JP2006524506A - 植物培養における高マンノースタンパク質の製造 - Google Patents
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Abstract
Description
図面の簡単な記述
図1aはカリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモーター、TMV(タバコモザイクウイルス)のΩ翻訳エンハンサーエレメント、ER標的化シグナル、ヒトGCD配列(これはまた配列番号7によって表される)、液胞シグナル、および、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のオクトピンシンターゼターミネーター配列を含む得られた発現カセットを示す。
図1bはpGreenIIプラスミド骨格の概略マップを示す。
図2は抗hGCD特異的抗体を使用するhGCD形質転換細胞抽出物のウエスタンブロット分析を示す。標準品Cerezyme(レーン1)が陽性コントロールとして使用され、非形質転換カルスが陰性コントロール(レーン2)として使用され、様々な選択されたカルスの抽出物がレーン3〜8に示される。
図3aは精製工程の標準的な処理を表す。XKカラム(2.6x20cm)に充填された強カチオン交換樹脂(Macro−Prep high−S担体、Bio−Rad)でrh−GCDを精製する最初の工程を示す。カラムは、伝導率モニターリング、pHおよび280nmでの吸光度を可能にするAKTAプライムシステム(Amersham Pharmacia Biotech)と一体化された。rh−GCDの溶出が、600mMのNaClを含有する平衡化緩衝液で得られた。
図3bは処理時に集められた分画物の酵素活性アッセイの結果である。酵素活性を示したチューブ(溶出ピークでの)がプールされた。
図3cは活性についてアッセイされた溶出分画物のクーマシーブルー染色を示す。
図3dは第2のカラムでの、図3aに対応するグラフを示す。
図3eは第2のカラムでの、図3bに対応するグラフを示す。
図3fは第2のカラムでの、活性についてアッセイされた溶出分画物のクーマシーブルー染色を示す。
図4aは精製工程の標準的な処理を表す。XKカラム(2.6x20cm)に充填された疎水性相互作用樹脂(TSKゲル、Toyopearl Phenyl−650M、Tosoh Corp.)での組換えhGCDの最終精製工程を示す。カラムは、伝導率モニターリング、pHおよび280nmでの吸光度を可能にするAKTAプライムシステム(Amersham Pharmacia Biotech)と一体化された。前カラムから得られたGCD溶出プールを6ml/分で負荷し、その後、UV吸光度がベースラインに達するまで平衡化緩衝液で洗浄した。純粋なGCDが、50%エタノールを含有する10mMクエン酸緩衝液によって溶出された。
図4bは酵素活性アッセイによりモニターされた処理時に集められた分画物を示す。
図4cは活性についてアッセイされた溶出画分のクーマシーブルー染色を示す。
図5aは腹腔マクロファージによる取り込みの後における組換えhGCDの活性を示す。
図5bは腹腔マクロファージによる取り込みの後における組換えhGCDの活性を示す。
図5cは腹腔マクロファージによる取り込みの後における組換えhGCDの活性を示す。
図5dは本発明による組換えGCDのウエスタンブロットを示す。
図6は本発明によるrGCDおよびCerezyme(商標)についての比較されるグリコシル化構造を示す。
図7は本発明によるrGCDについてのグリコシル化構造を示す。
図8aは本発明によるrGCDについてのさらなるN−グリカングリコシル化構造を示す。
図8bは本発明によるrGCDについてのさらなるN−グリカングリコシル化構造を示す。
図8cは本発明によるrGCDについてのさらなるN−グリカングリコシル化構造を示す。
図8dは本発明によるrGCDについてのさらなるN−グリカングリコシル化構造を示す。
プラスミドベクター
*CE−T:これは、Galili教授から得られたプラスミドCEから構築された[米国特許第5367110号、1994年11月22日]。
プラスミドCEをSalIで消化した。
hGCD:これはATCC(アクセション番号65696)から得られ、グルコシダーゼβ(酸性)[グルコセレブロシダーゼ]を含有するGC−2.2[GCS−2kb;λEZZ−γ3ホモサピエンス]である。インサート長(kb):2.20;組織:繊維芽細胞WI−38細胞。
hGCDをコードするcDNA(ATTCクローン番号65696)を、フォワードプライマー(5’CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA3’)およびリバースプライマー(5’CTCAGATCTTGGCGATGCCACA3’)を使用して増幅した。精製されたPCR DNA産物をEcoRIおよびBglIIのエンドヌクレアーゼ(プライマー内の下線部の認識配列を参照のこと)で消化し、同じ酵素で消化された、発現カセットE−Tを有する中間ベクターに連結した。発現カセットを、SmaIおよびXbaIの制限酵素を使用して切断し、中間ベクターから取り出し、バイナリーベクターpGREENIIに連結して、これにより、最終的な発現ベクターを形成させた。カナマイシン抵抗性が、pGREENIIベクターと一緒に得られるnosプロモーターにより駆動されるNPTII遺伝子によって付与される(図1B)。得られる発現カセットが図1Aにより示される。
