JPH04229182A - 新規シグナル配列 - Google Patents

新規シグナル配列

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JPH04229182A
JPH04229182A JP3170549A JP17054991A JPH04229182A JP H04229182 A JPH04229182 A JP H04229182A JP 3170549 A JP3170549 A JP 3170549A JP 17054991 A JP17054991 A JP 17054991A JP H04229182 A JPH04229182 A JP H04229182A
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JP
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plant
dna
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gene
dna sequence
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Application number
JP3170549A
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English (en)
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Thomas Boller
トーマス　ボーレル
Jean-Marc Dr Neuhaus
イエン−マルク　ノイハウス
John Dr Ryals
ジョン　ライアルズ
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Novartis AG
Original Assignee
Ciba Geigy AG
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【産業上の利用分野】本発明は、新規なペプチド断片（
標的性シグナル）に関し、より詳しくは、植物液胞タン
パク質のＣ末端領域（Ｃ末端範囲）から得られ、かつあ
らゆる所望のタンパク質分子と操作可能に結合されて、
それらのペプチド断片と結合したタンパク質が特異的に
植物液胞に方向づけられることを確実にするペプチド断
片に関する。 【０００２】本発明はまた、上で詳細に特徴づけられた
ペプチド断片をコードし、そしてあらゆる所望の発現性
ＤＮＡと操作可能に連結されて、特異的に植物液胞に方
向づけられる遺伝子産物を生じるＤＮＡ配列、およびそ
れらの突然変異体および変種に関する。 【０００３】本発明はさらに、発現性ＤＮＡと操作可能
に連結された本発明に係るＤＮＡ配列を含む組換えＤＮ
Ａ分子、およびそれから誘導されたベクターに関する。 また、上記組換えＤＮＡまたはそれから誘導されたベク
ターを含むトランスジェニック植物などの宿主細胞およ
び／または宿主有機体をも包含する。 【０００４】本発明はまた、本発明に係るＤＮＡ配列な
らびに該ＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子およびベク
ターの製法、およびトランスジェニック植物作出のため
のそれらの使用にも関する。 【０００５】 【従来の技術】遺伝子工学において、結合した遺伝子産
物をその機能に従って特定の目的地に到達させ、その場
所で最適活性を示し得るか、または適当な方法で貯蔵さ
れ得る、いわゆるシグナル配列をコードするＤＮＡ配列
を同定することは、挿入された外来遺伝子の純粋な発現
以上に近年興味が高まってきている。概して植物に関し
、このことは、挿入された外来遺伝子の組織および／ま
たは成長特異的発現を可能にするプロモーターの同定ま
たは開発のための試みがなされていることを意味する。 【０００６】挿入された外来遺伝子またはそれらの発現
産物の標的または目的地指向配置は植物のレベルで適切
であるばかりでなく、特に形質転換の効果に関し細胞レ
ベルでも非常に重要である。 【０００７】例えば、植物ならびにその他の真核細胞に
おいて、大部分のタンパク質が細胞質リボソーム上で合
成されるけれども、非常に多くのタンパク質が全く異な
る細胞下区画において要求されることが知られている。 唯一の例外は、それらが使用される場所で製造されるミ
トコンドリアおよび葉緑素のいくつかのタンパク質によ
り形成される。他方、細胞質で製造されたタンパク質は
細胞を貫通する内膜系に沿って細胞の溶解区画（液胞、
リソソーム）および細胞外空間に運ばれるか、またはそ
れらの特定の区画（液胞、葉緑素、ペルオキシソーム）
により直接取り込まれる。 【０００８】細胞下レベルでこの区画化の維持のために
、細胞質で製造されたタンパク質がそれらの機能に従っ
て分配されることを確実にする細胞内での特異的輸送お
よび選別系がなければならない。それ故に、これらのタ
ンパク質は、細胞の輸送および選別系がそれら自身の特
定の基質を認識し、そして該基質をそれらの特定の目的
地に方向づけることを可能にする情報の付加事項を一つ
またはそれ以上含んでいなければならない。従って、例
えば、ミトコンドリアおよび葉緑素タンパク質の非常に
多くの細胞質前駆体において、タンパク質がそれらの特
定の区画に取り込まれることを確実にするいわゆる輸送
ペプチドをＮ末端に検出することが可能であった。同様
に、核タンパク質は細胞−核特異的配列を有する。 【０００９】細胞内タンパク質輸送にとって特に重要な
のは細胞の内膜系である。細胞を貫通し、そして小胞体
およびゴルジ装置からなるこの膜系はタンパク質、特に
細胞質で製造されたタンパク質を溶解区画（液胞、リソ
ソーム）および細胞外空間に輸送するために実質的に機
能する。 【００１０】内膜系を介して輸送されたタンパク質は小
胞体をまず最初に通過する。この段階で必要な輸送シグ
ナルは分子のＮ末端にあるシグナル配列、いわゆるシグ
ナルペプチドにより示される。このシグナルペプチドは
その機能を果たすとすぐに、前駆体タンパク質からタン
パク質分解的に分離除去される。その特異的な機能のた
めに、このタイプのシグナルペプチド配列は、バクテリ
ア、酵母、菌類、動物または植物によらず全ての生存細
胞において進化の間に高度に保存されてきた。 【００１１】その他の選別段階は次いでゴルジ装置で起
こり、そこでは溶解区画（液胞、リソソーム）に意図さ
れたタンパク質および細胞外空間への分泌が意図された
タンパク質の分離が行われている。酵母および動物に関
する実験では、追加のシグナルを含まないタンパク質が
細胞外空間内に自動的に明らかに分泌され、一方、その
ような追加の選別シグナルを含むタンパク質は溶解区画
に送り出されることが見出されている。 【００１２】この選別シグナルの性質は非常に広範囲に
変化し得る。これまで研究された動物において、例えば
、それは一般的に糖タンパク質のグリカン鎖、すなわち
マンノース６−ホスフェート基内での特異的修飾である
。この基は特異的なマンノース６−ホスフェートレセプ
ターにより認識され、その結果特定の小胞中の相当する
タンパク質がゴルジ装置から供給され、そしてリソソー
ムに輸送される。しかしながら、どのポリペプチド配列
がグリカン側鎖中のマンノース基のリン酸化に刺激を与
えるかを決定することはこれまで可能ではなかった。 【００１３】酵母において、溶解区画のための相当する
選別シグナルはグリカン鎖ではなくアミノ酸配列であり
、シグナルペプチドの除去の後、タンパク質のＮ末端を
形成する。液胞のためのこのＮ末端標的性シグナルはプ
ロテイナーゼＡによりそれ自身液胞内で一般に分離除去
される。しばしば、液胞内に輸送されたタンパク質は、
標的性シグナルを分離除去してはじめて、酵素的に活性
な酵素になる。 【００１４】植物において、液胞が植物細胞の溶解区画
を示すだけでなく、貯蔵物質、解毒剤および防御物質の
ための最大の貯蔵区画を形成するから、タンパク質を液
胞に方向づけるのに関連する標的性シグナルの問題は特
に応用の観点から非常に興味深い〔６〕（なお、〔　　
〕内の数字は参考文献一覧の番号に一致する）。 【００１５】それ故に、液胞が溶解物質のための植物細
胞中でとびぬけて大きな区画であるから、植物の栄養含
量における改良に関連したタンパク質を特異的に液胞に
方向づけ、そしてそれらをそこに貯蔵することが可能で
あることは非常に有利である。塊茎、球根、根および茎
の最も重要な貯蔵タンパク質は例えばこれらの器官を構
成する細胞の液胞中に局在している〔６〕。さらに、ほ
とんどの種子の貯蔵タンパク質はいわゆるタンパク体、
特殊化液胞に局在しており、この液胞には同様の標的性
シグナルが植物器官の液胞に対するように当てはまるも
のと思われる。 【００１６】同様の考えはまた、有害生物または疾病の
防除において使用され得る物質（それらの物質がそれ自
体植物に対して毒性であると証明されている場合に特に
）に対して当てはまる。それ故に、それらの物質を植物
液胞中に蓄積することも有利である。最終的に、ある場
合には、液胞は、例えば植物により合成された解毒剤を
貯蔵することによる解毒器官としても作用する〔６〕。 それ故に、解毒酵素を特異的に液胞に方向づける試みが
なされている。 【００１７】しかしながら、例えば、ある種の病原菌に
よる栽培植物の攻撃の場合に問題が明らかに生じる。こ
れらの病原菌は植物の細胞内空間を介して菌糸体を広げ
ることにより宿主植物を冒す。これらの病原体を防除す
るために使用され得るキチナーゼおよびグルカナーゼは
非常に多く液胞中に局在するから、細胞内空間での生体
利用性は元々非常に限定されている。それ故に、その場
合には、細胞内空間内におけるそれらの物質の生体利用
性を高め、そして病原菌の有効な防除を可能にするため
に、細胞外区画に特異的に上記タンパク質を送り出せる
ことが望ましい。 【００１８】細胞外空間への分泌はまた、特定の物質が
細胞培養体を用いて製造される場合に有利である。その
場合、方向づけられた外来タンパク質は細胞外空間に分
泌されるから、方向づけられた該タンパク質は非常に容
易に周囲の培地から単離され得る。細胞内産生の場合に
必要である細胞の破壊を不要とし得る。 【００１９】しかしながら、植物液胞のためのそのよう
な標的性シグナルを同定し、単独で分離させることは、
これまで可能ではなかった。 【００２０】酵母のＮ末端標的性シグナルに匹敵するシ
グナルが液胞にタンパク質を方向づけるのに植物におい
て関与し得ると仮定して、タグエおよびクリスピールズ
はエンドウからの植物性血球凝集素分子の種々の部分を
リポーター遺伝子と連結し、そしてそれらを酵母内で試
験した〔６８〕。酵母宿主において、植物性血球凝集素
の場合にも、分子のＮ末端部分が液胞のための標的性シ
グナルとして作用することが見出された。 【００２１】その他の液胞タンパク質、塩基性β−１，
３−グルカナーゼは分子が成熟する際に失われるＣ末端
範囲とともに合成される。同様のことがイネ、大麦およ
び小麦（小麦胚凝集素）からのレクチンにも当てはまる
。この範囲の機能はこれまで知られていなかった。 【００２２】液胞からの種々のタンパク質のＣ末端の比
較はこの領域で明らかな相同性をこれまで示さなかった
から、これまで支持されてきた仮説は、酵母の場合と同
様に、植物における決定的なシグナル活性はそれらの液
胞タンパク質のＮ末端に由来するというものだった。 【００２３】 【発明が解決しようとする課題】それ故に、本発明の範
囲内で解決されるべき主な課題の一つは、結合されたタ
ンパク質分子を植物細胞の液胞に特異的に方向づけるの
に関連するペプチド断片（標的性配列）および該ペプチ
ド断片をコードするＤＮＡ配列を同定し、そして単離す
ることである。 【００２４】 【課題を解決するための手段】驚くべきことに、本発明
の範囲内で、いくつかが公知である操作を用いることに
よりこの課題を解決できることが今可能となった。 【００２５】詳しくは、本発明は、あらゆる所望の結合
されたタンパク質分子を特異的に植物液胞内に方向づけ
る（標的として導く）のに関連する短いペプチド断片、
および該ペプチド断片をコードするＤＮＡ配列に関する
。上記結合されたタンパク質分子は使用された標的性配
列に関して同種または異種起源のタンパク質であってよ
い。 【００２６】液胞に本来存在するタンパク質分子のＣ末
端領域から得られ、かつあらゆる所望のタンパク質分子
と結合して、該分子が植物液胞内に標的指向様式で方向
づけられることを導く短いペプチド断片が好ましい。該
ペプチド断片をコードし、そして液胞に本来存在するタ
ンパク質分子をコードする相当遺伝子の３’末端領域か
ら対応して得られるＤＮＡもまた好ましい。 【００２７】液胞内に本来存在するキチナーゼ分子のＣ
末端領域から得られ、かつあらゆる所望のタンパク質分
子と結合して、該分子が植物液胞内に標的指向様式で方
向づけられることを導く短いペプチド断片、および該ペ
プチド断片をコードし、そして植物キチナーゼ遺伝子の
３’末端領域から対応して得られるＤＮＡが特に好まし
い。 【００２８】植物液胞のための標的性シグナルとして作
用し、かつ以下の配列番号：１および２：Ａｒｇ　Ｓｅ
ｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ
　ＶａｌＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　で示されるアミノ酸
配列を有するペプチド断片、および該ペプチド断片をコ
ードしそして以下の配列番号：１：ＣＧＮ／ＡＧＲ　Ｔ
ＣＮ／ＡＧＷ　ＴＴＹ　ＧＧＮ　ＡＡＹ　ＧＧＮ　ＣＴ
Ｎ／ＴＴＲ　ＴＴＲ／ＣＴＮ　ＧＴＮ　ＧＡＹ　ＡＣＮ
　ＡＴＧ　ＴＡＡ　（ただし、ＮはＡまたはＧまたはＣ
またはＴ／Ｕであり、ＲはＧまたはＡであり、ＷはＡま
たはＴ／Ｕであり、そしてＹはＴ／ＵまたはＣである）
で示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ配列がとり
わけ好ましい。 【００２９】大部分が植物により優先的に使用されるコ
ドンからなるＤＮＡ配列が好ましい。 【００３０】実質的に純粋な形態にあり、ニコチアナ・
タバカムの園芸品種ハバナ４２５（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
　ｔａｂａｃｕｍ　Ｌ．　ｃ．ｖ．　Ｈａｖａｎａ　４
２５）植物の塩基性キチナーゼ遺伝子の３’末端（Ｃ末
端範囲）から得られ、そして以下の配列番号：２： ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　Ｃ
ＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＴＡＡ
　　　 で示されるＤＮＡ配列を実質的に有するＤＮＡ配列が特
に好ましい。 【００３１】実質的に純粋な形態にあり、ニコチアナ・
タバカムの園芸品種ハバナ４２５植物の塩基性グルカナ
ーゼ遺伝子の３’末端（Ｃ末端範囲）から得られ、そし
て以下の配列番号：１２： ＧＴＣ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＴＧＧ　Ｇ
ＡＣ　ＡＧＴ　ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＡ
Ｔ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＣＧＴＡ　
ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＴＧＡ　で示されるＤＮＡ配
列を実質的に有するＤＮＡ配列が特に好ましい。 【００３２】上記ＤＮＡ配列によりコードされるペプチ
ド断片は、植物液胞のための標的性シグナルとして作用
し、かつ以下の配列番号：１２： Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａ
ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓ
ｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＶａｌ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　で示されるアミノ酸配列を有
するが、該ペプチド断片もまた本発明に包含される。 【００３３】上記のＤＮＡ配列に実質的に相同であり、
そして本発明に必須の特性を依然有する、すなわち植物
液胞のための標的性シグナルとして作用するＣ末端ペプ
チドをコードするＤＮＡ配列の全ての誘導体もまた包含
される。 【００３４】本発明の範囲内で、あるＤＮＡ配列の活性
部分の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも８０％
そして特に好ましくは少なくとも９０％が第２のＤＮＡ
配列と相同である場合に、それらは実質的に相同である
。 【００３５】本発明に係るＤＮＡ配列の上記誘導体は自
然に生じる変種もしくは突然変異体であっても、または
特にそれらは公知突然変異方法により特異的に製造され
得る変種もしくは突然変異体であってもよい。 【００３６】突然変異は本明細書において、１個または
それ以上の塩基の欠失または挿入、そして１個またはそ
れ以上の塩基の置換、またはこれらの組合せを意味する
ものと理解されるべきである。上記塩基置換がアミノ酸
置換を生じないサイレント突然変異により達成されるの
が特別な場合である。 【００３７】これもまた本発明に包含されるそのような
突然変異の例は、下のＤＮＡ配列にまとめられ、そして
配列番号：３ないし７で示されている。これらの突然変
異体は配列番号：１および２で示される親配列からオリ
ゴヌクレオチド仲介突然変異誘発により創成され得、そ
してこの親配列によりコードされた断片と同様の標的特
性を依然有するペプチド断片をコードする：（ａ）　　
　　　　　　　　　　　　　　　ＧＧＡ　ＡＡＡ　ＧＡ
Ｔ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　
ＴＡＡ （ｂ）　　　　　　　　　　　　　　　　　ＧＧＡ　Ａ
ＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＡＡＴ　ＡＣＴ
　ＡＴＧ　ＴＡＡ （ｃ）　　　　　　　　　　　　　　　　　ＧＧＡ　Ａ
ＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＣＧＴ　ＡＣＴ
　ＡＴＧ　ＴＡＡ （ｄ）　　　Ａ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧＡ　Ａ
ＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ
　ＡＴＧ　ＴＡＡ （ｅ）　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ　Ｇ
ＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＧＡＴ　ＡＣＴ
　ＡＴＧ　ＴＡＡ 配列（ａ）ないし（ｃ）中の空白のスペースは標的性配
列に比較して相違しない突然変異標的性配列の領域に関
する。 【００３８】上記のＤＮＡ配列によりコードされ、かつ
配列番号：１および２で示される親配列によりコードさ
れた天然に生じる未変性のペプチド断片と同様の標的特
性を依然有するペプチド断片もまた本発明に包含される
。 【００３９】植物液胞のための標的性シグナルとして作
用し、そして配列番号：３ないし７で示されるアミノ酸
配列を有するペプチド断片が特に好ましい：（ａ）　　
　　　　　　　　　　　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ （ｂ）　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｍｅ
ｔ　Ｅｎｄ （ｃ）　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｍｅ
ｔ　Ｅｎｄ （ｄ）　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ
　Ｅｎｄ （ｅ）　　　　　　　　　　　　　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ
　Ｅｎｄ 配列（ａ）ないし（ｃ）中の空白のスペースは出発配列
に比較して相違しない突然変異標的性配列の領域に関す
る。 【００４０】例として挙げたこのリストは何ら限定を意
図するものでなく、本発明に必須である配列の特性が失
われることなしに、上記配列の変種が当業者により非常
に容易に創成され得ることを単に示すものである。 【００４１】本発明はまた、上で詳細に記載されたＤＮ
Ａ配列から、またはそれらのＤＮＡ配列の誘導体から得
られ、かつ出発配列の特性を依然有する断片または部分
配列を包含する。 【００４２】本発明の範囲内で、配列番号：２の本発明
のＤＮＡ配列から得られ、そして以下の配列番号：８お
よび９で示されるヌクレオチド配列を実質的に有するＤ
ＮＡ断片が特に好ましい： ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　Ｔ
ＡＡ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣ
Ｔ　ＡＴＧ　ＴＡＡ　【００４３】上記のＤＮＡ配列は
、植物液胞のための標的性シグナルとして作用し、そし
て以下の配列番号：８および９で示されるアミノ酸配列
を有するペプチド断片をコードする： Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｅ
ｎｄ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈ
ｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ　それ故に、本発明は上記のペプチ
ド断片にも関する。 【００４４】本発明はさらに、あらゆる所望の発現性Ｄ
ＮＡが本発明に係るＤＮＡ配列の一つ、ならびに植物細
胞内で活性な発現シグナルおよび場合により３’および
／または５’領域のその他のコード性配列および／また
は非コード性配列に操作可能に連結され、その結果植物
宿主内で形質転換して、発現産物が特異的に植物液胞内
に方向づけられるキメラ遺伝子構築物からなる組換えＤ
ＮＡ分子に関する。 【００４５】５’末端領域にある発現性ＤＮＡが、植物
細胞内で機能し得るＮ末端シグナルペプチドをコードす
る配列を含むか、またはそのような配列に連結されてい
ることが有利である。さらに、ＤＮＡ分子は、全体とし
て液胞中に入り込む能力の改善に寄与するペプチド断片
、例えばスポラミンのＮ末端範囲にマツオカおよびナカ
ムラにより発見されたペプチド断片〔３５〕をコードす
る配列のその他の部位を含んでいてもよい。 【００４６】本発明はまた、本発明に係る組換えＤＮＡ
分子を含むクローニング、形質転換および発現ベクター
、該ベクターで形質転換された宿主有機体を包含する。 【００４７】本発明はさらに、本発明に係る組換えＤＮ
Ａ分子を含み、かつ大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）　および
アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）　の両方
において安定に複製し得るいわゆるシャトルベクターま
たは二元ベクターに関する。 【００４８】宿主有機体の中で、上記組換えＤＮＡで形
質転換された植物プロトプラスト、細胞、カルス、組織
、器官、接合子、胚、花粉および／または種子そして特
に全体の、好ましくは稔性の植物体からなる群から選択
される植物宿主が特に好ましい。全体の植物体は例えば
本発明に係る組換えＤＮＡ分子で直接形質転換されるか
、または予め形質転換されたプロトプラスト、細胞およ
び／または組織から再生により得られる。 【００４９】本発明に係る構築物の一つを含み、そして
発現された遺伝子産物が所望どおりに液胞に局在してい
るトランスジェニック植物、特に稔性のトランスジェニ
ック植物が非常に好ましい。 【００５０】本発明はまた、本発明に係る組換えＤＮＡ
分子の一つを用いる直接形質転換により形成されるか、
まかは予め形質転換されたプロトプラスト、細胞、カル
ス、組織、器官、接合子、胚、花粉および／または種子
（これらに限定されない）から再生により得られるトラ
ンスジェニック植物の全ての増殖材料を包含する。 【００５１】本発明の範囲内で、増殖材料は有性または
無性で、そして試験管内または生体内で増殖され得るあ
らゆる植物材料を意味するものと理解されるべきであり
、好ましくは、本発明に係るトランスジェニックから得
られるプロトプラスト、細胞、カルス、組織、器官、胚
珠、接合子、胚、花粉および／または種子である。本発
明はまた、体細胞融合、遺伝的改変または突然変異選択
により得られた植物から得られるものを包含する、上記
植物の後代ならびにそれらの突然変異体および変種に関
する。 【００５２】本発明はさらに、 （ａ）本発明に係るＤＮＡ配列の一つの製造方法（ｂ）
あらゆる所望の発現性ＤＮＡ配列と操作可能に連結した
本発明に係る上記ＤＮＡ配列（好ましくはこのＤＮＡ配
列は植物発現シグナルの調節制御下にある）を含む本発
明に係る組換えＤＮＡの製造方法（ｃ）本発明に係る上
記組換えＤＮＡ分子を含むクローニング、形質転換およ
び／または発現ベクターの製造方法 （ｄ）形質転換された宿主有機体、特に植物プロトプラ
スト、細胞、カルス、組織、器官、接合子、胚、花粉お
よび／または種子そして特に全体の、好ましくは稔性の
植物体からなる群から選択される植物宿主の製造方法（
ｅ）形質転換された植物材料から出発する増殖材料の製
造方法、特に有性および無性の後代の製造方法に関する
。 【００５３】本発明はまた、以下の工程：（ａ）まず最
初に、液胞内に特異的に方向づけるのに関連するＤＮＡ
配列を公知方法により、適当な供給源から単離するか、
または合成し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列をあらゆる所望の発現性ＤＮＡ配列
の３’末端に操作可能な様式で挿入し、（ｃ）生成した
構築物を植物発現ベクター中に植物内で活性な発現シグ
ナルの制御下にクローニングし、そして（ｄ）該発現ベ
クターを植物宿主内に形質転換し、そしてその中で発現
ベクターを発現させる、から実質的になる植物液胞内に
発現産物を標的にむけて方向づける方法を包含する。 【００５４】５’末端領域にある発現性ＤＮＡが、植物
細胞内で機能し得るＮ末端シグナルペプチドをコードす
る配列を含むか、またはそのような配列に連結されてい
ることが有利である。さらに、ＤＮＡ分子は、全体とし
て液胞中に入り込む能力の改善に寄与するペプチド断片
、例えばスポラミンのＮ末端範囲にマツオカおよびナカ
ムラにより発見されたペプチド断片〔３５〕をコードす
る配列のその他の部位を含んでいてもよい。 【００５５】本発明の範囲内で行われた研究の間に、本
発明に係るシグナル配列を失う場合に、本発明に係る標
的性配列の一つを本来含み、かつそれ故に液胞内に通常
方向づけられるタンパク質が細胞外空間に分泌されるこ
とが見出された。 【００５６】それ故に、本発明はさらに、標的性配列を
本来含み、そしてそれ故に植物液胞内に通常方向づけら
れる植物タンパク質を細胞外空間に送り出す方法であっ
て、以下の工程： （ａ）上記タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離し
、 （ｂ）特定の細胞区画への方向づけに関連するＣ末端に
ある標的性配列を読み枠から除去し、 （ｃ）上記の変異させたＤＮＡ配列を適当な植物発現ベ
クター中にスプライシングし、そして （ｄ）生成した構築物を植物宿主内に形質転換する、か
ら実質的になる上記方法に関する。 【００５７】定義 以下の記載において組換えＤＮＡ技術および植物遺伝学
において慣用である多くの用語が用いられている。発明
の詳細な説明および特許請求の範囲、およびこれらの用
語にあてられた範囲の明確な、そして首尾一貫した理解
を確実にするために、以下に定義を記載する。 植物材料：培養液中でまたはそのままで生育可能な植物
の部分、例えばプロトプラスト、細胞、カルス、組織、
胚、植物器官、芽、種子等、および全体の植物。 植物細胞：プロトプラストおよび細胞壁からなる植物の
構造的および生理学的単位。 プロトプラスト：植物細胞または植物組織から分離され
、そして細胞クローンまたは全体の植物に再生する能力
を有する細胞壁のない「裸の」植物細胞。 植物組織：構造的および機能的単位の形態に組織化され
た植物細胞の群。 植物器官：種々の組織、例えば根、茎、葉または胚から
構成される構造的および機能的単位。 異種遺伝子またはＤＮＡ：特定の生成物をコードするか
、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿入
される種以外の種に由来するＤＮＡ配列；該ＤＮＡ配列
は外来遺伝子または外来ＤＮＡとも記載される。 相同遺伝子またはＤＮＡ：特定の生成物をコードするか
、または生物学的機能を遂行し、そして該遺伝子が挿入
される種と同一種に由来するＤＮＡ配列。 合成遺伝子またはＤＮＡ：特定の生成物をコードするか
、または生物学的機能を遂行し、そして合成手段により
製造されるＤＮＡ配列。 植物プロモーター：植物内であらゆる所望の相同または
非相同ＤＮＡ遺伝子配列の転写を確実に行わせるＤＮＡ
発現の制御配列であるが、前記遺伝子配列はそのような
プロモーターと操作可能に結合されている。 終結配列：転写工程の終了をシグナルで伝える転写単位
の末端のＤＮＡ配列。 過産生植物プロモーター（ＯＰＰ）：このＯＰＰで形質
転換されなかった宿主細胞において自然状態で観察され
るよりも明らかに高い程度まで（ＲＮＡの形態またはポ
リペプチドの量で測定される）、操作可能に結合された
