合、ある種のプロモーターの下流に、該植物
内で発現させたいタンパク質の構造遺伝子（以下、目的
とする構造遺伝子と記す。）を連結させたキメラ遺伝子
を植物細胞に導入し、得られた植物細胞を通常の植物組
織培養技術により再生させ、目的とするタンパク質を発
現する形質転換植物体を作製する方法が知られている。
上記の方法で用いられる代表的なプロモーターとして
は、例えば、カリフラワーモザイクウイルス35S プロモ
ーター（以下、35S プロモーターと記す。）があり、該
プロモーターは、植物細胞内で目的とするタンパク質を
組織非特異的に発現させることが知られ、比較的汎用性
の高いプロモーターとして、特に試験研究において広く
使用されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、植物を
改良する場合、例えば、目的とするタンパク質を局所的
に発現させることにより効果的な改良が行えることがあ
り、このような改良により新しいタイプの高機能性植物
を開発する一環として、組織特異的な発現をもたらす各
種の植物プロモーターの探索が望まれている。
【０００４】
【課題を解決するための手段】このような状況下、本発
明者らは鋭意検討を行った結果、根部において特異的に
高発現している新規なタンパク質をコードする遺伝子を
見い出し、その遺伝子の上流に存在する、特定の塩基配
列である領域を含む植物細胞内で機能可能なプロモータ
ーの単離に成功し、そして該プロモーターを使用するこ
とにより、植物の維管束（特に根部における維管束）に
おいて目的とするタンパク質を高発現させることができ
ることを突き止め、本発明に至った。すなわち、本発明
は、 1 ）配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５
０ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター
（以下、本発明プロモーターと記す。）、 ２）配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋ
ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター、 ３）XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),
EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイ
トを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を
含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該
領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配
列が配列番号２で示されるプロモーター、 ４）配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５
０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモーターを有
することを特徴とするプラスミド（以下、本発明プラス
ミドと記す。）、 ５）配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋ
ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターを有
することを特徴とするプラスミド、 ６）XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),
EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイ
トを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を
含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該
領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配
列が配列番号２で示されるプロモーターを有することを
特徴とするプラスミド、 ７）配列番号１で示される塩基配列である領域（約２５
０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモーター及び
目的の構造遺伝子を有することを特徴とするキメラ遺伝
子（以下、本発明キメラ遺伝子と記す。）、 ８）配列番号２で示される塩基配列である領域（約２Ｋ
ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター及び
目的の構造遺伝子を有することを特徴とするキメラ遺伝
子、 ９）XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),
EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイ
トを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）を
含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであって、該
領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配
列が配列番号２で示されるプロモーター及び目的の構造
遺伝子を有することを特徴とするキメラ遺伝子、 １０）配列番号１で示される塩基配列である領域（約２
５０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモーター、
目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミ
ネーターを有することを特徴とするプラスミド（以下、
本発明発現プラスミドと記す。）、 １１）配列番号２で示される塩基配列である領域（約２
Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーター、
目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミ
ネーターを有することを特徴とするプラスミド、 １２）XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3k
b),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素
サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂ
ｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであっ
て、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の
塩基配列が配列番号２で示されるプロモーター、目的の
構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミネータ
ーを有することを特徴とするプラスミド、 １３）図１で示されることを特徴とするプラスミド、 １４）前項４、前項５又は前項６記載のプラスミドを含
有することを特徴とする微生物（以下、本発明微生物と
記す。）、 １５）前項７、前項８又は前項９記載のキメラ遺伝子を
含有することを特徴とする微生物、 １６）前項１、前項２又は前項３記載のプロモーターの
制御下で目的の構造遺伝子がコードするタンパク質を発
現することを特徴とする植物細胞（以下、本発明植物細
胞と記す。）、 １７）前項７、前項８又は前項９記載のキメラ遺伝子を
含有することを特徴とする植物細胞、 １８）前項１、前項２又は前項３記載のプロモーターの
制御下で目的の構造遺伝子がコードするタンパク質を発
現することを特徴とする植物体（以下、本発明植物体と
記す。）、 １９）前項７、前項８又は前項９記載のキメラ遺伝子を
含有することを特徴とする植物体、 ２０）前項１、前項２又は前項３記載のプロモーターの
下流に、目的とする構造遺伝子を連結することを特徴と
するキメラ遺伝子の作製方法（以下、本発明キメラ遺伝
子作製方法と記す。）、 ２１）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有する分子
量16kDのタンパク質（以下、本発明タンパク質と記
す。）、 ２２）配列番号３で示されるアミノ酸配列をコードする
塩基配列を有する分子量16kDのタンパク質遺伝子（以
下、本発明タンパク質遺伝子と記す。）、 ２３）配列番号４で示される塩基配列を有する分子量16
kDのタンパク質遺伝子、 ２４）前項２３記載の遺伝子を含有することを特徴とす
るプラスミド（以下、本発明タンパク質遺伝子プラスミ
ドと記す。）。 ２５）配列番号５で示される塩基配列である領域を含む
植物細胞内で機能可能なターミネーター（以下、本発明
ターミネーターと記す。）、を提供するものである。
【０００５】
【発明の実施の形態】以下、さらに詳細に本発明を説明
する。本発明で用いられる遺伝子工学的技術は、たとえ
ば、J.,Sambrook, E.,F.,Frisch,T.,Maniatis 著、モレ
キュラークローニング第 2版（Molecular Cloning 2nd
edition ）、コールド スプリング ハーバー ラボラ
トリー発行（Cold Spring Harbor Laboratory press
）、1989年及び D.,M.,Glover 著、DNA クローニング
（DNA Cloning ）、IRL 発行、1985年などに記載されて
いる通常の方法である。
【０００６】本発明プロモーターは、配列番号１で示さ
れる塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む植物細
胞内で機能可能なプロモーターである。配列番号１で示
される塩基配列である領域（約２５０ｂｐ）を含む他の
具体的な領域としては、例えば、配列番号２で示される
塩基配列である領域（約２Ｋｂｐ）を含む領域やXhoI(0
kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3k
b),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有す
るニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）であって、
該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域の塩基
配列が配列番号２で示される領域を含む領域等をあげる
ことができる。尚、特に強い発現を必要とする場合に
は、例えば、XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV
(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限
酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋ
ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであ
って、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域
の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーターを用い
ることが好ましい。ここで「植物細胞内で機能可能なプ
ロモーター」とは、該プロモーターの下流に目的とする
タンパク質の構造遺伝子を連結した場合、該タンパク質
の植物細胞内における発現を制御する能力を有するよう
なプロモーターを意味し、上記の配列番号１又は２で示
される塩基配列である領域からのみなるプロモーターや
XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoR
I(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを
有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋｂｐ）からの
みなるプロモーターであって、該領域（約４Ｋｂｐ）の
うちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示さ
れるプロモーターであってもよく、また、例えば、アグ
ロバクテリウムのオクトピン合成遺伝子の-333〜-116の
領域とマンノピン合成酵素遺伝子の-318〜-138の領域を
連結した転写翻訳活性化配列、またはマンノピン合成酵
素遺伝子の-318〜-213の領域とオクトピン合成遺伝子の
-333〜-116の領域を連結した転写翻訳活性化配列（The
Plant Journal 7(4):661-676（1995））、カリフラワー
モザイクウイルス35S プロモーターの-343〜-91 を含む
領域（Nature 313:810-812（1985））、トマトのリブロ
ース-1,5- 二リン酸カルボキシラーゼ・オキシダーゼ小
サブユニット遺伝子（rbc-3A）の-1099 〜-205を含む領
域（Plant Cell 1:217-227（1990））、タバコのPR1a遺
伝子の-902〜-287を含む領域（Plant Cell 2:357-366
（1990））、ジャガイモのプロテアーゼインヒビター遺
伝子（PI-II ）の-1300-195 を含む領域（Plant Cell
2:61-70（1990））等を上記の配列番号１又は２で示さ
れる塩基配列である領域やXhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoR
V(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII
(4kb) の制限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の
領域（約４Ｋｂｐ）であって、該領域（約４Ｋｂｐ）の
うちの約２Ｋｂｐの領域の塩基配列が配列番号２で示さ
れる領域と連結してなるプロモーターであってもよい。
【０００７】このような本発明プロモーターを有するプ
ラスミド、即ち、本発明プラスミドは、通常、目的の構
造遺伝子を挿入、切除できるように本発明プロモーター
の下流に１つ以上のクローニング部位を有するように作
製することが好ましい。さらに、複数個のクローニング
部位を有するように作製するとより好ましい。ここでの
クローニング部位とは、遺伝子工学的技術で用いられる
制限酵素によって認識切断可能な部位のことを意味す
る。
【０００８】本発明プロモーターは、目的とするタンパ
ク質を植物細胞内で発現させるために、通常、該プロモ
ーターの下流に目的とするタンパク質の構造遺伝子を連
結することにより作製されたキメラ遺伝子（プロモータ
ーに対して構造遺伝子はヘテロローガスな関係である）
の形で使用される。このようなキメラ遺伝子、即ち、本
発明キメラ遺伝子には、例えば、１）本発明プロモータ
ー及び目的の構造遺伝子のみを有する組換えＤＮＡ遺伝
子、２）該組換えＤＮＡ遺伝子を含有し、宿主染色体と
は物理的に独立して自律複製し、安定に遺伝することが
できる染色体外性遺伝体のようなプラスミド、等が含ま
れる。
【０００９】目的とするタンパク質の発現効率を高める
には、例えば、本発明プロモーター、目的の構造遺伝
子、及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを有す
るプラスミド、即ち、本発明発現プラスミドを用いて植
物細胞を形質転換させる方法が適している。ここで「植
物細胞内で機能可能なターミネーター」とは、植物細胞
内で目的の構造遺伝子を効率的に転写終結させる能力を
有するようなターミネーターを意味し、これは各種のタ
ンパク質の構造遺伝子における終止コドンの下流の３′
末端非翻訳領域に存在するpoly（Ａ）付加シグナル（AA
TAAAとコンセンサス配列とする）のさらに下流に通常存
在するpoly Ａ配列下流に相当するゲノムＤＮＡ領域に
存在している。例えば、配列番号６で示される塩基配列
である領域を含む植物細胞内で機能可能なターミネータ
ー（即ち、本発明ターミネーター）、植物遺伝子由来の
ノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーター（NOS ）、
ニンニクウイルスGV1 、GV2 遺伝子のターミネーター等
があげれられる。このような本発明発現プロモーター
は、通常、目的の構造遺伝子を挿入、切除できるように
本発明プロモーターの下流で、かつ植物細胞内で機能可
能なターミネーターの上流に１つ以上のクローニング部
位を有するように作製することが好ましい。さらに、複
数個のクローニング部位を有するように作製するとより
好ましい。ここでのクローニング部位とは、遺伝子工学
的技術で用いられる制限酵素によって認識切断可能な部
位のことを意味する。このようなクローニング部位を有
する具体的な本発明発現プラスミドとしては、例えば、
図１で示されるプラスミド、pCR16G1/250-GUS 、pCR16G
1/EV-GUS、pCR16G1/H-GUS をあげることができる。
【００１０】本発明発現プラスミドは、例えば、以下の
方法により作製することができる。配列番号１で示され
る塩基配列である領域を含む植物細胞内で機能可能なプ
ロモーター、すなわち、本発明プロモーターを、植物細
胞内で機能可能なターミネーターを含むプラスミド、例
えば、pBI101（CLONTECH社製）（Jefferson et al.EMBO
J. 6:3901-39 07(1987)）のマルチクローニング部位に
挿入する。つぎに、あらかじめ存在するマーカー遺伝子
等の外来遺伝子、例えばβ- グルクロニダーゼ遺伝子
（以下、GUS 遺伝子と記す。）を切り出し、該外来遺伝
子を目的の構造遺伝子で置換することによって作製する
ことができる。また、別な方法として、バイナリーベク
ター、例えば、pBIN19（Nuc.Acid.Res.12:8711-8721(19
84) ）のマルチクローニング部位に本発明プロモータ
ー、目的の構造遺伝子、植物細胞内で機能可能なターミ
ネーター、の順に挿入する方法等もあげることができ
る。
【００１１】本発明キメラ遺伝子に含まれる目的の構造
遺伝子として、例えば、フェニールアラニンアンモニア
リアーゼ遺伝子（PAL ）、カルコンシンターゼ遺伝子
（CHS）、キチナーゼ遺伝子（CHT ）、リゾチーム遺伝
子、PRタンパク質遺伝子等の植物防御遺伝子、Pto 遺伝
子等の病害抵抗性遺伝子、ウイルスコートタンパク質遺
伝子等、病虫害に対する抵抗性を増強することができる
有用遺伝子を好ましくあげることができる。このような
遺伝子によってコードされるタンパク質を本発明プロモ
ーターを利用することにより植物の維管束において高発
現させ、植物の維管束に局在する病原菌や、維管束領域
から養分を吸収する害虫等を効率良く防除することがで
きる。また、本発明プロモーターは、目的とするタンパ
ク質を特に根部における維管束において発現させるの
で、１）薬剤による防除が難しい土壌病虫害に有効であ
り、羅病虫性根に病虫免疫又は抵抗性を付与した機能性
作物をつくること、２）根部を食用とする作物ではタン
パク質などの栄養素の含量を効率的に高めた機能性作物
をつくること等に有益である。このような目的で使用さ
れる目的の構造遺伝子として、例えば、ＢＴ（Bacillus
thuringiensis) 毒素タンパク質遺伝子や上記のような
病虫害に対する抵抗性を増強することができる有用遺伝
子の他に、ダイズのグリシニン遺伝子、β- コングリシ
ニン遺伝子等の貯蔵タンパク質遺伝子をはじめ、飼料作
物における種々のタンパク質含量を増加させることがで
きる有用遺伝子、ブラジルナッツの2Sアルブミン遺伝
子、トウモロコシやイネの10kDa 及び15kDa タンパク質
遺伝子等、飼料作物のメチオニン含量あるいはリジン含
量を増加さることができる有用遺伝子、大腸菌等の微生
物のbioA、bioB、bioC、bioD、bioF、bioH酵素遺伝子
等、ビオチン生合成関連遺伝子であり飼料作物における
ビオチン含量を増加させることができる有用遺伝子、さ
らにステアロイル-ACP- デサチュレース、アシル-ACP-
チオエステラーゼ、3-ホスフェートアシルトランスフェ
ラーゼ遺伝子等、脂質の酸化安定性の増大とリン脂質の
減少及びオレイン酸とリノレン酸の増加による脂質の改
良をすることができる有用遺伝子、あるいはアシルトラ
ンスフェラーゼ遺伝子等、不飽和脂肪酸の割合を増加さ
せ低温に対する抵抗性を増大させることができる有用遺
伝子が挙げられる。さらに、L-ホスフォノスリシンアセ
チル化酵素や(EPSP)合成酵素、PPO 遺伝子等、除草剤抵
抗性に関与する遺伝子であり除草剤抵抗性作物を作出す
ることができる有用遺伝子をあげることができる。
【００１２】本発明プラスミド、本発明キメラ遺伝子、
又は本発明発現プラスミドを植物細胞に導入する方法と
しては、たとえば、アグロバクテリウム菌法（土壌菌で
あるアグロバクテリウム菌を植物組織に感染させる方
法）、電気的導入法（プロトプラストへの電気的導入
法：エレクトロポーレーション）、あるいはパーティク
ルガンによる直接導入法（植物組織及び培養細胞への直
接導入法：パーティクルガン法）等の公知な方法が挙げ
られる。本発明プラスミド、本発明キメラ遺伝子、又は
本発明発現プラスミドを含有する植物細胞は、たとえ
ば、S.B.Gelvin,R.A.Schilperoot and D.P.S.Verma著：
プラント・モレキュラー・バイオロジー/ マニュアル
（Plant Molecular Biology/Manual,Kluwer Academic P
ublishers press,1988）、Valvekens et al.Proc.Natl.
Acad.Sci.,85:5536 -5540 （1988）に記載される通常の
植物組織培養技術において用いられる方法に準じて再生