本発明者らが行ったニンジンカルスの確立およびニンジン細胞懸濁培養は、Torres K.C.によって以前に記載された通りであった(Tissue culture techniques for horticular crops、111頁、169)。
ニンジン細胞の形質転換を、以前に記載された方法[Wurtele,E.S.およびBulka,K.、Plant Sci.、61:253〜262(1989)]の適合化によるアグロバクテリウム形質転換を使用して行った。液体培地で成長する細胞を、カルスの代わりに、プロセスを通して使用した。インキュベーション時間および成長時間を、液体培養における細胞の形質転換のために適合させた。簡単に記載すると、アグロバクテリウム細菌をエレクトロポレーションによりpGREENIIベクターで形質転換し[den Dulk−Ra,A.およびHooykaas、P.J.(1995)、Methods Mol.Biol.、55:63〜72]、その後、30mg/mlのパロモマイシン抗生物質を使用して選択した。ニンジン細胞をアグロバクテリウム細菌で形質転換し、液体培地において60mg/mlのパロモマイシン抗生物質を使用して選択した。
形質転換後14日目に、培養から得られた細胞を、個々の細胞クラスターからカルスを形成させるために3%充填細胞体積の希釈度で固体培地に置床した。個々のカルスが1cm〜2cmの直径に達したとき、細胞をSDSサンプル緩衝液においてホモジネートし、得られたタンパク質抽出物をSDS−PAGE[Laemmli U.(1970)、Nature、227:680〜685]で分離し、ニトロセルロースメンブラン(hybondCニトロセルロース、0.45ミクロン、カタログ番号:RPN203C、Amersham Life Scienceから得られる)に転写した。GCDを検出するためのウエスタンブロットを、ポリクローナル抗hGCD抗体(本明細書中下記に記載される)を使用して行った。著量のGCDを発現するカルスを拡大して、スケールアップ、タンパク質精製および分析のために液体培地での成長に移した。
75マイクログラムの組換えGCD(Cerezyme(商標))を3mlの完全フロイントアジュバントに懸濁して、2羽のウサギのそれぞれに注射した。各ウサギには、追加免疫注射が2週間後に与えられた。ウサギは追加免疫注射後の約10日目に採血され、そして再び、抗体力価が低下し始めるまで1週間間隔で採血された。凝血塊を除いた後、血清を小分けして、−20℃で保存した。
rh−GCD遺伝子を含有する遺伝子改変されたニンジン細胞の約1cm(直径)のカルスを、4.4gr/lのMSD培地(Duchefa)、9.9mg/lのチアミンHCl(Duchefa)、0.5mg/lの葉酸(Sigma)、0.5mg/lのビオチン(Duchefa)、0.8g/lのカゼイン加水分解物(Ducifa)、30g/lの糖、およびホルモンの2−4D(Sigma)を含有する、直径9cmのムラシゲ・スクーグ(MS)寒天培地平板に置床した。カルスを25℃で14日間増殖させた。
培地を不溶性GCDから分離するために、約100gの湿重量の細胞を含有する凍結細胞ケークを解凍し、その後、解凍された細胞を、17000xgで20分間、4℃で遠心分離した。不溶物および無傷の細胞を、100mlの洗浄緩衝液(20mMリン酸ナトリウム(pH7.2)、20mM EDTA)に再懸濁することによって洗浄し、次いで、17000xgで20分間の4℃での遠心分離によって沈殿させた。rh−GCD(組換えヒトGCD)を、ペレットを200mlの抽出緩衝液(20mMリン酸ナトリウム(pH7.2)、20mM EDTA、1mM PMSF、20mMアスコルビン酸、3.8gポリビニルピロリドン(PVPP)、1mM DTT、および1% Triton−x−100)においてホモジネートすることにより抽出し、可溶化した。その後、ホモジネートを、30分間、室温で振とうし、17000xgで20分間の4℃での遠心分離によって清澄化した。ペレットを捨て、上清のpHを濃クエン酸の添加によってpH5.5に調節した。pH調節後に生じた濁りを、上記に記載された同じ条件での遠心分離によって清澄化した。
細胞抽出物および分画物におけるタンパク質濃度を、ウシ血清アルブミン標準品(第V画分、Sigma)を使用してLowry/Bradfordの方法(Bio Radタンパク質アッセイ)[Bradford、M.、Anal.Biochem.(1976)、72:248]によってアッセイした。あるいは、均質なタンパク質サンプルの濃度は280nmにおける吸収によって決定された(1mg/ml=1.4O.D280)。純度は280/260nm比によって決定された。