機能遺伝子配列のトランスジェニック植物細胞内での発
現を引起し得る植物プロモーター。 ３’／５’非翻訳領域：ｍＲＮＡに転写されるけれども
ポリペプチドに翻訳されないコード領域の上流／下流に
位置するＤＮＡ部分。この領域は、調節配列例えばリボ
ソーム結合部位（５’）またはポリアデニル化シグナル
（３’）を含む。 ＤＮＡクローニングベクター：適当な宿主細胞内に挿入
されたＤＮＡのクローニングに必要な全てのシグナル配
列を含有するクローニングビヒクル、例えばプラスミド
またはバクテリオファージ。 ＤＮＡ発現ベクター：適当な宿主細胞内に挿入されたＤ
ＮＡの発現に必要な全てのシグナル配列を含有するクロ
ーニングビヒクル、例えばプラスミドまたはバクテリオ
ファージ。 ＤＮＡトランスファーベクター：適当な宿主細胞内への
遺伝物質の挿入を可能にするトランスファービヒクル、
例えばＴｉプラスミドまたはウイルスファージ。 トランスジェニック植物の突然変異体、変種：自然に、
または公知方法例えば紫外線処理、突然変異誘発剤での
処理その他を用いて人工的に作製され、そして本発明に
必須である出発植物の特徴および特性を依然有するトラ
ンスジェニック植物の誘導体。 実質的に純粋なＤＮＡ配列：天然または非天然源から実
質的に純粋な形態で単離されたＤＮＡ配列。そのような
配列は天然系、例えば細菌、ウイルスまたは植物もしく
は動物細胞中に存在していても、また合成ＤＮＡまたは
ｃＤＮＡの形態で利用されてもよい。実質的に純粋なＤ
ＮＡ配列は挿入物として上記ＤＮＡを含むベクターの形
態で一般に単離される。実質的に純粋とは、その他のＤ
ＮＡ配列がほんの無視できる量で存在し、そして５％未
満、好ましくは１％未満、そして特に好ましくは０．１
％未満含有されることを意味する。そのような配列およ
び該配列を含むベクターは一般に水溶液中に、すなわち
緩衝液または慣用の培養基の一つの中に存在する。 【００５８】本発明の範囲内で、あらゆる所望の結合さ
れた遺伝子産物を特異的に植物液胞内に方向づけるのに
関連する短いペプチド断片をコードする実際のＤＮＡ配
列を同定および単離することが今はじめて可能になった
。本発明に係る上記ＤＮＡ配列の単離のための出発材料
として、液胞に本来存在するタンパク質のｃＤＮＡおよ
び／またはゲノムＤＮＡクローン、例えば植物キチナー
ゼまたはグルカナーゼクローンが特に好ましい。 【００５９】それ故に、本発明は、液胞に本来存在する
タンパク質分子をコードする遺伝子の３’末端領域から
得られ、かつあらゆる所望の発現性ＤＮＡと操作可能と
連結して、特異的に植物液胞内に方向づけられる遺伝子
産物を生じる新規で実質的に純粋なＤＮＡ配列に特に関
する。 【００６０】本発明の範囲内で、植物キチナーゼ遺伝子
の３’末端領域から得られるＤＮＡ配列が好ましい。同
様に、植物グルカナーゼ遺伝子の３’末端領域から得ら
れるＤＮＡ配列も好ましい。 【００６１】適当な遺伝子、特にキチナーゼまたはグル
カナーゼ遺伝子の単離のために、当業者には十分に公知
の慣用の一般的方法により創生され得るゲノムまたはｃ
ＤＮＡ遺伝子ライブラリィを出発材料として使用するの
が好ましい。ゲノムまたはｃＤＮＡ遺伝子ライブラリィ
の基本的創生方法は、例えば、文献〔３４〕に詳細に記
載され、また植物系への導入およびそれらの方法の応用
は、例えば文献〔３９〕に記載されている。 【００６２】ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは種々の方法
で入手され得る。ゲノムＤＮＡは、例えば公知方法を用
いて適当な細胞から抽出され、そして精製され得る。 【００６３】本発明の特定の実施態様において、ｃＤＮ
Ａの作成のために、選択された細胞または組織から、し
かし特に高いキチナーゼまたはグルカナーゼ濃度を有す
ることが知られている細胞または組織から単離され得る
ｍＲＮＡが出発材料として一般的に使用される。単離さ
れたｍＲＮＡは次に相当するｃＤＮＡ作成のためのマト
リックスとして逆転写において使用され得る。 【００６４】ｃＤＮＡ作成のための出発材料として特に
好ましいのは、適当な手段により予め刺激され高レベル
でキチナーゼまたはグルカナーゼを産生する植物細胞も
しくは組織またはその他の適当な植物材料である。これ
は、例えば培養された細胞もしくは組織またはその他の
適当な植物材料を無ホルモン培地上に接種し、そして高
キチナーゼまたはグルカナーゼレベルの誘導に十分な期
間それらを培養することにより達成され得る。発明の範
囲内で、文献〔３３〕により提案された塩およびチアミ
ン−塩化水素濃度を含有する基本培地（ＬＳ培地）が特
に好ましい。 【００６５】ポリ（Ａ＋　）ＲＮＡを単離する方法およ
びｃＤＮＡを作成する方法は当業者に公知であり、そし
て実施例において以下に詳細に記載されている。 【００６６】抽出され、そして精製されたＤＮＡ調製物
は次に引き続くクローニングのための断片に切断される
。クローン化されるべきゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは
、機械的切断または好ましくは適当な制限酵素での切断
により、クローニングベクター内への挿入に適当な大き
さに断片化され得る。ゲノムおよび／またはｃＤＮＡ遺
伝子ライブラリィの創生のための一般的物質として既に
使用されている適当なクローニングベクターは例えば、
ファージベクター例えばλシャロンファージ、または細
菌ベクター例えば大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２を包含
する。その他の適当なクローニングベクターは当業者に
公知である。 【００６７】上記方法で創生された遺伝子ライブラリィ
から、キチナーゼまたはグルカナーゼ遺伝子またはそれ
らの部分を含む適当なクローンがスクリーニングプログ
ラム、例えば適当なオリゴヌクレオチドプローブ（プロ
ーブ分子）を用いて同定され、そして次に単離され得る
。種々の方法、例えば分別コロニーハイブリダイゼーシ
ョンまたはプラークハイブリダイゼーションが適当なク
ローンを同定するために利用可能である。特定の翻訳産
物の同定に基づいた免疫学的検出方法が使用されてもよ
い。 【００６８】プローブ分子として、例えば同一のキチナ
ーゼまたはグルカナーゼ遺伝子または構造的に関連する
キチナーゼまたはグルカナーゼ遺伝子から予め単離され
、そして本発明に係るキチナーゼまたはグルカナーゼ遺
伝子内の配列の相当する部分とハイブリダイゼーション
し得るＤＮＡ断片が使用され得る。 【００６９】単離されるべき遺伝子のアミノ酸配列また
は該配列の少なくとも一部が公知であれば、その配列情
報に基づいて相当するＤＮＡ配列は引き出され得る。遺
伝コードは縮重していることが知られているから、大部
分の場合、異なるコドンが一つおよび同じアミノ酸のた
めに使用され得る。結果として、いくつかの例外を別に
して、特定のアミノ酸配列が、互いに類似しているオリ
ゴヌクレオチドの全体の系により一般にコード化され得
る。しかしながら、オリゴヌクレオチドの系の一つだけ
が検索されている遺伝子内の相当する配列に実際に相当
することを確認することに注意が払われなければならな
い。可能性のあるオリゴヌクレオチドの数を始めから制
限するために、特定のコドンが真核細胞において実際に
使用されている頻度を考慮する文献〔３２〕に主張され
たコドンの使用に関する規則が例えば適用され得る。 【００７０】その情報に基づいて、プローブ分子をゲノ
ムＤＮＡまたはｃＤＮＡと上記方法の一つにおいてハイ
ブリダイゼーションさせることにより、適当なクローン
の同定および単離のためのプローブ分子として使用され
得るオリゴヌクレオチド分子を引き出すことも可能であ
る。 【００７１】所望の遺伝子、例えばキチナーゼまたはグ
ルカナーゼをコードする所望の遺伝子の検出を促進する
ために、上記のＤＮＡプローブ分子が適当な容易に検出
可能な群で標識され得る。本発明の範囲内で、検出可能
な群は特に容易に同定可能な物理的または化学的特性を
有するあらゆる物質として理解されるべきである。 【００７２】そのような物質は特にイムノアッセイの分
野で広く使用されており、そしてそれらの大部分は本発
明において使用され得る。酵素的に活性な群、例えば酵
素、酵素基質、補酵素および酵素阻害剤、および蛍光剤
および発色剤、発色団および放射性同位元素、例えば　
３Ｈ，３５Ｓ，３２Ｐ，　１２５Ｉおよび１４Ｃがこの
点で特別な記載がなされ得る。これらの標識の容易な検
出性は、一方で固有の物理的特性（例えば蛍光標識、発
色団、放射性同位元素）、そして他方でそれらの反応お
よび結合特性（例えば酵素、基質、補酵素、阻害剤）に
基づいている。 【００７３】高いキチナーゼまたはグルカナーゼレベル
の産生のために誘導された組織または細胞から順に単離
されるポリ（Ａ＋　）ＲＮＡから誘導された一本鎖ｃＤ
ＮＡがプローブ分子として適当である。 【００７４】ハイブリダイゼーションに関する一般的方
法は、例えば文献〔３４〕および〔２２〕に記載されて
いる。 【００７５】プローブ分子とハイブリダイゼーションし
得、そして上記の検出方法の一つにより同定され得る上
記遺伝子ライブラリィ内のそれらのクローンは、キチナ
ーゼまたはグルカナーゼをコードする配列の範囲および
性質を詳細にさらに決定するために次に分析され得る。 【００７６】遺伝子、特にキチナーゼまたはグルカナー
ゼ遺伝子をクローニングする別の方法は発現ベクターか
らなる遺伝子ライブラリィの創生に基づいている。その
方法において、上記方法と同様に、ゲノムＤＮＡ、しか
し好ましくはｃＤＮＡがキチナーゼまたはグルカナーゼ
を発現し得る細胞または組織からまず分離され、そして
次に適当な発現ベクター内にスプライシングされる。そ
のようにして創生された遺伝子ライブラリィは次いで適
当な手段を用いて、好ましくは抗キチナーゼまたはグル
カナーゼ抗体を用いてスクリーニングされ、そして挿入
物として所望の遺伝子または少なくともその一部を含む
クローンが選択され得る。 【００７７】上記方法を用いて、あらゆる所望の構造遺
伝子と操作可能に連結して、遺伝子産物の形質転換され
た植物材料の液胞への特異的な方向づけを導くＤＮＡ配
列をＣ末端範囲に有する、液胞内に本来存在する遺伝子
産物をコードする遺伝子、例えば植物キチナーゼまたは
グルカナーゼ遺伝子、しかし特にタバコからの塩基性キ
チナーゼまたはグルカナーゼ遺伝子を単離することが可
能である。 【００７８】その他の特徴づけのために、上記のように
精製および単離されたＤＮＡ配列を配列分析に供する。 予め単離されたＤＮＡを最初に適当な制限酵素により断
片に切断し、そして次に適当なクローニングベクター、
例えばＭ１３ベクターｍｐ１８およびｍｐ１９内にクロ
ーン化する。配列決定は５’→３’方向に行われ、好ま
しくはサンガーのジデオキシヌクレオチド鎖停止法〔５
５〕またはマキサムおよびギルバートの方法〔３６〕が
用いられる。配列決定におけるエラーを防止するために
、同時に２本のＤＮＡ鎖の配列を決定することが有利で
ある。ヌクレオチド配列および相当するアミノ酸配列の
分析は適当な市販のコンピュータソフトウエア（例えば
ウイスコンシン大学のＧＣＧソフトウエア）を用いて有
利にコンピュータアシストされている。 【００７９】公知の方法を用いて、本発明に係るＤＮＡ
配列は次に、上記の方法で製造されたＤＮＡクローンか
ら、特にキチナーゼまたはグルカナーゼクローンから非
常に容易に単離され得る。 【００８０】本発明の範囲内で、実質的に純粋な形態に
あり、そして例えばニコチアナ・タバカムの園芸品種ハ
バナ４２５植物の塩基性キチナーゼ遺伝子の３’末端（
Ｃ末端範囲）から得られ、そして以下の配列番号：２：
ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　Ｃ
ＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴＡＴＧ　ＴＡＡ
　　　で示されるＤＮＡ配列を実質的に有するＤＮＡ配
列が特に好ましい。 【００８１】上に示されたＤＮＡ配列は、タンパク質分
子と操作可能に連結して、液胞のための標的性シグナル
として作用し、そして以下の配列番号：２：Ａｒｇ　Ｓ
ｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅ
ｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　で示されるアミ
ノ酸配列を有するペプチド断片をコードする。本発明は
上記ペプチド断片にも関する。 【００８２】実質的に純粋な形態にあり、そして例えば
ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５植物の塩
基性グルカナーゼ遺伝子の３’末端（Ｃ末端範囲）から
得られ、そして以下の配列番号：１２：ＧＴＣ　ＴＣＴ
　ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＴＧＧ　ＧＡＣ　ＡＧＴ　
ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＡＴ　ＧＣＴ　Ａ
ＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＣＧＴＡ　ＡＧＴ　ＧＡＧ
　ＡＴＧ　ＴＧＡ　で示されるＤＮＡ配列を実質的に有
するＤＮＡ配列が特に好ましい。 【００８３】上記ＤＮＡ配列によりコードされるペプチ
ド断片は、植物液胞のための標的性シグナルとして作用
し、かつ以下の配列番号：１２： Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａ
ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓ
ｎ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＶａｌ　
Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　で示されるアミノ酸配列を有
するが、該ペプチド断片もまた本発明に包含される。 【００８４】このＤＮＡ配列は公知の塩基配列であり、
適当なキチナーゼまたはグルカナーゼ遺伝子から各回新
たに単離される必要はなく、もちろんいつでも化学的操
作により非常に容易に合成され得る。短いＤＮＡオリゴ
ヌクレオチドの合成に適当な方法、例えばホスホトリエ
ステル法またはホスフィット法は当業者には公知である
。今日、多くのオリゴヌクレオチド合成は機械化され、
そして自動化されており、そのため短いＤＮＡ断片は短
時間で製造され得る。 【００８５】同様のことが相当する標的性ペプチドのア
ミノ酸配列にも当てはまり、該配列は塩基配列から直接
誘導され得る。 【００８６】それ故に、１個またはそれ以上の塩基対の
欠失、挿入または置換による、上で非常に詳細に記載さ
れたＤＮＡ配列の変種または突然変異体は容易に製造さ
れ得、そしてそれらの標的性配列としての適性が検査さ
れ得る。 【００８７】本発明の範囲内には、突然変異誘発により
自然に生じる出発配列から非常に容易に製造され得る非
常に多数の配列が開示されている。 【００８８】詳しくは、操作は、本発明に係るＤＮＡ配
列の一つを含む遺伝子を最初に同定および単離すること
であってよい。適当なクローニングベクター内にスプラ
イシングさせた後、上記遺伝子、特に３’末端の標的性
配列は次に公知工程手段により変性され得る。特定の突
然変異体を作成する特に適した方法はいわゆるオリゴヌ
クレオチド仲介突然変異誘発である。その方法において
、野生型配列に実質的に相同であるけれども、個々のヌ
クレオチドにおいて相違する短いオリゴヌクレオチド断
片が合成される。上記相違は１個またはそれ以上のヌク
レオチドの挿入、欠失または置換であってよい。これら
の突然変異された断片は次に一般的公知方法により野生
型遺伝子の相同対と置換される。最終構築物は次いで、
以下に詳細に記載されるように、適当な植物発現ベクタ
ーにクローン化され、そして植物内に形質転換され得る
。 【００８９】しかしながら、ある種のＤＮＡ断片の突然
変異はまた、好ましくはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）
を用いて行われ得る。この試験管内方法において、突然
変異させるべきＤＮＡ断片の周辺領域に一般的に由来し
、そして鎖特異的である化学的に合成されたオリゴヌク
レオチドが使用される。適当な条件下で、オリゴヌクレ
オチドと変性により作成されたＤＮＡ単鎖上の相補的領
域とのハイブリッド形成が起こる。この方法で作成され
た二本鎖領域は引き続くポリメラーゼ反応のためのプラ
イマーとして使用される。この方法において、大腸菌か
らのＲＮＡポリメラーゼの他に、好熱菌例えばテルムス
・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｓ
）からの熱安定性ポリメラーゼを使用してもよい。 【００９０】それ故に、本発明は上に非常に詳しく記載
した塩基配列に限定されず、１個またはそれ以上の塩基
の欠失または挿入により、１個またはそれ以上の塩基の
置換により作成され得、かつ出発配列の本発明に係る特
性を依然有する上記ＤＮＡ配列の全ての突然変異体およ
び／または変種を包含する。 【００９１】本発明の範囲内で、配列番号：１および２
で示される出発配列からオリゴヌクレオチド仲介突然変
異誘発により創成され得、そして該出発配列によりコー
ドされたペプチドと同様の標的特性を依然有するペプチ
ドをコードする以下の変種（配列番号：３ないし７）が
特に好ましい： （ａ）　　　　　　　　　　　　　　　　　ＧＧＡ　Ａ
ＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＧＡＴ　ＡＣＴ
　ＡＴＧ　ＴＡＡ （ｂ）　　　　　　　　　　　　　　　　　ＧＧＡ　Ａ
ＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＡＡＴ　ＡＣＴ
　ＡＴＧ　ＴＡＡ （ｃ）　　　　　　　　　　　　　　　　　ＧＧＡ　Ａ
ＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＣＧＴ　ＡＣＴ
　ＡＴＧ　ＴＡＡ （ｄ）　　　Ａ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧＡ　Ａ
ＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ
　ＡＴＧ　ＴＡＡ （ｅ）　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ　Ｇ
ＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＧＡＴ　ＡＣＴ
　ＡＴＧ　ＴＡＡ 配列（ａ）ないし（ｃ）中の空白のスペースは出発配列
に比較して相違しない突然変異標的性配列の領域に関す
る。 【００９２】上記の方法で単離または製造され得る本発
明に係るＤＮＡ配列は同様の機能を有する相同ＤＮＡ配
列を同定するために今使用され得る。例えば、これは最
初にゲノムまたはｃＤＮＡ遺伝子ライブラリーを作成し
、そしてプローブ分子として本発明に係るＤＮＡ配列を
用いて、前記プローブ分子とハイブリッド形成し得る相
同ＤＮＡ配列の存在を求めて前記ライブラリーを調べる
ことにより行われる。本発明はまた、このような同様の
機能を有する相同ＤＮＡ配列の位置決定方法に関する。 【００９３】上記のＤＮＡ配列によりコードされ、かつ
配列番号：１および２で示される親配列によりコードさ
れた天然に生じる未変性のペプチド断片と同様の標的特
性を依然有するペプチド断片もまた本発明に包含される
。 【００９４】植物液胞のための標的性シグナルとして作
用し、そして配列番号：３ないし７で示されるアミノ酸
配列を有するペプチド断片が特に好ましい：（ａ）　　
　　　　　　　　　　　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ （ｂ）　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｍｅ
ｔ　Ｅｎｄ （ｃ）　　　　　　　　　　　　　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｍｅ
ｔ　Ｅｎｄ （ｄ）　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ
　Ｅｎｄ （ｅ）　　　　　　　　　　　　　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａ
ｓｐ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ
　Ｅｎｄ 配列（ａ）ないし（ｃ）中の空白のスペースは出発配列
に比較して相違しない突然変異標的性配列の領域に関す
る。 【００９５】本発明はまた、上で詳細に記載されたＤＮ
Ａ配列から、またはそれらのＤＮＡ配列の誘導体から得
られ、かつ出発配列の特性を依然有する断片または部分
配列を包含する。 【００９６】本発明の範囲内で、本発明に係るＤＮＡ配
列から得られ、そして以下の配列番号：８および９で示
されるヌクレオチド配列を実質的に有するＤＮＡ断片が
特に好ましい： ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　Ｔ
ＡＡ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣ
Ｔ　ＡＴＧ　ＴＡＡ　【００９７】上記のＤＮＡ配列は
、植物液胞のための標的性シグナルとして作用し、そし
て以下の配列番号：８および９で示されるアミノ酸配列
を有するペプチド断片をコードする： Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｇ
ｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅ
ｔ　それ故に、本発明は上記のペプチド断片にも関する
。 【００９８】本発明の範囲内で、それらに自然に結合さ
れた構造遺伝子を特異的に方向づけるのに関連する短い
Ｃ末端ペプチドをコードする本発明の上で詳細に特徴づ
けられたＤＮＡ配列は異種遺伝子に連結した場合でさえ
もそれらの標的性機能を果たし得ることを示すことが今
はじめて可能になった。 【００９９】本発明の特定の実施態様において、本発明
に係るＤＮＡ配列は、上記の方法により、相当する３’
末端配列を含まない異種遺伝子、好ましくは異種キチナ
ーゼ遺伝子に操作可能な様式で連結し、そして植物宿主
内に形質転換させる。植物液胞内に特異的に方向づけら
れる遺伝子産物は次に形質転換された植物宿主中に発現
される。 【０１００】詳しくは、最初にｃＤＮＡ遺伝子ライブラ
リィが適当な植物材料から作成され、そして３’末端範
囲を持たない適当なキチナーゼｃＤＮＡクローンが適当
なプローブ分子を用いて前記遺伝子ライブラリィから単
離される方法であってよい。ｃＤＮＡクローンを適当な
クローニングベクター内にスプライシングさせた後、前
記クローンは、本発明に係るＤＮＡ標的性配列が異種キ
チナーゼ遺伝子に操作可能な様式で連結され得るように
制限切断部位の挿入または欠失により変性され得る。最
終構築物は次に適当な植物発現ベクター内にクローン化
させ得、それにより植物内で活性な発現シグナルの調節
制御下におかれる。この点での例として、ＣａＭＶウイ
ルスの３５Ｓプロモーターおよびその終結配列を含む植
物発現ベクターｐＧＹ１を記載し得るが、これは本発明
の対象を制限するものではない。もちろん、あらゆるそ
の他の適当なベクターもまたこの点で使用され得る。 【０１０１】例えば、本発明に係る標的性配列との連結
により、Ｃ末端シグナルペプチドを持たず、それ故に細
胞外空間に通常分泌される、キュウリ由来の酸性キチナ
ーゼを植物液胞内に特異的に方向づけることが可能であ
る。 【０１０２】本発明はさらに、発現性ＤＮＡ、特に構造
遺伝子、好ましくは異種構造遺伝子を本発明に係るＤＮ
Ａ配列および植物細胞内で活性な発現シグナル例えばプ
ロモーターおよび終結配列、ならびに場合により３’お
よび／または５’領域のその他のコード配列および／ま
たは非コード配列と操作可能に連結して含むキメラ組換
えＤＮＡ分子の構築にも関する。 【０１０３】プロモーター配列と隣接するコード性ＤＮ
Ａ配列との間にリーダー配列を含むことはしばしば有利
であり、そのリーダー配列の長さはプロモーター配列と
本発明に係るＤＮＡ配列との距離が結合された構造遺伝
子の発現のために最適な距離であるように選択される。 【０１０４】挿入されるべきＤＮＡ分子が、植物細胞内
で機能し得るＮ末端シグナルペプチドをコードする配列
を含むか、またはそのような配列に５’末端領域におい
て連結されていることが有利である。さらに、ＤＮＡ分
子は、全体として液胞中に入り込む能力の改善に寄与す
るペプチド断片、例えばスポラミンのＮ末端範囲にマツ
オカおよびナカムラにより発見されたペプチド断片〔３
５〕をコードする配列のその他の部位を含んでいてもよ
い。 【０１０５】形質転換された植物細胞およびそれらから
発生する組織、そして特に植物に保護作用、例えば病原
体（例えば植物病原性菌類、バクテリア、ウイルスその
他）に対する増加した耐性；化学物質〔例えば除草剤（
例えばトリアジン、スルホニル尿素、イミダゾリノン、
トリアゾールピリミジン、ビアラホス、グリホセートそ
の他）、殺虫剤もしくはその他の殺生物剤〕に対する耐
性；不利な環境要因（例えば暑さ、寒さ、風、不利な土
壌条件、湿気、乾燥その他）に対する耐性を導く全ての
遺伝子が本発明の方法における使用に特に適している。 【０１０６】本発明の範囲内で、植物病原体または寄生
虫の防除に関連した構造遺伝子が特に言及され得る。 【０１０７】昆虫耐性は、例えば昆虫および／またはそ
れらの幼虫に対して毒性であるポリペプチド、例えばバ
チラス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒ
ｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の結晶性タンパク質をコードして
いる遺伝子により付与され得る。 【０１０８】昆虫耐性を与える第二類のタンパク質はプ
ロテアーゼインヒビターである。プロテアーゼインヒビ
ターは植物貯蔵構造体の通常の構成要素である。ダイズ
から単離・精製されたボウマン−バーク（Ｂｏｗｍａｎ
−Ｂｉｒｋ）　プロテアーゼインヒビターは、テネブリ
オ幼虫の内蔵プロテアーゼを阻害することが示された〔
３〕。ササゲトリプシンインヒビターをコードしている
遺伝子は、文献〔２３〕に記載されている。 【０１０９】本発明の範囲内で、その起源に関係なくあ
らゆる所望のプロテアーゼインヒビター（例えば非植物
または純粋に合成起源のプロテアーゼインヒビター）を
植物細胞内で機能し得るＮ末端シグナルペプチドおよび
本発明に係るＣ末端標的性配列に操作可能に連結するこ
とにより、上記のあらゆるプロテアーゼインヒビターを
使用することが今では可能である。結果として、そのよ
うに変性されたプロテアーゼインヒビターは液胞内に特
異的に方向づけられ、その場所でそれらは最適な様式で
貯蔵され得る。 【０１１０】プロテアーゼインヒビターをコードしてい
る遺伝子は、植物プロモーター、例えばＣａＭＶ３５Ｓ
プロモーターのような構造的なプロモーターの制御下で
適当なベクター内に導かれていてもよい。遺伝子、例え
ばダイズボウマン−バークプロテアーゼインヒビターの
コード配列は、ｃＤＮＡクローニング方法を用いて得る
ことができる。１００個より少ないアミノ酸を有するプ
ロテアーゼインヒビター、例えばリママメトリプシンイ
ンヒビターを得る方法は、それを合成することである。 コード配列はアミノ酸配列のバックトランスレーション
により予測され得る。さらに、所望の特定のベクターに
対して適当な制限部位は両端部に包含される。合成遺伝
子は３０ないし６０塩基対の重複オリゴヌクレオチド断
片を合成し、それらの断片にリン酸転移し、次に互いを
連結し〔３４〕、そして最後に適当なベクター内にクロ
ーン化することにより製造される。その挿入が正確な配
向にあるクローンは、配列決定により同定され得る。プ
ロトプラスト内への挿入のために、単離されたプラスミ
ドＤＮＡが使用され得る。 【０１１１】これに関連して、植物病原体自体の細胞壁
の破壊を生じ得るか、またはその他の物質と一緒になっ
て相乗的に破壊を少なくとも補助する加水分解酵素が言
及されるべきである。 【０１１２】多くの昆虫は、ラメラ層中のキチンミセル
が基質内に埋め込まれているクチクラ骨格を有する。非
常に多くの植物病原性菌類は、菌糸および胞子構造の欠
くことのできない成分としてキチンを含有し、例えば担
子菌類（黒穂菌およびサビ菌）および子のう菌類および
不完全菌類〔アルテルナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）
およびビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）　、エクセロ
フィラム・タルシカム（Ｅｘｅｒｏｐｈｉｌｕｍ　ｔｕ
ｒｃｉｃｕｍ）、コレトットリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔ
ｒｉｃｕｍ）　、グレオセルコスポラ（Ｇｌｅｏｃｅｒ
ｃｏｓｐｏｒａ）およびセルコスポラ（Ｃｅｒｃｏｓｐ
ｏｒａ）〕を包含する。キチナーゼは試験管内である種
の病原体の菌糸体の増殖を阻害し得る。構造的に、また
は病原体侵入に応じてキチナーゼを発現する植物の器官
または組織は、非常に多くの異なる菌類の攻撃から保護
される。 【０１１３】植物内に本来存在する内因性キチナーゼは
細胞外にあるか（酸性キチナーゼ）、または液胞内部に
局在しており（塩基性キチナーゼ）、２つの別の操作が
本発明の範囲内で考えられる。 【０１１４】一方で、液胞内に方向づけるのに関連する
Ｃ末端の配列を欠いている酸性キチナーゼ遺伝子は、遺
伝子産物が液胞を特異的に通過するように本発明に係る