することによって該植物細胞由来の植物体またはその一
部を得ることができる。
【００１３】尚、本発明に用いることが可能な植物種と
しては、例えば、イネ、トウモロコシ、オオムギ、コム
ギ、タマネギ等の単子葉植物、ダイズ、エンドウ、イン
ゲン、アルファルファ等のマメ科植物、タバコ、トマ
ト、ジャガイモ等のナス科植物、キャベツ、ナタネ、カ
ラシナ等のアブラナ科植物、メロン、カボチャ、キュウ
リ等のウリ科植物、ニンジン、セロリ等のセリ科植物、
レタス等のキク科植物等の双子葉植物等を挙げることが
できる。以上のようにして、本発明プロモーターの制御
下に目的の構造遺伝子がコードするタンパク質を発現す
る植物細胞及び植物体を得ることができる。
【００１４】本発明タンパク質は、例えば黒田五寸など
のニンジン（Daucus carota L.）に存在しており、しか
もその根部に最も多く存在している。分子量16kDで、配
列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、例えば配列番
号４で示される塩基配列（本願では、イントロンを含ん
だゲノムＤＮＡの塩基配列及びそれに対応するｃＤＮＡ
の塩基配列の両者ともに意味している）を有している。
例えば、このようなアミノ酸をコードする遺伝子を、例
えば、本発明プロモーターを利用する前記方法に準じて
根部で高発現させることにより、栄養素を高めたニンジ
ンの作出が可能になる。また同様に他の根菜作物、例え
ばダイコン、カブ、サトウダイコン、ゴボウ等の根部に
このようなアミノ酸をコードする遺伝子を高発現させる
ことにより、根部の栄養価を高めることが可能になる。
さらに本発明タンパク質をコードする塩基配列およびア
ミノ酸配列と相同性の高い遺伝子およびアミノ酸配列
を、EMBL、NBRF等のデータベースで検索することによ
り、例えば、1 ）病害抵抗性に関与するタンパク質の遺
伝子およびアミノ酸配列と相同性が高い場合には、本発
明タンパク質のアミノ酸配列をコードする領域を含む遺
伝子を用いた通常の遺伝子工学的手法により、植物自体
に病害抵抗性を付与したり、病害抵抗性機構の解明を行
うことができる、2 ）外界のストレス等によって、植物
ホルモンの含有量が変化して発現、誘導されるタンパク
質の遺伝子およびアミノ酸配列と相同性が高い場合に
は、本発明タンパク質をコードする領域を含む遺伝子を
用いた通常の遺伝子工学的手法により、ストレス応答、
ホルモン応答を利用した種々の品種改良ができる、3 ）
花粉アレルギータンパク質の遺伝子およびアミノ酸配列
と相同性が高い場合には、本発明タンパク質をコードす
る領域を含む遺伝子を用いた通常の遺伝子工学的手法に
より、花粉の改良、発現量を抑制した非アレルギー、ま
たは低アレルギー性の品種改良ができる、4 ）ヒートシ
ョックタンパク質の遺伝子およびアミノ酸配列と相同性
が高い場合には、本発明タンパク質をコードする領域を
含む遺伝子を用いた通常の遺伝子工学的手法により、有
用タンパク質のホールディングを補助して保存性を向上
させたり、有用タンパク質の輸送を改良させることがで
きる。
【００１５】つぎに本発明プロモーター、本発明ターミ
ネーター、及び本発明タンパク質遺伝子を単離する方法
について説明する。まず、葉部からゲノムDNA を調製
し、適当な酵素で部分分解後λファージ由来のベクター
アームに連結する。これをin vitroパッケージングして
ファージ粒子をつくらせ、さらに大腸菌に感染させて寒
天培地上にプラークを形成させる。これを回収し、ゲノ
ミックライブラリーとして遺伝子のスクリーニングに用
いる。ゲノムDNA の調製法には例えば、M.Shure et al
, Cell .35:225(1983)に記載されているCTAB法、S.O.R
ogers and A.J.Bendich , Plant.Mol.Biol.5:69(1985)
に記載されている尿素−フェノール法等が挙げられる。
λベクターには例えば、STRATAGENE社のλ FIX II 、λ
EMBL3 、λ EMBL4、λ DASH II等を用いることができ
る。in vitroパッケージングには例えば、STRATAGENE社
のGigapack packagingExtracts を用いることができ
る。ゲノミックライブラリーから本発明プロモーター、
本発明ターミネーター、及び本発明タンパク質遺伝子の
塩基配列を含むゲノミッククローンを選抜するには例え
ば、目的とする遺伝子に相当するcDNA、または目的とす
る遺伝子に似たcDNAを、RIや蛍光試薬でラベルしたプロ
ーブを用いたプラークハイブリダイゼーション等が有効
である。RIラベルには例えば、ベーリンガー社、宝酒造
のRandom Labelling Kit等を用いることができる。また
蛍光ラベルには例えば、アマシャム社のECL Direct Nuc
leic Acid Labelling and Ditection Systemを用いるこ
とができる。スクリーニングで得られた本発明プロモー
ター、本発明ターミネーター、及び本発明タンパク質遺
伝子の塩基配列を含むゲノミッククローンは、DNA 調製
や解析が容易なプラスミドベクター、例えば市販のpUC1
8 、pUC19 、pBLUESCRIPT KS+ 、pBLUESCRIPT KS- 等に
サブクローニングして、プラスミドDNA を調製し、Sang
er et a l, J.Mol.Biol. ,94:441（1975）、Sanger et
al , Proc.Natl.Acad.Sci. , 74:5463（1977）に記載さ
れているSanger法、Saiki et al.,Science,230:1350(19
85) に記載されているPCR 法を組み合わせたサイクルシ
ークエンス法を用いてその塩基配列を決定することがで
きる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例を挙げてさらに詳細に本発明を
説明する。尚、本発明はこれら実施例に限定されるもの
ではない。
【００１７】実施例１ （本発明タンパク質遺伝子の単
離） ニンジン葉部より調製したゲノムDNA を用いて、ゲノミ
ックライブラリーを作製した。既に取得しているcDNA断
片をプローブにしてこのゲノミックライブラリーをスク
リーニングし、2 つのポジティブクローンを取得した。
以下にそのスクリーニング方法について説明する。
【００１８】ステップ１ ニンジンゲノミックライブラ
リーの作製 （１）ニンジンゲノムDNA の調製 播種後６週目のニンジン葉部10g を液体窒素中で磨砕
し、5ml の2xCTAB液（2%Cetylt rimetyl ammonium brom
ide、100mM トリス- 塩酸緩衝液 pH8.0、20mM EDTA pH
8.0 、1.4M NaCl 、1% Polyvinylpyrrolidone ）に懸濁
後、55℃で10分間保温した。これに等量のクロロホルム
/ イソアミルアルコール（24:1）を加え、室温で30分穏
やかに混合した後、遠心分離し、上層、下層を分離し
た。ａ）上層には等量のクロロホルム/ イソアミルアル
コール（24:1）、ｂ）下層には等量の1xCTAB液（2xCTAB
液を滅菌蒸留水で2 倍に希釈したもの）を加え、室温で
10分間穏やかに混合、再度遠心分離し、ａ）、ｂ）両方
より上層を分取して混合した。これに1/10量の10％CTAB
液（10% Cetyltrimetyl ammonium bromide、0.7M NaC
l）、等量の沈澱バッファー（2% Cetyltrimetyl ammoni
um bromide 、50mMトリス- 塩酸緩衝液 pH8.0、10mM ED
TA pH8.0 ）を加え、穏やかに混合した後遠心分離し
た。得られた沈殿物を1MNaCl-TE （1M NaCl 、10mMトリ
ス- 塩酸緩衝液 pH8.0、1mM EDTA pH8.0）に懸濁、さら
に等量のイソプロパノールを加えて穏やかに混合し、遠
心分離し、得られた沈殿物を70% エタノールでリンスし
て軽く乾かし、TEに懸濁した。最終濃度10μg/mlになる
ようにRNase を加え、37℃で30分反応させた後、1/4 量
の4M酢酸アンモニウムと2 倍量の100 ％エタノールを加
え混合し、DNA を析出させた。このDNA を70% エタノー
ルでリンスして軽く乾かし、TE（10mMトリス- 塩酸緩衝
液 pH8.0、1mM EDTA pH8.0）に懸濁した。このDNA 溶液
を適当に希釈し、吸光度測定、アガロースゲル電気泳動
を行い、約 350μg のゲノムDNA が得られたことを確認
した。 （２）ゲノムDNA の部分分解とλベクターへの挿入 上記のようにして得られたゲノムDNA50 μg 分と終濃度
0.08U/μl のSau3AIを混合して37℃で50分間保温し、DN
A を部分分解した。溶液の一部を0.5%アガロースゲル電
気泳動により分画し、20-50kb のDNA 断片が多く含まれ
ることを確認した。このDNA 溶液に等量のフェノール/
クロロホルム/ イソアミルアルコール（25:24:1 ）を加
えてよく混合し、遠心分離後上層を分取した。このフェ
ノール/クロロホルム/ イソアミルアルコール（25:24:1
）処理をもう一度繰り返した後、得られた溶液に1/10
量の3M酢酸ナトリウムと2 倍量の100 ％エタノールを加
えよく混合し、-80 ℃で10分冷却して遠心分離した。沈
澱物を70％エタノールでリンスし、軽く乾かして、TEに
懸濁した。このDNA 溶液に167 μMdATP 、167 μMdGTP
を加え、終濃度0.05U/μl のKlenon（宝酒造）を添加し
て室温で15分反応させた。これに1/10量の10xSTE、等量
の1xSTE を加え混合した。等量のフェノール/ クロロホ
ルム/ イソアミルアルコール（25:24:1 ）を加えよく混
合し、遠心分離して上層を分取した。このフェノール/
クロロホルム/ イソアミルアルコール（25:24:1 ）処理
をもう一度繰り返し、得られた溶液に1/10量の3M酢酸ナ
トリウムと2 倍量の100 ％エタノールを加え、ー80℃で
10分冷却した後遠心分離した。得られた沈澱を70％エタ
ノールでリンスして軽く乾かし、TEに懸濁した。この溶
液の1 部とλ/FIXIIベクター（STRATAGENE）1 μg とを
加えた反応液（50mMトリスー塩酸緩衝液 pH7.5、70mM
MgCl2 、10mM DTT）を調製し、Ｔ4 DNA リガーゼ（宝酒
造）を添加して、16℃で1 晩反応させた。 （４）パッケージングとライブラリーの増幅 （３）の反応液を、GigapackII Gold packaging extrac
t （STARATAGENE ）を用いてパッケージングし、バンク
サイズ6x104 のゲノミックライブラリーを得た。37℃で
1 晩振とう培養した宿主大腸菌XL1-Blue MRA（P2）を、
菌体濃度がOD60 0 =0.5になるように10mM硫酸マグネシウ
ムに懸濁した。この菌液200 μl に10000pfuのファージ
を添加して、予め50℃に温めたトップアガーと共にNZY
プレートに蒔き、37℃で8 時間保温し、増殖してきたフ
ァージをSMバッファー（50mMトリス- 塩酸緩衝液 pH7.