GCDの酵素活性を、p−ニトロフェニル−β−D−グルコピラノシド(Sigma)を基質として使用して測定した。アッセイ緩衝液は、60mMリン酸塩−クエン酸塩緩衝液(pH=6)、4mMのβ−メルカプトエタノール、1.3mMのEDTA、0.15%のTriton X−100、0.125%のタウロコール酸ナトリウムを含有した。アッセイを96ウエルELISAプレートで行った。0〜50マイクロリットルのサンプルを250マイクロリットルのアッセイ緩衝液とインキュベーションし、基質を4mMの最終濃度に添加した。反応液を37℃で60分間インキュベーションした。生成物(p−ニトロフェニル;pNP)の形成が405nmにおける吸光度によって検出された。405nmにおける吸光度をt=0および終点でモニターした。60分後、6マイクロリットルの5N NaOHを各ウエルに加え、405nmにおける吸光度を再びモニターした。並行してアッセイされた参照標準曲線を使用して、試験されたサンプルにおけるGCDの濃度を定量した[Friedman他(1999)、Blood、93(9):2807〜16]。
ゲル内タンパク質分解および質量分析法による分析
ゲル内の染色されたタンパク質バンドを清浄なカミソリ刃で切り、ゲル内のタンパク質を10mMのDTTで還元し、100mMのヨードアセトアミド/10mM重炭酸アンモニウムで修飾した。ゲル片を50%アセトニトリル/10mM重炭酸アンモニウムで処理して、タンパク質から染色剤を除き、その後、ゲル片を乾燥した。乾燥したゲル片を、サンプルあたり約0.1μgのトリプシンを含有する10%アセトニトリル/10mM重炭酸アンモニウムで再水和した。ゲル片を37℃で一晩インキュベーションし、得られたペプチドを、0.1%トリフルオロアセタートを含む60%アセトニトリルで回収した。
GCDのマクロファージに対する標的化および取り込みが、マンノース/N−アセチルグルコサミン受容体によって媒介されることが知られており、これは、Stahl P.およびGordon S.[J.Cell Biol.(1982)、93(1):49〜56]によって記載されるように、マウスから得られたチオグリコラート誘発の腹腔マクロファージを使用して測定することができる。簡単に記載すると、マウス(メス、C57−B6系統)に2.4%のデキストロース非含有Bacto−チオグリコラート培地(Difcoカタログ番号0363−17−2)の2.5mlを腹腔内注射した。4日後〜5日後、処置マウスを頸部脱臼によって屠殺し、腹膜腔をリン酸塩緩衝化生理的食塩水で洗い流した。細胞を遠心分離(1000xg、10分間)によってペレット化し、10%ウシ胎児血清を含有するDMEM(Beit Haemek、イスラエル)に再懸濁した。その後、細胞を1〜2x105細胞/mlで96ウエル組織培養プレートに置床して、37℃でインキュベーションした。90分後、非接着性細胞を、PBSを使用して3回洗浄して除き、接着性マクロファージを、酵母マンナン(2−10、5mg/ml)の非存在下および存在下、200マイクロリットルの最終体積における0〜40マイクログラムの範囲で指定量のrhGCDを含有する培養培地において37℃で90分間インキュベーションした。インキュベーション後、過剰なrGCDを含有する培地を除き、細胞をPBSで3回洗浄して、溶解緩衝液(10mM Tris(pH=7.3)、1mM MgCl2、0.5%NP−40、およびプロテアーゼ阻害剤)で溶解した。細胞によるrGCD取り込みの活性を、細胞溶解物を、上記のようなインビトログリコシダーゼアッセイに供することによって測定した。
発現プラスミドの構築
本実施例では、下記の実施例に関して使用される例示的な発現プラスミドの構築がより詳しく記載される。
5’の35Sプライマーに由来するプライマー:5’CTCAGAAGACCAGAGGGC3’(これはまた配列番号5によって表される)、および3’のターミネーター:5’CAAAGCGGCCATCGTGC3’(これはまた配列番号6によって表される)。確認されたクローン化hGCDのコード配列が配列番号7によって表される。
ニンジン細胞の形質転換、およびrhGCDを発現する形質転換された細胞に対するスクリーニング
本実施例では、下記の実施例で使用されるような、本発明に従ってニンジン細胞を形質転換するための例示的な方法が記載される。
カルス22の懸濁培養物を、形質転換されたカルスを液体培地で継代培養することによって得た。細胞を、(実験手順に記載されるように)、総体積がバイオリアクターへの接種のために十分になるまで振とう三角フラスコで培養した。遺伝子改変された遺伝子組換えニンジン細胞は数ヶ月間にわたって培養することができ、細胞収穫を5日〜7日のサイクルで行うことができる(データは示されず)。ニンジン細胞におけるrh−GCD産生量がピークに達する培養7日目に、細胞を、培養物を100メッシュの網に通すことによって集めた。細胞は、ろ過または遠心分離などのこの分野で知られている手段によって集めることができることには留意しなければならない。充填細胞ケーク(これは、h−GCDを均一に精製するための材料を提供する)は凍結温度で保存することができる。
形質転換ニンジン細胞からの組換え産生された活性なHGCDタンパク質の精製
形質転換されたニンジン細胞で発現した組換えh−GCDは、細胞の内膜に結合し、培地に分泌されないことが見出された。機械的な細胞破壊では、rGCDは不溶性の膜破砕物に結合したままである(データは示されず)。その場合、rGCDは、穏和な界面活性剤を使用して溶解され、細胞破砕物および他の不溶成分から分離された。可溶性酵素は、実験手順において記載されたように、カチオン交換クロマトグラフィーカラムおよび疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムを含むクロマトグラフィー技術を使用してさらに精製された。