ＤＮＡ配列を用いて変性され得、その場合それらは病原
体の侵入に対する活性を自然に生じる内因性塩基性キチ
ナーゼを補助することができる。 【０１１５】第２の変法において、液胞内に本来存在す
る塩基性キチナーゼ遺伝子のＣ末端範囲は遺伝子工学法
により読み枠から除去されるか、または例えばＣ末端範
囲の直前に停止コドンを挿入することにより少なくとも
不活性化される。結果として遺伝子産物は細胞内空間に
分泌され、そこで病原体侵入と直接関与するようになる
。 【０１１６】それ故に、本発明のその他の面は、液胞内
に本来存在し、そして植物細胞内で活性な発現シグナル
と操作可能に連結している構造遺伝子であって、該遺伝
子に本来存在するの３’末端の標的性配列を欠失させる
か、または不活性化させた構造遺伝子を含む組換えＤＮ
Ａ分子に関する。植物宿主で形質転換して、これらの構
造遺伝子は機能的Ｃ末端シグナル配列を含まず、それ故
に植物の細胞外空間に分泌される発現産物を生じる。 【０１１７】植物細胞内で活性な発現シグナルと操作可
能に連結している構造遺伝子であって、該遺伝子に本来
存在するの３’末端の標的性配列が欠失されるか、また
は不活性化された塩基性キチナーゼ遺伝子を含み、それ
故に、植物宿主で形質転換して、これらの構造遺伝子は
機能的Ｃ末端シグナル配列を含まず、それため植物の細
胞外空間に分泌される発現産物を生じる組換えＤＮＡ分
子が特に好ましい。 【０１１８】病原体に対する植物の保護機構において中
心的な役割をおそらく演じるその他の酵素はβ−１，３
−グルカナーゼであり、それ故に、この酵素を本発明に
係るＤＮＡ配列と組合せて使用することは本発明の範囲
内で好ましい。 【０１１９】それ故に、植物細胞内で活性な発現シグナ
ルと操作可能に連結している構造遺伝子であって、該遺
伝子に本来存在するの３’末端の標的性配列が欠失され
るか、または不活性化された塩基性グルカナーゼ遺伝子
を含み、それ故に、植物宿主で形質転換して、これらの
構造遺伝子は機能的Ｃ末端シグナル配列を含まず、それ
ため植物の細胞外空間に分泌される発現産物を生じる組
換えＤＮＡ分子が好ましい。 【０１２０】本発明はさらに、本発明に係る標的性配列
のいわゆる溶菌ペプチドへの連結にも関する。これらは
病原体の細胞膜に侵入するか、該膜を溶解するか、また
はその別の様式で該膜に損傷を与え得る抗病原性を有す
る天然または合成ペプチドである。本発明の範囲内で使
用され得る上記溶菌ペプチドの代表例は動物起源（昆虫
を含む）または植物および微生物起源のものが知られて
おり、例えば動物のデフェンシン、セルコピン、チオニ
ンおよびメリチン、および昆虫のデフェンシン、マガイ
ニン、アタシン、ジプテリン、サペシン、カエルリンお
よびキセノプシン、およびそれらのハイブリッドである
。種々の溶菌ペプチドのアミノ酸配列は以下の刊行物に
記載されている：ＷＯ８９／１１２９１；ＷＯ８６／０
４３５６；ＷＯ８８／０５８２６；ＵＳ４８１０７７７
；ＷＯ８９／０４３７１および文献〔４〕、〔５８〕お
よび〔６９〕。 【０１２１】用語の最も広い意味での溶菌ペプチドは、
細胞膜に侵入するか、該膜を溶解するか、または該膜に
損傷を与える能力が酵素活性に基づいている化合物、例
えばリゾチームおよびホスホリパーゼであると理解され
るべきである。 【０１２２】本発明の範囲内で、加水分解性および溶菌
性ペプチドと、液胞内、適当である場合には細胞外空間
への引き続く標的指向方向づけとの組合せ発現に関する
。さらに、発現適用と外因性適用の相互の使用が考えら
れ、後者の目的には、この目的には慣用の助剤および／
または添加剤と組み合わせた溶菌ペプチドが特に適して
いる。 【０１２３】本発明に係るＤＮＡ配列はまた、植物細胞
自体またはより高度なオーガナイゼーション単位、例え
ば組織、カルス、器官、胚または全体の植物の一部に望
ましく有用な化合物の産生における可能な増加を生じさ
せるために理想的な様式で使用され得る。 【０１２４】本発明の範囲内で使用され得る遺伝子は、
例えば、葉、種子、塊茎、根、茎その他における保存物
質または貯蔵物質の増加した形成を導く遺伝子を包含す
る。トランスジェニック植物により産生され得る望まし
い物質は、例えばタンパク質、デンプン、糖、アミノ酸
、ビタミン、アルカロイド、フラビン、芳香剤および色
素、脂肪その他を包含する。 【０１２５】薬学的に活性な物質、例えばある種のアル
カロイド、ステロイド、ホルモン、免疫モジュレーター
およびその他の生理学的に活性な物質をコードする構造
遺伝子もまた、本発明に係る調節ＤＮＡ配列に結合され
得る。 【０１２６】それ故に、本発明範囲内で考慮され得る遺
伝子は公知遺伝子、例えば植物に特有の遺伝子、例えば
トウモロコシからのゼイン遺伝子、オート麦からのアベ
ニン遺伝子、イネからのグルテリン遺伝子等、哺乳類特
有の遺伝子、例えばインシュリン遺伝子、ソマトスタチ
ン遺伝子、インターロイキン遺伝子、ｔ−ＰＡ−遺伝子
等、または微生物起源の遺伝子、例えばＮＰＴＩＩ遺伝
子等ならびに合成遺伝子、例えばインシュリン遺伝子等
を包含するが、しかしこれに限定されない。 【０１２７】有用でそして望ましい特性をコードする天
然に生じる構造遺伝子を別にして、本発明の範囲内で、
化学的方法または遺伝子操作方法を用いる特定の方法で
予め変形した遺伝子を使用することも可能である。 【０１２８】さらに、本発明の広い概念はまた、化学合
成により全体が製造される遺伝子も包含する。それ故に
、本発明の範囲内で使用され得る遺伝子またはＤＮＡ配
列は、本発明の範囲内で与えられた定義に従う、相同お
よび異種遺伝子またはＤＮＡおよび合成遺伝子またはＤ
ＮＡである。インシュリン遺伝子がこの点で合成遺伝子
の例として記載され得る。 【０１２９】本発明の範囲内で使用され得るＤＮＡ配列
は、ゲノムＤＮＡから、ｃＤＮＡから、または合成ＤＮ
Ａから排他的に構築される得る。もう一つの可能性は、
ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡ
からなるハイブリッドＤＮＡ配列の構築である。 【０１３０】その場合、ｃＤＮＡはゲノムＤＮＡと同じ
遺伝子から生じてもよく、またｃＤＮＡとゲノムＤＮＡ
の両方が異なる遺伝子から生じてもよい。しかしながら
、あらゆる場合において、ゲノムＤＮＡおよび／または
ｃＤＮＡは同一遺伝子または異なる遺伝子から個々に各
々製造されてもよい。 【０１３１】ＤＮＡ配列が１以上の遺伝子の部分を含む
場合には、これらの遺伝子は１種そして同一個体に由来
しても、または同一属の同一種もしくは様々な種の種々
の株もしくは変種に属する種々の個体に由来しても、ま
た同一もしくは異なる分類学上の単位（門）の１以上の
属に属する個体に由来してもよい。 【０１３２】植物細胞中の上記構造遺伝子の発現を確実
にするために、コード遺伝子配列は植物細胞内で機能し
得る発現配列に操作可能な様式で最初に連結されること
が有利である。 【０１３３】従って、本発明の範囲内のハイブリッド遺
伝子構築物は、本発明に係るＤＮＡ配列に加えて、１種
またはそれ以上の構造遺伝子ならびにプロモーターおよ
びターミネーター配列の両方および３’および５’非翻
訳領域のその他の調節配列を包含する発現シグナルを含
有する。 【０１３４】コードＤＮＡ配列（構造遺伝子）の発現の
誘導を引き起こし得るあらゆるプロモーターおよびあら
ゆるターミネーターをハイブリッド遺伝子配列の成分と
して使用し得る。植物または植物ウイルスの遺伝子に由
来する発現シグナルは特に適当である。適当なプロモー
ターおよびターミネーターの例は、カリフラワーモザイ
クウイルス遺伝子（ＣａＭＶ）のもの、または記載した
発現シグナルの特徴的な特性を依然有する相同ＤＮＡ配
列である。細菌の発現シグナル、特にアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンスのＴｉプラスミドからのノパリ
ンシンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）またはオクトピンシンタ
ーゼ遺伝子（ｏｃｓ）もまた適当である。 【０１３５】ＣａＭＶゲノムの３５Ｓおよび１９Ｓ発現
シグナルまたはそれらの相同物が本発明の範囲内で好ま
しく、例えば文献〔３４〕に記載されるような分子生物
学的方法を用いて前記ゲノムから単離され、そしてコー
ドＤＮＡ配列に結合され得る。 【０１３６】３５Ｓおよび１９Ｓ発現シグナルの相同物
は、本発明の範囲内で、わずかな配列の相違があっても
実質的に出発配列と実質的に相同であり、そしてそれら
の出発配列と同一の機能を依然有する配列を意味するも
のとして理解されるべきである。 【０１３７】本発明に従って、３５Ｓ転写制御配列に使
用される出発材料は、例えば遺伝子地図〔１５〕のヌク
レオチド６８０８−７６３２を包含するＣａＭＶ“Ｓ”
株のＳｃａＩ断片であってよい。 【０１３８】１９Ｓプロモーターおよび５’非翻訳領域
は、ＣａＭＶ遺伝子地図〔２５〕のＰｓｔＩ部位（５３
８６位）とＨｉｎｄＩＩＩ　部位（５８５０位）との間
のゲノム断片上に位置する。相当するターミネーターお
よび３’非翻訳領域は、ＣａＭＶゲノムの７３４２位と
７６４３位との間のＥｃｏＲＶ／　ＢｇｌＩＩ断片上に
位置する。 【０１３９】完全なヌクレオチド配列が文献〔１６〕に
記載されているＣａＭＶ　　ＣＭ１８４１株の発現シグ
ナルが本発明の範囲内で好ましい。 【０１４０】使用し得る効果的な植物プロモーターのも
う１つの例は、過産生植物プロモーターである。この種
のプロモーターは、所望の遺伝子産物をコードする遺伝
子配列に操作可能に連結されているならば、前記遺伝子
配列の発現を仲介可能であるべきでる。 【０１４１】本発明の範囲内で使用し得る過産生植物プ
ロモータは、ダイズからのリブロース−１，５−ビスホ
スフェートカルボキシラーゼの小サブユニットのプロモ
ーターおよびクロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロ
モーターを包含する。これらの２種のプロモーターは、
それらが真核植物細胞において光により誘導されるとい
う事実で知られている（例えば、文献〔９〕参照）。 【０１４２】それ故に、本発明は、本発明に係るＤＮＡ
配列が発現性ＤＮＡおよび植物細胞内で活性な発現シグ
ナルならびに場合により３’および／または５’領域の
その他のコード配列および／または非コード配列に操作
可能に連結され、その結果植物宿主内で形質転換して、
発現産物が特異的に植物液胞内に方向づけられるキメラ
遺伝子構築物からなる組換えＤＮＡ分子に関する。 【０１４３】本発明に係るＤＮＡ配列が形質転換された
植物細胞およびそれらから発生する組織、特に植物に、
病原体、化学物質および不利な環境要因に対する保護作
用を付与する構造遺伝子と操作可能に連結されているキ
メラ遺伝子構築物を含む組換えＤＮＡ分子が特に好まし
い。 【０１４４】本発明に係るＤＮＡが植物細胞内でキチナ
ーゼ、特に酸性キチナーゼまたはグルカナーゼ、特に酸
性グルカナーゼを発現する構造遺伝子と操作可能に結合
されているキメラ遺伝子構築物を含む組換えＤＮＡ分子
が本発明の範囲内でとりわけ好ましい。 【０１４５】本発明はまた、形質転換された植物細胞自
体または組織、器官、カルス、胚および全体の植物から
なる群から選択されるより高度なオーガナイゼーション
単位の部分において発現して、望ましく有用な化合物の
植物液胞内への方向づけを導く、構造遺伝子と本発明に
係るＤＮＡ配列が操作可能に結合されているキメラ遺伝
子構築物を含む組換えＤＮＡ分子を包含する。 【０１４６】液胞内に本来本来存在するタンパク質をコ
ードする遺伝子、特に塩基性キチナーゼ遺伝子、とりわ
けタバコまたはキュウリ植物体からの塩基性キチナーゼ
遺伝子が、該タンパク質分子が細胞外空間に分泌される
ように変性されたキメラ遺伝子構築物を含む組換えＤＮ
Ａ分子はさらに好ましい。詳細には、このことは、前記
遺伝子、特にキチナーゼ遺伝子に本来存在し、液胞内へ
の方向づけに関連するＤＮＡ配列を含むＣ末端範囲の除
去または不活性化を、遺伝子工学法を用いて、例えばＣ
末端範囲の前に直接停止コドンを挿入することにより行
われ得る。 【０１４７】キメラ遺伝子の構築に使用され得るその他
の調節ＤＮＡ配列は、例えば誘導または抑制によって植
物組織内で結合ＤＮＡ配列の転写を制御し得る配列を包
含する。 【０１４８】種々の内部および外部要因、例えば植物ホ
ルモン、熱ショック、化学物質、病原体、酸素不足、光
、その他により誘導されることが知られている個々の植
物遺伝子が例として挙げられる。 【０１４９】植物ホルモンによる遺伝子調節の例として
、ワタの後胚期の間に生じる過剰のｍＲＮＡを誘導する
ことが知られているアブシジン酸（ＡＢＳ）が言及され
るべきである。その他の例は、ヒマの実におけるマレー
トシンターゼ転写物および大麦の糊粉層におけるα−ア
ミラーゼのイソ酵素を誘導するジベレリン酸（ＧＡ３）
である。 【０１５０】マメの葉におけるグルカナーゼまたはグル
カナーゼおよびキチナーゼまたはグルカナーゼの活性は
ストレスホルモンエチレンとの処理により著しく高めら
れ得る。キチナーゼの場合、誘導作用はキチナーゼ遺伝
子のプロモーターを介して制御され、そしてマメ〔ファ
セオルス・ヴァルガリス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌ
ｇａｌｉｓ）〕のキチナーゼ遺伝子からのプロモーター
を用いるリポーター遺伝子試験により、これを示すこと
が可能だった。 【０１５１】ダイズの熱ショック感受性タンパク質遺伝
子の調節は詳細に研究されてきた。４０℃の温度で数時
間植物を処理すると、いわゆる熱ショックタンパク質の
新たな合成を生じる。これまで非常に多くの遺伝子が単
離され、そしてそれらの調節が詳細に分析された。それ
らの遺伝子の発現は転写段階で主として制御される。例
えば、ｈｐｓ７０遺伝子のプロモーターがネオマイシン
ホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子と
融合される場合、その様にして形成されたキメラ遺伝子
は熱ショックにより誘導され得る〔６７〕。 【０１５２】植物内に誘導可能な遺伝子のもう一つのク
ラスは、光調節化遺伝子、特にリブロース１，５−ビス
ホスフェートカルボキシラーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小
サブユニットの核コード化遺伝子からなる。文献〔４１
〕は、リポーター遺伝子がエンドウからのＲＵＢＩＳＣ
Ｏ遺伝子の５’−フランキング配列にキメラの形態で連
結される場合に、該５’−フランキング配列がリポータ
ー遺伝子に光誘導性を導入し得ることを示した。この観
察をその他の光誘導化遺伝子、例えばクロロフィルａ／
ｂ結合タンパク質に広げることも可能となった。 【０１５３】トウモロコシのアルコールデヒドロゲナー
ゼ遺伝子（ａｄｈ遺伝子）が鋭意研究の対象だった。ト
ウモロコシからａｄｈ１−ｓ遺伝子が単離され、そして
一時的に形質転換された組織が嫌気条件下に暴露された
とき５’−フランキングＤＮＡがキメラリポーター遺伝
子（例えばクロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ，ＣＡＴ）の発現を誘導し得ることが示された〔
２８〕。 【０１５４】制御可能なＤＮＡ配列のその他の群は化学
的に制御可能な配列であり、それは例えばタバコのＰＲ
（病原体関連）タンパク質遺伝子内に存在し、そして化
学調節剤により誘導され得る。 【０１５５】上に例示した調節性ＤＮＡ配列は、天然起
源または合成起源であってよく、また天然および合成Ｄ
ＮＡ配列の混合物からなっていてよい。 【０１５６】発現性ＤＮＡ、特に挿入されるべき構造遺
伝子が、植物細胞内で機能し得るＮ末端シグナルペプチ
ドをコードする配列を含むか、またはそのような配列に
５’末端領域で連結されていることは有利である。シグ
ナルペプチドは内膜系を介して輸送されるタンパク質の
Ｎ末端に見出される輸送シグナルである。このシグナル
配列は、上記タンパク質が最初に小胞体を通過し、そこ
でシグナルペプチドがその機能を果たすとすぐに前駆体
タンパク質からタンパク質分解的に分離されることを可
能にする。その特異的な機能のために、このタイプのシ
グナルペプチド配列は、バクテリア、酵母、菌類、動物
または植物によらず全ての生存細胞において進化の間に
高度に保存されてきた。 【０１５７】さらに、ＤＮＡ分子は、全体として液胞中
に入り込む能力の改善に寄与するペプチド断片、例えば
スポラミンのＮ末端範囲にマツオカおよびナカムラによ
り発見されたペプチド断片〔３５〕をコードする配列の
その他の部位を含んでいてもよい。 【０１５８】それ故に、本発明は、本発明に係る標的性
配列の他に、構造遺伝子またはあらゆるその他の発現性
遺伝子、例えば遺伝子発現の特異的に制御される誘導ま
たは抑圧を可能にするＤＮＡ配列のその他の制御部位を
操作可能に連結されて含むキメラ遺伝子構築物を包含す
る。 【０１５９】配列の種々の部位はそれ自体公知の方法に
より互いに連結されて、植物細胞内で発現可能な完全な
ＤＮＡ配列を形成する。適当な方法は、例えば相同部位
を有するＤＮＡ配列の生体内組換えおよび制限断片の試
験管内連結を包含する。 【０１６０】一般的に使用されるクローニングベクター
は宿主細胞に適合する種起源の、複製および制御配列を
有するプラスミドまたはウイルス（バクテリオファージ
）ベクターである。 【０１６１】クローニングベクターは一般的に、一つの
複製開始点、そしてさらに形質転換された宿主細胞内で
表現型の選択特性、特に抗生物質またはある種の除草剤
に対する耐性を導く特有の遺伝子を有する。宿主細胞内
で形質転換後、形質転換されたベクターはこれらの表現
型マーカーにより選択され得る。 【０１６２】本発明の範囲内で使用され得る選択可能な
表現型マーカーは、例えばこれが本発明の主題を限定す
ることなくアンピシリン、テトラサイクリン、ハイグロ
マイシン、カナマイシン、メトトレキサート、Ｇ４１８
およびネオマイシンに対する耐性を包含する。 【０１６３】本発明の範囲内の適当な宿主細胞は、原核
生物であり、細菌宿主、例えばアグロバクテリウム・チ
ュメファシエンス（Ａ．　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、
大腸菌（Ｅ．　ｃｏｌｉ）　、エス．・チフィムリウム
（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびセルラチア・マ
ルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎ
ｓ）　およびシアノバクテリアを含む。真核生物宿主、
例えば酵母、菌糸体形成菌および植物細胞も本発明の範
囲内で使用できる。 【０１６４】本発明に係るハイブリッド遺伝子構築物の
適当なクローニングベクター内へのスプライシングは、
例えば文献〔３４〕に記載された標準法を用いて行われ
る。 【０１６５】一般的に、スプライシングされるべきベク
ターおよびＤＮＡ配列をまず最初に適当な制限酵素で切
断する。適当な制限酵素は、例えばブラント末端を有す
る断片を生じるもの、例えばＳｍａ　Ｉ、Ｈｐａ　Ｉお
よびＥｃｏＲＶ　、または粘着端を形成する酵素、例え
ばＥｃｏＲＩ　、Ｓａｃ　ＩおよびＢａｍＨＩ　である
。 【０１６６】ブラント末端を有する断片と互いに相補的
である粘着端を有する断片の両方を、適当なＤＮＡリガ
ーゼにより再び連結し、連続的で均一なＤＮＡ分子を形
成することができる。 【０１６７】突出する粘着端を有するＤＮＡ断片を大腸
菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片と処理して、相当
する相補的ヌクレオチドで空隙を充填することによりブ
ラント末端を製造することもできる。 【０１６８】他方、例えば、末端デオキシヌクレオチジ
ルトランスフェラーゼを用いて所望のＤＮＡ配列および
切断されたベクター分子の端部に相補的ホモポリマー尾
部を添加するか、または制限切断部位を有する合成オリ
ゴヌクレオチド配列（リンカー）を添加し、そして次に
適当な酵素で切断することにより、粘着端を人工的に製
造することもできる。 【０１６９】本発明の範囲内で、キチナーゼ突然変異体
の構築において、使用されるキチナーゼクローンの種々
の部分は互いに連結される。この目的を達成し得るため
に、それらの部分は類似していなければならず、すなわ
ち、適当な制限切断部位は種々の配列中に導入されなれ
ばならない。それ故に、本発明の特定の実施態様におい
て、以下の示した制限切断部位が好ましくは使用され、
それらは全て同一粘着端を導く： ＢａｍＨＩ　〔Ｇ／ＧＡＴＣＣ　〕 ＢｃｌＩ　　〔Ｔ／ＧＡＴＣＡ　〕 ＢｇｌＩＩ　〔Ａ／ＧＡＴＣＴ　〕 読み枠は、ＧＡＴがアスパラギン酸のコドンとして機能
するように各々の場合において選択されるのが好ましい
。 【０１７０】クローニングベクターおよび該ベクターで
形質転換された宿主細胞は、一般にベクターのコピー数
を増やすために使用される。増加したコピー数によって
、ハイブッド遺伝子構築物を有するベクターを単離する
こと、そして例えばキメラ遺伝子配列を植物細胞内に挿
入するために前記ベクターを使用することが可能となる
。 【０１７１】その他の操作段階において、所望の遺伝子
産物をコードする構造遺伝子または制御機能を有する非
コードＤＮＡ配列、例えばアンチセンスＤＮＡを植物細
胞内に挿入し、そして場合によってはそれを植物ゲノム
内に組み込むために上記プラスミドを使用することがで
きる。 【０１７２】本発明はそれ故に、構造遺伝子またはその
他の望ましい遺伝子または遺伝子断片またはそれらのゲ
ノム内に含まれるその他の有用なＤＮＡ配列を含む受容
性植物細胞の作成にも関する。 【０１７３】キメラ遺伝子構築物の挿入は公知の遺伝子
導入方法を用いて植物プロトプラスト中で行われるのが
好ましい。 【０１７４】多くの非常に有効な方法が植物細胞中にＤ
ＮＡを導くために存在しており、該方法は遺伝子導入ベ
クターの使用または直接遺伝子導入方法に基づいている
。 【０１７５】一つの可能な方法は、例えば植物細胞をウ
イルスまたはアグロバクテリウムと接触させることから
なる。これは、感受性植物細胞を感染させるか、または
該植物細胞から誘導されたプロトプラストを共培養する
ことにより達成され得る。本発明の範囲内でカリフラワ
ーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）が植物内への本発明に
係るキメラ遺伝子構築物の挿入のためのベクターとして
使用されてもよい。ＣａＭＶの全ウイルスＤＮＡゲノム
が細菌親プラスミド内に組み込まれ、細菌中で増殖され
得る組換えＤＮＡ分子を形成する。クローニングが行わ
れた後、組換えプラスミドは制限酵素を用いて無作為に
または該組換えプラスミドのウイルス部分、例えばアフ
ィドによりウイルスの移動性をコードする遺伝子内の非
常に特異的な非必須部位で切断し、そしてハイブリッド
遺伝子構築物が切断部位中にクローン化される。 【０１７６】単一の特定の制限認識部位を有する小さい
オリゴヌクレオチド、いわゆるリンカーもまた組み込ま
れ得る。そのようにして変形された組換えプラスミドは
再びクローン化され、そしてハイブリッド遺伝子構築物
をたった一度出現する制限部位中にスプライシングさせ
ることによりさらに変形される。 【０１７７】組換えプラスミドの変形ウイルス部分は次
いで細菌の親プラスミドから切り出され、そして植物細
胞または全体の植物の接種のために使用される。 【０１７８】キメラ遺伝子構築物を細胞中に挿入するも
う一つの方法は、該遺伝子構築物を用いて形質転換され
たアグロバクテリウム・チュメファシエンスおよび／ま
たはアグロバクテリウム・リゾゲネスでの植物細胞の感
染を利用する。トランスジェニック植物細胞は次に当業
者には公知の適当な培養条件下で培養され、その結果そ
れらは苗条および根を形成し、そして全体の植物が最終
的に形成される。 【０１７９】植物材料を形質転換するもう一つの可能な
方法は、文献〔４８〕にニンジンの形質転換のために記
載されたように、アグロバクテリウム・リゾゲネスおよ
び形質転換されたアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンスの両方を用いる混合感染からなる。混合比率は、ア
グロバクテリウム・リゾゲネスの形質転換に基づいて形
成された根コロニーが高比率のアグロバクテリウム・チ
ュメファシエンスＴｉプラスミドを含むようでなければ
ならない。このことは、例えば、アグロバクテリウム・
リゾゲネスおよびアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンスを一緒に植物材料に公知方法により混合比率１：１
ないし１：１００で、好ましくは１：１０で適用するこ
とにより達成され得る。トランスジェニック植物は次に
当業者には公知の適当な培養条件下で培養され、その結
果それらは苗条および根を形成し、そして全体の植物が
最終的に形成される。２つのアグロバクテリウム種は、
形質転換されるべき植物材料の実際の接種直前に混合さ
れるのが有利である。 【０１８０】本発明に係るキメラ遺伝子構築物は、それ
故に、例えばアグロバクテリウム・チュメファシエンス
のＴｉプラスミドまたはアグロバクテリウム・リゾゲネ
スのＲｉプラスミドにより適当な植物細胞内に形質転換
され得る。ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミドはアグ
ロバクテリウムによる感染を介して植物に導入され、そ
して適当な様式で植物ゲノム内に組み込まれる。 【０１８１】ＴｉプラスミドおよびＲｉプラスミドの両
方は形質転換された細胞の産生に必須である２つの領域
を有する。それらの領域の１つ、トランスファーＤＮＡ
（Ｔ−ＤＮＡ）領域は植物に導入され、そして腫瘍の誘
導を導く。その他の領域、毒性付与（ｖｉｒ）領域は、
腫瘍の維持のためでなく、腫瘍形成のためにだけ必要で
ある。トランスファーＤＮＡ領域の大きさは移動性を損
傷することなくキメラ遺伝子構築物の組み込みにより大
型化され得る。腫瘍誘導遺伝子を除去し、そして選択性
マーカーを組み込むことにより、変形されたＴｉプラス
ミドまたはＲｉプラスミドは適当な植物細胞内への本発
明に係る遺伝子構築物の導入のためのベクターとして使
用される得る。 【０１８２】ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡ領域およびｖｉ
ｒ領域が同一アグロバクテリウム細胞内の同一ベクター
に存在するか、または異なるベクターに存在するかに関
係なく植物細胞のゲノムに、アグロバクテリウムのＴ−
ＤＮＡの導入を引き起こす。染色体上のｖｉｒ領域はま
た、ベクターから植物細胞へのＴ−ＤＮＡの移動を誘導
する。 【０１８３】それ故に本発明の範囲内で、植物細胞内に
アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡ領域を導入するための
系が好ましく使用されるが、該系においてｖｉｒ領域お
よびＴ−ＤＮＡ領域は異なるベクターに位置している。 そのような系は「二元ベクター系」として知られており
、そしてＴ−ＤＮＡを含むベクターは「二元ベクター」
と呼ばれる。 【０１８４】植物細胞内に形質転換され得、そして形質
転換された細胞の選択を可能にするあらゆるＴ−ＤＮＡ
含有ベクターは本発明の範囲内での使用に適している。 【０１８５】左側境界配列（ＬＢ）と右側境界配列（Ｒ
Ｂ）との間にクローン化された本発明に係るキメラ遺伝
子構築物を含み、そして大腸菌およびアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンスの両方で安定に複製可能である
シャトルベクターが本発明の範囲内で特に好ましい。 【０１８６】新規に開発された形質転換技術を用いて、
アグロバクテリウムの天然の宿主植物でない植物種を試
験管内で形質転換することが可能となった。例えば、単
子葉植物、特に穀類の種および種々のグラス類はアグロ
バクテリウムの天然の宿主ではない。 【０１８７】単子葉類はアグロバクテリウムを用いて形
質転換され得ることが徐々に明らかになってきており、
その結果、現在利用可能である新規実験方式を用いて、
穀類およびグラス類の種もまた形質転換されやすい〔２
０〕。 【０１８８】アグロバクテリウムを用いるいわゆる葉デ
ィスク形質転換〔２７〕が本発明の範囲内で好ましい。 適当な標的植物からの滅菌葉ディスクを本発明に係るキ
メラ遺伝子構築物の一つを含有するアグロバクテリウム
細胞と培養し、そして次に適当な栄養培地中または該培
地上に移す。それ故に、本発明の範囲内では、寒天の添
加により固化され、そして慣用の植物生長調節剤、特に
α−ナフト酢酸、ピクロラム、２，４，５−トリクロロ
フェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、イ
ンドール−３−酪酸、インドール−３−乳酸、インドー
ル−３−コハク酸、インドール−３−酢酸およびｐ−ク
ロロフェノキシ酢酸からなるオーキシンの群、カイネチ
ン、６−ベンジルアデニン、２−イソペンテニルアデニ
ンおよびゼアチンからなるサイトカイニンの群から選択
されるもの１種またはそれ以上で富化されたＬＳ培地が
特に適当である。オーキシンおよびサイトカイニンの好
ましい濃度は０．１ｍｇ／ｌないし１０ｍｇ／ｌの範囲
内である。 【０１８９】２０℃ないし４０℃、好ましくは２３℃な
いし３５℃、特に２５℃の温度および散光下で、数日間
、しかし好ましくは２ないし３日間の培養後、葉ディス
クを苗条誘導のために適当な培地に移す。選択物質が添
加され、オーキシンを含有せずにサイトカイニンを含む
ＬＳ培地が特に好ましい。培養物は光の中に保持され、
適当な間隔で、しかし好ましくは１週間の間隔で新鮮培
地に移される。発生する未熟苗条が切り取られ、そして
苗条を誘導する培地中でさらに培養されて根を形成する
。本発明の範囲内では、オーキシンまたはサイトカイニ
ンを含有しないが、形質転換体の選択のための選択物質
を含有するＬＳ培地が特に好ましい。 【０１９０】アグロバクテリウム仲介形質転換の他に、