5 、0.1 NaCl、7mM MgSO4 、0.01% ゼラチン）中に懸濁
させた。ファージの懸濁液を回収し、以下のスクリーニ
ングに用いた。
【００１９】ステップ２ ニンジンゲノミックライブラ
リーのスクリーニング （１）スクリーニング用フィルターの作製 NZY プレートに50000pfuのファージを蒔き、37℃で8 時
間培養した。このプレート上にナイロンフィルター Hyb
ond-N （アマシャム）を置き、1 分間静置してファージ
を吸着させた。次にフィルターをアルカリ処理（1.5NNa
Cl、0.5NNaOH、7 分）してファージを溶解させ、フィル
ターにDNA を結合させた後、中和処理（1.5NNaCl、0.5M
Tris-HCl pH8.0、3 分x2回）を行った。2xSSC （300mM
NaCl、30mMクエン酸）で5 分洗った後、風乾し、2 分間
UV照射することによりDNA をフィルターに固定した。こ
のように作製したフィルター12枚を用いて、以下のハイ
ブリダイゼーション反応を行った。 （２）プラークハイブリダイゼーション 上記のようにして作製したフィルターをハイブリバック
に入れ、ハイブリダイゼーション液（6xSSC/1% SDS/100
μg/ml Calfthymus DNA ）を入れて、45℃で2時間保温
し、プレハイブリダイゼーションを行った。本発明タン
パク質cDNA断片20-50ng を、ランダムラベリングキット
（ベーリンガーマンハイム）を用いて〔αー32P 〕dCTA
（0.74MBq 、アマシャム）でラベルし、プローブを調製
した。このプローブ300 万cpm 分、10mlのハイブリダイ
ゼーション液、フィルターをハイブリバックに封入し、
45℃で1 晩保温した。ハイブリダイゼーション反応後、
2xSSC/1%SDS 中、45℃で10分洗浄した。この洗浄を2 回
繰り返し、さらに2xSSC で軽くすすぎ、イメージングプ
レートに4 時間露光後、BAS2000 （富士フィルム）を用
いて解析した。シグナルが検出された位置に相当するプ
レートを5mm 角にくり抜き、500 μl のSMバッファーに
浸して、ファージを溶出させた。このファージ懸濁液か
ら1 プレート当たり数百pfu のファージを蒔き、37℃で
8 時間培養した。1 シグナルにつき2 プレートから上記
と同様にフィルターを作製し、〔αー 32P 〕dCTAでラベ
ルした本発明タンパク質cDNA断片をプローブにしてハイ
ブリダイゼーションを行った。イメージアナライザーで
検出されたシグナルの領域からファージを回収し、3 度
目のスクリーニングを上記の方法と同様に行い、本発明
タンパク質遺伝子を含むと予想されるファージクローン
2 つを単離した。このうち1 つのクローンについて、以
下の解析を行った。
【００２０】ステップ３ 本発明タンパク質遺伝子のサ
ブクローニングとシークエンス （１）ファージDNA の調製 1L三角コルベンにNZYM液体培地（NZY 液体培地に0.2%マ
ルトースを添加）を入れ、1 晩37℃で振とう培養した宿
主大腸菌XL-1 Blue MRA(P2) （STRAGENE製）を加え、37
℃、275rpmで振とう培養した。OD600 ＝0.1 になった
ら、5x1010pfu のファージを添加し、さらに培養を続け
た。1 時間おきにOD600 の値を測定し、宿主大腸菌が溶
菌したことを確認し、1.7ml のクロロホルムを加えて10
分撹拌した。このように調製したファージ液360ml か
ら、Lambda-trap （CLONTECH）を用いてファージDNA を
調製し、約21mgのファージDNA を取得した。 （２）サザンハイブリダイゼーションによる本発明タン
パク質遺伝子断片の同定 （１）で得られたファージDNA50ng 分を制限酵素NotI、
XbaI、SalI、それぞれ0.5Uで消化し、0.8%アガロースゲ
ル電気泳動を行い、DNA 断片を分画した。エチジウムブ
ロマイド染色によりゲル中のDNA の移動度を確認後、軽
く水でゆすぎ、0.25NHCl中で15分間振とうした。再び軽
く水でゆすぎ、1.5NNaCl/0.5NNaOH 中で30分間振とうし
た。このゲルをVacugene（ファルマシア）を用いて、ナ
イロンフィルターHybond-N（アマシャム）にブロッティ
ングした（1.5N NaCl/0.5NNaOH中、55気圧、1 時間）。
ブロッティングしたフィルターを2xSSC で5 分洗い、風
乾し、2 分間UV照射してDNA をフィルターに固定した。
このフィルターをプレハイブリダイゼーション液と共に
ハイブリバックに封入し、45℃で2 時間保温した。ステ
ップ２（２）のように調製した本発明タンパク質cDNAプ
ローブ300 万cpm 分を10ml のハイブリダイゼーション
液、フィルターをハイブリバックに封入し、45℃で1 晩
保温した。ハイブリダイゼーション反応後、2xSSC/1%SD
S 中、45℃ 10 分の洗浄を2 回繰り返し、2xSSC で軽く
すすぎ、イメージングプレートに2 時間露光後、BAS200
0 （富士フィルム）を用いて解析した。その結果、XbaI
で得られる1.5kb のDNA 断片に本発明タンパク質遺伝子
が含まれていることが明らかになった。 （３）本発明タンパク質遺伝子を含むDNA 断片のクロー
ニング pBluescript KS- ベクター（STRATAGENE製）を2 μg を
XbaI10U で完全消化した後、CIAP（宝酒造）で末端を脱
リン酸化させ、反応液と等量のフェノール/ クロロホル
ム/ イソアミルアルコール（25:24:1 ）を加えよく混合
し、遠心分離した。上清を分取し、1/10量の3M酢酸ナト
リウム、2 倍量の100%エタノールを加えて、よく混合し
た。-80 ℃で10分冷却後、遠心分離し、得られた沈澱を
軽く乾かしてTEに懸濁した。（１）で得られたファージ
DNA1μg 分をXbaI100Uで完全消化し、これと上記のよう
に調製したpBluescript KS- ベクター50ng分をライゲー
ションキット（宝酒造）で連結した。この反応液の一部
を大腸菌JM109 コンピテントセル（東洋紡）に添加し、
トランスフォーメーションを行い、アンピシリン50μg/
mlを含むLBプレートに蒔いた。37℃で1 晩培養後、コロ
ニーハイブリダイゼーションを行った。フィルターの作
製、プローブの調製、ハイブリダイゼーション、および
洗浄の方法はステップ２（１）（２）と同様である。た
だし、ハイブリダイゼーション、洗浄は65℃で行った。
イメージアナライザーで解析した結果、多数のポジティ
ブクローンが得られ、そのうちの18個のクローンから、
QIA-prep spin カラム（QIAGEN）を用いてプラスミドDN
A を調製した。このプラスミドDNA を、クローニングさ
れたＤＮＡ断片を切り出すのに適する制限酵素XbaIで消
化した後、0.8%アガロースゲルで分画、解析し、本発明
タンパク質遺伝子断片（1.5kb ）を含むクローン1 つ、
pCR16G1/Xb（図２参照）を選抜した。この選抜したクロ
ーンについて、Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Seque
ncing Kit （ABI）、蛍光シークエンサー（ABI ）を用
いて全塩基配列を決定した（配列番号１、４、５参
照）。その結果、このクローン中には、プロモーター領
域247bp （本発明プロモーター）、コーディング領域59
2bp （本発明タンパク質遺伝子）、およびターミネータ
ー領域836bp （本発明ターミネーター）が含まれている
ことが明らかとなった。
【００２１】実施例２ （本発明タンパク質の相同性） 実施例１で決定された本発明タンパク質遺伝子の塩基配
列（配列番号４参照）およびこれにコードされている本
発明タンパク質のアミノ酸配列（配列番号３参照）を、
データベースEMBLおよびNBRFで検索した。その結果、本
発明タンパク質遺伝子およびこれにコードされているア
ミノ酸配列は、セロリ、シラカバなどの花粉アレルゲン
タンパク質、パセリ、ジャガイモなどの病害抵抗性に関
与するPRタンパク質、エンドウ、ダイズなどの、外界か
らのストレスによって誘導されるタンパク質と高い相同
性を示した（図３参照）。最も相同性が高かったのは、
ニンジンと同じセリ科である、セロリのAPIg1 、パセリ
のPRタンパク質であるPR1-3 、PR1-1 、であった。ま
た、マウスのヒートショックタンパク質、HSP60 のmRNA
とも比較的高い相同性が認められた。
【００２２】実施例３ （ノザンハイブリダイゼーショ
ンよる本発明タンパク質遺伝子の発現パターンの解析） ニンジンの花部、葉部、根部それぞれ2gからISOGEN（日
本ジーン）を用いて全RNA を抽出し、さらにOligotex-d
T30 （宝酒造）を用いて、約40μg のmRNAを調製した。
このmRNA5 μg 分を1.2%変性アガロースゲル電気泳動で
分画し、10xSSC中、キャピラリーブロッティング法でナ
イロンフィルターHybond-N（アマシャム）にブロッティ
ングした。ブロッティング後、フィルターを風乾し、80
℃で2 時間ベーキングすることによってDNA を固定し
た。このフィルターをプレハイブリダイゼーション液に
浸して、45℃で2 時間保温した。pCR16G1/Xbを鋳型にし
て、3'ノンコーディング領域を増幅するプライマー （プライマー配列） 5'-GCTGA ACTTT CCACC GTGTT-3' 5'-GACAT CTCAT AGTTG AGACT C-3' を用いてPCR 反応（９４℃１分、５５℃１分、７２℃１
分を１サイクルとして３０サイクル）を行なった。この
際、〔αー32P 〕dCTPを添加することによってラベルを
入れ、これをプローブに用い、ステップ３（２）と同様
の方法でハイブリダイゼーションを行った。イメージア
ナライザーで解析し、本発明タンパク質遺伝子が根部で
高転写されていることを確認した。
【００２３】実施例４ （本発明プロモーターの取得） XhoIで完全消化し末端を脱リン酸化したpBluescript KS
- ベクター50ngと、XhoIで完全消化したファージゲノミ
ッククローンDNA1μg を、ライゲーションキット（宝酒
造）を用いて連結した。この反応液の一部を大腸菌JM10
9 コンピテントセル（東洋紡）100 μl に添加し、トラ