精製されたrhGCDの同一性を確認するために、Mass−Spec Mass−Spec(MSMS)分析が行われた。得られた結果から、リーダーペプチド配列および標的化配列を含めて、タンパク質配列の49%の範囲が、発現カセットのDNAに基づく予測されたアミノ酸配列と一致することが示された。
ニンジンにおいて産生されたrhGCDが正しくグリコシル化されており、また、標的細胞による取り込みを受けることができ、従って、ゴーシェ病を処置するために有用であるかどうかを明らかにするために、マクロファージに結合し、マクロファージによって取り込まれるrhGCDの能力を次にアッセイした。マクロファージに対するrhGCDの標的化は、マンノース/N−アセチルグルコサミン(Man/GlcNAc)受容体によって媒介されており、チオグリコラート誘発の腹腔マクロファージを使用して明らかにすることができる。図5によって示されるように、rGCDは、高いレベルで、細胞による取り込みを受ける。図5Aには、マンナン濃度に関して本発明によるrGCDの細胞による取り込みが示される。
毒物学試験
上記の精製手順に従って得られた物質を、標準的な毒物学試験プロトコル(医薬品のための単回用量急性毒性試験に関する業界指針、薬物評価研究センター(CDER)PT1(61FR43934、1996年8月26日)に従って、また、ICH M3(M)、医薬品のためのヒト臨床試験を実施するための非臨床的安全性研究、CPMP/ICH/286/95改訂、2000年11月16日)によって調べた。
グリコシル化分析
前記の実施例に関して記載されたように産生されたrGCDに存在するグリカン構造の分析を行った。より詳細には下記において記載されるように、結果は、グリカンの大部分が、高マンノース構造だけでなく、末端マンノース残基を含有することを示している。好都合には、この高マンノース精製物は生物学的に活性であることが見出され、従って、さらなる工程がその活性化のために必要とされなかった。
分析を、ガスクロマトグラフィー−質量分析(GC−MS)、高速原子衝撃質量分析(FAB−MS)および遅延抽出−マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間質量分析(DE−MALDI−TOF MS)の組合せを使用して行った。
無傷サンプルの透析
1個のバイアル(0.8mg/mlの規定された濃度で1mlのタンパク質を含有する)をSlide−A−Lyzer透析カセット(10kDaの分子量排除)に入れ、水に対して4℃で24時間にわたって透析した。水は3回交換された。透析後、サンプルをカセットから取り出し、凍結乾燥した。
透析された凍結乾燥サンプルを、10%アンモニア水でpH8.4に調節された50mM重炭酸アンモニウム緩衝液に再懸濁して、SOP B001およびSOP B003に従って37℃で4時間、TPCK処理トリプシンで消化した。反応を、95℃の加熱ブロックに2分間入れることによって停止させ、その後、凍結乾燥した。
ペプチドN−グリコシダーゼAによる消化
糖タンパク質サンプルから得られる、トリプシン切断されたペプチド/糖タンパク質の混合物を、酢酸アンモニウム緩衝液(pH5.5)において37℃で15時間、酵素ペプチドN−グリコシダーゼA(PNGaseA)で処理した。反応を凍結乾燥によって停止させた。得られた生成物を、C18Sep−Pakカートリッジを使用して精製した。
潜在的なO結合型糖ペプチドを含有するSep−Pak画分を、0.05M水酸化ナトリウムにおける10mg/mlのホウ水素化ナトリウムの溶液に溶解し、45℃で16時間インキュベーションした。反応を氷酢酸の添加によって停止させた。
Dowexビーズを使用する脱塩をSOP B022に従って行った。サンプルをカラムに負荷し、4mlの5%酢酸水溶液で溶出した。回収された画分を凍結乾燥した。
5%酢酸水溶液のSep−Pak画分に溶出しているN結合型炭水化物、および、還元的脱離により遊離する潜在的なO結合型グリカンを、水酸化ナトリウム(NaOH)/ヨウ化メチル(MeI)法(SOP B018)を使用して完全メチル化した。完全メチル化されたN結合型グリカン混合物の一部をFAB−MSおよびMALDI−TOF MSによって分析し、残りを結合分析に供した。
誘導体化
トリプシンおよびPNGaseAでの消化または還元的脱離の後に得られた完全メチル化グリカンサンプル混合物を加水分解し(2M TFA、120℃で2時間)、次いで還元した(2M NH4OHにおけるホウ重水素化ナトリウム(NaBD4)、室温で2時間、SOP B025)。ホウ重水素化物の分解時に生じるホウ酸塩を、メタノール/氷酢酸(90:10)の混合物の添加、それに続く凍結乾燥を3回行うことによって除いた。その後、サンプルを、無水酢酸を使用してアセチル化した(100℃で1時間)。アセチル化されたサンプルを、クロロホルムへの抽出によって精製した。部分的にメチル化されたアルジトールアセタートを、その後、ガスクロマトグラフィー/質量分析(GC/MS)によって調べた。部分的にメチル化されたアルジトールアセタートの標準物混合物、およびブランクもまた、同じ条件のもとで処理された。
ヘキサンに溶解された誘導体化後の炭水化物サンプルの一部(1μl)を、Autosystem XLガスクロマトグラフおよびDellデータシステムを備えるPerkin Elmer Turbomass Gold質量分析計によって下記の条件のもとで分析した:
ガスクロマトグラフィー
カラム:DB5
注入:オンカラム
インジェクター温度:40℃
プログラム:40℃で1分間、その後、70℃/分で100℃に、100℃で1分間保持し、その後、8℃/分で290℃に、最後に、290℃で5分間保持する。
キャリアガス:ヘリウム
質量分析
イオン化電圧:70eV
取得モード:スキャニング
質量範囲:35〜450ダルトン
MS分解能:ユニット
誘導体化
500μgのグルコセレブロシダーゼに等しい小分け物を、内部標準としての10μgのアラビトールとともに凍結乾燥した。これを、その後、80℃で一晩のメタノリシスに供し、窒素下で乾燥した。遊離した単糖を、メタノール、ピリジンおよび無水酢酸の溶液を使用して再度N−アセチル化し、再び窒素下で乾燥して、SOP B023に従ってそれらのトリメチルシリル(TMS)誘導体に変換した。TMS誘導体を窒素下で濃縮し、2mlのヘキサンに溶解し、3分間超音波処理した。その後、サンプルを4℃で一晩平衡化させた。10μgのアラビトールを含有するブランクと、各10μgのフコース、キシロース、マンノース、ガラクトース、グルコース、N−アセチルガラクトサミン、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルノイラミン酸およびアラビトールを含有する標準物単糖混合物とを、並行して調製した。その後、TMS誘導体をガスクロマトグラフィー/質量分析(GC/MS)によって調べた。
ヘキサンに溶解された誘導体化後の炭水化物サンプルの一部(1μl)を、Autosystem XLガスクロマトグラフおよびDellデータシステムを備えるPerkin Elmer Turbomass Gold質量分析計によって下記の条件のもとで分析した:
ガスクロマトグラフィー
カラム:DB5
注入:オンカラム
インジェクター温度:40℃
プログラム:90℃で1分間、その後、25℃/分で140℃に、5℃/分で220℃に、最後に10℃/分で300℃に、そして300℃で5分間保持する。
キャリアガス:ヘリウム
質量分析
イオン化電圧:70eV
取得モード:スキャニング
質量範囲:50〜620ダルトン
MS分解能:ユニット
MALDI−TOF質量分析を、遅延抽出(DE)と結合させたVoyager STR Biospectrometry Research Stationレーザー解離質量分析計を使用して行った。
グルコセレブロシダーゼのTMS糖分析
N結合型オリゴ糖スクリーニング
無傷の糖タンパク質を透析に供し、トリプシン消化して、凍結乾燥生成物を、PNGaseAを使用して消化し、その後、C18Sep−Pakを使用して精製した。5%酢酸水溶液(N結合型オリゴ糖含有)画分を完全メチル化し、FAB質量スペクトルを、誘導体化されたオリゴ糖の一部を使用して、フラグメントイオンについて低質量範囲において得た。DE−MALDI−TOF質量スペクトルを、誘導体化されたオリゴ糖の一部を使用して、分子イオンについて高質量範囲において得た。
表1には、FABスペクトルに存在する優勢なフラグメントイオン、および、MALDIスペクトルに存在する分子イオンが列挙される。分子イオン領域(付録IIIに示される)には、優勢なシグナルが、1505.8のm/z(これは、Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc2の組成を有する構造について[M+Na]+擬分子イオンと一致する)において含まれる。強度がより小さい一連の擬分子イオンもまた、複合マンノース構造および高マンノース構造と一致して検出された。検出された高マンノース構造は、サイズが、1579.8のm/zでのHex5.HexNAc2から、2193.0のm/zでのHex8.HexNAc2まで及ぶ。複雑なシグナルが、1331.7のm/z(これは、Pent.Hex3.HexNAc2の組成を有する構造について[M+Na]+擬分子イオンと一致する)などのあまりプロセシングされていないN−グリカンから、または、例えば、1751.0のm/z(これは、Pent.deoxyHex.Hex3.HexNAc3の組成を有する構造について[M+Na]+擬分子イオンと一致する)、2375.4のm/z(これは、Pent.deoxyHex2.Hex4.HexNAc4の組成を有する構造について[M+Na]+擬分子イオンと一致する)、および、2753.6のm/z(これは、Pent.deoxyHex2.Hex5.HexNAc4の組成を有する構造について[M+Na]+擬分子イオンと一致する)でのより大きいN−グリカンから生じている。
結合分析を、PNGaseA消化、Sep−Pak精製および完全メチル化の後に遊離したN結合型炭水化物について行った。
還元的脱離を、トリプシン消化およびPNGaseA消化の後におけるグルコセレブロシダーゼのSep−Pak精製から得られる60%2−プロパノール画分(潜在的なO結合型糖タンパク質画分)について行った。サンプルを反応停止後に脱塩し、ホウ酸塩の除去後、完全メチル化した。FAB質量スペクトルを、誘導体化されたオリゴ糖の一部を使用して、フラグメントイオンについて低質量範囲において得た。DE−MALDI−TOF質量スペクトルを、誘導体化されたオリゴ糖の一部を使用して、分子イオンについて高質量範囲において得た。O結合型グリカンと一致するシグナルは観測されなかった(データは示されず)。