本発明の範囲内では、植物材料内に本発明に係る遺伝子
構築物を挿入するための直接形質転換法を用いることも
可能である。 【０１９１】例えば、ベクター内に包含された遺伝物質
は、純粋な物理的方法、例えば細く引き伸ばされたマイ
クロピペットを用いるマイクロインジェクション〔４５
〕または形質転換性ＤＮＡで被覆されているマイクロプ
ロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）　
での細胞の砲撃〔７１〕により、植物細胞内に直接挿入
され得る。 【０１９２】植物細胞内への遺伝物質の直接導入のその
他の可能な方法は、原形質膜を変性する操作、例えばポ
リエチレングリコール処理、熱ショック処理もしくはエ
レクトロポレーションまたはそれらの組合せ〔５９〕を
用いるプロトプラストの処理からなる。 【０１９３】エレクトロポレーション技術において、植
物プロトプラストはハイブリッド遺伝子構築物を含むプ
ラスミドと共に高電圧の電気パルスに晒される。これは
生体膜の透過性に可逆的増加をもたらし、そしてプラス
ミドの挿入を可能にする。エレクトロポレーションされ
た植物プロトプラストはそれらの細胞壁を新たに作り、
分化し、そしてカルス組織を形成する。形質転換された
植物細胞の選択は上記の表現型マーカーを用いて行われ
得る。 【０１９４】植物細胞への遺伝物質の直接導入のその他
の方法は、純粋に化学的な方法に基づき、形質転換が非
常に効率良くそして迅速に行われることを可能にするも
のであり、文献〔４４〕や〔１９〕に記載されている。 【０１９５】共形質転換を用いる直接遺伝子導入〔５７
〕もまた植物材料の形質転換に適当である。 【０１９６】共形質転換は植物ゲノム内への種々のＤＮ
Ａ分子（非選択性および選択性遺伝子）の同時取り込み
および組み込みに基づいており、そしてそれ故に非選択
性遺伝子で形質転換された細胞の検出を可能にする方法
である。 【０１９７】例として上に挙げた可能な形質転換法のリ
ストは完全であると主張するものでなく、そして本発明
の対象をなんら制限するものでもない。 【０１９８】それらのゲノム内に組み込まれたハイブリ
ッド遺伝子構築物を含む細胞クローンは通常の選択、ス
クリーニングおよび検出を用いて選択され、そしてトラ
ンスジェニック植物の再生のために使用される。 【０１９９】全体の植物を形成するために培養液中に保
持されたプロトプラストの再生は、例えば文献〔５０〕
に記載されている。 【０２００】再生方法は植物の種によって異なる。しか
しながら、一般的に、公知の培養培地の一つにおいてプ
ロトプラストが分化しそして細胞壁を形成するように刺
激される。特定の活性剤、例えばオーキシンおよびサイ
トカイニンとの処理により根または苗条を形成するよう
に誘導され得るカルス培養物が最終的に形成される。 【０２０１】そのようにして得られた小植物は土壌に移
され、そして通常の実生と同様にさらに栽培され得る。 【０２０２】効率的な再生は培地、遺伝子型およびこれ
までの培養歴に特に依存する。これらの３つの変数が適
当に制御される場合、再生は完全に再現および反復可能
である。 【０２０３】植物ゲノムの組み込み成分として上記のハ
イブリッド遺伝子構築物の植物細胞内で発現可能な構造
遺伝子を含む再生されたトランスジェニック植物は、好
ましくは滅菌苗条培養体の形態で、活発に増殖させるこ
とができる。 【０２０４】再生されたトランスジェニック植物の植物
ゲノム内への操作上の発現性遺伝子の安定な組み込みは
、組み込まれた遺伝子の有糸分裂安定性との関係により
、そして有糸分裂の間のメンデル形質としてのふるまい
に基づいて、さらにサザンブロット分析〔６６〕を用い
て変更される。 【０２０５】それ故に本発明の広い概念は、上記方法に
より形質転換され、そして発現可能な形態で本発明に係
る組換えＤＮＡを含むプロトプラスト、細胞、カルス、
組織、器官、種子、胚、花粉、胚珠、接合子および全体
の植物、特に全体の稔性植物からなる群から選択される
トランスジェニック植物材料ならびに該トランスジェニ
ック植物材料の製造方法を包含する。 【０２０６】植物液胞内に特異的に方向づけられる遺伝
子産物を含む形質転換された植物材料の作出方法は以下
の工程： （ａ）まず最初に、液胞内に特異的に方向づけるのに関
連するＤＮＡ配列を公知方法により、適当な供給源から
単離するか、または合成し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列をあらゆる所望の発現性ＤＮＡ配列
の３’末端に操作可能な 様式で挿入し、 （ｃ）生成した構築物を植物発現ベクター中に植物内で
活性な発現シグナルの制御下にクローニングし、そして
（ｄ）該発現ベクターを植物材料内に公知方法により形
質転換し、そしてその中で発現ベクターを発現させる、
から実質的になる。 【０２０７】上記ＤＮＡがＮ末端シグナルペプチドを本
来コードする構造遺伝子でないならば、発現されるべき
ＤＮＡの５’末端領域に前記シグナルペプチドをコード
するＤＮＡ配列をさらに操作可能に挿入することは有利
である。 【０２０８】以下の工程： （ａ）上記タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離し
、 （ｂ）特定の細胞区画への方向づけに関連するＣ末端に
ある標的性配列を読み枠から除去し、 （ｃ）上記の変異させたＤＮＡ配列を適当な植物発現ベ
クター中にスプライシングし、そして （ｄ）生成した構築物を植物材料内に形質転換する、か
ら実質的になる、細胞外空間に特異的に筆される遺伝子
産物を含む形質転換された植物材料の作出方法もまた本
発明は包含する。 【０２０９】本発明の範囲内で、プロトプラスト、細胞
、カルス、組織、器官、種子、胚、花粉、胚珠、接合子
および全体の植物、その他からなる群から選択される植
物材料から再生され得、そして本発明に係る組換えＤＮ
Ａ分子の一つを含む、それらの有性および無性の後代を
包含するトランスジェニック植物が好ましい。 【０２１０】野生型に比べ植物液胞および／または細胞
外空間内に著しく増加されたタンパク質含量を有する、
トランスジェニック植物ならびにその有性および無性の
後代が好ましい。 【０２１１】野生型に比べ植物液胞内に著しく増加され
たキチナーゼ含量を有する、トランスジェニック植物な
らびにその有性および無性の後代が特に好ましい。 【０２１２】野生型に比べ植物液胞内に著しく増加され
たグルカナーゼ含量を有する、トランスジェニック植物
ならびにその有性および無性の後代が特に好ましい。 【０２１３】「トランスジェニック植物の無性および／
または有性の後代」という本発明の範囲内で定義された
ような表現はそれ故に、公知方法、例えば細胞融合また
は突然変異選択により得られ、そして形質転換された出
発植物体の特徴的な特性を依然有するあらゆる突然変異
体および変種を含み、そして形質転換された植物材料を
用いて得られる全てのハイブリッド形成体および融合産
生物をも包含する。 【０２１４】本発明はまた、トランスジェニック植物の
増殖材料に関する。本発明の範囲内で、トランスジェニ
ック植物の増殖材料とは、生体内または試験管内で有性
的にまたは無性的に増殖され得るあらゆる植物材料であ
ると理解されるべきである。本発明の範囲内で特に好ま
しいとみなされるべきである植物増殖材料は、特にプロ
トプラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚、花
粉、胚珠および接合子、ならびにトランスジェニック植
物から得ることができるあらゆるその他の増殖材料であ
る。 【０２１５】本発明はまた植物の部分、例えば本発明の
方法を用いて予め形質転換され、それ故に少なくとも一
部はトランスジェニック細胞からなるトランスジェニッ
ク植物またはそれらの後代から生じる花、茎、果実、葉
および根にも関する。 【０２１６】本発明の方法は、全ての植物、特に被子植
物亜門および裸子植物亜門の体系的な群に属するものの
形質転換に適当である。裸子植物亜門の中では球果植物
綱の植物が特に興味深い。 【０２１７】被子植物亜門の中では落葉樹および灌木に
加えて、ナス科、ジュウジバナ科、キク科、ユリ科、ブ
ドウ科、アカザ科、マツカゼソウ科、アリアセアエ科、
ヒガンバナ科、アスパラガセアエ科、ラン科、ヤシ科、
アナナス科、アカネ科、ツバキ科、バショウ科、アオイ
科またはホモノ科、およびマメ目、および特にパピリオ
ナセアエ科の植物が特に興味深い。ナス科、ジュウジバ
ナ科およびホモノ科の代表種が好ましい。 【０２１８】本発明の範囲内の標的作物は、例えばフラ
ガリア（Ｆｒａｇａｒｉａ）、ロータス（Ｌｏｔｕｓ）
　、メディケーゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、オノブリィキ
ス（Ｏｎｏｂｒｙｃｈｉｓ）、トリホリウム（Ｔｒｉｆ
ｏｌｉｕｍ）　、トリゴネラ（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）
、ビグナ（Ｖｉｇｎａ）　、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）
、リナム（Ｌｉｎｕｍ）　、ゼラニウム（Ｇｅｒａｎｉ
ｕｍ）、マニホット（Ｍａｎｉｈｏｔ）　、ドーカス（
Ｄａｕｃｕｓ）、アラビトプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓ
ｉｓ）　、ブラッシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、ラファヌ
ス（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、シナピス（Ｓｉｎａｐｉｓ）
　、アトロパ（Ａｔｒｏｐａ）、カプシカム（Ｃａｐｓ
ｉｃｕｍ）、ダチュラ（Ｄａｔｕｒａ）、ハイオシアム
ス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、リコペルシオン（Ｌｙｃ
ｏｐｅｒｓｉｏｎ）　、ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎ
ａ）　、ソラヌム（Ｓｏｌａｎｕｍ）　、ペチュニア（
Ｐｅｔｕｎｉａ）　、ジギタリス（Ｄｉｇｉｔａｒｉｓ
）　、マジョラナ（Ｍａｊｏｒａｎａ）、シコリウム（
Ｃｉｃｈｏｒｉｕｍ）　、ヘリアンタス（Ｈｅｌｉａｎ
ｔｈｕｓ）、ラクチュカ（Ｌａｃｔｕｃａ）　、ブロム
ス（Ｂｒｏｍｕｓ）、ゴッシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕ
ｍ）　、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）　、アン
チリヌム（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ）　、ヘメロカリス
（Ｈｅｍｅｒｏｃａｌｌｉｓ）、ネメシア（Ｎｅｍｅｓ
ｉａ）　、ペラルゴニウム（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ）
　、パニカム（Ｐａｎｉｃｕｍ）　、ペンニセタム（Ｐ
ｅｎｎｉｓｅｔｕｍ）、ラヌンクルス（Ｒａｎｕｎｃｕ
ｌｕｓ）、セネシオ（Ｓｅｎｅｃｉｏ）　、サルピグロ
ッシス（Ｓａｌｐｉｇｌｏｓｓｉｓ）、ククミス（Ｃｕ
ｃｕｍｉｓ）　、ブロワリナ（Ｂｒｏｗａｌｌｉａ）　
、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）　、ロリウム（Ｌｏｌｉ
ｕｍ）、ゼア（Ｚｅａ）　、トリチカム（Ｔｒｉｔｉｃ
ｕｍ）、ソルガム（Ｓｏｒｇｈｕｍ）　、イポモエア（
Ｉｐｏｍｏｅａ）　、パッシフローラ（Ｐａｓｓｉｆｌ
ｏｌａ）、シクラメン（Ｃｙｃｌａｍｅｎ）、マルス（
Ｍａｌｕｓ）　、プルナス（Ｐｒｕｎａｓ）、ローザ（
Ｒｏｓａ）、ルブス（Ｒｕｂｕｓ）　、ポプラス（Ｐｏ
ｐｕｌｕｓ）　、サンタラム（Ｓａｎｔａｌｕｍ）、ア
リウム（Ａｌｌｉｕｍ）、リリウム（Ｌｉｌｉｕｍ）、
ナルシサス（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ）　、アナナス（Ａｎ
ａｎａｓ）、アラキス（Ａｒａｃｈｉｓ）　、ファセオ
ルス（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ）　およびピサム（Ｐｉｓｕ
ｍ）　からなる群から選択されるものを含む。 【０２１９】植物の試験管内培養の分野、特に植物再生
の分野における新しい発展によって、ホモノ科の代表種
でさえも、植物プロトプラストから出発して全体の植物
を再生することが今可能となった。ホモノ科での再生実
験の成功の例は、イネのプロトプラストに対して文献〔
７９〕に、トウモロコシのプロトプラストに対して文献
〔５１〕および〔６０〕に、ダクチリス・グロメラタの
プロトプラストに対して文献〔２６〕に特に記載されて
いる。 【０２２０】それ故に本発明の範囲内で、以下の植物：
ロリウム、ゼア、トリチカム、ソルガム、サッカラム（
Ｓａｃｃｈａｒｕｍ）　、ブロムス、オリザエ（Ｏｒｙ
ｚａｅ）、アベナ（Ａｖｅｎａ）　、ホルデウム（Ｈｏ
ｒｄｅｕｍ）　、セカーレ（Ｓｅｃａｌｅ）およびセタ
リア（Ｓｅｔａｒｉａ）　を使用することも可能である
。 【０２２１】従って、本発明は好ましくは、プロトプラ
スト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚、花粉、胚
珠、接合子および全体の植物、その他からなる群から選
択される植物材料から再生され得、そして本発明に係る
組換えＤＮＡ分子の一つを含む、それらの有性および無
性の後代を包含するホモノ科の群からのトランスジェニ
ック植物に関する。 【０２２２】形質転換された植物細胞から得られた成熟
植物はそれ自体交雑され種子を生じる。種子のいくつか
は遺伝学の確立された法則に正確に従う比率でもって有
用で望ましい特性をコードする遺伝子を含有する。これ
らの種子はトランスジェニック植物の作出のために使用
され得る。 【０２２３】ホモ接合系は繰り返し自家受粉により、お
よび近交系の作出により得ることができる。これらの近
交系は順に雑種の発生のために使用され得る。この操作
において、上記外来遺伝子を含む近交系は繁殖のために
もう一つの近交系と交雑される。 【０２２４】 【実施例】本発明に関する一般的な説明をした後に、本
発明のよりよい理解のために次に実施例を記載するが、
これは説明のためだけのものであり、特記しない限り本
発明を制限するものではない。 【０２２５】以下に記載される本発明の特定の実施態様
において、本発明に係る標的性配列を持つ、およびそれ
を持たない塩基性キチナーゼ、および細胞外空間に本来
分泌されそしてＩ型またはＩＩ型キチナーゼと相同性が
ない非関連ＩＩＩ　型キチナーゼ（キュウリキチナーゼ
）がニコチアナ・シルベストリス（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
　ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）内に発現され、そしてそれら
の植物細胞内での位置が決定される。 【０２２６】液胞への標的指向局在のため、および細胞
外空間に特異的に後記タンパク質を原則的に送り出す可
能性のための、液胞内に本来存在するタンパク質のＣ末
端範囲の必要性は、タバコからの塩基性キチナーゼおよ
び塩基性グルカナーゼにより証明され得る。その末端に
向けて、液胞内に本来存在するタンパク質のＣ末端範囲
を形成する７または２２個のＣ末端アミノ酸は、除去さ
れるか、またはオリゴヌクレオチド仲介突然変異により
コード性配列内の適当な部位に適当な停止コドンを置く
ことにより不活性化される。これにより引き続いて細胞
空間内に送り出される突然変異グルカナーゼまたはキチ
ナーゼを生じる。 【０２２７】他方、本発明に係る標的性配列が結合タン
パク質を液胞内に特異的に方向づけ得ることを示すため
に、タバコからの塩基性キチナーゼのＣ末端配列はキュ
ウリの葉からの酸性キチナーゼに連結される。操作は以
下のとおりである：まず最初に、塩基性キチナーゼから
の５’非コード性配列およびその領域に同様に位置する
シグナルペプチドをコードする配列を成熟キュウリキチ
ナーゼをコードする配列に連結する。構築物の３’末端
は次にリンカー断片を介してタバコキチナーゼ遺伝子の
Ｃ末端範囲からの９個のアミノ酸をコードする配列に添
加される。上記構築物は次いで強力なＣａＭＶ３５Ｓプ
ロモーターの制御下におかれ、そしてアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンス形質転換によりニコチアナ・シ
ルベストリス植物内に挿入される。 【０２２８】形質転換が行われたら、強いキチナーゼ発
現を示すトランスジェニック植物が選択され、そしてキ
チナーゼの位置を分析するために使用される。プロトプ
ラストが作成され、そしてホモジネート中およびプロト
プラスト中のキチナーゼの比活性が比較される。 【０２２９】細胞内キチナーゼの細胞下局在を決定する
ために、液胞がプロトプラストから分離される。 【０２３０】一般的な組換えＤＮＡ技術本発明において
用いられる組換えＤＮＡ技術の多くは当業者にとって一
般的なものであるので、それらが出現する度に記載する
よりもむしろ通常用いられる技術に関してここで簡潔に
記載しておく方がよい。別に特記したことを除いて、こ
れらの全ての操作は文献〔３４〕に記載されている。 【０２３１】Ａ．制限エンドヌクレアーゼでの切断反応
バッチは典型的には、マサチューセッツ州ビバリーのニ
ュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ
ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　により推奨される緩衝溶液
中に約５０ないし５００μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む。制
限エンドヌクレアーゼ２ないし５単位をＤＮＡ１μｇに
つき添加し、そして反応バッチを上記の会社により推奨
される温度で１ないし３時間保温する。６５℃で１０分
間加熱するか、またはフェノールでの抽出により反応を
終結させ、エタノールでＤＮＡを沈澱させる。この方法
は文献〔３４〕の第１０４ないし１０６頁にも記載され
ている。 【０２３２】Ｂ．ブラント末端を製造するためのＤＮＡ
のポリメラーゼでの処理 ＤＮＡ断片５０ないし５００μｇ／ｍｌを、製造会社ニ
ュー・イングランド・バイオラブスにより推奨される緩
衝液中の反応バッチに添加する。反応バッチは全４種の
デオキシヌクレオチド三リン酸を０．２ｍＭの濃度で含
有する。反応は１５℃で３０分間の期間に起こり、次い
で６５℃で１０分間加熱することにより終結される。５
’突出末端を製造する制限エンドヌクレアーゼ例えばＥ
ｃｏＲＩ　およびＢａｍＨＩ　で切断することにより得
られる断片のためには、ＤＮＡポリメラーゼの大断片ま
たはクレノウ断片が使用される。３’突出末端を製造す
るエンドヌクレアーゼ例えばＰｓｔＩＩ　およびＳａｃ
Ｉにより製造される断片のためには、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼが使用される。これらの２つの酵素の使用は文献
〔３４〕の第１１３ないし１２１頁に記載されている。 【０２３３】Ｃ．アガロースゲル電気泳動およびゲルか
らのＤＮＡ断片の精製 アガロースゲル電気泳動を文献〔３４〕の第１５０ない
し１６３頁に記載のように水平型装置で行う。使用され
る緩衝液はその中に記載されているトリス−ホウ酸塩緩
衝液である。ＤＮＡ断片は、電気泳動の間にゲルまたは
タンク緩衝液に存在するか、または電気泳動の後に添加
されるいずれかの０．５ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウムを用
いて染色される。ＤＮＡを長波長の紫外線の照射により
視覚化する。断片をゲルから分離する場合には、使用さ
れるアガロースは低いゲル化温度のものであり、これは
ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル（Ｓｉｇｍ
ａＣｈｅｍｉｃａｌ）から入手できる。電気泳動後、望
ましい断片を削り取り、プラスチック管内に入れ、６５
℃で約１５分間加熱し、次いでフェノールで３回抽出し
、そしてエタノールで２回沈澱させる。この操作は文献
〔３４〕の第１７０頁の記載とはわずかに異なっている
。変法として、ＤＮＡはジェネクリーン・キット（Ｇｅ
ｎｅｃｌｅａｎ　ｋｉｔ）［米国カリフォルニア州ラ・
ジョラのバイオ１０１社（Ｂｉｏ　１０１　Ｉｎｃ．）
］　を用いてアガロースから単離され得る。 【０２３４】Ｄ．ＤＮＡ末端への合成リンカー断片の付
加 ＤＮＡ分子末端へ新規なエンドヌクレアーゼ切断部位を
添加することが望ましい場合、上の項に記載されている
ように、ブラント末端を製造するために、場合によって
はこの分子をまずＤＮＡポリメラーゼで処理する。この
断片約０．１ないし１．０μｇを、ニュー・イングラン
ド・バイオラブスから得られるホスホリル化リンカーＤ
ＮＡ約１０ｎｇに、同社のＴ４ＤＮＡリガーゼ２μｌお
よび同社により推奨される緩衝液中の１ｍＭＡＴＰを含
有する２０ないし３０μｌ容量中で添加する。１５℃で
一晩保温後、６５℃で１０分間加熱することにより反応
を終結させる。反応バッチを次に、合成リンカー配列で
切断する制限エンドヌクレアーゼに適当な緩衝液中に約
１００μｌに希釈し、そしてこのエンドヌクレアーゼ約
５０ないし２００単位を添加する。混合物を適温で２な
いし６時間保温し、次に断片をアガロースゲル電気泳動
に供し、そして上記Ｃのように断片を精製する。精製し
た断片は今では制限エンドヌクレアーゼでの切断により
製造された終端を有するであろう。これらの終端は通常
粘着性であり、その結果、精製断片は同じような粘着端
を有するその他の断片に容易に連結され得る。 【０２３５】Ｅ．ＤＮＡ断片からの５’末端ホスフェー
トの除去 プラスミドクローニング工程の間に、ベクタープラスミ
ドのホスファターゼでの処理はベクターの再環状化を減
少させる文献〔３４〕の第１３頁に記載されている）。 正しい制限エンドヌクレアーゼでのＤＮＡの切断の後、
ベーリンガー−マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍ
ａｎｎｈｅｉｍ）　から得られる子ウシ消化管のアルカ
リホスファターゼ１単位を添加する。ＤＮＡを３７℃で
１時間保温し、次にフェノールで２回抽出し、そしてエ
タノールで沈澱させる。 【０２３６】Ｆ．ＤＮＡ断片の連結 相補的な粘着端を有する断片を互いに結合させる場合、
各々の断片約１００ｎｇは、ニュー・イングランド・バ
イオラブスからのＴ４ＤＮＡリガーゼ約０．２単位をこ
の会社により推奨される緩衝液中に含有する２０ないし
４０μｌの反応混合物中で保温される。保温は１５℃で
１ないし２０時間行われる。ブラント末端を有するＤＮ
Ａ断片が結合される場合、それらはＴ４ＤＮＡリガーゼ
の量を２ないし４単位に増加させる以外は上記と同様に
保温される。 【０２３７】Ｇ．ＤＮＡの大腸菌内への形質転換大腸菌
ＨＢ１０１株がほとんどの実験において使用される。文
献〔３４〕の第２５０および２５１頁に記載されている
ように、塩化カルシウム法を用いてＤＮＡが大腸菌内に
導入される。 【０２３８】Ｈ．プラスミドのための大腸菌のスクリー
ニング 形質転換の後に、大腸菌の生成したコロニーは迅速プラ
スミド単離法により所望のプラスミドの存在が試験され
る。２種の慣用の方法は、文献〔３４〕の第３６６ない
し３６９頁に記載されている。 【０２３９】Ｉ．プラスミドＤＮＡの大規模な分離大腸
菌からプラスミドを大規模に分離する方法は文献〔３４
〕の第８８ないし９４頁に記載されている。 【０２４０】Ｊ．Ｍ１３ファージベクターにおけるクロ
ーニング 以下の記載においてファージＭ１３誘導体の二重鎖複製
体は決まりきった操作、例えば制限エンドヌクレアーゼ
での切断、連結その他のために用いられることが理解さ
れるべきである。特記しない限り、酵素はベーリンガー
・バイオラブス［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｌａｂ
ｓ（ＢＲＬ）］　から入手できる。それらはことわらな
い限り製造会社の指示に従って使用される。 【０２４１】Ｋ．サザンブロット分析 抽出したＤＮＡを最初に制限酵素で処理し、次いで０．
８％ないし１％のアガロースゲル中で電気泳動し、ニト
ロセルロース膜に移し〔６６〕、そして予めニック−ト
ランスレーションに供された検出されるべきＤＮＡ（Ｄ
ＮＡ比活性５×１０８　ないし１０×１０８　ｃ．ｐ．
ｍ．／μｇ）とハイブリッド形成させる。フィルターを
各回１時間３回６５℃で０．０３Ｍクエン酸ナトリウム
と０．３Ｍ塩化ナトリウムの水溶液を用いて洗浄する。 ハイブリッド形成したＤＮＡはＸ線フィルムを２４ない
し４８時間黒化することにより可視化される。 【０２４２】Ｌ．ウエスタンブロット分析ＳＤＳボリア
クリルアミドゲル電気泳動の後、タンパク質をニトロセ
ルロースまたはナイロンフィルターに電気泳動で移す。 このフィルターを次にブロック剤（例えばＰＢＳ中の５
％スキムミルク粉末；以下ミルク／ＰＢＳと記載する）
で前処理する。フィルターを次に検出されるべき化合物
と反応する抗血清（今回の場合、ウサギ抗タバコキチナ
ーゼＩｇＧ）と数時間保温する。このようにして前処理
したフィルターをミルク／ＰＢＳで数回洗浄し、次いで
酵素と結合している市販の第２の抗体〔例えばパーオキ
シダーゼ結合ヤギ抗ウサギ抗体〔バイオラッド（ＢＩＯ
ＲＡＤ）〕、ミルク／ＰＢＳ中に希釈１：２０００〕と
保温する。フィルターを再びＰＢＳ中で洗浄し、次に製
造会社（バイオラッド）の指示に従ってクロロナフトー
ルおよび過酸化水素で染色する。さらに詳しい記載は文
献〔５４〕になされている。 【０２４３】Ｍ．ペプチドの生成、精製および自動的配
列決定のための一般的技術 還元およびアルキル化：精製され、凍結乾燥されたタン
パク質を１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）および１０
ｍＭ　　ＥＤＴＡ含有の６Ｍ塩酸グアニジンに溶解させ
る。ジチオトレイトール（ＤＤＴ）を最終濃度２０ｍＭ
まで添加し、そして４−ビニルピリジンを最終濃度５０
ｍＭまで添加する。このバッチを次いで窒素雰囲気下で
１．５時間保温する。ピリジルエチル化された材料を次
にＨＰＬＣ〔アクアポアフェニルカラム（２．１×１０
ｃｍ，ブラウンリー）〕により脱塩する。カラムは０．
１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル：
イソプロパノール混合物（１：１）の５％から８０％に
及ぶリニアグラジエントで溶出される。 臭化シアン分解およびピログルタミン酸アミノペプチダ
ーゼでの消化：臭化シアン分解は文献〔６５〕に従って
その場で（ｉｎ　ｓｉｔｕ）　行われる。ピログルタミ
ン酸アミノペプチダーゼ（ベーリンガー・マンハイム）
での消化は文献〔１〕に従って行われる。 ＬｙｓＣ消化：タンパク質をエンドプロテイナーゼＬｙ
ｓＣ（ベーリンガー・マンハイム）で０．１Ｍトリス−
ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中室温で２４時間にわたり消化す
る（酵素：基質＝１：１０の比率）。生成するペプチド
をＨＰＬＣ〔アクアポアＣ８カラム（１×２２ｃｍ，ブ
ラウンリー）〕により単離する。０．１％ＴＦＡ中のア
セトニトリル：イソプロパノール（１：１）のリニアグ
ラジエント（０％ないし６０％）を溶出液として使用す
る。 トリプシン消化：タンパク質のトリプシン（クーパー）
での消化は０．１Ｍ塩化カルシウムを含む０．１Ｍ炭酸
水素アンモニウム（ｐＨ８．２）中３７℃の温度で行わ
れる（酵素：基質＝１：１００の比率）。保温時間は５
時間である。生成するペプチドをＨＰＬＣ（上記参照）
により分離する。この方法を変更して、消化は０．１Ｍ
トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）中３７℃で酵素：基質＝
１：５０の比率を用いて行われてもよい。その場合、保
温時間は２４時間である。生成するペプチドをＨＰＬＣ
〔ヴィダックＣ１８カラム（２．１×１５０ｃｍ）〕に
より、０．１％ＴＦＡ中のアセトニトリル：イソプロパ
ノール（１：１）のリニアグラジエント（０％ないし６
０％）を用いて分離する。 配列決定：自動化エドマン分解がアプライド・バイオシ
ステムズ４７０Ａガス相シーケンサーを用いて行われる
。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸の同定
はアプライド・バイオシステムズ１２９Ａ　　ＰＴＨ　
　アナライザーを用いて行われる。 【０２４４】かなり一般的な記載を説明するために、そ
して本発明のよりよい理解のために、特定の実施例を記
載するが、特記しない限り本発明はこれらに限定されな
い。同様のことが上記の例示にも当てはまる。 【０２４５】Ｉ．タバコからのｃＤＮＡおよびゲノム遺
伝子ライブラリィの作成 実施例１：植物材料 ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５植物を温
室中で、または表面滅菌種子から出発して生長させる。 種子の表面滅菌は以下のように行われる：種子２０ない
し３０個を約２００μｍの孔径を有するふるいに通し、
そして市販の１０％漂白液（ＮａＯＣｌ）１０ｍｌ中で
保温する。次いで種子を滅菌蒸留水で繰り返しすすぐ。 【０２４６】以下の実施例において、文献〔１２〕に従
ってニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５植物
から分離され得る柔細胞髄組織（Ｎ）のクローン化系列
を用いることが好ましい。 【０２４７】実施例２：組織培養 リンスマイゼルおよびスクッグ〔３３〕（ＬＳ）による
塩およびチアミン−ＨＣｌ濃度を含有し、１０ｇ／ｌの