ンスフォーメーションを行い、アンピシリン100 μg/ml
を含むLBプレートに蒔いた。37℃で1 晩培養後、生育し
てきたクローンから、QIA-prep spin （QIAGEN）を用い
てプラスミドDNA を調製し、含まれているインサートDN
A の端、数百bpの領域をシークエンスした。その結果、
本発明タンパク質遺伝子のコーディング領域の一部とそ
の上流域約13kbを含むクローン、pCR16G1/Xh（図４参
照）を取得した。この中に含まれる本発明タンパク質遺
伝子のプロモーター領域（2kb ）について、Taq Dye De
oxy Terminator CycleSequencing Kit （ABI ）、蛍光
シークエンサー（ABI ）を用いてシークエンスを行った
（配列番号１参照）。
【００２４】実施例５ （本発明（発現）プラスミドの
構築） （１）本発明プロモーター（247bp ）の調製 プライマーにベクターの内部と本発明タンパク質遺伝子
ATG の上流数十bp （プライマー配列） 5'-GTAAA ACGAC GGCCA GT-3'（宝酒造） 5'-GGGCT AGCGA CCTTT AGAAT GTTTT TGC-3' を用い、pCR16G1/Xbを鋳型にしてPCR 反応（94℃ 1分、
40℃ 2分、72℃ 3分を１サイクルとして40サイクル）を
行い、本発明プロモーター（247bp ）を含むDNA断片を
増幅させた。尚、本発明タンパク質遺伝子ATG の上流プ
ライマーには、5’末端に予め制限酵素NheIの認識部位
をつけて合成したものを使用した。この反応産物に、等
量のクロロフォルム/ イソアミルアルコール（24：1 ）
を加えよく撹拌し、遠心分離して上清を分取した。1/10
量の3M酢酸アンモニウム、２倍量の100%エタノールを混
合し、遠心して得られた沈澱を、制限酵素XbaI、NheIで
完全消化した後、4%ポリアクリルアミド電気泳動により
分画した。目的の長さのDNA断片を含むようにゲルを切
り出し、Molecular Cloning 記載の方法に従ってDNA断
片を回収した。まずゲルを細かく刻み、抽出バッファー
に浸して37℃で5 時間保温後、遠心分離によりゲルの破
片を取り除いた。その溶液に2 倍量の100%エタノールを
加え、氷上で30分冷却後、遠心分離して得られた沈澱を
さらにTEに懸濁した。これに1/10量の3M酢酸アンモニウ
ム、2 倍量の100%エタノールを混合し、前記のようにエ
タノール沈澱を行った。得られた沈澱を再びTEに懸濁
し、4%ポリアクリルアミド電気泳動を行ってDNA 断片の
濃度を確認した。これを以下の本発明（発現）プラスミ
ドの構築に用いた。
【００２５】（２）本発明（発現）プラスミド（pCR16G
1/250-GUS ）の構築 バイナリーベクターpBI101（CLONTECH製）をXbaIで切断
してCIAP処理したものに、実施例により調製された本発
明プロモーター（247bp ）を連結し、大腸菌JM109 コン
ピテントセルにトランスフォームした。カナマイシン50
μg/mlを添加したLBプレート上で選抜し、生育してきた
クローンからプラスミドDNA を調製し、制限酵素で切断
することにより、本発明プロモーター（247bp ）を含有
するクローンの候補を取得した。このクローンについ
て、GUS 遺伝子コーディング領域内部の合成プライマー （プライマー配列） 5'-TCACG GGTTG GGGTT TCTAC-3' を用いてシークエンスを行い、プロモーター領域である
247bp 内にTaq ポリメラーゼによる塩基置換が起こって
いないことを確認した（図５参照）。
【００２６】（３）本発明（発現）プラスミド（pCR16G
1/EV-GUS）の構築 pCR16G1/XhoIをEcoRV で切断し、0.8%アガロースゲル電
気泳動により分画した。本発明プロモーター（247bp ）
を含むDNA 断片に相当するバンドを切りだし、ガラスビ
ーズ（バイオラッド）を用いてDNA 断片を回収した。回
収したDNA 断片について、そのDNA 濃度を0.8%アガロー
スゲル電気泳動により確認し、制限酵素SmaIで消化した
バイナリーベクターpBI101に連結した。これを大腸菌JM
109 コンピテントセルにトランスフォームし、カナマイ
シン50μg/mlを添加したLBプレート上で選抜した。生育
してきたクローンについてプラスミドDNA を調製し、制
限酵素切断でインサートの方向を調べ、順方向に挿入さ
れているクローンを取得した。このクローンを大量培養
し、QIAGEN tip-500カラム（QIAGEN）を用いて、プラス
ミドDNA を大量調製した。このプラスミドDNA をさらに
XbaIで消化して0.8%アガロースゲル電気泳動により分画
し、上記と同様にして1.75kb（前記247bp の上流域を含
む）のDNA 断片を回収した。これをCIAP処理し、制限酵
素XbaIで消化したpCR16G1 /250-GUS（NheIとXbaIの連結
部位は切断されなくなっている）と連結した。大腸菌JM
109 コンピテントセルにトランスフォームし、カナマイ
シン耐性クローンからプラスミドを調製し、制限酵素切
断により目的とする本発明プロモーター（2kb ）を含む
クローンを確認した。また、GUS コーディング領域内部
の合成プライマー （プライマー配列） 5'-TCACG GGTTG GGGTT TCTAC-3' を用いてプロモーター領域のシークエンスを行い、GUS
遺伝子のATG 上流約500bp についての構造を確認した
（配列番号２、図６参照）。
【００２７】（４）本発明（発現）プラスミド（pCR16G
1/H-GUS ）の構築 pCR16G1/XhoIをXbaIで切断し、本発明タンパク質遺伝子
のATG 上流域5kb を含むDNA 断片を上記（３）と同様に
回収した。これを制限酵素XbaIで消化したバイナリーベ
クターpBI101に連結し、コンピテントセルにトランスフ
ォームし、順方向にインサートが挿入されているクロー
ンを得た。このクローンをさらにHindIII で消化し、セ
ルフライゲーションさせ、トランスフォーメーションを
行い、得られたクローンについてHindIII 切断部位が1
つになっていることを確認した。このプラスミドDNA を
XbaIで消化し、前記のようにして調製した本発明プロモ
ーター（247bp ）を連結した。この本発明プロモーター
（247bp ）が順方向に挿入されているクローンについ
て、プラスミドを調製し、上記と同様に、GUS コーディ
ング領域内部の合成プライマー （プライマー配列） 5'-TCACG GGTTG GGGTT TCTAC-3' を用いてシークエンスを行い、GUS 遺伝子のATG 上流約
500bp についての構造を確認した（図７及び８参照）。
これにより、連結部とその周辺部の構造が変化していな
いことが確認できた。
【００２８】実施例５ （本発明植物細胞及び植物体の
作製） トランスジェニック植物の作製は、S.B.Gelvin、R.A.Sc
hilperoort and D.P.S.Verma著；Plant Molecular Biol
ogy/Manual（1988）（Kliwer Academic Publishers発
行、Valvekens et al.Proc.Natl.Acad.Sci.,85:5536-55
40（1988）に記載してある方法に準じて行った。YEB 培
地中、30℃で一晩振とう培養したアグロバクテリウム菌
LBA4404 を、新たなYEB 培地に植え継ぎ、OD600 =0.6に
なるまで培養した。以下の操作は、低温室にて行った。
この培養液から、遠心して菌体を集め、冷やしておいた
滅菌蒸留水で懸濁後、再度遠心して集菌した。この洗い
を2 回繰り返し、さらに滅菌蒸留水を10% グリセロール
溶液に変えて同様の操作を行った。こうして得られた菌
体を最終的に400 倍濃縮になるように10% グリセロール
溶液に懸濁した。このコンピテントセルに、上記のよう
にして構築した3 種のTiプラスミド発現ベクター（以
下、pCR16G1/250-GUS 、pCR16G1/EV-GUS、pCR16G1/H-GU
S と記す。）を、エレクトロポレーション法を用いて導
入し、カナマイシン50μg/mlを含むYEB プレート上で選
抜した。生育してきたカナマイシン耐性クローンからア
ルカリ-SDS法によりプラスミドDNA を調製し、0.8%アガ
ロースゲル電気泳動、エチジウムブロマイド染色によ
り、Tiプラスミド発現ベクターが導入されていることを
確認した。このアグロバクテリウム菌（pCR16G1/250-GU
S/LBA4404 、pCR16G1/EV-GUS/LBA4404、pCR16G1/H-GUS/
LBA4404 ）をカナマイシン50μg/m を含むYEB 液体培地
中、30℃で2 晩振とう培養した。無菌播種後、23℃で2-
3 週間生育させたアラビドプシスの根を1cm 程度に切断
し、CIM プレートで2 日間培養したものを、30℃で2 晩
振とう培養したアグロバクテリウム培養液（pCR16G1/25
0-GUS/LBA4404 、pCR16G1/EV-GUS/LBA4404、pCR16G1/H-
GUS/LBA4404 ）に浸し、再びCIM プレート上で培養し
た。2 日後、根部切片をSIMC培地に移し、さらに2 日
後、SIMCK 培地に植え継いだ。約１カ月経って再生して
きたシュートを切断してRIM 培地に植え替え、発根させ
た。発根した個体を土壌、またはロックウールに植え、
人工気象器で育てて自殖種子を得た。無菌培養したタバ
コの葉部切片をＭＳ液体培地に浸し、その中に30℃でで
1 晩培養したアグロバクテリウム菌（pCR16G1/250-GUS/
LBA4404 、pCR16G1/EV-GUS/LBA4404、pCR16G1/H-GUS/LB
A4404 ）を添加して、暗所、25℃で２日間共存培養し
た。培養後、MS液体培地で葉部切片を洗浄し、MS-NBCK
培地上に置いた。これを明所、25℃で約１カ月程度静置
培養し、再生してきたシュートを葉部切片本体より切断
し、MS-CK 培地に植え継いだ。約１カ月後、発根してき
た個体について土壌に植え替え、温室で育てて自殖種子
を得た。
【００２９】実施例６ （本発明植物体における導入遺
伝子の確認） 実施例５で得られたトランスジェニックアラビドプシス