結合分析を、還元的脱離の生成物について、完全メチル化の後に行った。典型的なO結合型グリカンの存在と一致するシグナルは観測されなかった(データは示されず)。
本発明による処置
本発明に従って製造される組換えタンパク質は、好ましくは、植物細胞培養物によって産生される好適にグリコシル化されたタンパク質(これは、好ましくは、例えば、リソソーム酵素である)、および/または高マンノース型のグリコシル化タンパク質を含む。
配列番号2はタバコキチナーゼAからの液胞標的化シグナルの配列を示す。
配列番号3〜6は一本鎖DNAオリゴヌクレオチドの配列を示す。
配列番号10はERシグナルペプチドをコードする核酸配列を示す。
配列番号11は液胞標的化配列をコードする核酸配列を示す。
配列番号12はアグロバクテリウム・ツメファシエンスのターミネーターの核酸配列を示す。
配列番号13は高マンノースヒトグルコセレブロシダーゼ(GCD)をコードする核酸配列を示す。
配列番号14は高マンノースヒトグルコセレブロシダーゼ(GCD)の配列を示す。
Claims (72)
- 高マンノース組換えタンパク質を産生する宿主細胞であって、組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよび組換えタンパク質を高マンノースタンパク質として産生させるためのシグナルを含む宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチドは、目的とする前記タンパク質をコードする第1の核酸配列を、シグナルペプチドをコードする第2の核酸配列に機能的に連結されて含む請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記シグナルペプチドは、ER(小胞体)標的化シグナルペプチドを含む請求項2に記載の宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチドは、液胞標的化シグナルペプチドをコードする第3の核酸配列をさらに含む請求項3に記載の宿主細胞。
- 前記シグナルは、組換えタンパク質をERに対して標的化させる請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記シグナルは、組換えタンパク質をERに対して標的化させるためのシグナルペプチドを含む請求項5に記載の宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチドは、前記シグナルペプチドをコードする核酸セグメントを含む請求項6に記載の宿主細胞。
- 前記シグナルは、組換えタンパク質にゴルジ体を迂回させる請求項1,3〜7のいずれかに記載の宿主細胞。
- 前記シグナルは、組換えタンパク質にゴルジ体に対して標的化させないためのシグナルペプチドを含む請求項8に記載の宿主細胞。
- 前記ポリヌクレオチドは、前記シグナルペプチドをコードする核酸セグメントを含む請求項9に記載の宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、真核生物細胞または原核生物細胞のいずれか1つである請求項1に記載の宿主細胞。
- 前記原核生物細胞は、細菌細胞であり、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)細胞である請求項11に記載の宿主細胞。
- 前記真核生物細胞は、植物細胞である請求項12に記載の宿主細胞。
- 前記植物細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rihzogenes)で形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される植物根細胞である請求項13に記載の宿主細胞。
- 前記植物根細胞は、ニンジン細胞である請求項14に記載の宿主細胞。
- 前記組換えポリヌクレオチドは、塩基性タバコキチナーゼA遺伝子に由来する液胞標的化シグナルペプチドをコードする第2の核酸配列との機能的な連結にある、目的とする前記タンパク質をコードする第1の核酸配列を含み、この液胞シグナルペプチドは、配列番号2によって表されるようなアミノ酸配列を有し、前記第1の核酸配列は、場合により、さらに、配列番号1によって表されるようなER(小胞体)標的化シグナルペプチドをコードする第3の核酸配列と機能的に連結される請求項15に記載の宿主細胞。
- 前記組換えポリヌクレオチドは、植物細胞において機能的であるプロモーターをさらに含み、前記プロモーターは前記組換え分子に機能的に連結される請求項16に記載の宿主細胞。
- 前記組換えポリヌクレオチドは、植物細胞において機能的であるターミネーターをさらに含み、前記ターミネーターは前記組換え分子に機能的に連結される請求項17に記載の宿主細胞。
- 前記組換えポリヌクレオチドは、場合により、さらに、さらなる制御エレメント、促進エレメントおよび調節エレメント、および/または選択マーカーを含み、前記調節エレメントは前記組換え分子に機能的に連結される請求項18に記載の宿主細胞。
- 前記高マンノースタンパク質は、少なくとも1つの露出したマンノース残基を伴うグリコシル化を有する高マンノース糖タンパク質である請求項19に記載の宿主細胞。