寒天の添加により固化された基本培地上でタバコ組織を
培養する。その他の添加剤としてこの基本培地はｐＨ指
示剤例えばクロロフェノールレッド５ｍｇ／ｌを含有す
る。このＬＳ基本培地を基にし、そして引き続く実施例
において使用されるその他の培地はその他の添加剤とし
て、例えばカイネチン（１．４μＭ）〔サイトカイニン
培地〕またはα−ナフチル酢酸（１０．７μＭ）〔オー
キシン培地〕またはカイネチンおよびα−ナフチル酢酸
の混合物〔オーキシン／サイトカイニン培地（培地Ａ）
〕を含有する。 【０２４８】選択培地ＢおよびＣはα−ナフチル酢酸を
含有しないが、その代わりにその物質により形質転換体
が大量の非形質転換細胞および組織から選択され得るよ
うな選択物質を含有する。これらの選択培地の正確な組
成はＶＩＩ　項（培地）に示してある。 【０２４９】ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４
２５植物から分離された貯蔵系列（２７５Ｎ）はオーキ
シン／サイトカイニン培地（１０ｍｌ）上で２１日間隔
で継代培養される。すなわち、それらは各回新しい培地
（１０ｍｌ）上に接種され、そして明所２５℃で培養さ
れる。 【０２５０】培養組織中に高レベルのキチナーゼの誘導
のために、組織はオーキシン／サイトカイニン培地から
無ホルモン基本培地上に接種される。植物組織の培養お
よびキチナーゼ誘導に関するその他の詳細は文献〔１４
〕に記載されている。 【０２５１】実施例３：タバコプロトプラストの作成実
施例１による２日令のタバコ細胞懸濁液１００ｍｌを等
量の２倍濃厚酵素溶液と混合する。該酵素溶液は以下の
成分： 　　セルラーゼＲ．１０オノズカ（ヤクルト本社製）　
　　　　　　　　　１０．０　　ｇ／ｌ　　マセラーゼ
〔カリフォルニア州ラ・ホイアのベーリング・ダイアグ
ノスティクス（Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｓ）　製のリゾプス種からのペクチナーゼ〕２．５　　
ｇ／ｌ　　ペクトリアーゼＹ−２３（盛進製薬社製）　
　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０　　ｇ／ｌ
　　ＣａＮＯ３　・４Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１．４５ｇ／ｌ　　ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．５　　ｇ／ｌ　　ＮＨ４　Ｈ２　Ｐ
Ｏ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２３ｇ／ｌ
　　ＫＮＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１．２　　ｇ／ｌ　　Ｄ−マンニトール（ｐ
Ｈ５．７０）　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　７３．０　　ｇ／ｌを含有する。 【０２５２】上記酵素溶液を遠心分離し、そして０．２
ｍｍフィルターを通して滅菌する。タバコ懸濁培養液と
酵素溶液からなるバッチをロータリーシェーカー上（４
０ｒｐｍ）室温で５時間注意深くかきまぜる。特定の時
間間隔で、試料をこのバッチから採取し、そして顕微鏡
で分析する。細胞の約８０％が球形のプロトプラストに
変化するまで酵素消化を続ける。次に保温容器をシェー
カーから取り出す。細胞／プロトプラスト懸濁液を静置
し、そして細胞およびプロトプラストを含まない培地の
上半分をピペットで吸い上げて除き、それを廃棄する。 残部を５０ｍｌ遠心管に移し、臨床用遠心分離機（ＨＮ
−ＳＩＩ型，ＩＥＣ）内５００ｒｐｍで１０分間遠心分
離する。プロトプラスト含有ペレットはすすぎ溶液Ｉ（
ＶＩＩ　項参照）中に再懸濁され、そして次に１０００
ｒｐｍで１０分間再び遠心分離する。 【０２５３】プロトプラストを含有するバンドは遠心管
の上端部に位置する。プロトプラスト画分を集め、次に
すすぎ溶液Ｉで再びすすぐ。プロトプラストを遠心管に
戻し、そして次の使用のために必要となるまで氷中に保
存する。 【０２５４】実施例４：ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリィの
構築 ｃＤＮＡ遺伝子ライブラリィは、ニコチアナ・タバカム
の園芸品種ハバナ４２５植物の柔細胞髄組織のクローン
化系列（実施例１参照）から得ることができるポリ（Ａ
）＋ＲＮＡから出発して作成される。タバコ組織は、無
ホルモンＬＳ基本培地上で組織を培養することにより実
施例２に記載したように高レベルのキチナーゼを産生す
るように最初に刺激される。 【０２５５】４．１：全ＲＮＡの単離 全ＲＮＡの調製は文献〔３０〕に記載された方法に実質
的に従って行われる。 【０２５６】液体窒素で急速冷凍されたタバコ組織を乳
鉢中で最初に粗く粉末化し、次に適当なホモジナイザー
緩衝液中に入れる（組織１ｇあたり緩衝液２．５ｍｌ）
。該緩衝液は（１）７．５６ＭグアニジンＨＣｌ、０．
７３Ｍメルカプトエタノール、１８．９ｍＭ酢酸ナトリ
ウムｐＨ５．０、（２）４％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１
ＭトリスＨＣｌｐＨ７．８（１容量）＋８０％（ｖ／ｖ
）フェノール、０．１％（ｗ／ｖ）ヒドロキシキノリン
、０．１ＭトリスＨＣｌｐＨ７．８（１容量）または（
３）文献〔３０〕に準拠したもののいずれかである。等
量のフェノールを添加した後、バッチを例えばポリトロ
ンホモジナイゼーションでホモジナイズする。 半容量のクロロホルムを次に添加し、そしてエマルジョ
ンを約１５分間注意深く混合する。次に遠心分離（１０
４００ｇで１０分間）により様々な相に分け、水相を廃
棄する。この時点で所望するならば、さらに抽出段階を
加えることも可能であるが、これは例えば付加的なフェ
ノール／クロロホルム抽出またはフェノール：クロロホ
ルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）の混合
物での抽出２回の形態で行われる。抽出の次は沈澱工程
が行われる。これは０．３Ｍ酢酸ナトリウムおよびエタ
ノール２．５容量部の添加により行われる。沈澱物を遠
心分離（１０４００ｇで１５分間）により集め、そして
滅菌水２ｍｌ中に再懸濁させる。塩化リチウムを最終濃
度３Ｍに添加した後、全体のバッチを４℃で一晩保温す
る。沈澱を次に遠心分離により再び集め、そして形成さ
れたペレットを氷冷エタノールで洗浄する。ペレットを
次に乾燥させ、そして滅菌水５００μｌ中に再懸濁させ
る。この沈澱物中の全ＲＮＡの濃度は分光分析により決
定される。 【０２５７】上記方法の変法として、全ＲＮＡはカルス
組織から単離され得る。この場合もまた、上記の工程段
階が使用されるが、使用される出発材料は立方体（約３
ｍｍ）に切断されたカルス組織であり、これはホモジナ
イゼーション段階の前にまず液体窒素での急速冷凍を行
い、次に予め冷却された乳鉢中で微粉末に粉砕される。 【０２５８】４．２：ポリアデニル化ＲＮＡの単離ポリ
（Ａ）＋ＲＮＡはそれ自体公知の方法（例えば文献〔４
０〕参照）に従って、オリゴ−ｄ（Ｔ）セルロースクロ
マトグラフィー〔米国マサチューセッツ州レキシントン
のコラボラティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉ
ｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）〕により単離される。 【０２５９】オリゴ−ｄ（Ｔ）セルロースを最初に２．
０ＭのＮａＣｌ２０容量中で１５分間洗浄し、次に滅菌
水中に懸濁し、そしてカラム（直径１．５ｃｍ，長さ２
０ｃｍ）中に充填する。カラムを次に緩衝液（４４０ｍ
ＭＮａＣｌ，０．９ｍＭ　　ＥＤＴＡ，９ｍＭトリス−
ＨＣｌ，ｐＨ７．５；または０．５ＭのＮａＣｌ，１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）で、溶出液のｐＨが
７．０ないし７．６になるまで洗浄する。４．０ｍｌの
容量中のＲＮＡ含量が０．６ｍｇないし６．０ｍｇのＲ
ＮＡ溶液を、最終濃度ＥＤＴＡが１ｍＭ、そしてピペラ
ジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）が１０ｍ
Ｍ、ｐＨ７．５に調整する。ＲＮＡを７０℃で５分間加
熱することにより変性させ、そして氷上で冷却する。全
体の溶液を次に４ＭのＮａＣｌ０．１容量部で０．３６
ＭのＮａＣｌの値に調整する。ＲＮＡ溶液をカラムに入
れ、そして非ポリアデニル化ＲＮＡ〔ポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａ〕を上記緩衝液で溶出させる。溶出液の吸光度は分光
光度計（日立１００−４０型）およびそれに連結された
Ｗ＋Ｗレコーダー〔スイス国バーゼルのサイエンティフ
ィック・インストルメンツ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）〕により決定される。吸光度が
基底状態に達したらすぐに、カラムに結合されているポ
リ（Ａ）＋ＲＮＡを１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−
ＨＣｌｐＨ７．５で溶出させる。溶出液を０．５ｍＭＥ
ＤＴＡおよび０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．０の溶液
中に導入し、そしてエタノール２．５容量部の添加によ
り沈澱させる。次に８３０００×ｇ（３０ないし４５分
）の遠心分離によりＲＮＡを集め、窒素下で乾燥させ、
そして１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ７
．５または水中に再懸濁させる。 【０２６０】４．３：ｃＤＮＡクローンの構築および選
択 ５−２５％（ｗ／ｖ）ショ糖グラジエント（１ｍＭＥＤ
ＴＡ；１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）上での調
製超遠心分離（５７０００ｇで１７時間）によりポリ（
Ａ）＋ＲＮＡを個々の画分に分離する。キチナーゼに対
する情報を含有する画分は抗キチナーゼ抗体による試験
管内での翻訳の後に同定され得る。これらの画分を次に
一緒にし、そしてさらに仕上げのために使用する。 【０２６１】抗キチナーゼ抗体作成の操作は当業者には
公知であり、そして例えば文献〔６３〕および〔３９〕
に記載された方法に従って実施され得る。その方法にお
いて、完全フロイントのアジュバント中の精製キチナー
ゼ調製物を含む実質的なエマルジョンは３ヵ月令のメス
ウサギ（ニュージーランド白色ウサギ）に注射される。 さらに１週間後および２週間後そしてその後１ヵ月間隔
で注射を行う。血液は各注射の７ないし１０日後に採取
され、血清試料を−２０℃で保存する。免疫グロブリン
ＧはプロテインＡ−セファロースＣ１４Ｂカラム〔ファ
ルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）　〕上のアフィニティ
クロマトグラフィーにより精製され、次いで凍結乾燥さ
れ、そして−２０℃で保存される。 【０２６２】ポリ（Ａ）＋ＲＮＡマトリックスから出発
する二重鎖ＤＮＡの合成、ｐＢＲ３２２内での該二重鎖
ＤＮＡのクローニング、分別コロニーハイブリダイゼー
ションおよびプラスミドの分離は、文献〔３４〕の指示
および記載に実質的に従って行われる。 【０２６３】二重鎖ＤＮＡ約０．８μｇの合成のために
、予め単離され、そしてキチナーゼｍＲＮＡで富化され
たポリ（Ａ）＋ＲＮＡ３μｇを逆転写酵素〔フロリダ州
サンペテルスブルクのライフ・サイエンセズ（Ｌｉｆｅ
　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）　〕およびＤＮＡポリメラーゼＩ
（マサチューセッツ州ビバリーのニュー・イングランド
・バイオラブス）と保温する。生成するｃＤＮＡをホモ
ポリマーｄＣ−ｄＧテーリングによりｐＢＲ３２２のＰ
ｓｔＩ切断部位内にスプライシングさせる。該テーリン
グはｃＤＮＡとベクターＤＮＡに相補的な粘着端を付与
することを可能にし、そして文献〔３４〕の２１７−２
１９頁に記載されている。オリゴ−ｄＣ末端を有するＰ
ｓｔＩ直線化ベクターｐＢＲ３２２は市販されている。 【０２６４】生成する組換えプラスミドは次にコンピテ
ント大腸菌ＤＨ１細胞の形質転換のために使用される。 プラスミド内でのクローニングは文献〔３４〕の２４２
−２４６頁および３９１頁に記載されている。 【０２６５】寒天プレート上の細菌コロニーの形態にあ
るこのようにして構築されたｃＤＮＡライブラリィはま
ず最初に放射活性標識ｃＤＮＡを用いる分別コロニーハ
イブリダイゼーションによりスクリーニングされる。 【０２６６】分別コロニーハイブリダイゼーションにお
いて、細菌コロニーの複製は寒天プレート上にフィルタ
ーを置き、次にそれらを再び注意深く取り除くことによ
り、ニトロセルロースフィルターで行われる。最初の寒
天プレートは陽性コロニーの後の同定のために保存され
る。細菌コロニーを付着しているフィルターを次に栄養
培地上に置き、そしてコロニーが約２ｍｍの大きさに成
長するまで放置する。フィルターを次に、細菌細胞の溶
解およびフィルター上の細菌ＤＮＡの変性および固定を
導く水酸化ナトリウム溶液で処理する。ｐＨを中和した
後、フィルターを繰り返し洗浄し、乾燥し、そして最後
に真空中８０℃の温度で「黒化」し、その結果ＤＮＡを
フィルターに共有結合させる。 【０２６７】フィルターを放射標識（非クローン化）ｃ
ＤＮＡプローブと連続して２回ハイブッド形成させる。 これらのｃＤＮＡプローブは、キチナーゼを産生するよ
うに予め誘導された（ホルモンを添加しない基本培地で
７日間の保温）タバコ組織からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡお
よび非誘導化タバコ組織からのポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（オ
ーキシン／サイトカイニン上で７日間の保温）である。 非誘導化組織からの対照ＤＮＡと反応するよりも、誘導
化組織からのｃＤＮＡとより強く反応する有望ｃＤＮＡ
クローンは文献〔４０〕および〔３９〕に記載された方
法に従う「ハイブリッド選択」翻訳法を用いるその他の
分析に供される。プラスミドＤＮＡを０．２Ｍないし０
．３ＭのＮａＯＨ、３ＭのＮａＣｌ中で１分間煮沸する
ことにより変性させ、そして氷上で冷却させる。ハイブ
リダイゼーション反応はフィルターあたり２００μｇな
いし２５０μｇの全ＲＮＡを用いて、スクエアＢＡ／８
５ニトロセルロースフィルター〔西ドイツ国ダッセルの
シュライヒャー・ウント・シューエル（Ｓｃｈｌｅｉｃ
ｈｅｒ　ｕｎｄ　Ｓｃｈｕｅｌｌ）〕上で行われる。フ
ィルター上でハイブッド形成されたＲＮＡを溶出させ、
エタノールで沈澱させ、そして水１０μｌ中に溶解させ
、試験管内翻訳（市販の小麦麦芽抽出物を用いる）によ
り分析される。放射標識された生成物は所望のタンパク
質に対する抗体と沈澱し、そしてＳＤＳポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分析される。 【０２６８】４．４：ｃＤＮＡクローンｐＣＨＮ４８ｃ
ＤＮＡ遺伝子ライブラリィはコロニーまたはプラークハ
イブリダイゼーションを用いて文献〔３４〕に従ってス
クリーニングされる。ＤＮＡプローブとして、成熟タン
パク質をコードする全体のＤＮＡ配列を含むが完全なＮ
末端シグナルペプチド配列を欠いている文献〔６２〕に
記載されたｃＤＮＡクローンｐＣＨＮ５０が用いられて
いる。このようにして異なる長さを有する種々のクロー
ンが得られる。これらのクローンの最長のものが選択さ
れ、そしてヌクレオチド配列分析に供される。ｐＣＨＮ
４８と記載されるこのクローンは１．１４ｋｂからなり
、そしてポリ（Ａ）末端に７個のアデノシン、３２９個
のアミノ酸からなるポリペプチドに相当する単一の大き
な読み枠（読み取り可能枠）長さ９８７ヌクレオチド、
および５’非翻訳領域からのヌクレオチドを有する挿入
物を有する。コード領域のＤＮＡ配列から誘導可能なア
ミノ酸配列は、タバコからの公知キチナーゼの２０個の
最初のＮ末端アミノ酸に対する配列に一致する。 【０２６９】実施例５：ゲノム遺伝子ライブラリィの構
築 ５．１：染色体タバコＤＮＡの単離 プロトプラストの溶菌のために、氷冷プロトプラスト懸
濁液１００ｍｌを氷冷ＴＥＮＰ緩衝液（ＶＩＩ　項参照
）４００ｍｌと混合する。ＩＥＣ臨床用遠心分離機中２
０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによりこの溶
菌物から核を分離する。そのように得られるペレットを
氷冷ＴＥＮＰ緩衝液５００ｍｌ中に再懸濁し、そして上
記のように再びペレット化する。次いでＣｓＣｌグラジ
エント試験管８本を準備し、各試験管中のプロトプラス
ト懸濁液約１２．５ｍｌを含む細胞ペレットを１０倍濃
厚ＴＥ緩衝液（ＶＩＩ　項参照）２６ｍｌに添加する。 細胞核を溶菌するために、２０％（ｗ／ｖ）ナトリウム
ラウリルサルコシン溶液５ｍｌおよびＣｓＣｌ３２．２
ｇおよび臭化エチジウム溶液（ＥｔＢｒ；１０ｍｇ／ｍ
ｌ）２．８９ｍｌをバッチに添加する。全体のバッチを
ゆっくりかきまぜ、ＣｓＣｌを溶解させる。 【０２７０】このようにして得られた溶菌物をポリアロ
マー試験管（ベックマンＶＴｉ５０，３９ｍｌ試験管）
に移し、そして４５０００ｒｐｍ　　および２０℃で１
６時間ＶＴｉ５０ローター〔ベックマン（Ｂｅｃｋｍａ
ｎ）　〕中で遠心分離する。紫外線で蛍光性であるバン
ドが１６ゲージの針を付けた３ｍｌのシリンジによりグ
ラジエントから除去され、そして集められる。さらにＤ
ＮＡの仕上げが上記のＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ平衡遠心分離
の反復により行われる。蛍光性バンドが再び集められ、
付着するＥｔＢｒが２０×ＳＳＣ（ＶＩＩ　項参照）で
飽和されたイソプロパノール（等量）を用いる６回の連
続抽出段階で除去される。ＤＮＡがグラジエント溶液か
ら沈澱され、そして蒸留水２容量、３．０Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．４）０．１容量およびエタノール２容量
を連続的に添加することにより上記のように精製される
。フィラメント状のＤＮＡをパスツールピペットにより
溶液から巻き取り、７０％エタノールで洗浄し、そして
さらに等量のクロロホルムで抽出する。３Ｍ酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５．４）０．１容量およびエタノール２．０
容量を添加することによりＤＮＡを沈澱させる。ＤＮＡ
フィラメントを再び巻き取り、７０％エタノールで洗浄
し、そして５分間風乾する。これを次に全量７ｍｌのＴ
Ｅ緩衝液（ＶＩＩ　項参照）中に溶解し、そして次の使
用まで４℃で保存する。 【０２７１】５．２：ゲノムλ遺伝子ライブラリィの構
築 予め単離されたタバコＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａ　で
消化し、ＳＷ４１ローター（ベックマン）内２００００
ｒｐｍでの１０％−４０％ショ糖グラジエントにより２
０時間分離する。グラジエントから得られる画分をゲル
電気泳動（ＴＢＥ緩衝液中０．５％のアガロースゲル）
により分析する。正しい大きさの断片を有する画分を貯
める。３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）０．１容量お
よびエタノール２容量を用いてＤＮＡを沈澱させ、そし
てＢａｍＨＩ　〔カリフォルニア州ラ・ホイアのストラ
タゲン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）　〕で消化されたホスフ
ァターゼ処理された１ＥＭＢＬ３ＤＮＡと連結させる。 連結反応は製造会社の指示に従って行われ、１−ベクタ
ーＤＮＡ１μｇおよび組み入れられるべきタバコＤＮＡ
０．１μｇを含有する５μｌの反応バッチが使用される
。この連結反応から生じるＤＮＡの１−ファージの頭部
への組入れはストラタゲンによるギガパック・プラス・
キットを用い、製造会社の指示に従って行われる。大腸
菌ＣＥＳ２０１（Ｇｌｏｖｅｒ　ＤＭ）　の感染後に得
られたファージは挿入されたＤＮＡ１μｇあたり約２×
１０６　ファージである。 【０２７２】５．３：遺伝子ライブラリィのスクリーニ
ングおよびゲノムクローンの分離 ゲノム遺伝子ライブラリィはコロニーまたはプラークハ
イブリダイゼーションを用いて文献〔３４〕に従ってス
クリーニングされる。文献〔６２〕に記載されたｃＤＮ
ＡクローンｐＣＨＮ５０および４．４．項で単離された
クローンｐＣＨＮ４８がＤＮＡプローブとして使用され
る。 【０２７３】この方法で得られる組換え体は精製され、
そしてサザンブロット分析を用いて部分的に特徴づけら
れる。これらのクローンの一つはｃＤＮＡプローブ分子
ｐＣＨＮ５０およびｐＣＨＮ４８との非常に強いハイブ
リダイゼーションシグナルを示し、そしてサザンブロッ
ト分析に従って完全なキチナーゼ遺伝子を含有するが、
さらに試験のために選択され、そして１−ＣＨＮ１７と
記載される。 【０２７４】実施例６：ゲノムタバコキチナーゼクロー
ン１−ＣＨＮ１７ ６．１：ＤＮＡ配列決定および配列分析制限酵素Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ　での消化の後、完全なキチナーゼ遺伝子を含
有し、そしてタ バコＤＮＡからの同様の大きさの断片に関連する５．４
ｋｂＤＮＡ断片が得られる。３８５０ｂｐからなり、そ
して全体のコード配列を含むこの断片の一部を次に配列
決定する。 【０２７５】制限断片を適当なクローニングベクター、
例えばＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９〔７４〕内
にクローン化し、ジデオキシヌクレオチド法〔５５〕に
より両方の開始部位の配列決定を行う。決定されたヌク
レオチドおよびアミノ酸配列はジェネティクス・コンピ
ューター・グループ・ソフトウエア〔１０〕を用いてコ
ンピュータによりさらに分析される。 【０２７６】遺伝子４８と命名されるタバコからの塩基
性キチナーゼ遺伝子の完全なＤＮＡ配列は配列番号：１
０に示されているとおりである。ｃＤＮＡクローンｐＣ
ＨＮ４８とｐＣＨＮ５０との配列比較は、遺伝子４８の
コード領域内に２か所の介在配列部位（イントロン）が
あることを明らかにしている。これらのイントロンの最
初のものは２７４ｂｐからなり、そしてグリシンをコー
ドするコドン１４８の第一ヌクレオチドと第二ヌクレオ
チドとの間に位置する。第二のイントロンは長さ２６９
ｂｐであり、ヒスチジンをコードするコドン１９９の第
二ヌクレオチドと第三ヌクレオチドとの間に位置する。 両方のイントロンは、公知のその他の公知植物および動
物イントロンと一致して、ドナーおよびアクセプター配
列（ＧＴＡＡＧＴＣおよびＡＣＡＧ）を有するコンセン
サススプライシング部位を有する。さらに、両方のイン
トロンは配列ＣＴ（Ｇ／Ａ）Ａ（Ｃ／Ｔ）、動物コンセ
ンサス配列（ＰｙＴＰｕＡＰｙ）と類似性を有する３’
境界からの３３ヌクレオチドを有する。これらのコンセ
ンサス配列は切除における投げなわ中間体の形成に関与
する。 【０２７７】遺伝子４８のエキソンのヌクレオチド配列
はクローンｐＣＨＮ４８のコード領域のＤＮＡ配列と同
一である。 【０２７８】実施例７：キュウリの葉からのｃＤＮＡ遺
伝子ライブラリィの生成 ７．１：キュウリキチナーゼの精製およびアミノ酸配列
病原体により誘導され得るキチナーゼタンパク質を文献
〔３８〕に記載された方法に従って感染させたキュウリ
の葉から単離する。次にペプチドを公知の方法によりこ
の同種タンパク質調製物から生成する。これらのペプチ
ド断片のアミノ酸配列を以下にまとめる：アミノ末端　
　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｉ
ｌｅ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌ
ｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅ
ｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ
　Ｔｈｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ
　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　ＬｅｕＬ
ｙｓＣペプチド　　　　　　　（Ｌｙｓ）　　　Ａｓｎ
　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　
Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｃｙｓ　
Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｌ
ｅｕ　Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（Ｌｙｓ
）　　　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｓ
ｅｒ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｐｈｅ　Ｔ
ｙｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｍｅ
ｔ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓ
ｐ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　（Ｌｙｓ）　　　Ｌｅ
ｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ
　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　
Ａｌａ　Ａｓｐ　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　（Ｌｙｓ）　　　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　
Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｌ
ｅｕ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＣＮＢＲペプチド　　
　　　　　（Ｍｅｔ）　　　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ａｓｐ　
Ａｓｎ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｓ
ｅｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
（Ｍｅｔ）　　　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａ
ｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓ
ｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ａｌ
ａ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅトリプシ
ンペプチド　　　　　　　　　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ
　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　？　　　
Ｖａｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　
Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｌａ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　
Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ａｌａ　
Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　　【０２７
９】７．２：ＴＮＶ感染キュウリ葉からのｃＤＮＡライ
ブラリィの作成 キュウリの葉をタバコ壊死ウイルス（ＴＮＶ）に感染さ
せる。感染５日後、ＲＮＡを上記したように単離する（
実施例４．１参照）。 【０２８０】ポリアデニル化ＲＮＡ〔ポリ（Ａ）＋ＲＮ
Ａ〕を標準法（項４．２参照）により単離し、そしてｃ
ＤＮＡ遺伝子ライブラリィの作成のために使用する。こ
れは文献〔２１〕の方法に従ってλＺａｐクローニング
ベクター〔ストラタゲン（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮ）　〕中
で実質的に作成される。 【０２８１】７．３：キュウリキチナーゼをコードする
ｃＤＮＡクローンの単離 上で決定されたアミノ酸配列からの２つの領域がオリゴ
ヌクレオチドプローブの作成のために選択される。合成
されたオリゴヌクレオチドプローブは選択されたペプチ
ドをコードし得るｍＲＮＡの全ての可能な組合せをカバ
ーする： 約３０００００プラークが前もって構築されたｃＤＮＡ
ライブラリィからプレートにより得られる。これらのプ
ラークの２重コピーが３２Ｐ標識オリゴヌクレオチド混
合物１（プローブ１）または２（プローブ２）で試験さ
れる。両方のプローブとで陽性の結果を与えるプラーク