の種子を1%次亜塩素酸で５分間滅菌し、滅菌蒸留水で3-
5 回洗浄した後、カナマイシン20μg/mlを含むMS培地で
無菌発芽させた。カナマイシン耐性を示した個体からロ
ゼット葉を4-5枚をとって、CTAB法によりゲノムDNA を
調製した。このDNA50ng を鋳型にし、プライマーとして
レポーター遺伝子であるGUS 遺伝子の内部とGUS 遺伝子
のATG から250bp 上流付近（本発明プロモーター内部）
の組合せ、 （プライマー配列） 5'-TCTGC ATCGG CGAAC TGATC-3' 5'-ACAAA CACAG CACTA ACTTT TC-3' さらにＧＵＳ遺伝子内部とＮＯＳターミネーター内部の
組合せ （プライマー配列） 5'-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C-3' 5'-CATGC TTAAC GTAAT TCAAC AG-3' を用いてPCR 反応（94℃1 分、55℃2 分、72℃3 分を1
サイクルとして40サイクル）を行い、PCR 産物の一部を
0.8%アガロースゲル電気泳動で分画し、目的とするDNA
断片（導入遺伝子）の増幅を確認した。トランスジェニ
ックタバコについても種子を2.5%次亜塩素酸/0.002%Tri
ton X-100 で5 分間滅菌し、滅菌水で4-5 回洗浄した。
これをカナマイシン100 μg/mlを含むMS培地で無菌発芽
させた。カナマイシン耐性を示した中から1 個体を用い
て、CTAB法によりゲノムDNA を調製し、アラビドプシス
の方法と同様な方法、即ち、カナマシン耐性を示した中
から１個体を用いて、CTAB法によりゲノムDNA を調製し
た。このDNA50ng を鋳型にし、プライマーとして、ＧＵ
Ｓ遺伝子内部とＧＵＳ遺伝子ＡＴＧから２５０ｂｐ上流
付近（本発明プロモーター内部）の組合せ、 （プライマー配列） 5'-TCTGC ATCGG CGAAC TGATC-3' 5'-ACAAA CACAG CACTA ACTTT TC-3' さらに、ＧＵＳ遺伝子内部とＮＯＳターミネーター内部
の組合せ （プライマー配列） 5'-ACATG TGGAG TGAAG AGTAT C-3' 5'-CATGC TTAAC GTAAT TCAAC AG-3' を用いてPCR 反応（94℃１分、55℃2 分、72℃3 分を1
サイクルとして40サイクル）を行い、PCR 産物の一部を
0.8 ％アガロースゲル電気泳動で分画し、目的とするDN
A 断片（導入遺伝子）の増幅を確認した。
【００３０】実施例７ （導入遺伝子の発現パターンの
確認） 実験例５で得られた本発明植物体（本発明発現プラスミ
ド：pCR16G1/250-GUS、pCR16G1/EV-GUS、pCR16G1/H-GUS
、及び対照としてpBI121（CLONTECH製）、pBI101を含
む。）の実生の葉と根におけるGUS 染色及びGUS 活性の
測定をPlant Mol.Biol.Rep.5:387-405(1987)記載の方法
に準じて行った。尚、 GUSの活性測定は、4-メチルウン
ベリフェリルグルクロン酸を基質とした蛍光法で、活性
染色は 5- ブロモ-4- クロロ-3- インドリル- β-D- グ
ルクロン酸（X-Gluc）を基質として青色色素（インジゴ
チン）の沈着量を測定した。 （1 ）GUS 染色 トランスジェニックアラビドプシスの種子を、カナマイ
シン20μg/mlを含むMS培地で無菌発芽させ、カナマイシ
ン耐性を示した個体を３週間生育させた。根を傷つけな
いように植物体を抜き、GUS 染色液（1 mM X-Gluc 、0.
5 mM K3 Fe(CN) 6 、0.5 mM Fe4 Fe(CN)6 、0.3% Trito
n X-100 ）に浸して37℃で１晩反応させた。反応後、10
0%エタノールで数回洗浄して脱色し、染色パターンを観
察した。その結果、いずれの本発明植物体においても導
入遺伝子の産物が維管束、中でも根部における維管束に
おいて高発現していることを確認した（図９、１０参
照）。またその発現の強さにおいて、pCR16G1/H-GUS を
導入した本発明植物体が最も強い発現を示した（表１参
照）。トランスジェニックタバコの種子をカナマイシン
100 μg/mlを含むMS培地で無菌発芽させ、１週間後、３
週間後、１カ月後にカナマイシン耐性の植物体を引き抜
き、GUS 染色液に浸して37℃で１晩反応させた。これを
100%エタノールを用いて脱色し、その染色パターンを観
察した。その結果、トランスジェニックアラビドプシス
での発現と同様な傾向を示すことが確認できた。また成
長段階が進むにつれて、その染色が強くなる傾向も認め
られた。 （2 ）GUS 活性測定 トランスジェニックタバコ種子をカナマイシン100 μg/
mlを含む培地で無菌発芽させ、25℃で1 カ月培養した。
根部0.8g、葉部0.5gを乳鉢にとり、それぞれ1ml 、0.5m
l の抽出バッファー（50mMリン酸緩衝液 pH7.0、10mM E
DTA 、0.1% Triton X-100 、0.1 % Sarcosyl、10mMメル
カプトエタノール）を添加し、海砂を適当量加え摩砕し
た。この摩砕液をエッペンドルフチューブに移して遠心
分離し、上清を分取した。この液10-70 μl 分を500 μ
l の反応基質液（50mMリン酸緩衝液 pH7.0、10mM EDTA
、0.1% Triton X-100 、0.1% Sarcosyl 、10mMメルカ
プトエタノール、1mM 4-methylumberlifer- β-D-glucu
ronide）に添加し、37℃で反応させた。反応後、一定時
間おきに100 μl をサンプリングし、直ちに900 μlの
反応停止液（0.2M炭酸ナトリウム溶液）と混合した。こ
のように調製したサンプルを分光蛍光光度計（日立製作
所 F-2000 ）で測定した。この測定値と葉部、根部の抽
出液のタンパク質濃度からGUS 活性を算出した。タンパ
ク質濃度の定量はBIO-RAD 社のProtein assay reagent
を用いた方法で行った。その結果、本発明植物体では根
部において高いGUS 活性が検出された（表２参照）。
【００３１】
【表１】 各種プロモーターを導入したトランスジェニックタバコの根におけるGUS 活性 比較 ────────────────────────────── 導入遺伝子 GUS 活性比 ────────────────────────────── pCR16G1/250-GUS １２１ pCR16G1/EV-GUS ４０１ pCR16G1/H-GUS ３０５ ────────────────────────────── pBI101（no promoter-GUS ） １００ ─────────────────────────────── * 比はpBI101の根部におけるGUS 活性を１００として計算した値である。
【００３２】
【表２】 各種プロモーターを導入したトランスジェニックタバコの組織別のGUS 活性比 較 ────────────────────────────── 導入遺伝子 GUS 活性比 葉部 根部 ────────────────────────────── pCR16G1/250-GUS １ ５６ pCR16G1/EV-GUS １ ３４ pCR16G1/H-GUS １ ２４５ ────────────────────────────── pBI121（35S promoter-GUS） １ ４ ─────────────────────────────── * 比は葉部におけるGUS 活性を１として計算した値である。
【００３３】実施例において用いられた培地の組成を以
下に示す。 （１）タバコ用培地 ａ）MS寒天培地 MURASHIGE AND SKOOG(Flow Laboratories)4.4g、ショ糖
30g を蒸留水 1 Lに溶かし、1M KOHで pH 5.8 に調製
し、ジェランガム（和光純薬）を3g添加した後、オート
クレーブ滅菌した。 ｂ）MS-NBCK 寒天培地 MS寒天培地に、1-ナフタリン酢酸（NAA ）0.1 μg/ml、
6-ベンジルアミノプリン（BA）1.0 μg/ml、カナマイシ
ン20μg/ml、クラフォラン300 μg/mlを添加した培地で
ある。 ｃ）MS-CK 寒天培地 MS寒天培地にカナマイシン100 μg/ml、クラフォラン30
0 μg/mlを添加した培地である。 （２）アラビドプシス用培地 ａ）MS寒天培地 MURASHIGE AND SKOOG(Flow Laboratories)4.4g、ショ糖
20g を蒸留水 1 Lに溶かし、1M KOHで pH 6.3 に調製
し、ジェランガム（和光純薬）を2g添加した後、オート
クレーブ滅菌した。 ｂ）CIM 寒天培地 MS寒天培地に、2,4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D ）
0.5 μg/ml、カイネチン0.05μg/mlを添加した培地であ
る。 ｃ）SIMC寒天培地 MS寒天培地にN6- ［２- イソペンテニル］アデニン（2-
Pi）5 μg/ml、インドール酢酸（IAA ）0.15μg/ml、ク
ラフォラン300 μg/mlを添加した培地である。 ｄ）SIMCK 寒天培地 SIMC培地にカナマイシン20μg/mlを添加した培地であ
る。 （３）細菌、ファージ用培地 ａ）L-培地 バクトトリプトン（Difco ）10g 、バクトイーストエキ
ストラクト（Difco ）5g、NaC l 10g を蒸留水 1 Lに溶
かし、5M NaOH で pH 7.0 に調整し、オートクレーブ滅
菌する。プレートの場合はこれに15g の寒天を添加す
る。 ｂ）YEB 培地 バクトビーフエキストラクト（Difco ）5g、バクトイー
ストエキストラクト（Difco ）1g、ポリペプトン5g、シ
ョ糖5g、10M NaOH 0.2mlを蒸留水 1 Lに溶かし、オート
クレーブ滅菌する。オートクレーブ後、フィルター滅菌
した1M MgSO4を0.2ml 添加して用いる。プレートの場合
はこれに15g の寒天を添加する。 ｃ）NZY 培地 イーストエキストラクト5g、NZアミン10g 、NaCl 5g 、
MgSO4 ・7H2O2gを蒸留水1Lに溶かし、5M NaOH で pH 7.