- 前記高マンノースタンパク質は、グルコセレブロシダーゼ(GCD)、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−L−イズロニダーゼ、イズロナートスルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択される生物学的に活性な高マンノースリソソーム酵素である請求項20に記載の宿主細胞。
- 前記リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシダーゼ(GCD)である請求項21に記載の宿主細胞。
- 前記GCDは、配列番号7によって表されるような核酸配列によりコードされる、実質的には配列番号8によって表されるようなアミノ配列を含む請求項22に記載の宿主細胞。
- 前記細胞は、組換えポリヌクレオチド、または前記分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションされ、その組換えポリヌクレオチドは、カリフラワーモザイクウイルス由来の35Sプロモーター、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトピンシンターゼターミネーター、および、TMV(タバコモザイクウイルス)のΩ翻訳エンハンサーエレメントである調節エレメントをさらに含み、そして、実質的には配列番号14によって表されるようなアミノ酸配列を有するGCDをコードする、実質的には配列番号13によって表されるような核酸配列を有する請求項23に記載の宿主細胞。
- 請求項1〜24のいずれかに記載の宿主細胞によって産生される組換え高マンノースタンパク質。
- 前記高マンノースタンパク質は、グルコセレブロシダーゼ(GCD)、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−L−イズロニダーゼ、イズロナートスルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択される生物学的に活性な高マンノースリソソーム酵素である請求項25に記載の組換え高マンノースタンパク質。
- 前記リソソーム酵素はヒトグルコセレブロシダーゼ(GCD)である請求項26に記載の組換え高マンノースタンパク質。
- 露出したマンノース残基を含む少なくとも1つのオリゴ糖鎖を有する組換え産生された生物学的に活性な高マンノースリソソーム酵素。
- シグナルペプチド活性を有する第1の部分と、リソソーム酵素活性を有する第2の部分とを含む組換えタンパク質であって、前記第1の部分は、露出したマンノース残基を含む少なくとも1つのオリゴ糖鎖により前記第2の部分を植物細胞においてプロセシングさせる組換えタンパク質。
- 前記リソソーム酵素は、ゴーシェ病を処置または予防するためのタンパク質を含む請求項29に記載のタンパク質。
- 前記タンパク質はhGCDを含む請求項29または30に記載のタンパク質。
- 前記第1の部分は植物細胞のER標的化シグナルペプチドを含む請求項29〜31のいずれかに記載のタンパク質。
- 前記組換え酵素は、リソソーム蓄積疾患に罹患している対象の体内の標的部位おける標的細胞上のマンノース受容体に結合することができる請求項29に記載の組換えリソソーム酵素。
- 前記組換えリソソーム酵素は、天然に存在するリソソーム酵素の前記標的細胞に対する対応する親和性と比較して、前記標的細胞に対する増大した親和性を有する請求項33に記載の組換えリソソーム酵素。
- 前記組換えリソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ(GCD)、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−L−イズロニダーゼ、イズロナートスルファターゼ、α−マンノシダーゼまたはシアリダーゼからなる群から選択される請求項34に記載の組換えリソソーム酵素。
- 前記組換えリソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ(GCD)である請求項35に記載の組換えリソソーム酵素。
- 標的部位における前記標的細胞は前記対象の肝臓におけるクッパー細胞である請求項36に記載の組換えリソソーム酵素。
- 植物細胞培養において産生される組換え高マンノースタンパク質。
- タンパク質をERに標的化するための植物シグナルペプチドを含む請求項38に記載の組換え高マンノースタンパク質。
- 前記植物シグナルペプチドは、根の植物細胞培養物において前記タンパク質をERに標的化するためのペプチドを含む請求項39に記載のタンパク質。
- 前記根の植物細胞培養物はニンジン細胞を含む請求項40に記載のタンパク質。
- 植物細胞培養において産生される組換え高マンノースhGCDタンパク質。
- 高マンノースタンパク質を製造するための植物細胞培養物の使用。
- 高マンノースタンパク質を製造する方法であって、組換えタンパク質をコードする組換えポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクションされた組換え宿主細胞の培養物を調製すること;前記宿主細胞培養物を、前記タンパク質の発現を可能にする条件のもとで培養し、前記宿主細胞は前記タンパク質を高度にマンノシル化された状態で産生することを含む方法。