が単離される。プラークの単離および自動切断は製造会
社の推奨（ストラタジーン・ラムダ・ザップ・ラボラト
リー・マニュアル，米国サンジエゴのストラタゲン）に
従って行われる。 【０２８２】適当な陽性クローンは「ブルースクリプト
」プラスミド中にスプライシングされ、そしてｐＢＳＣ
ｕｃＣｈｔ５と表される。このｃＤＮＡクローンの配列
はジデオキシ配列決定法により決定され得る（配列番号
：１１参照）。 【０２８３】ＩＩ．　キチナーゼおよびグルカナーゼ突
然変異体の構築 ＩＩ．　１．キチナーゼ突然変異体 実施例８：新規制限部位の導入 キチナーゼ突然変異体の構築において、使用されるキチ
ナーゼクローンの種々の部分は互いに連結される。この
目的を達成するために、それらの部分は類似していなけ
ればならず、すなわち、適当な制限切断部位は種々の配
列中に導入されなればならない。以下の示した制限切断
部位が使用され、それらは全て同一粘着端を導く：Ｂａ
ｍＨＩ　〔Ｇ／ＧＡＴＣＣ　〕 ＢｃｌＩ　　〔Ｔ／ＧＡＴＣＡ　〕 ＢｇｌＩＩ　〔Ａ／ＧＡＴＣＴ　〕 読み枠は、ＧＡＴがアスパラギン酸のコドンとして機能
するように各々の場合において選択されるのが好ましい
。 【０２８４】実施例９：タバコキチナーゼ遺伝子の突然
変異体の構築 ゲノム性キチナーゼクローンＣＨＮ１７のサブクローン
化断片（その製造は項１２．２参照）であるｐＣＨＮ８
７からのＥｃｏＲＩ　／ＨｉｎｄＩＩＩ　挿入物をプラ
スミドｐＴＺ１８Ｒ中にスプライシングすることにより
ｐＴＲＣＨ１が得られる。プラスミドｐＴＺ１８Ｒはフ
ァルマシアから市販されている。 【０２８５】全体のｃＤＮＡ配列を含むｃＤＮＡクロー
ンｐＣＨＮ４８（項４．４参照）の挿入物はＰｓｔＩで
の部分消化により単離され、そしてプラスミドｐＵＣ８
内にクローン化される。そのように形成されたクローン
はｐＣＨＮ６と表される。 【０２８６】ｐＣＨＮ６からのＰｓｔＩ大断片をプラス
ミドｐＵＣ８内にクローン化し、ポリリンカー内にスプ
ライシングされた挿入物の配向と相違する２つの異なる
クローン（ｐＵＣＨ２およびｐＵＣＨ３）を形成する。 【０２８７】ｐＵＣＨ２からのＥｃｏＲＩ　／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ　断片を次に単離し、そしてプラスミドｐＴＺ１
８Ｕ内にスプライシングする。プラスミドｐＴＵＣＨ２
がこのようにして得られる。プラスミドｐＴＺ１８Ｕは
同様にファルマシアから市販されている。 【０２８８】ｐＵＣＨ３からのＥｃｏＲＩ　／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ　断片を同様に単離し、そしてプラスミドｐＴＺ
１８Ｒ内にクローン化する。このようにして形成された
クローンはプラスミドｐＴＲＣＨ３と表される。 【０２８９】実施例１０：オリゴヌクレオチド仲介突然
変異誘発 オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発のために、以下の
オリゴヌクレオチドが当業者には公知である慣用の方法
により合成される： 野生型と比較して変化しているヌクレオチドは下線を付
しボールド体で示している。制限切断部位は空白により
示されている。オリゴヌクレオチドＮｏ．８中の欠失は
Δにより示されている。オリゴヌクレオチドＮｏ．３お
よびＮｏ．８中の挿入はイタリック体で示されている。 【０２９０】１０．１：タバコキチナーゼクローンの突
然変異誘発 一本鎖プラスミドを作成するために、出発プラスミドを
大腸菌のｄａｍ−株内に上記バクテリアをヘルパーファ
ージＭ１３ＫＯ７（ファルマシア）と一晩培養すること
により導入する。次いでこれらのプラスミドは酢酸アン
モニウムおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ６００
０）により培養上澄みから非常に容易に沈殿され得、そ
してフェノール／クロロホルムおよびクロロホルムで抽
出される。エタノールで再び沈殿させた後、単離された
ＤＮＡは実際の突然変異誘発のために使用される（突然
変異誘発あたり培養物約５ｍｌからのＤＮＡ）。 【０２９１】各オリゴヌクレオチド２００ｐｍｏｌを０
．１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　　Ｍ
ｇＣｌ２　、６ｍＭジニトロトレイトール（ＤＴＴ）、
２ｍＭＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単
位中、３７℃の温度で４５分間リン酸化する。反応は６
０℃で１０分間保温することにより停止させる。 【０２９２】一本鎖ＤＮＡをリン酸化オリゴヌクレオチ
ド２．５μｌおよび溶液Ａ〔０．２Ｍトリス−ＨＣｌ（
ｐＨ７．５），０．１Ｍ　　ＭｇＣｌ２　，０．５Ｍ　
　ＮａＣｌ，１０ｍＭ　　ＤＴＴ〕１μｌと最終容量３
０μｌで混合し、そして最初に８０℃で５分間、次に室
温で２０分間保温する。 【０２９３】以下の混合物１０μｌを次に各試験管に添
加する： Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　１８．５μｌ溶液Ｂ〔０．２Ｍトリス−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５），０．１Ｍ　　ＭｇＣｌ２　，０．
１Ｍ　　ＤＴＴ〕　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　２．０μｌ１０ｍＭ　　ＡＴＰ　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　２．０μｌｄＮＴＰ混合物（
ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ各１０ｍＭ）
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　２．０μｌクレノウ断片　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０μｌＴ
４ＤＮＡリガーゼ　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０．５μｌ。 この混合物を３２℃の温度で３０分間保温し、次いで室
温でさらに２ないし１６時間保温する。 【０２９４】このバッチの４分の１を感応性大腸菌ｍｕ
ｔＳ細胞（修復−欠損株）内に形質転換する。これらの
細胞を２×Ｌまたは２×ＴＹ培地中３７℃で３ないし６
時間揺動する。プラスミドＤＮＡを次に当業者には公知
の微量調製法により単離する。単離されたＤＮＡを次に
、アンピシリン含有培地での平板培養により得られる感
応性大腸菌ＤＨ５ａ細胞内に形質転換する。突然変異体
は次に放射標識突然誘発性オリゴヌクレオチドを用いる
コロニーハイブリダイゼーションにより非常に容易に同
定され得る。さらに、全ての突然変異体は突然変異の結
果として切断部位を得るか、または失っているので、制
限分析が行われ得る。 【０２９５】１０．１．２．ｐＴＲＣＨ４プラスミドｐ
ＴＲＣＨ１をオリゴヌクレオチドＮｏ．１で突然変異さ
せる。この新規に形成されたプラスミドはｐＴＲＣＨ４
と表される。この突然変異において、ＢｃｌＩ制限切断
部位は成熟キチナーゼをコードするＤＮＡ配列の第１コ
ドンに導入され、コードされるアミノ酸はグルタミン酸
からアスパラギン酸に変化する（Ｇｌｕ１→Ａｓｐ１）
。 【０２９６】１０．１．３．ｐＴＲＣＨ６プラスミドｐ
ＴＲＣＨ３をオリゴヌクレオチドＮｏ．２で突然変異さ
せる。この新規に形成されたプラスミドはｐＴＲＣＨ６
と表される。この突然変異において、成熟キチナーゼを
コードするＤＮＡ配列のコドン３００はグリシンコドン
から停止コドンに変化し（Ｇｌｙ３００→停止３００）
、そしてＨｉｎｆＩ　制限切断部位は同時に導入される
。 【０２９７】１０．１．３．ｐＴＵＣＨ６上記突然変異
を含む、ｐＴＲＣＨ３のＨｉｎｄＩＩＩ　／ＰｖｕＩＩ
　断片およびｐＴＲＣＨ６のＰｖｕＩＩ　／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ　断片を予めＨｉｎｄＩＩＩ　／ＥｃｏＲＩ　で切
断したベクターｐＴＺ１８Ｕ内にスプライシングする。 プラスミドｐＴＵＣＨ６はこのようにして得られる。 【０２９８】１０．１．５．ｐＴＵＣＨ７プラスミドｐ
ＴＵＣＨ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．３で突然変異さ
せる。この新規に形成されたプラスミドはｐＴＵＣＨ７
と表される。この突然変異において、ＢｇｌＩＩ　制限
切断部位は成熟キチナーゼをコードするＤＮＡ配列のコ
ドン２９５／２９６の領域に導入される。この制限切断
部位は上記のその他の突然変異体の場合とは異なる読み
枠に位置しており、Ｇがコドン２９７に挿入されている
。適合読み枠はこのようにして再び得られる。 【０２９９】１０．１．６．ｐＴＵＣＨ８プラスミドｐ
ＴＵＣＨ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．４で突然変異さ
せる。この新規に形成されたプラスミドはｐＴＵＣＨ８
と表される。この突然変異において、成熟キチナーゼを
コードするＤＮＡ配列のコドン３０４はアスパラギン酸
コドンからアスパラギンコドンに変化する（Ａｓｐ３０
４→Ａｓｎ３０４）。これはＴａｑＩ切断部位の損失を
導く。 【０３００】１０．１．７．ｐＴＵＣＨ９プラスミドｐ
ＴＵＣＨ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．５で突然変異さ
せる。この新規に形成されたプラスミドはｐＴＵＣＨ９
と表される。この突然変異において、コドン３０４はア
スパラギン酸コドンからアルギニンコドンに変化し（Ａ
ｓｐ３０４→Ａｒｇ３０４）、同様にＴａｑＩ切断部位
の損失を導く。 【０３０１】１０．１．８．ｐＴＵＣＨ１０プラスミド
ｐＴＵＣＨ２をオリゴヌクレオチドＮｏ．６で突然変異
させる。この新規に形成されたプラスミドはｐＴＵＣＨ
１０と表される。この突然変異において、コドン２９９
はアスパラギンコドンからリジンコドンに変化し（Ａｓ
ｎ２９９→Ｌｙｓ２９９）、そしてコドン３００はグリ
シンコドンからアスパラギン酸コドンに変化する（Ｇｌ
ｙ３００→Ａｓｐ３００）。ＢｇｌＩＩ　切断部位が同
時に導入される。 【０３０２】１０．２．キュウリキチナーゼクローンの
突然変異誘発 キュウリキチナーゼクローンの突然変異誘発は実施例１
１．１に記載した方法と同様に行われる。 【０３０３】キュウリキチナーゼｃＤＮＡクローンｐＢ
ＳＣｕｃＣｈｔ５（項７参照）からのＥｃｏＲＩ　挿入
物をプラスミドｐＴＺ１８Ｕ内にクローン化する。その
ようにして得られたプラスミドをｐＴＵＣＵ２と表す。 【０３０４】１０．２．１．ｐＴＵＣＵ４ｐＴＵＣＵ２
をオリゴヌクレオチドＮｏ．７で突然変異させる。この
新規に形成されたプラスミドはｐＴＵＣＵ４と表される
。この突然変異において、ＢａｍＨＩ　制限切断部位が
シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列の最後のコド
ンに導入され、その結果として続くコドンが変化し、ア
ラニンの代わりにプロリンをコードする（Ａｌａ１→Ｐ
ｒｏ１）。 【０３０５】１０．２．２．ｐＴＵＣＵ５ｐＴＵＣＵ２
をオリゴヌクレオチドＮｏ．８で突然変異させる。この
新規に形成されたプラスミドはｐＴＵＣＵ５と表される
。この突然変異において、ＢｃｌＩ制限切断部位がキュ
ウリキチナーゼの停止コドンの領域に導入される。結果
として停止コドンがアスパラギン酸コドンに変化する（
停止２６８→Ａｓｐ２６８）。 【０３０６】１０．２．３．ｐＴＵＣＵ６ｐＴＵＣＵ２
をオリゴヌクレオチドＮｏ．９で突然変異させる。この
新規に形成されたプラスミドはｐＴＵＣＵ６と表される
。この突然変異において、ＸｂａＩ制限切断部位がｃＤ
ＮＡ配列の３’非コード性配列の領域（クローンｐＢＳ
ＣｕｃＣｈｔ５のヌクレオチド９８１−９８６の領域）
に導入され、その結果としてベクターｐＧＹ１内へのク
ローニングが可能になる。 【０３０７】ＩＩ．　２．グルカナーゼ突然変異体実施
例１１：ＰＣＲ仲介突然変異誘発 Ｃ末端範囲の最初のアミノ酸をコードする塩基トリプレ
ット（ＧＴＣ＝バリン）をＰＣＲ法により停止コドンＴ
ＧＡに変化させる。 【０３０８】ＰＣＲ突然変異誘発を行う方法は当業者に
は非常によく知られている。それらは例えば以下の文献
：〔７２〕，〔２９〕，および〔１１〕。さらに、相当
するＰＣＲキットはパーキン−エルマー・シータス（米
国コネチカット州ノーウォーク）やその他の会社から市
販されており、そして操作はその中の指示書に従って行
われ得る。 【０３０９】１１．１．ｐＣＩＢ１００５ＢΔＶＴＰの
構築この構築は、米国メリーランド州ロックヴィレにあ
るアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ＴＣＣ）にＡＴＣＣ番号４０７７０の下に寄託されてお
り、その構築がＥＰ−Ａ０３９２２２５に詳細に記載さ
れているプラスミドｐＣＩＢ１００５Ｂから出発して行
われる。 【０３１０】プラスミドｐＣＩＢ１００５ＢはＣａＭＶ
３５Ｓ発現ベクターにおいて、完全なＮ末端シグナル配
列および２２個のアミノ酸からなるＣ末端範囲を有する
タバコからの完全キメラ塩基性プレプロ−β−１，３−
グルカナーゼをコードする。下に記載される生成物であ
るプラスミドｐＣＩＢ１００５ＢΔＶＴＲは同様のグル
カナーゼをコードするが、２２個のアミノ酸からなるＣ
末端範囲が、成熟タンパク質をコードする配列の末端へ
の停止コドンの挿入により機能的に欠失されている。 【０３１１】以下のオリゴヌクレオチドがＰＣＲ増幅に
使用される：オリゴ１：　　５’−ＧＧＧ　ＡＣＡ　Ｃ
ＡＣ　ＧＴＧ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　−３’オリゴ２：　　
５’−ＣＴＧ　ＴＣＣ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＣＣＡ　ＣＣ
Ａ　ＧＡＴ　ＣＡＣ　ＣＣＡ　ＡＡＧ　ＴＴＧ　ＡＴＡ
　ＴＴＡ　ＴＡＴ　Ｔ　−３’オリゴ３：　　５’−Ａ
ＡＴ　ＡＴＡ　ＡＴＡ　ＴＣＡ　ＡＣＴ　ＴＴＧ　ＧＧ
Ｔ　ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＡＧ　ＴＴＴ　ＧＧＧ
　ＡＣＡ　Ｇ　−３’オリゴ４：　　５’−ＧＣＣ　Ｔ
ＣＣ　ＣＣＴ　ＴＣＡ　ＴＣＧＴＣＣ　−３’オリゴヌ
クレオチド１（オリゴ１）はＸｈｏＩ切断部位の上流に
位置するグルカナーゼＤＮＡのコード性領域内の配列に
相当する。オリゴヌクレオチド３（オリゴ３）は挿入さ
れる停止コドンおよびＣ末端範囲をコードする配列の一
部が続く成熟グルカナーゼタンパク質をコードする配列
の３’末端の領域にある領域を含む。オリゴヌクレオチ
ド２（オリゴ２）はアンチセンス配向にある他はオリゴ
３に相当する配列を有する。オリゴヌクレオチド４（オ
リゴ４）はＳａｃＩ切断部位の下流のｐＣＩＢ１００５
Ｂのｔｍｌ３’領域に位置する配列を含む。 【０３１２】３つのＰＣＲ反応が行われる：（１）プラ
イマーとしてオリゴ１およびオリゴ２ならびに鋳型とし
てｐＣＩＢ１００５Ｂを用いるＰＣＲ１；（２）プライ
マーとしてオリゴ２およびオリゴ４ならびに鋳型として
ｐＣＩＢ１００５Ｂを用いるＰＣＲ２；（３）プライマ
ーとしてオリゴ１およびオリゴ４ならびに鋳型としてＰ
ＣＲ１およびＰＣＲ２反応の生成物を用いるＰＣＲ３。 ＰＣＲ３の最初の２つの工程は鋳型とだけ行われ、そし
て次にプライマーだけが添加される。 【０３１３】ＰＣＲ３反応の生成物をＳａｃＩおよびＸ
ｈｏＩで消化し、そしてアガロースゲルにより分離され
る。７２５ｂｐに相当するバンドをゲルから切出し、そ
して精製する。 【０３１４】プラスミドｐＣＩＢ１００５Ｂを次に同様
にＸｈｏＩおよびＳａｃＩで消化し、そしてリガーゼ反
応における消化および精製ＰＣＲ３断片に一晩連結させ
る。連結混合物は感応性大腸菌ＤＨ５ａ細胞を形質転換
するために使用される。プラスミドｐＣＩＢ１００５Ｂ
およびｐＣＩＢ１００５ＢΔＶＴＰを形質転換された細
胞の一晩培養物から単離し、そしてニコチアナ・プルム
バギニホリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｐｌｕｍｂａｇｉ
ｎｉｆｏｌｉａ）　プロトプラストの引き続く感染のた
めに使用される。この方法で得られる構築物の正確さは
配列分析により確認される。 【０３１５】ＩＩＩ．植物発現プラスミド内へのキチナ
ーゼ突然変異体の混入 実施例１２：プラスミドｐＳＣＨ１０の構築プラスミド
ｐＳＣＨ１０は、ベクタープラスミドｐＧＹ１中にスプ
ライシングされた、ゲノムクローンＣＨＮ１７ならびに
ｃＤＮＡクローンＣＨＮ４８からなる、タバコキチナー
ゼをコードする配列を含む。この配列の両側にはＣａＭ
Ｖウイルスの３５Ｓプロモーターおよび終結配列が位置
している。この構築物はそれ故に野生型キチナーゼ構築
物である。それを以下に詳細に記載する。 【０３１６】１２．１：プラスミドｐＧＹ１の構築プラ
スミドｐＧＹ１は文献〔４９〕に記載された植物発現ベ
クターｐＤＨ５１から誘導される。プラスミドｐＧＹ１
では出発プラスミドｐＤＨ５１のＮｃｏＩ切断部位がＸ
ｈｏＩ切断部位に置換されていた。 【０３１７】プラスミドｐＤＨ５１がＮｃｏＩで切断さ
れ、そして突出末端がクレノウポリメラーゼを用いて充
填される。このときブラントである末端はＸｈｏＩリン
カー（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）と連結される。 １２．２：プラスミドｐＳＣＨ１０の構築プラスミドｐ
ＳＣＨ１０はキチナーゼをコードする配列、５’の転写
される非コード性配列（転写開始部位の上流に位置する
キチナーゼ遺伝子４８の２１塩基対）および３１ｂｐの
転写される非コード性配列を、ＣａＭＶ３５Ｓ植物発現
ベクターｐＧＹ１のＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩクローニング
部位内にスプライシングされて含む。 【０３１８】ｐＳＣＨ１０の作成に必要な工程段階は以
下にさらに詳細に記載される： （１）キチナーゼ遺伝子４８を含むゲノムクローン１−
ＣＨＮ１７をＨｉｎｄＩＩＩ　で切断する。生成する５
．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ　断片を単離し、そしてプラ
スミドｐＵＣ８のＨｉｎｄＩＩＩ　クローニング部位内
にスプライシングし、プラスミドｐＣＨＮ６５を形成す
る。 （２）プラスミドｐＣＨＮ６５をＥｃｏＲＩ　で切断し
、キチナーゼコード化領域の５’末端を含む生成する２
．５ｋｂ断片を同様にｐＵＣ８にクローン化する。生成
するプラスミドをｐＣＨＮ６８と記載する。 （３）プラスミドｐＣＨＮ６８をＰｓｔＩで消化し、そ
して０．５ｋｂＰｓｔＩ／　ＥｃｏＲＩ　断片を失って
再び連結する（それ自体に連結する）。生成するプラス
ミドをｐＣＨＮ７４と記載する。 （４）遺伝子４８の転写の５’非コード領域をＢａｍＨ
Ｉ　切断部位の後方にクローン化するために、プラスミ
ドｐＣＨＮ７４を最初にＨｐｈＩで消化し、次にＴ４Ｄ
ＮＡポリメラーゼの作用によりブラント末端を付与し、
そして最後にＰｓｔＩで切断する。ＨｐｈＩ／ＰｓｔＩ
　断片を単離し、そしてＨｉｎｃＩＩ／　ＰｓｔＩ〔７
０〕で消化されたプラスミドｐＵＣ８内にスプライシン
グし、ｐＣＨＮ８７を形成する。配列決定の後、最後の
工程段階の間に１／２　ＨｉｎｃＩＩ切断部位の塩基が
失われたことをＤＮＡ配列に対する参照により見ること
ができる。 （５）ｐＣＨＮ８７をＥｃｏＲＩ　およびＨｉｎｄＩＩ
Ｉ　で消化し、そしてクローニングベクターｐＵＣ９〔
７０〕内にスプライシングする。生成するプラスミドは
ｐＣＨＮ８８と記載される。 （６）タバコｃＤＮＡクローン４８（ｐＣＨＮ４８）の
１ｋｂＰｓｔＩ断片をプラスミドｐＵＣ８のＰｓｔＩク
ローニング部位内にスプライシングし、ｐＣＨＮ７８を
形成する。 （７）プラスミドｐＣＨＮ７８のＰｓｔＩ挿入物を制限
酵素ＰｓｔＩでプラスミドを切断することにより外し、
そしてｐＣＨＮ８８のＰｓｔＩ部位にスプライシングし
、結果としてキチナーゼをコードする完全なＤＮＡ配列
を再構築する。生成するプラスミドはｐＣＨＮ８９と記
載される。 （８）プラスミドｐＣＨＮ８９を次にＢａｍＨＩ　で完
全に消化し、そしてＰｓｔＩで部分的に消化する。生成
する１．５ｋｂ断片を、同様にＢａｍＨＩ　およびＰｓ
ｔＩで予め切断された植物発現ベクターｐＧＹ１内にク
ローン化し、ｐＳＣＨ１０を形成する。このクローニン
グ段階の結果として、キチナーゼをコードするＤＮＡ配
列はＣａＭＶプロモーターとＣａＭＶ終結配列との間に
位置している。 【０３１９】実施例１３：植物発現プラスミドｐＳＣＨ
１０内へのキチナーゼ突然変異体の混入１３．１：タバ
コキチナーゼ突然変異体の混入プラスミドｐＳＣＨ１０
のＰｓｔＩ断片を以下のＰｓｔＩ断片に置換する： ｐＴＵＣＨ６のＰｓｔＩ断片　　　　→　　ｐＳＣＭ３
ｐＴＵＣＨ７のＰｓｔＩ断片　　　　→　　ｐＳＣＭ２
５ｐＴＵＣＨ８のＰｓｔＩ断片　　　　→　　ｐＳＣＭ
２２ｐＴＵＣＨ９のＰｓｔＩ断片　　　　→　　ｐＳＣ
Ｍ２３ｐＴＵＣＨ１０のＰｓｔＩ断片　　→　　ｐＳＣ
Ｍ２４これらのプラスミドは今３’末端標的性配列を含
み、以下のヌクレオチド配列を有する： 野生型プラスミド（ｐＳＣＨ１０）と比較して変化して
いる（突然変異している）ヌクレオチドはボールド体で
示され、下線を付してある。 【０３２０】１３．２：キュウリキチナーゼ突然変異体
の混入 １３．２．１．プラスミドｐＳＣＵ１ プラスミドｐＳＣＭ１からのＥｃｏＲＩ　／ＢｃｌＩ断
片およびｐＴＵＣＵ４からのＢａｍＨＩ　／ＥｃｏＲＩ
　断片を、前もってＥｃｏＲＩ　で切断したプラスミド
ｐＴＺ１８Ｕ内にクローン化する。プラスミドｐＴＵＣ
Ｕ７が形成される。 【０３２１】プラスミドｐＴＵＣＵ７からのＥｃｏＲＩ
　／ＮｓｉＩ断片およびプラスミドｐＴＵＣＵ６からの
ＮｓｉＩ／ＥｃｏＲＩ　断片を、前もってＥｃｏＲＩ　
で切断したプラスミドｐＴＺ１８Ｕ内にクローン化する
。プラスミドｐＴＵＣＵ１１が形成される。 【０３２２】プラスミドｐＴＵＣＵ１１を次にＢａｍＨ
Ｉ　およびＸｂａＩで消化し、そしてＢａｍＨＩ　／Ｘ
ｂａＩ断片を単離する。次いで前もってＢａｍＨＩ　／
ＸｂａＩで切断したプラスミドｐＧＹ１内にスプライシ
ングし、プラスミドｐＳＣＵ１を形成する。 【０３２３】１３．２．２．プラスミドｐＳＣＵ３プラ
スミドｐＴＵＣＵ７からのＥｃｏＲＩ　／ＮｓｉＩ断片
およびｐＴＵＣＵ５からのＮｓｉＩＩ　／ＥｃｏＲＩ　
断片を、前もってＥｃｏＲＩ　で切断したプラスミドｐ
ＴＺ１８Ｕ内にクローン化する。このようにしてプラス
ミドｐＴＵＣＵ１０が得られる。プラスミドｐＳＣＵ３
がプラスミドｐＴＵＣＵ１０のＸｈｏＩ／ＢｃｌＩ断片
およびプラスミドｐＴＵＣＵ７のＢｇｌＩＩ　／Ｐｓｔ
Ｉ断片を、前もってＸｈｏＩ／ＰｓｔＩで切断したプラ
スミドｐＧＹ１中にクローニングすることにより形成さ
れる。 【０３２４】１３．２．３．プラスミドｐＳＣＵ６プラ
スミドｐＴＵＣＵ６が、ｐＴＵＣＵ１０からのＸｈｏＩ
／ＢｃｌＩ断片およびｐＴＵＣＨ１０からのＢｇｌＩＩ
　／ＰｓｔＩ断片を、前もってＸｈｏＩ／ＰｓｔＩで切
断したプラスミドｐＧＹ１中にクローニングすることに
より得られる。 【０３２５】プラスミドｐＳＣＵ３およびｐＳＣＵ６は
今、対照のプラスミドｐＳＣＵ１と比較して、以下のヌ
クレオチド配列〔５’→３’〕を有する３’末端標的性
配列を含む： 野生型と比較して変化している（突然変異している）ヌ
クレオチドはボールド体で示され、下線を付してある。 挿入により新たに導入されたヌクレオチドはイタリック
体で示してある。 【０３２６】実施例１４：ｐＳＣＭおよびｐＳＣＵ構築
物の二元植物ベクター内へのスプライシング１４．１：
プラスミドｐＣＩＢ２００の構築この二元ベクターの構
築は、ＰＫ２〔２〕の誘導体である文献〔５６〕に記載
されたプラスミドｐＴＪＳ７５を基にしており、該二元
ベクターは広い宿主範囲を有し、そしてテトラサイクリ
ン耐性遺伝子を有する。このプラスミドを制限酵素Ｎａ
ｒＩで切断し、そして次にＮｐｔＩ遺伝子を有するｐＵ
Ｃ４Ｋ〔７０〕のＡｃｃＩ断片に連結される。 この方法で形成されたプラスミドｐＴＪＳ７５ｋａｎは
このときテトラサイクリン耐性遺伝子の他にＮｐｔＩ遺
伝子を含み、次に制限酵素ＳａｌＩで消化される。 【０３２７】同時に、文献〔５３〕に記載されているプ
ラスミドｐＣＩＢ７をＥｃｏＲＶ　で切断し、そしてア
グロバクテリウム・チュメファシエンスのＴｉプラスミ
ドからの左側および右側のＴ−ＤＮＡ境界配列ならびに
キメラＮｏｓ／ＮｐｔＩＩ　遺伝子およびｐＵＣポリリ
ンカー領域を含む生成ＥｃｏＲＶ　断片をＸｈｏＩリン
カーと連結する。 【０３２８】生成する構築物は次にＸｈｏＩで消化され
、そしてプラスミドｐＴＪＳ７５ｋａｎのＳａｌＩ切断
部位にクローン化される。遺伝子地図が図１に示される
生成するプラスミドをｐＣＩＢ２００と記載する。 【０３２９】１４．２：ｐＣＩＢ２００内へのＥｃｏＲ
Ｉ　断片のクローニング プラスミドｐＣＩＢ２００を最初にＥｃｏＲＩ　で切断
する。 次に以下のＥｃｏＲＩ　断片を切断されたｐＣＩＢ２０
０内にクローン化する： ｐＳＣＨ１０のＥｃｏＲＩ　断片　　　　→　　ｐＳＣ
Ｈ１２ｐＳＣＭ３のＥｃｏＲＩ　断片　　　　　　→　
　ｐＳＣＭ１３ｐＳＣＵ１のＥｃｏＲＩ　断片　　　　
　　→　　ｐＳＣＵ１１ｐＳＣＵ３のＥｃｏＲＩ　断片
　　　　　　→　　ｐＳＣＵ１３【０３３０】ＩＶ．　
タバコプロトプラストでの形質転換上記のプラスミドは
「一時的発現系」を用いてニコチアナ・プルムバギニホ
リアのプロトプラストにおいて試験管内で試験される。 実施例１５：ニコチアナ・プルムバギニホリアのプロト
プラストの生成および培養 ニコチアナ・プルムバギニホリアのプロトプラストの生
成および培養はタバコに対して記載された操作〔項３参
照〕と同様に公知方法により行われる。詳細な記載は文
献〔６０〕または〔４４〕に見出されるであろう。 【０３３１】実施例１６：プロトプラストの形質転換ニ
コチアナ・プルムバギニホリアのプロトプラストの形質
転換は文献〔４４〕に記載の方法に従って行われる。 上記の方法に従って生成されたプロトプラストを最後の
精製段階の後、以下の組成： マンニトール　　０．４Ｍ ＣａＣｌ２　　　　　１４−３０ｍＭ ＭＥＳ　　　　　　　　０．１％（ｗ／ｖ）を有する溶
液中に懸濁する。プロトプラスト濃度は１．６−２×１
０６　／ｍｌである。 【０３３２】このプロトプラスト懸濁液３ｍｌをまず１
５ｍｌの遠心管中で殺菌水性懸濁液の形態にあるプラス
ミドＤＮＡ５μｇと混合する〔４７〕。数分後、ポリエ
チレングリコール溶液〔０．４Ｍマンニトール，０．１
Ｍ　　Ｃａ（ＮＯ３　）２　，ｐＨ７．０中の４０％（
ｗ／ｖ）ＰＥＧ６０００〕０．３ｍｌを混合物に添加し
、そしてそのバッチを注意深く混合する。さらに数分後
、Ｋ３培地〔Ｚ　Ｐｆｌａｎｚｅｎｐｈｙｓｉｏｌ，　
７８：４５３−４５５（１９７６）；　Ｓｈｉｌｌｉｔ
ｏ　等（１９８１）〕４ｍｌを添加し、そして遠心管を
２４時間暗所において２５℃ないし２７℃で保温する。 【０３３３】プロトプラストのペレット形成性を改良す
るために、Ｗ５塩溶液〔４４〕（５．４ｍｌ）を次に添
加してもよい。次いでプロトプラストを低速遠心分離す
る（約６０−１００×ｇ）。上澄みの一部を引き続くキ
チナーゼ活性の分析のために分離し、そして残りを廃棄
する。分別されたプロトプラストを残りの培地中に再懸
濁し、そしてエッペンドルフチューブに移し、そこで容
量をおおよそ決定する。この懸濁液の一部をキチナーゼ
活性の分析およびウエスタンブロットのために使用する
。 【０３３４】ニコチアナ・プルムバギニホリアのプロト
プラストのプラスミドｐＣＩＢ１００５ＢおよびｐＣＩ
Ｂ１００５ＢΔＶＴＰでの形質転換は文献〔１９〕によ
る変形された「ネグルチウ」の方法に従って行われ得る
。 【０３３５】Ｖ．形質転換およびトランスジェニック植
物の作出 実施例１７．１：アグロバクテリウム・チュメファシエ
ンスの二元ベクターでの形質転換 上の実施例１４に記載された二元ベクターを以下の方法
に従ってアグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢ
４４０４株内に形質転換する。アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンスＬＢＡ４４０４株はＴ−ＤＮＡ領域を
欠いているが、完全なｖｉｒ領域を依然として有する欠
失Ｔｉプラスミドを含む〔２４〕。 【０３３６】アグロバクテリウム・チュメファシエンス
ＬＢ４４０４株をＭＧ／Ｌ培地〔ＶＩＩ項参照〕５ｍｌ
中の一晩培養液中３０℃の温度で培養する。ＭＧ／Ｌ培
地２５０ｍｌをこれらの５ｍｌの一晩培養液中に添加し
、そして全体のバッチを光学密度ＯＤ＝０．６（６００
ｎｍ）が得られるまで十分に混合する。次いで細胞を８
０００×ｇでの遠心分離により集め、そしてＭＧ／Ｌ培
地５ｍｌ中に再懸濁する。この細胞懸濁液２００μｌを
ＭＧ／Ｌ培地中の二元プラスミドＤＮＡ０．２μｇない
し１μｇと保温し、そしてゆっくり混合した後、バッチ
をすぐにドライアイス／エタノール浴中で急速冷凍する
。５分後、試験管を３７℃の水浴中に置き、そこに５分
間放置する。ＭＧ／Ｌ培地２ｍｌを次に添加する。この
懸濁液を次に３０℃の水浴で２ないし３時間保温する。 細胞を次に遠心分離により集める。細胞を少量のＭＧ／
Ｌ培地に再懸濁し、次に選択培地（ゲンタマイシン１０
０μｇ／ｍｌを含むＭＧ／Ｌプレート）上に置く。 最初のコロニーは３０℃で２ないし３日後に現れる。 【０３３７】実施例１７．２：アグロバクテリウム・チ
ュメファシエンスの二元ベクターでの形質転換別の実施
態様において、上の実施例１４に記載された二元ベクタ
ーを、ｔｒａ機能を備えたプラスミドを有する大腸菌ヘ
ルパー株を用いて三親交雑法〔５２〕によりアグロバク
テリウム・チュメファシエンスＬＢＡ４４０４株内に導