5 に調整し、オートクレーブ滅菌する。プレートの場合
はこれに15g の寒天（Difco ）を添加しておく。 ｄ）トップアガー NZY 培地100ml にのAgarose-II（Dojin ）0.7gを添加し
たものである。
【００３４】
【発明の効果】本発明プロモーターを利用することによ
り、植物の維管束（特に根部における維管束）において
目的とするタンパク質を高発現させることが可能になっ
た。
【００３５】
【配列表】
配列番号１ 配列の長さ：２４７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列の特徴 起源 生物名：ニンジン（Daucus carota L.） 品種名：黒田五寸 特徴を表す記号：promoter 存在位置：1..247 配列 TTCTAGAATA TATCTTTTGA AATTTCAACA AACACAGCAC TAACTTTTCT TTTAACAGAT 60 TAGAATCGTT TCCTAAACTT TTAAAATTAA AAAATACATT ACTATAATAT TTATCAACAC 120 CTCAACATTC ATGTTAGCGT ACTATAAATA GGTGCTCTTG GTGCTCTACT ATCATCACAT 180 CAATCTTCCA GCACAAACCT TGAGCTTAAT CTTTCTACTA ATTTTTAGCA AAAACATTCT 240 AAAGGTC 247
【００３６】配列番号２ 配列の長さ：2042 配列の型：核酸 鎖の数：1 本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列の特徴 起源 生物名：ニンジン（Daucus carota L.） 品種名：黒田五寸 特徴を表す記号：promoter 存在位置：1..2042 配列 TCTCGGGCCA CTTTCAAGGA TAAAAGCACC GGGAAGAACG AGAAATCCGT AGTTCCGTGG 60 AATTGAGATC TAAGAAAAGA AGGCCAAATC GGAAAAGGTT TTGAATCCTT AGATCCGGAA 120 AAACAAATGC CAAAGAAGTT TTATTGGAAG AAAAAAGCAA ACACAAAAGA AGAGAAATAA 180 AAAATTTTGG GGCTTTCCAC CGGTAATGGA AGAATATGCA CAAAAATTCA CGCCAACAGA 240 GTCCTTACTT AACTCTCACC TTTTGCACAC TCTTTCTCAT ATTTTTTTTT ATCTTTTTGT 300 TCAAAAAATT TGAATATAAT ATAATAATAA TAATAATAAT AATAATAATA ATAATAATAA 360 TAATAATAAT AATAATAATA ATAATAATAA TAATAATAAT AGGGAAGGCA AATAGGGATC 420 ATTGTTCGAG TTGTCAATCA ATACGGAGTC AATTGAAGTG TTATATATTT AGGATACCTT 480 CTTATTACAC AGCTGGAGAT GTTCTAGTCT ATCGAACTTA AAATTCCTCC AAATACAAAA 540 TATTTCTTAT GAAGAGCATC AACAGAATAA TTTCCAACTA ACACCCAATC GAGAAAGAGA 600 TTGATGCTTA TTGCCCAGTT TGTAATGCTG AAGCAGAGAC TACTCTTCAT GCGTTCGTTA 660 CACCTCATCA GTTCGCTAAT TACAAGACTT ATTGGGATAG TGTTGAGAGT CTAATTACAG 720 CTACAGAGCA TGCTTCCTTT TTAGAATGGT TGAGCAATAC TTTCAACCAG GTGAAGAGTT 780 AAATCGGAGG GTAATGCTAA GTTGGGCCCT ATGGAAGAAC TGAAATGAGT TAGTGTGGCA 840 CCAAAGTATT ATGGAAATTA CAGGGGTGAC ATGTCTGCAC AACGGGCCCT TATACAACAC 900 TTTGGGCATG TTTGGGAAAG ACAGCTTATG GCTTTTTTTA TAAAGAGTCA GCTTCTACTT 960 CTCTTGACCC GTTTGTGTAA AAGGTTAGAA GCACTTAAAA AAAACCGACA ATACTAACTT 1020 TAGTTTCACG ACTTCTGCTT CTTTCCCAAA CAATTTAATC ACTTATAAAT CTTAATTTAC 1080 TTCTTACTTC TGGTGCACTT CTTTACTTTA TGCAAGAGAC ACTTTTTTTA AGTTTAACCA 1140 AACGACCCTT TCTCATCCCT TGTTCGAGTA GTCGAAGAAT GCAAAGAGAA GTAAGAATCA 1200 GCAGGTGTCA CTACAGTTTG CAAAATGACA CGCAAATAAA GTAGCCCACC GCTCAGTGAG 1260 ATATTGATTC TACCATTGAT CGTGTTTGGT GTGTAGATGA TGCACACATG GACTTCATTC 1320 ACGTAATGTT GAACGATTTG ATAAATTAGT GAAATTTCAT TTCTTGGGCA AAAAAAGTCC 1380 CAAAGTCTAT ATAGGTTCTA AGTGAAACCA ACTCCTAAAT TATACAGCTA AATTGAGCAT 1440 CAGTGGAATC CATCTTCTCA ATTATAAATG CAAATAGAAT TAGTACATAT AACTAGAATT 1500 TAAATTAACA TATGTAATTC ATGTAACGGT CTACATCGCA TGAAATTATT TATCTGAATG 1560 ATAACATCTT TGTAAACAAA ACTGGGCCAA ATAGGACCAT AACCAAGTTC ACGTGTATTC 1620 TAAAATGTTA ATACTAACAT GAGTATTTTC TTTTCAAGGT ATAAGTTAAT TCTTCAATCA 1680 ATTAACTTTA AATTTGGACA TTATTGAGCA ACTTTATGCC CACGTTGTAT TGTTTAAACA 1740 ACGTTTGTCC GGTGTATATT TATGACCTTT CAACTCAAGC TAGCCAGTGA ATGCTTTCTA 1800 GAATATATCT TTTGAAATTT CAACAAACAC AGCACTAACT TTTCTTTTAA CAGATTAGAA 1860 TCGTTTCCTA AACTTTTAAA ATTAAAAAAT ACATTACTAT AATATTTATC AACACCTCAA 1920 CATTCATGTT AGCGTACTAT AAATAGGTGC TCTTGGTGCT CTACTATCAT CACATCAATC 1980 TTCCAGCACA AACCTTGAGC TTAATCTTTC TACTAATTTT TAGCAAAAAC ATTCTAAAGG 2040 TC 2042
【００３７】配列番号３ 配列の長さ：１５７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列の特徴 起源 生物名：ニンジン（Daucus carota L.） 品種名：黒田五寸 特徴を表す記号：peptide 存在位置：1..154 配列 1 5 10 15 Met Gly Ala Gln Ser His Ser Leu Glu Ile Thr Ser Ser Val Ser Ala 20 25 30 Glu Lys Ile Phe Ser Gly Ile Val Leu Asp Val Asp Thr Val Ile Pro 35 40 45 Lys Ala Ala Pro Gly Ala Tyr Lys Ser Val Asp Val Lys Gly Asp Gly 50 55 60 Gly Ala Gly Thr Val Arg Ile Ile Thr Leu Pro Glu Gly Ser Pro Ile 65 70 75 80 Thr Ser Met Thr Val Arg Thr Asp Ala Val Asn Lys Glu Ala Leu Thr 85 90 95 Tyr Asp Ser Thr Val Ile Asp Gly Asp Ile Leu Leu Gly Phe Ile Glu 100 105 110 Ser Ile Glu Thr His Leu Val Val Val Pro Thr Ala Asp Gly Gly Ser 115 120 125 Ile Thr Lys Thr Thr Ala Ile Phe His Thr Lys Gly Asp Ala Val Val 130 135 140 Pro Glu Glu Asn Ile Lys Phe Ala Asp Ala Gln Asn Thr Ala Leu Phe 145 150 154 Lys Ala Ile Glu Ala Tyr Leu Ile Ala Asn
【００３８】配列番号４ 配列の長さ：５９３ 配列の型：核酸 鎖の数：2 本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列の特徴 起源 生物名：ニンジン（Daucus carota L.） 品種名：黒田五寸 特徴を表す記号：CDS 存在位置：1..593 特徴を表す記号：intron 存在位置：184..311 配列 1 5 10 15 ATG GGT GCC CAG AGC CAT TCA CTC GAG ATC ACT TCT TCA GTC TCC GCA 48 20 25 30 GAG AAA ATA TTC AGC GGC ATT GTC CTT GAT GTT GAT ACA GTT ATC CCC 96 35 40 45 AAG GCT GCC CCT GGA GCT TAC AAG AGT GTC GAT GTT AAA GGA GAT GGT 144 50 55 60 GGA GCT GGA ACC GTC AGA ATT ATC ACC CTT CCC GAA GGT 183 TAGTTATATA TCTCACCCCA TCTTGTTGAT GTATCATTTC TGATACCATA TTAATTTGAG 243 GGGATTATTT CCCGACATTG TACAATTAAT AAATTTTTTG AATACATATA TAATTCTCTG 303 CTGCAGGT 311 65 70 75 AGC CCG ATC ACC TCA ATG ACG GTT AGA ACT GAT GCA GTC AAC AAG GAG 359 80 85 90 GCC TTG ACA TAC GAC TCC ACC GTT ATT GAT GGA GAC ATC CTT TTA GGC 407 95 100 105 TTC ATC GAA TCC ATT GAA ACC CAT CTT GTC GTT GTG CCA ACT GCT GAC 455 110 115 120 125 GGG GGT AGC ATT ACC AAG ACC ACG GCC ATA TTC CAC ACT AAA GGT GAT 503 130 135 140 GCC GTC GTT CCT GAA GAG AAC ATC AAG TTT GCA GAT GCT CAG AAC ACC 551 145 150 155 GCT CTC TTC AAA GCT ATC GAG GCC TAC CTC ATT GCT AAC TAA 593