- 前記宿主細胞培養物は懸濁状態で培養される請求項44に記載の方法。
- 前記タンパク質を精製することをさらに含む請求項45に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、請求項1〜15のいずれかに記載されるようなものである請求項45に記載の方法。
- 前記高マンノースタンパク質は、露出したマンノース残基を含む少なくとも1つのオリゴ糖鎖を有する生物学的に活性な高マンノースリソソームタンパク質である請求項46または47に記載の方法。
- 前記組換え酵素は標的部位における標的細胞上のマンノース受容体に結合する請求項48に記載の方法。
- 前記組換え酵素は、天然に存在するリソソーム酵素の前記標的細胞に対する対応する親和性と比較して、前記標的細胞に増大した親和性を有する請求項49に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ(GCD)、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−L−イズロニダーゼ、イズロナートスルファターゼ、α−マンノシダーゼおよびシアリダーゼからなる群から選択される請求項50に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ(GCD)である請求項51に記載の方法。
- 標的部位おける前記標的細胞は前記対象の肝臓におけるクッパー細胞である請求項52に記載の方法。
- 前記宿主細胞は、アグロバクテリウム・リゾゲネスで形質転換された根細胞、セロリ細胞、ショウガ細胞、西洋ワサビ細胞およびニンジン細胞からなる群から選択される植物根細胞である請求項53に記載の方法。
- 前記植物根細胞はニンジン細胞である請求項54に記載の方法。
- 前記形質転換された宿主ニンジン細胞は懸濁状態で成長する請求項55に記載の方法。
- 外因性の組換えリソソーム酵素を使用して、リソソーム蓄積疾患を有する対象を処置するための方法であって、
(a)形質転換された植物根細胞から精製され、かつ前記リソソーム酵素が異常に不足している細胞を効率的に標的化することができる組換え産生された生物学的に活性な形態のリソソーム酵素を提供し、組換え産生された生物学的に活性な酵素は、露出した末端マンノース残基を結合しているオリゴ糖に有すること;および、
(b)治療効果的な量の前記組換え産生された生物学的に活性なリソソーム酵素を前記対象に投与すること
を含む方法。 - 前記宿主細胞は請求項1〜24のいずれかに記載されたものである請求項57に記載の方法。
- 前記宿主細胞はニンジン細胞である請求項58に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素は、露出したマンノース残基を有する少なくとも1つのオリゴ糖鎖を含む高マンノース酵素である請求項59に記載の方法。
- 前記組換え酵素は、対象の体内において標的部位における標的細胞上のマンノース受容体に結合することができる請求項60に記載の方法。
- 前記組換えリソソーム酵素は、天然に存在するリソソーム酵素の前記標的細胞に対する対応する親和性と比較して、前記標的細胞に対する増大した親和性を有する請求項61に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素は、グルコセレブロシダーゼ(GCD)、酸性スフィンゴミエリナーゼ、ヘキソサミニダーゼ、α−N−アセチルガラクトサミニダーゼ、酸性リパーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、α−L−イズロニダーゼ、イズロナートスルファターゼ、α−マンノシダーゼまたはシアリダーゼからなる群から選択される請求項62に記載の方法。
- 前記リソソーム酵素はグルコセレブロシダーゼ(GCD)である請求項63に記載の方法。
- 前記リソソーム蓄積疾患はゴーシェ病である請求項64に記載の方法。
- 標的部位における前記標的細胞は前記対象の肝臓におけるクッパー細胞である請求項65に記載の方法。
- 請求項25〜42のいずれかに記載されたような組換え産生された生物学的に活性な高マンノースリソソーム酵素を有効成分として含む、リソソーム蓄積疾患を処置するための医薬組成物であって、場合により、さらに、医薬的に許容され得る希釈剤、キャリアまたは賦形剤を含む医薬組成物。
- 前記リソソーム蓄積疾患はゴーシェ病である請求項67に記載の組成物。
- 前記組換えリソソーム酵素は、生物学的に活性な高マンノース型ヒトグルコセレブロシダーゼ(GCD)である請求項68に記載の組成物。
- リソソーム蓄積疾患を処置または予防するための医薬品を製造することにおける、請求項25〜42のいずれかに記載されたような組換え産生された生物学的に活性な高マンノースリソソーム酵素の使用。
- 前記疾患はゴーシェ病である請求項70に記載の使用。
- 前記生物学的に活性なリソソーム酵素は、生物学的に活性な高マンノース型ヒトグルコセレブロシダーゼ(GCD)である請求項71に記載の使用。
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