入する。使用される大腸菌ヘルパー株は、例えば二元ベ
クターの導入に必要なｔｒａ機能を有するプラスミドｐ
ＲＫ２０１３を含む大腸菌ＢＨＢ１０１１であってよい
。 【０３３８】アグロバクテリウム・チュメファシエンス
ＬＢＡ４４０４株はリファムピシン２０ｍｇ／ｌおよび
ストレプトマイシン５００ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地中２
８℃で一晩培養される。大腸菌ＢＨＢ１０１１および二
元ベクターを有する大腸菌株はカナマイシン２５ｍｇ／
ｌを含むＬＢ培地中３７℃で一晩培養される。これらの
培養液各１ｍｌを８０００×ｇで遠心分離し、１ｍｌの
滅菌水または１０ｍＭＭｇＳＯ４　で洗浄し、再び遠心
分離し、そして１００μｌの水またはＭｇＳＯ４　溶液
中に再懸濁する。ＬＢ固体培地を含むプレートを４区画
に分ける。これらの４区画のうちの３区画において２つ
の培養液からなる３種の可能な組合せが混合されるよう
に、３つの細菌培養液の滴を前記区画に載せる。これら
は対照として作用する。しかしながら第４の区画では３
つの培養液全てが一緒に混合される。滴が乾燥した後、
プレートを２８℃で一晩保温する。次に試料を各区画か
ら採取し、そして水またはＭｇＳＯ４　溶液中に懸濁す
る。これらの懸濁液の希釈物を調製し、そしてリファム
ピシン２０ｍｇ／ｌ、ストレプトマイシン５００ｍｇ／
ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌを含むＬＢ培地にプ
レーティングし、そして約２８℃で２ないし３日培養す
る。高希釈の三親ハイブリッド〔同様の希釈の対照ハイ
ブリッドでは何も増殖しない〕で増殖するコロニーは個
々のコロニーのプレーティングを繰り返すことにより依
然として存在し得る親細菌が除去される。 【０３３９】実施例１８：ニコチアナ・シルベストリス
およびニコチアナ・タバカムの葉ディスク形質転換葉デ
ィスク形質転換は文献〔２７〕に記載された方法に従っ
て実質的に行われる。アグロバクテリウム・チュメファ
シエンスＬＢＡ４４０４株（ｐＳＣＨ１２；ｐＳＧＬ７
）をリファムピシン２０ｍｇ／ｌ、ストレプトマイシン
５００ｍｇ／ｌおよびカナマイシン２５ｍｇ／ｌで富化
され、ｐＨ５．６に調整されたグルタミン酸塩培地中２
８℃で一晩培養する。約３．３×１０８　細胞を含有す
るこの一晩培養液中で、ニコチアナ・シルベストリスま
たはニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５の滅
菌葉ディスク（直径５ｍｍないし１０ｍｍ）が５分間培
養される。ディスクを次に培養液から除去し、滅菌ペー
パータオルで軽くたたいて乾燥させ、その後栄養培地を
含む直径１００ｍｍのペトリ皿に移す。 【０３４０】この栄養培地は、１％寒天（ＤＩＦＣＯ）
で固化され、そしてその他の添加剤としてｐＨ指示剤（
クロロフェノールレッド；５ｍｇ／ｌ）および植物生長
剤カイネチン（０．３ｍｇ／ｌ）およびα−ナフチル酢
酸（２ｍｇ／ｌ）を含有する文献〔３３〕による基本培
地（３０ｍｌ）からなる。この寒天培地（培地Ａ）はニ
コチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５〔１２〕の
髄組織から誘導されたＳ２７５Ｎ細胞の２週令懸濁培養
液１ｍｌないし２ｍｌの層で覆われており、そしてロ紙
（Ｎｏ．１ホワットマンロ紙）で覆われている。上記の
ように前処理した葉ディスクを次にロ紙上に載せる。 【０３４１】４８時間後、苗条誘導のために、同一組成
を有するがセフォタキシム３５０ｍｇ／ｌおよびカナマ
イシン１００ｍｇ／ｌを含有する選択培地（培地Ｂ）上
に載せ、２５℃および散光（８０ないし１００μアイン
シュタイン）中で外植片を培養する。共培養された対照
組織はカナマイシンを含まない同様の培地上に接種され
る。外植片は１週間間隔で新鮮な培地Ｂに移される。 【０３４２】４ないし８週の共培養後、外植片から発生
する未熟苗条を収穫し、そして５０ｍｌの容器中の培地
Ｃ（０．６％フィトアガーを含有する固体地）２５ｍｌ
上に移す。全体の組織を２４℃ないし２８℃の温度、８
０ないし１００μアインシュタインの光強度で培養する
。１ないし２週間後苗条は根を形成する。 【０３４３】ＶＩ．　トランスジェニック植物材料の分
析（Ａ）液胞局在の間接的証明 実施例１９：形質転換されたプロトプラストの分析形質
転換されたプロトプラストの分析は項１７および２０．
３に詳細に記載された方法に従って行われる。 【０３４４】１９．１：キチナーゼ活性表１の活性デー
タからわかるように、対照プロトプラストは内因性キチ
ナーゼ活性を有するけれども、わずかな活性だけが上澄
み中に示され得る。 【０３４５】これに対し、タバコキチナーゼの全ての構
築物はペレットおよび上澄みの両方に著しく高められた
全活性を示す。試験された全ての上澄み試料中のキチナ
ーゼ活性の全般的な増加は細胞の貯蔵系の過剰保持にお
そらく原因がある。しかしながら、著しい相違が見られ
る：構築物ｐＳＣＨ１０、ｐＳＣＭ２２、ｐＳＣＭ２３
およびｐＳＣＭ２４の場合、ペレット中のキチナーゼ活
性は対照のものに比べ３−４倍高い。しかしながら、ｐ
ＳＣＭ３の場合、ペレット中のキチナーゼ活性は３５％
だけ高められている。キュウリキチナーゼ構築物ｐＳＣ
Ｕ１、ｐＳＣＵ３およびｐＳＣＵ６の場合、ペレット中
のキチナーゼ活性は対照に比べて１０−２０％高いだけ
であるが、上澄み中の活性は７ないし８のファクターで
（ｐＳＣＵ３の場合は４のファクターで）高い。表１に
示された結果はウエスタンブロットの結果により確認さ
れる。キュウリキチナーゼ構築物に対するウエスタンブ
ロットデータは、例えば、ｐＳＣＵ１（野生型）の場合
にはごくわずかのキチナーゼが形質転換されたプロトプ
ラスト中に存在するだけであるのに対し、ｐＳＣＵ３お
よびｐＳＣＵ６で形質転換されたプロトプラストは非常
に高いキチナーゼ濃度を有することを明らかに示してい
る。 【０３４６】１９．２：グルカナーゼ活性対照プロトプ
ラストで得られた結果（表１０参照）は、ニコチアナ・
プルムバギニホリアからのβ−１，３−グルカナーゼが
細胞内に保持されることを示す。 【０３４７】匹敵する結果を無傷の構築物（ｐＣＩＢ１
００５Ｂ）で得ることができ、この場合、プロトプラス
ト抽出物中により強いシグナルが観察されるにすぎない
。このことは、タバコグルカナーゼがプロトプラスト中
にも保持され、それ故に細胞の区画内に正確に方向づけ
られることを示す。 【０３４８】しかしなから、Ｃ末端範囲を欠失させるか
、不活性化させた構築物（ｐＣＩＢ１００５Ｂ６ＶＴＰ
）が使用される場合、β−１，３−グルカナーゼが培養
培地中に分泌される。 【０３４９】実施例２０：形質転換された植物の分析実
施例１８に従って形質転換された植物体は以下の方法に
より分析される。 【０３５０】２０．１：細胞内液（ＩＣＦ）の抽出植物
組織から細胞内液の抽出は、文献〔４６〕に記載された
方法に従って行われ得る。この方法において再生された
トランスジェニック植物の葉は最初に集められ、そして
４ないし５ｃｍ２　の小片に切断され、そしてゆっくり
かきまぜながら大過剰の冷緩衝液（約４℃）に各々３０
秒間真空下で浸漬する。該緩衝液は以下の組成：　　０
．５Ｍショ糖を含むトリスＨＣｌ〔ｐＨ７．８〕　　２
５．０ｍＭ　　　　ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１０．０ｍＭ　　ＣａＣｌ２　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１０．０ｍＭ　　フェニルメチルスルホニル
フルオリド（ＰＭＳＦ）　　０．５　　ｍＭ　　２−メ
ルカプトエタノール　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　５．０　　ｍＭを有することが有利で
ある。 【０３５１】また、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．
５）を使用することも可能である。操作は室温で行われ
てもよい。 【０３５２】真空を解除すると緩衝液は葉を貫通する。 葉片を次に注意深く乾燥し、そして２０ｍｌのシリンジ
に移す。シリンジは遠心管内で懸濁され、そして低速（
約１０００×ｇ）および低温（４℃）で１０分間遠心分
離される。 【０３５３】２０．２：細胞内タンパク質画分の抽出項
２０．１に従って処理された葉片を次に同様の緩衝液中
でホモジナイズする。粗い粒子を遠心分離により除去す
る。 【０３５４】２０．３：キチナーゼ活性の決定２つの抽
出物中のタンパク質濃度はブラッドフォード法に基づい
たバイオラド・プロテイン・アッセイにより決定される
。該方法はタンパク質濃度に応じた染料の色変化に基づ
いている。 【０３５５】キチナーゼ活性は放射標識（トリチウム化
）キチンを用いたバイオメトリックアッセイにより決定
され得る〔５〕。タバコキチナーゼ形質転換体に対する
結果は表２に示されており、そしてキュウリキチナーゼ
形質転換体に対する結果は表３に示されている。 【０３５６】要するに、プロトプラストおよび植物全体
で行われた形質転換実験の結果は、タバコからの塩基性
キチナーゼのＣ末端にある本発明に係るペプチド断片が
植物の液胞に特異的にキチナーゼを方向づけるのに関連
することを示す。さらに、ｐＳＣＭ２２、ｐＳＣＭ２３
およびｐＳＣＭ２４での結果は、Ｃ末端にあるアミノ酸
配列内のある種の変異が配列の標的性機能が結果として
消失することなしに許されることを示す。３’末端の標
的性配列が失われているならば（ｐＳＣＭ３；ｐＳＣＭ
１３）、そのときは液胞内に存在するキチナーゼの大部
分は細胞外空間に分泌される。 【０３５７】さらに、これらの結果に基づいて、本発明
に係るＤＮＡ配列が、自然に分泌されるキチナーゼタン
パク質が植物細胞、おそらくほとんどが液胞内に保持さ
れる異種遺伝子（キュウリキチナーゼ遺伝子；ｐＳＣＵ
３；ｐＳＣＵ６；ｐＳＣＵ１３）に操作可能に連結され
ている場合でも標的性シグナルとして作用することを示
すことも可能である。 【０３５８】（Ｂ）液胞局在の直接的証明実施例２１．
１：プロトプラストの単離（文献〔４２〕に準拠して） トランスジェニックニコチアナ・シルベストリス植物の
葉を１−１．５ｇの小片に切断し、そしてペトリ皿のＫ
３Ｍ浸透圧調整培地中に入れる。Ｋ３ＭはＫ３大量成分
の濃度の半分（すなわち、１リットルに対し、ＮａＨ２
　ＰＯ４　・Ｈ２　Ｏ７５ｍｇ、ＣａＣｌ２　・２Ｈ２
　Ｏ４５０ｍｇ、ＫＮＯ３　１２５０ｍｇ、ＮＨ４　Ｎ
Ｏ３　１２５ｍｇ、（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　６７ｍｇ
、ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ１２５ｍｇ）およびマンニ
トール８４ｇ、ｐＨ５．６を含有し、浸透圧は５００ｍ
Ｏｓｍに調整されている。 葉を次に細片に切断し、そして同じ浸透圧調整培地中で
１時間保温する。葉片は次に排水され、そして消化溶液
１０ｍｌ／皿中に入れる。消化溶液はＫ３Ｍ（酵素とと
もに浸透圧が再び５００ｍＯｓｍとなるようにマンニト
ール７５．６ｇを含む）中に０．４％マセロザイムＲ１
０（セルバ）および０．６％セルリシン（カルビオケム
）を含む。ペトリ皿をパラフィルムで密封し、そして揺
動せずに暗所２６℃で一晩保温する。消化を促進するた
めに、葉片はまた２倍の酵素濃度で真空浸透され、そし
てわずかに揺動して（３０−４０ｒｐｍ）２−３時間保
温されてもよい。 【０３５９】プロトプラストを１００μｍフィルターに
通し、次いで半量の０．６Ｍショ糖ですすぐ。懸濁液を
１５ｍｌ遠心管に移し、Ｋ３Ｍ２ｍｌの層に覆い、そし
て１０００ｇで１０分間遠心分離する。プロトプラスト
を界面から吸引により除去し、Ｋ３Ｍで希釈し、そして
７００ｇで１０分間の遠心分離により除去する。遠心分
離により除去されたプロトプラストを次にＫ３Ｍ培地に
再懸濁する。 【０３６０】実施例２１．２：液胞の単離（文献〔８〕
に準拠して） ２０％フィコール含有のＫ３Ｍ培地（ｐＨ６．５）中に
プロトプラストを再懸濁する。そのうちの２．５ｍｌを
遠心管に移し、次いで以下の溶液の連続層で覆う：１５
％フィコール２ｍｌ，ＤＥＡＥデキストラン（ｐＨ６．
５）７ｍｇ；１０％フィコール２ｍｌ，硫酸デキストラ
ン（ｐＨ８．０）３ｍｇ；６％フィコール２ｍｌ，硫酸
デキストラン（ｐＨ８．５）３ｍｇ；０％フィコール（
ｐＨ８．０）約４ｍｌ（縁までいっぱいにする）。この
管を遠心ローター（ＳＷ４１．１４，コントロン）中で
最初に３５００ｒｐｍで１５分間、そして次に４０００
０ｒｐｍで１０５分間遠心分離する。液胞を吸引により
０−６％フィコール界面から除去する。 【０３６１】マーカーは文献〔７〕に従って測定される
。ヘキソースホスフェートイソメラーゼを測定するため
に、測定を可能とするには、硫酸デキストランはＤＥＡ
Ｅデキストランで沈殿されなければならない。ブラッド
ファード法によるタンパク質の測定は、ポリ塩基がその
測定を妨害するので不可能である。表５の結果は液胞マ
ーカー酵素α−マンノシダーゼを１００％として標準化
された。 【０３６２】表４に示されたキチナーゼ比活性の比較は
表２の結果を裏づける。プラスミドｐＳＣＭ１３または
ｐＳＣＵ１１でそれぞれ形質転換された植物Ｍ１３．４
およびＵ１１．４．２の場合、キチナーゼの分泌がみら
れ、一方、プラスミドｐＳＣＨ１２またはｐＳＣＵ１３
でそれぞれ形質転換された植物Ｍ１０．４およびＵ１３
．１５の場合、細胞内局在が明らかに示されている。 ウエスタンブロットは、内因性ニコチアナ・シルベスト
リスキチナーゼが細胞内に存在し、そしてプロトプラス
トＭ１３．４の場合には主な残留活性に関連することを
裏付ける。 【０３６３】植物体Ｍ１０．７．４およびＵ１３．１５
からのプロトプラストを単離することは可能だった。種
々のマーカーの測定（表５）はＣ末端配列を有するキチ
ナーゼの液胞中の局在を裏付ける。この場合もまた、ウ
エスタンブロットはこの局在を裏付ける。内因性キチナ
ーゼは同様に液胞中に局在している。 【０３６４】１またはそれ以上の自家受粉植物の種子が
全ての系から得られた。キチナーゼ過産生および局在が
引き続く世代に受け継がれることを証明することがてき
た。 【０３６５】寄託 以下の菌株はブダペスト条約の要求に従って米国メリー
ランド州ロックヴィレにあるアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託された。 【０３６６】培地および緩衝液 培地Ａ ＮＨ４　ＮＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　　１
６５０ｍｇ／ｌＫＮＯ３　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１９００ｍｇ／ｌＣａＣｌ２　・２Ｈ２
　Ｏ　　　　　　　　　　４４０ｍｇ／ｌＭｇＳＯ４　
・７Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　３７０ｍｇ／ｌＫＨ
２　ＰＯ４　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１
７０ｍｇ／ｌＮａ２　ＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　
　　　　　３７．３ｍｇ／ｌＦｅＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ
　　　　　　　　　　２７．８ｍｇ／ｌＨ３　ＢＯ３　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６．２
ｍｇ／ｌＭｎＳＯ４　・４Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　
　２２．３ｍｇ／ｌＺｎＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　　　
　　　　　　　　８．６ｍｇ／ｌＫＩ　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．８３ｍｇ／
ｌＮａ２　ＭｏＯ４　・２Ｈ２　Ｏ　　　　　　０．２
５ｍｇ／ｌＣｕＳＯ４　・５Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　
０．０２５ｍｇ／ｌＣｏＣｌ２　・６Ｈ２　Ｏ　　　　
　　　　０．０２５ｍｇ／ｌショ糖　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　３０．０ｇ／ｌチアミ
ンＨＣｌ　　　　　　　　　　　　　　０．４００ｍｇ
／ｌミオイノシトール　　　　　　　　　　　　１００
．０ｍｇ／ｌカイネチン　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．３ｍｇ／ｌα−ナフチル酢酸　　
　　　　　　　　　　　　　　２．０ｍｇ／ｌクロロフ
ェノールレッド　　　　　　　　　　５．０ｍｇ／ｌ寒
天　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１０．０ｇ／ｌ培地Ｂ 培地Ａと同じ組成であるが、α−ナフチル酢酸を含まず
、以下の追加の成分を含む。セファタキシム　　　　　
　　　　　　　　　　　５００ｍｇ／ｌ カナマイシン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　７５ｍｇ／ｌ培地Ｃ 培地Ｂと同じ組成であるが、カイネチンを含まない。ア
グロバクテリウム用のＭＧ／Ｌ培地 　　Ｌ−ブロス　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５
０％　　マンニトール−グルタメート培地〔Ｈｏｌｓｔ
ｅｒｓ等（１９７８）〕　　５０％　　Ｋ３Ｍ浸透圧調
整培地〔５００ｍＯｓｍ；ｐＨ５．６〕ＮａＨ２　ＰＯ
４　・Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　７５ｍｇ／ｌＣａ
Ｃｌ２　・２Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　４５０ｍｇ
／ｌＫＮＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　１２５０ｍｇ／ｌＮＨ４　ＮＯ３　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　１２５ｍｇ／ｌ（ＮＨ４　）２
　ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　　　６７ｍｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４　・７Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　１２５
ｍｇ／ｌマンニトール　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　８４ｇ／ｌＷ５塩溶液 ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　１５４ｍＭＣａＣｌ２　・２Ｈ２　Ｏ　　　　　　　
　　　１２５ｍＭＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　５ｍＭブドウ糖　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５ｍＭ
ｐＨ５．６−６．０ すすぎ溶液Ｉ ショ糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
１５４．０ｇ／ｌＭＥＳ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　０．５９ｇ／ｌＫＮＯ３　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　２５０．０ｍｇ／
ｌＮＨ４　ＮＯ３　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　２５．０ｍｇ／ｌＮａＨ２　ＰＯ４　・Ｈ２　Ｏ　
　　　　　　　１５．０ｍｇ／ｌＣａＣｌ２　・２Ｈ２
　Ｏ　　　　　　　　　　９０．０ｍｇ／ｌＭｇＳＯ４
　・７Ｈ２　Ｏ　　　　　　　　　　２５．０ｍｇ／ｌ
（ＮＨ４　）２　ＳＯ４　　　　　　　　　　　　　１
３．４ｍｇ／ｌＴＥＮＰ緩衝液 トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）　　　　　　　　１００ｍ
ＭＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　１０ｍＭＮＰ−４０（シグマ・ケミカ
ル）　　　　１％（ｖ／ｖ）ＴＢＥ緩衝液 トリス−ホウ酸塩　　　　　　　　　　　　　　　　　
　８９ｍＭホウ酸　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　８９ｍＭＥＤＴＡ　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２ｍＭ
ＴＥ緩衝液 トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）　　　　　　　　　　１０
ｍＭＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１ｍＭＳＳＣ ＮａＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　１．５４ｍＭクエン酸ナトリウム　　　　　　　
　　　　　０．１５４ｍＭ（ｐＨ７．０） 【０３６７】 キチナーゼ活性はタバコキチナーゼに対する免疫グロブ
リンの存在下で測定された。 【０３６８】参考文献一覧 【配列表】 【０３６９】配列番号：１ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）配列の種類
：遺伝コードの縮重に基づいて作成されたハイポセティ
カル配列 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 ＣＧＮ／ＡＧＲ　ＴＣＮ／ＡＧＷ　ＴＴＹ　ＧＧＮ　Ａ
ＡＹ　ＧＧＮ　ＣＴＮ／ＴＴＲ　ＴＴＲ／ＣＴＮ　ＧＴ
Ｎ　ＧＡＹ　ＡＣＮ　ＡＴＧ　ＴＡＡ　Ａｒｇ　　　　
　Ｓｅｒ　　　　　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　
Ｌｅｕ　　　　Ｌｅｕ　　　　　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈ
ｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ　 【０３７０】配列番号：２ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）配列の種類
：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
ｔａｂａｃｕｍ）　直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　Ｃ
ＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＴＡＡ
　 Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　ＶａｌＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ
　 【０３７１】配列番号：３ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）配列の種類
：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド仲介突
然変異誘発により突然変異させた）起源 生物名：ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
ｔａｂａｃｕｍ）　直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　Ｃ
ＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＴＡＡ
　 Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　ＶａｌＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ
　 【０３７２】配列番号：４ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）配列の種類
：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド仲介突
然変異誘発により突然変異させた）起源 生物名：ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
ｔａｂａｃｕｍ）　直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　Ｃ
ＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＡＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＴＡＡ
　 Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　ＶａｌＡｓｎ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ
　 【０３７３】配列番号：５ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）配列の種類
：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド仲介突
然変異誘発により突然変異させた）起源 生物名：ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
ｔａｂａｃｕｍ）　直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＧＧＡ　Ｃ
ＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＣＧＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＴＡＡ
　 Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　ＶａｌＡｒｇ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ
　 【０３７４】配列番号：６ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）配列の種類
：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド仲介突
然変異誘発により突然変異させた）起源 生物名：ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
ｔａｂａｃｕｍ）　直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 Ａ／Ｔ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　Ｇ
ＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ
　ＴＡＡ　 Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌ
ｅｕ　Ｌｅｕ　ＶａｌＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ
　 【０３７５】配列番号：７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）配列の種類
：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド仲介突
然変異誘発により突然変異させた）起源 生物名：ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
ｔａｂａｃｕｍ）　／キュウリ 直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８／ｐＢＳＣｕｃＣｈｔ５特性
：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連するシグ
ナルペプチドをコードする 配列 ＡＴＣ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　Ｇ
ＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧＴＡＡ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ
　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ＭｅｔＥ
ｎｄ　【０３７６】配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）配列の種類
：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（配列番号：２に示された配
列の断片） 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