【００３９】配列番号５ 配列の長さ：８３６ 配列の型：核酸 鎖の数：2 本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ゲノムDNA 配列の特徴 起源 生物名：ニンジン（Daucus carota L.） 品種名：黒田五寸 特徴を表す記号：terminator 存在位置：1..836 配列 GCTGAACTTT CCACCGTGTT TTAATAATCT GTCGTTTTTA AATTTATGGG AAGAGCGCCA 60 AAGATGCCTC AACTTCATAA TTTTATGAGC GGGCGAtAGA ATTGCAACTT TTTCTTTGTA 120 CTCTGTTTTA ATGAGCAATT TCATTTGGTA ACAATATGTG TAATCTTTTT AAATAAAATA 180 TAGTACCGAC ATTAATGTAA TCTTTCTGGA TCATCTGTGC TTTCATATGT TACTTATATT 240 TTTTAGTTAA AAATGTAATT CACTTGAACC TTAATGATAT ATAGGTCATC CCAATTAATT 300 AATTTCAAGT TTCGGTTTGA AATTAGAAAG AGTAAAGAAT TTGTAGTATG AACGATGAGT 360 CGATGACAGA AAAAAGAAGC TTGCAGTGTC CCAAAAAGAT AAATTTAATT ATTTCATTAA 420 GTGAGAATGA TAAGACTCAG TAAACCTCCT CAGTTAGTCC ATCCAACCCT TATAAGCCTG 480 ATAACTGGTG ATTAATTGTA ATGATGTTTT ATTACTATGG GGCAGTTTGG CTGGACTTAA 540 AAAAAGTGAC TTATTGCTTA AAATAAATAA GTAGATTATA AGTGAAAAGT TGATTTGGAC 600 TTATAAGTTA TTAAAAGTGT TTGAATATAT ATTGATTATA AGTGATAGAA GAAGCTAAAT 660 CCCCAAAATA AGCTAGGTTT CCTAACTTCT TTTTTGGGGC TTTTAAGCTT CAATATAAGT 720 GCTTCTCATA ATTAGCCAAA CACCTCCATT TAAGTAGAAG TCGACTTCTA TGTTAAAAAA 780 GCTCCGAAGT CGGTTTGCCA AACACCCCCT ATATGGGTCT ATTCTTGGCA TCTAGA 836
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明（発現）プラスミドであるpCR1
6G1/250-GUS 、pCR16G1/EV-GUS、pCR16G1/H-GUS を示す
図である。
【図２】図２は、本発明タンパク質遺伝子プラスミドで
あるpCR16G1/Xbを示す図である。
【図３】図３は、本発明タンパク質のアミノ酸配列と種
々のタンパク質のアミノ酸配列との比較を示す図であ
る。
【図４】図４は、本発明プラスミド（本発明タンパク質
遺伝子の一部と本発明プロモーターを含有するプラスミ
ド）であるpCR16G1/Xhを示す図である。
【図５】図５は、pBI101から本発明（発現）プラスミド
であるpCR16G1/250-GUS を構築する工程を示す図であ
る。
【図６】図６は、pBI101、pCR16G1/250-GUS から本発明
（発現）プラスミドであるpCR16G1/EV-GUSを構築する工
程を示す図である。
【図７】図７は、pBI101から本発明（発現）プラスミド
であるpCR16G1/H-GUS を構築する工程を示す図である。
【図８】図８は、本発明プロモーターであり、XhoI(0k
b),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV(2.3kb),EcoRI(3kb),
SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限酵素サイトを有する
領域（約４Ｋｂｐ）を示す図である。
【図９】図９は、本発明プロモーターにより植物の維管
束において目的とするタンパク質が高発現していること
を染色により視覚化した（生物の形態を示す）図であ
る。維管束部が染色された結果、図では白抜き表示され
ている。尚、図では黒表示が非染色域であり、白抜き表
示が染色域である。
【図１０】図１０は、本発明プロモーターにより植物の
維管束において目的とするタンパク質が高発現している
ことを染色により視覚化した（生物の形態を示す）図で
ある。維管束部が染色された結果、図では白抜き表示さ
れている。尚、図では黒表示が非染色域であり、白抜き
表示が染色域である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】配列番号１で示される塩基配列である領域
    （約２５０ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモ
    ーター。
  2. 【請求項２】配列番号２で示される塩基配列である領域
    （約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモー
    ター。
  3. 【請求項３】XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV
    (2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限
    酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋ
    ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであ
    って、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域
    の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーター。
  4. 【請求項４】配列番号１で示される塩基配列である領域
    （約２５０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモー
    ターを有することを特徴とするプラスミド。
  5. 【請求項５】配列番号２で示される塩基配列である領域
    （約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモー
    ターを有することを特徴とするプラスミド。
  6. 【請求項６】XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV
    (2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限
    酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋ
    ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであ
    って、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域
    の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーターを有す
    ることを特徴とするプラスミド。
  7. 【請求項７】配列番号１で示される塩基配列である領域
    （約２５０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモー
    ター及び目的の構造遺伝子を有することを特徴とするキ
    メラ遺伝子。
  8. 【請求項８】配列番号２で示される塩基配列である領域
    （約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモー
    ター及び目的の構造遺伝子を有することを特徴とするキ
    メラ遺伝子。
  9. 【請求項９】XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),EcoRV
    (2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制限
    酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４Ｋ
    ｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターであ
    って、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領域
    の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーター及び目
    的の構造遺伝子を有することを特徴とするキメラ遺伝
    子。
  10. 【請求項１０】配列番号１で示される塩基配列である領
    域（約２５０ｂｐ）を含む植物細胞で機能可能なプロモ
    ーター、目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能
    なターミネーターを有することを特徴とするプラスミ
    ド。
  11. 【請求項１１】配列番号２で示される塩基配列である領
    域（約２Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモ
    ーター、目的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能
    なターミネーターを有することを特徴とするプラスミ
    ド。
  12. 【請求項１２】XhoI(0kb),XbaI(0.3kb),EcoRV(2kb),Eco
    RV(2.3kb),EcoRI(3kb),SmaI(3.6kb),HindIII(4kb) の制
    限酵素サイトを有するニンジン遺伝子由来の領域（約４
    Ｋｂｐ）を含む植物細胞内で機能可能なプロモーターで
    あって、該領域（約４Ｋｂｐ）のうちの約２Ｋｂｐの領
    域の塩基配列が配列番号２で示されるプロモーター、目
    的の構造遺伝子、及び植物細胞内で機能可能なターミネ
    ーターを有することを特徴とするプラスミド。
  13. 【請求項１３】図１で示されることを特徴とするプラス
    ミド。
  14. 【請求項１４】請求項４、請求項５又は請求項６記載の
    プラスミドを含有することを特徴とする微生物。
  15. 【請求項１５】請求項７、請求項８又は請求項９記載の
    キメラ遺伝子を含有することを特徴とする微生物。
  16. 【請求項１６】請求項１、請求項２又は請求項３記載の
    プロモーターの制御下で目的の構造遺伝子がコードする
    タンパク質を発現することを特徴とする植物細胞。
  17. 【請求項１７】請求項７、請求項８又は請求項９記載の
    キメラ遺伝子を含有することを特徴とする植物細胞。
  18. 【請求項１８】請求項１、請求項２又は請求項３記載の
    プロモーターの制御下で目的の構造遺伝子がコードする
    タンパク質を発現することを特徴とする植物体。
  19. 【請求項１９】請求項７、請求項８又は請求項９記載の
    キメラ遺伝子を含有することを特徴とする植物体。
  20. 【請求項２０】請求項１、請求項２又は請求項３記載の
    プロモーターの下流に、目的とする構造遺伝子を連結す
    ることを特徴とするキメラ遺伝子の作製方法。
  21. 【請求項２１】配列番号３で示されるアミノ酸配列を有
    する分子量16kDのタンパク質。
  22. 【請求項２２】配列番号３で示されるアミノ酸配列をコ
    ードする塩基配列を有する分子量16kDのタンパク質遺伝
    子。
  23. 【請求項２３】配列番号４で示される塩基配列を有する
    分子量16kDのタンパク質遺伝子。
  24. 【請求項２４】請求項２３記載の遺伝子を含有すること
    を特徴とするプラスミド。
  25. 【請求項２５】配列番号５で示される塩基配列である領
    域を含む植物細胞内で機能可能なターミネーター。
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