ｔａｂａｃｕｍ）　直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　Ｔ
ＡＡ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅ
ｔ　Ｅｎｄ　【０３７７】配列番号：９ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）配列の種類
：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ（配列番号：２に示された配
列の断片） 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
ｔａｂａｃｕｍ）　直接の起源 クローン名：ｐＣＨＮ４８ 特性：液胞内への結合タンパク質分子の局在に関連する
シグナルペプチドをコードする 配列 ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　Ａ
ＴＧ　ＴＡＡ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓ
ｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ　【０３７８】配列番号：
１０ 配列の長さ：３８５０ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）鎖の数：二
本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ　　ＤＮＡ起源 生物名：ニコチアナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ　Ｌ．　ｃ．ｖ．
　Ｈａｖａｎａ　４２５）直接の起源 クローン名：ｌＣＨＮ１７（ｌファージ）特性：塩基性
キチナーゼ遺伝子 配列 【０３７９】配列番号：１１ 配列の長さ：１１０３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 起源 生物名：ＴＮＶに感染したキュウリの葉直接の起源 クローン名：ｐＢＳＣｕｃＣｈｔ５〔ＡＴＣＣ４０５２
８〕 特性：酸性キチナーゼ遺伝子 配列 【０３８０】配列番号：１２ 配列の長さ：６９ 配列の型：核酸（および相当するアミノ酸）配列の種類
：ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ 起源 生物名：ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　
ｔａｂａｃｕｍ）　直接の起源 クローン名：ｐＢＳ−Ｇｌｕｃ３９．１〔ＡＴＣＣ４０
５２６；ＥＰ−Ａ０３３２１０４に記載〕特性：液胞内
への結合タンパク質分子の局在に関連するシグナルペプ
チドをコードする 配列ＧＴＣ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＴＧＧ
　ＧＡＣ　ＡＧＴ　ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　
ＡＡＴ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＣＶａ
ｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ
　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　
Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＧＴＡ　Ａ
ＧＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＴＧＡ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
ｕ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ　
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドｐＣＩＢ２００の遺伝子地図を示す
。

Claims (64)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】　　あらゆる所望の結合された遺伝子産物
    を特異的に植物液胞内に方向づける（標的として導く）
    のに関連する短いペプチド断片をコードするＤＮＡ配列
    。
  2. 【請求項２】　　液胞に本来存在するタンパク質分子を
    コードする遺伝子の３’末端領域から得られ、かつ結合
    された遺伝子産物を特異的に植物液胞内に方向づける（
    標的として導く）のに関連する短いＣ末端ペプチド断片
    （Ｃ末端範囲）をコードする請求項１記載のＤＮＡ配列
    。
  3. 【請求項３】　　植物キチナーゼ遺伝子の３’末端領域
    から得られ、そして結合された遺伝子産物を特異的に植
    物液胞内に方向づける（標的として導く）のに関連する
    短いＣ末端ペプチド断片（Ｃ末端範囲）をコードする請
    求項１記載のＤＮＡ配列。
  4. 【請求項４】　　植物グルカナーゼ遺伝子の３’末端領
    域から得られ、そして結合された遺伝子産物を特異的に
    植物液胞内に方向づける（標的として導く）のに関連す
    る短いＣ末端ペプチド断片（Ｃ末端範囲）をコードする
    請求項１記載のＤＮＡ配列。
  5. 【請求項５】　　結合された遺伝子産物を特異的に植物
    液胞内に方向づける（標的として導く）のに関連する短
    いペプチド断片をコードし、そして以下の配列番号：１
    ：ＣＧＮ／ＡＧＲ　ＴＣＮ／ＡＧＷ　ＴＴＹ　ＧＧＮ　
    ＡＡＹ　ＧＧＮ　ＣＴＮ／ＴＴＲ　ＴＴＲ／ＣＴＮ　Ｇ
    ＴＮ　ＧＡＹ　ＡＣＮ　ＡＴＧ　ＴＡＡ　（ただし、Ｎ
    はＡまたはＧまたはＣまたはＴ／Ｕであり、ＲはＧまた
    はＡであり、ＷはＡまたはＴ／Ｕであり、そしてＹはＴ
    ／ＵまたはＣである）で示されるヌクレオチド配列を有
    する請求項１記載のＤＮＡ配列または元のペプチド断片
    の典型的な標的特性を依然有するペプチド断片をコード
    するそれらの突然変異体もしくは変種。
  6. 【請求項６】　　実質的に純粋な形態にあり、ニコチア
    ナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５植物の塩基性キチ
    ナーゼ遺伝子の３’末端領域から得られ、そして以下の
    配列番号：２： ３’−ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＧＧ
    Ａ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ
    　ＴＡＡ　−５’ で示されるヌクレオチド配列を実質的に有する請求項３
    記載のＤＮＡ配列または元のペプチド断片の典型的な標
    的特性を依然有するペプチド断片をコードするそれらの
    突然変異体もしくは変種。
  7. 【請求項７】　　実質的に純粋な形態にあり、ニコチア
    ナ・タバカムの園芸品種ハバナ４２５植物の塩基性グル
    カナーゼ遺伝子の３’末端領域から得られ、そして以下
    の配列番号：１２： ＧＴＣ　ＴＣＴ　ＧＧＴ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＴＧＧ　Ｇ
    ＡＣ　ＡＧＴ　ＴＣＡ　ＧＴＴ　ＧＡＡ　ＡＣＴ　ＡＡ
    Ｔ　ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＧＣＴ　ＴＣＴ　ＣＴＣＧＴＡ　
    ＡＧＴ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＴＧＡ　で示されるヌクレオ
    チド配列を実質的に有する請求項４記載のＤＮＡ配列ま
    たは元のペプチド断片の典型的な標的特性を依然有する
    ペプチド断片をコードするそれらの突然変異体もしくは
    変種。
  8. 【請求項８】　　あらゆる所望の結合されたタンパク質
    分子を特異的に植物液胞内に方向づける（標的として導
    く）のに関連し、かつ請求項１記載のＤＮＡ配列により
    コードされるペプチド断片。
  9. 【請求項９】　　あらゆる所望の結合されたタンパク質
    分子を特異的に植物液胞内に方向づける（標的として導
    く）のに関連し、かつ該液胞に本来存在するタンパク質
    分子のＣ末端範囲から得られる請求項８記載のペプチド
    断片。
  10. 【請求項１０】　　植物キチナーゼのＣ末端範囲から得
    られる請求項９記載のペプチド断片。
  11. 【請求項１１】　　植物グルカナーゼのＣ末端範囲から
    得られる請求項９記載のペプチド断片。
  12. 【請求項１２】　　植物液胞のための標的性シグナルと
    して作用し、かつ以下の配列番号：１および２：Ａｒｇ
    　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　
    Ｌｅｕ　ＶａｌＡｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　で示されるア
    ミノ酸配列を有する請求項１０記載のペプチド断片また
    は元のペプチド断片の典型的な標的特性を依然有するそ
    れらの突然変異体もしくは変種。
  13. 【請求項１３】　　植物液胞のための標的性シグナルと
    して作用し、かつ以下の配列番号：１２：Ｖａｌ　Ｓｅ
    ｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ
    　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　
    Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＬｅｕＶａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌ
    ｕ　Ｍｅｔ　で示されるアミノ酸配列を有する請求項１
    １記載のペプチド断片または元のペプチド断片の典型的
    な標的特性を依然有するそれらの突然変異体もしくは変
    種。
  14. 【請求項１４】　　請求項１ないし７のいずれか１項に
    示されたＤＮＡ配列に実質的に相同であり、そしてその
    配列の特性を依然有する、すなわち植物液胞のための標
    的性シグナルとして作用するＣ末端ペプチドをコードす
    るＤＮＡ配列。
  15. 【請求項１５】　　請求項１ないし７のいずれか１項に
    示されたＤＮＡ配列の自然に生じる変種または突然変異
    体である請求項１４記載のＤＮＡ配列。
  16. 【請求項１６】　　公知の突然変異方法により作成され
    た請求項１４記載のＤＮＡ配列。
  17. 【請求項１７】　　突然変異方法がオリゴヌクレオチド
    仲介突然変異誘発である請求項１６記載のＤＮＡ配列。
  18. 【請求項１８】　　配列番号：３ないし７：（ａ）　　
    　　　ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　ＡＡＡ　ＧＡ
    Ｔ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ
    　ＴＡＡ （ｂ）　　　　　ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　Ａ
    ＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＡＡＴ　ＡＣ
    Ｔ　ＡＴＧ　ＴＡＡ （ｃ）　　　　　ＡＧＧ　ＴＣＴ　ＴＴＴ　ＧＧＡ　Ａ
    ＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＣＧＴ　ＡＣ
    Ｔ　ＡＴＧ　ＴＡＡ （ｄ）　Ａ／Ｔ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　ＧＧＡ　Ａ
    ＡＴ　ＧＧＡ　ＣＴＴＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ
    　ＡＴＧ　ＴＡＡ （ｅ）　　　　　　　　　　　　　　　　　ＡＴＣ　Ｇ
    ＧＴ　ＧＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣＧＡＴ　ＡＣＴ
    　ＡＴＧ　ＴＡＡ で示されるヌクレオチド配列の一つを有する請求項１７
    記載のＤＮＡ配列。
  19. 【請求項１９】　　請求項１４ないし１８のいずれか１
    項に記載のＤＮＡ配列によりコードされ、かつ液胞に本
    来存在するタンパク質分子のＣ末端領域に位置する未変
    性のペプチド断片と同様の標的特性を依然有する変性ペ
    プチド断片。
  20. 【請求項２０】　　タンパク質分子と結合して植物液胞
    のための標的性シグナルとして作用し、かつ配列番号：
    ３ないし７： （ａ）　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａ
    ｓｐ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ
    　Ｅｎｄ （ｂ）　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇ
    ｌｙ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＶａｌ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ
    　Ｅｎｄ （ｃ）　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇ
    ｌｙ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＶａｌ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ
    　Ｅｎｄ （ｄ）　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇ
    ｌｙ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ
    　Ｅｎｄ （ｅ）　　　　　　　　　　　　　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａ
    ｓｐ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＶａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ
    　Ｅｎｄ で示されるアミノ酸配列の一つを有する請求項１９記載
    の変性ペプチド断片。
  21. 【請求項２１】　　請求項１ないし７または１４ないし
    １８のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列またはＤＮＡ配
    列の誘導体から得られ、かつ出発配列によりコードされ
    たペプチド断片の特異的標的特性を依然有するペプチド
    断片をコードする断片または部分配列。
  22. 【請求項２２】　　配列番号：８および９：ＣＴＴ　Ｔ
    ＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＴＡＡ　ＧＧ
    Ａ　ＣＴＴ　ＴＴＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ
    　ＴＡＡ　で示されるヌクレオチド配列の一つを実質的
    に有する請求項２１記載の部分的ＤＮＡ配列または出発
    配列によりコードされたペプチド断片の典型的標的特性
    を依然有するペプチド断片をコードするそれらの突然変
    異体もしくは変種。
  23. 【請求項２３】　　請求項１８記載の部分的ＤＮＡ配列
    の一つによりコードされ、かつ植物液胞のための標的性
    シグナルとして作用し、そして配列番号：８および９：
    Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｅ
    ｎｄ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈ
    ｒ　Ｍｅｔ　Ｅｎｄ　で示されるアミノ酸配列の一つを
    有するペプチド断片または元のペプチド断片の典型的標
    的特性を依然有するそれらの突然変異体もしくは変種。
  24. 【請求項２４】　　発現性ＤＮＡが請求項１ないし７、
    １４ないし１８または２１もしくは２２のいずれか１項
    に記載のＤＮＡ配列に操作可能な様式で連結されている
    キメラ遺伝子構築物からなる組換えＤＮＡ分子。
  25. 【請求項２５】　　あらゆる所望の発現性ＤＮＡが請求
    項１ないし７、１４ないし１８または２１もしくは２２
    のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列、ならびに植物細胞
    内で活性な発現シグナルおよび場合により３’および／
    または５’領域のその他のコード性配列および／または
    非コード性配列に操作可能に連結され、その結果植物宿
    主内で形質転換して、発現産物が特異的に植物液胞内に
    方向づけられるキメラ遺伝子構築物からなる請求項２４
    記載の組換えＤＮＡ分子。
  26. 【請求項２６】　　発現シグナルが植物または植物ウイ
    ルスの遺伝子に由来するか、またはバクテリアの発現シ
    グナルである請求項２５記載の組換えＤＮＡ分子。
  27. 【請求項２７】　　発現シグナルがカリフラワーモザイ
    クウイルス遺伝子（ＣａＭＶ）のプロモーターおよび／
    または終結シグナルである請求項２６記載の組換えＤＮ
    Ａ分子。
  28. 【請求項２８】　　発現シグナルがアグロバクテリウム
    ・チュメファシエンスのＴｉプラスミドからのノパリン
    シンターゼ遺伝子（ｎｏｓ）および／またはオクトピン
    シンターゼ遺伝子（ｏｃｓ）の発現シグナルである請求
    項２６記載の組換えＤＮＡ分子。
  29. 【請求項２９】　　誘導または抑制の意味において、植
    物組織内で、結合されたＤＮＡ配列の転写を調節し得る
    ３’および／または５’領域の追加的な非コード性調節
    ＤＮＡ配列を含む請求項２５記載の組換えＤＮＡ分子。
  30. 【請求項３０】　　発現性ＤＮＡが、植物細胞内で機能
    し得るＮ末端シグナルペプチドをコードする配列を５’
    末端に本来含むか、またはそのような配列に操作可能な
    様式に連結されている請求項２５記載の組換えＤＮＡ分
    子。
  31. 【請求項３１】　　標的性配列と結合された発現性ＤＮ
    Ａが、形質転換された植物細胞およびそれから成長する
    組織、そして特に植物それ自体に、病原体、化学物質お
    よび不利な環境要因に対する保護効果を与え得る構造遺
    伝子である請求項２４または２５のいずれかに記載の組
    換えＤＮＡ分子。
  32. 【請求項３２】　　構造遺伝子が植物細胞内でキチナー
    ゼを発現する遺伝子である請求項３１記載の組換えＤＮ
    Ａ分子。
  33. 【請求項３３】　　構造遺伝子が植物細胞内でグルカナ
    ーゼを発現する遺伝子である請求項３１記載の組換えＤ
    ＮＡ分子。
  34. 【請求項３４】　　標的性配列と結合された発現性ＤＮ
    Ａが、形質転換された植物細胞自体または組織、器官、
    カルス、胚および植物全体からなる群から選択されるよ
    り高度なオーガナイゼーションの単位の部分において発
    現して、植物液胞内に方向づけられる発現産物を生じる
    請求項２４または２５のいずれかに記載の組換えＤＮＡ
    分子。
  35. 【請求項３５】　　選択性表現型マーカーをコードする
    ＤＮＡ配列をさらに含む請求項２４または２５のいずれ
    かに記載の組換えＤＮＡ分子。
  36. 【請求項３６】　　１種またはそれ以上の微生物中での
    複製を可能にする複製の開始点をさらに含む請求項２４
    または２５のいずれかに記載の組換えＤＮＡ分子。
  37. 【請求項３７】　　植物細胞内で活性な発現シグナルと
    操作可能に連結しており、そして液胞内に本来存在する
    遺伝子産物をコードする構造遺伝子であって、該遺伝子
    内に本来存在する３’末端標的性配列は欠失されるか、
    または不活性化されており、そしてそれ故に植物宿主内
    で形質転換して、機能的Ｃ末端シグナル配列を含まず、
    そして植物の細胞外空間内に分泌される発現産物を産生
    する上記構造遺伝子を含む組換えＤＮＡ分子。
  38. 【請求項３８】　　構造遺伝子が塩基性キチナーゼ遺伝
    子である請求項３７記載の組換えＤＮＡ分子。
  39. 【請求項３９】　　構造遺伝子が塩基性グルカナーゼ遺
    伝子である請求項３７記載の組換えＤＮＡ分子。
  40. 【請求項４０】　　請求項２４ないし３９のいずれか１
    項に記載の組換えＤＮＡ分子を含むクローニングベクタ
    ー。
  41. 【請求項４１】　　請求項２４ないし３９のいずれか１
    項に記載の組換えＤＮＡ分子を含む形質転換ベクターお
    よび／または発現ベクター。
  42. 【請求項４２】　　大腸菌およびアグロバクテリウム・
    チュメファシエンスの両方において安定に複製し得る、
    請求項３６記載の組換えＤＮＡ分子を含むシャトルベク
    ター。
  43. 【請求項４３】　　請求項２４ないし３９のいずれか１
    項に記載の組換えＤＮＡ分子または請求項４０ないし４
    ２のいずれか１項に記載のベクターを含む宿主有機体。
  44. 【請求項４４】　　バクテリアであるか、またはプロト
    プラスト、細胞、カルス、組織、器官、種子、胚、花粉
    、胚珠、接合子その他からなる群から選択される植物材
    料である請求項４３記載の宿主有機体。
  45. 【請求項４５】　　請求項２４ないし３９のいずれか１
    項に記載の組換えＤＮＡ分子および／または請求項４０
    ないし４２のいずれか１項に記載のベクターを含む、ト
    ランスジェニック植物ならびにその有性および無性の後
    代。
  46. 【請求項４６】　　野生型に比べ植物液胞内に著しく増
    加されたタンパク質含量を有する、トランスジェニック
    植物ならびにその有性および無性の後代。
  47. 【請求項４７】　　野生型に比べ植物液胞内に著しく増
    加されたキチナーゼ含量を有する、トランスジェニック
    植物ならびにその有性および無性の後代。
  48. 【請求項４８】　　請求項４４記載の形質転換された植
    物材料から再生されたトランスジェニック植物。
  49. 【請求項４９】　　稔性植物である請求項４５ないし４
    ８のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
  50. 【請求項５０】　　請求項４５ないし４９のいずれか１
    項に記載のトランスジェニック植物の増殖材料。
  51. 【請求項５１】　　請求項４５ないし４９のいずれか１
    項に記載のトランスジェニック植物の部分。
  52. 【請求項５２】　　以下の工程： （ａ）まず最初に、液胞内に特異的に方向づけるのに関
    連するＤＮＡ配列を公知方法により、適当な供給源から
    単離するか、または合成し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列をあらゆる所望の発現性ＤＮＡ配列
    の３’末端に操作可能な 様式で挿入し、 （ｃ）生成した構築物を植物発現ベクター中に植物内で
    活性な発現シグナルの制御下にクローニングし、そして
    （ｄ）該発現ベクターを植物宿主内に形質転換し、そし
    てその中で発現ベクターを発現させる、から実質的にな
    る植物液胞内に発現産物を標的にむけて方向づける方法
    。
  53. 【請求項５３】　　発現性ＤＮＡが、植物細胞中で機能
    し得るＮ末端シグナルペプチドをコードする配列をその
    ５’末端領域に含むか、またはそのような配列に操作可
    能な様式で連結されている請求項５２記載の方法。
  54. 【請求項５４】　　発現性ＤＮＡ配列が構造遺伝子であ
    る請求項５２記載の方法。
  55. 【請求項５５】　　構造遺伝子が結合された標的性配列
    に関して異種である請求項５４記載の方法。
  56. 【請求項５６】　　標的性配列を本来含み、そしてそれ
    故に植物液胞内に通常方向づけられる植物タンパク質を
    細胞外空間に送り出す方法であって、以下の工程：（ａ
    ）上記タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離し、 （ｂ）特定の細胞区画への方向づけに関連するＣ末端に
    ある標的性配列を読み枠から除去し、 （ｃ）上記の変異させたＤＮＡ配列を適当な植物発現ベ
    クター中にスプライシングし、そして （ｄ）生成した構築物を植物宿主内に形質転換する、か
    ら実質的になる上記方法。
  57. 【請求項５７】　　植物液胞内に本来存在するタンパク
    質分子のＣ末端範囲をコードするＤＮＡ配列を公知方法
    により結合された構造遺伝子の３’末端領域から単離し
    、そして適当である場合、標的特性を変更することなく
    上記配列を変更することからなる、あらゆる所望の結合
    された遺伝子産物を特異的に植物液胞内に方向づける（
    標的として導く）のに関連するペプチド断片をコードす
    る短いＤＮＡ配列の製造方法。
  58. 【請求項５８】　　化学的方法によりＤＮＡ配列を合成
    することからなる、請求項１ないし７、１４ないし１８
    または２１もしくは２２のいずれか１項に記載のＤＮＡ
    配列の製造方法。
  59. 【請求項５９】　　適当なｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ
    クローンの３’末端からコード性ＤＮＡ配列を単離する
    ことからなる請求項５７記載の方法。
  60. 【請求項６０】　　あらゆる所望の発現性ＤＮＡを請求
    項１ないし７、１４ないし１８または２１もしくは２２
    のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列、ならびに植物細胞
    内で活性な発現シグナルおよび場合により３’および／
    または５’領域のその他のコード性配列および／または
    非コード性配列に操作可能な様式で連結し、その結果植
    物宿主内で形質転換して、発現産物が特異的に植物液胞
    内に方向づけられることからなる組換えＤＮＡ分子の製
    造方法。
  61. 【請求項６１】　　発現性ＤＮＡが、植物細胞中で機能
    し得るＮ末端シグナルペプチドをコードする配列をその
    ５’末端領域に含むか、またはそのような配列に操作可
    能な様式で連結されている請求項６０記載の方法。
  62. 【請求項６２】　　以下の工程： （ａ）まず最初に、液胞内に特異的に方向づけるのに関
    連するＤＮＡ配列を公知方法により、適当な供給源から
    単離するか、または合成し、 （ｂ）該ＤＮＡ配列をあらゆる所望の発現性ＤＮＡ配列
    の３’末端に操作可能な様式で挿入し、（ｃ）生成した
    構築物を植物発現ベクター中に植物内で活性な発現シグ
    ナルの制御下にクローニングし、（ｄ）該発現ベクター
    を植物宿主内に公知方法により形質転換し、そしてその
    中で発現ベクターを発現させ、そして （ｅ）そのように処理された植物材料をスクリーニング
    し、そして陽性の形質転換体を単離する、からなる植物
    液胞内に特異的に方向づけられる遺伝子産物を含む形質
    転換された植物材料の作出方法。
  63. 【請求項６３】　　細胞外空間に特異的に分泌される遺
    伝子産物（タンパク質）を含む形質転換された植物材料
    の作出方法であって、以下の工程： （ａ）上記タンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離し
    、 （ｂ）特定の細胞区画への方向づけに関連するＣ末端で
    標的性配列を読み枠から除去し、 （ｃ）上記の変異させたＤＮＡ配列を適当な植物発現ベ
    クター中にスプライシングし、 （ｄ）生成した構築物を植物宿主内に形質転換し、そし
    て （ｅ）そのように処理された植物材料をスクリーニング
    し、そして陽性の形質転換体を単離する、からなる上記
    方法。
  64. 【請求項６４】　　最初に適当な植物材料からｃＤＮＡ
    またはゲノム遺伝子ライブラリーを作成し、そしてプロ
    ーブ分子として請求項１ないし７、１４ないし１８また
    は２１もしくは２２のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列
    を用いて、前記プローブ分子とハイブリッド形成し得る
    相同ＤＮＡ配列の存在を求めて前記ライブラリーを調べ
    ることからなる、新規標識性配列の位置決定方法。
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