MXPA05011507A

MXPA05011507A - Produccion de proteinas con alto contenido de manosa en cultivo de plantas.

Info

Publication number: MXPA05011507A
Application number: MXPA05011507A
Authority: MX
Inventors: Daniel Bartfeld
Original assignee: Protalix Ltd
Priority date: 2003-04-27
Filing date: 2004-02-24
Publication date: 2006-07-03
Also published as: RU2535342C2; IL182888A; KR101332372B1; JP2011184445A; IL171561A; BRPI0410520A; RU2005136874A; KR20060018826A; EP2330205B1; WO2004096978A3; SI2333083T1; CA2523539A1; KR20110089193A; EP1618177A4; RU2009148012A; CN102240397A; US20060204487A1; AU2004234635A1; BRPI0410520B8; EP2322636B1

Abstract

Un dispositivo, sistema y metodo para producir proteinas glicosiladas en cultivo de plantas, particularmente proteinas que tienen una alta glicosilacion de manosa, mientras que se marcan dichas proteinas con una senal de ER y/o por medio del paso de Golgi. La invencion ademas se relaciona a vectores y metodos para la expresion y produccion de enzimas lisosomales con alto contenido de manosa enzimaticamente activas usando raices de plantas transgenicas, particularmente celulas de zanahoria. Mas particularmente, la invencion se relaciona a celulas hospederas, particularmente celulas de zanahoria suspendidas transgenicas, vectores y metodos para la alta expresion de rendimiento y produccion de Glucocerebrosidasa alta en manosa biologicamente activa (GDC). La invencion ademas proporciona composiciones y metodos para el tratamiento de enfermedades de acumulamiento lisosomal.

Description

PRODUCCION DE PROTEINAS CON ALTO CONTENIDO DE MAÑOSA EN CULTIVO DE PLANTAS Campo de la Invención La presente invención se relaciona a células hospederas transformadas para la producción de proteínas con alto contenido de mañosa y un método y sistema para producir las proteínas, particularmente en cultivo de plantas. Antecedentes de la Invención La enfermedad de Gaucher es el desorden de almacenamiento lísosomal más prevalente. Esta es causada por un desorden genético recesivo (cromosoma 1 q21-g31) que da por resultado la deficiencia de glucocerebrosidasa, también conocida como glucosilceramidasa, que es una enzima lisosomal enlazada a la membrana que cataliza la hidrólisis del glucocerebrósido de glicosfingolípido (glucosilceramida , GlcCer) a glucosa y ceramida. La enfermedad de Gaucher es causada por mutaciones puntuales en el gen hGCD (glucocerebrosidasa humana) (GBA) , que da por resultado la acumulación de GlcCer en los lisosomas de los macrofagos. Las células de almacenamiento características, llamadas células de Gaucher, se encuentran en el hígado, bazo y médula ósea. Los síntomas clínicos asociados incluyen la hepatosplenomegalia severa, anemia trombocitopenia y deterioro esquelético. El gen que codifica la GCD humana primero se secuenció en 1985 (6) . La proteína consiste de 497 aminoácidos derivados de un pro-péptido de 536-mer. La hGCD madura contiene cinco secuencias de consenso de aminoácidos de N-glicosilación (Asn-X-Ser/Thr) . Cuatro de estos sitios son normalmente glicosilados . La glicosilación del primer sitio es esencial para la producción de proteína activa. Ambas de las cadenas de oligosacárido de alto contenido de mañosa y complejo han sido identificadas (7) . hGCD de la placenta contiene 7% de carbohidrato, 20% del cual es del tipo de alto contenido de ma osa (8) . Los estudios bioquímicos y de mutagénesis dirigida al sitio han proporcionado un mapa inicial de regiones y residuos importantes para el plegamiento, interacción del activador y localización del sitio activo (9) . El tratamiento de hGCD placental con neuraminidasa (que produce una enzima asíalo) da por resultado una evacuación incrementada y proporciones de captación por las células del hígado de la rata con un incremento concomitante de actividad enzimática hepática (Furbish y colaboradores, 1981, Biochim. Biophys . Acta 673:425-434). La hGC placental modificada con glicano es actualmente utilizada como un agente terapéutico en el tratamiento de la enfermedad de Gaucher. Los estudios bioquímicos y de mutagénesis dirigida al sitio han proporcionado un mapa inicial de regiones y residuos importantes para el plegamiento, interacción del activador, y la localización del sitio activo [Grace y colaboradores, J. Biol. Chem. 269:2283-2291 (1994)]. Existen tres tipos diferentes de enfermedad de Gaucher, cada una determinada por el nivel de actividad de hGC. Las células mayores afectadas por la enfermedad son los macrófagos, que son altamente agrandados debido a la acumulación de GlcCer, y de esta manera son referidas como "células de Gaucher". La identificación de un defecto en GCD como la causa primaria de la enfermedad de Gaucher condujo al desarrollo de la terapia de reemplazo de enzima como una estrategia terapéutica para este desorden. De Duve primero sugirió que el reemplazo de la enzima lisosomal ausente con enzima biológicamente activa exógena podría ser un procedimiento viable para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosomal [Fed Proc. 23:1045 (1964) ] . Desde ese tiempo, varios estudios han sugerido que la terapia de reemplazo de enzima puede ser benéfica para tratar varias enfermedades de almacenamiento lisosomal. El mejor éxito se ha mostrado con individuos con enfermedades de Gaucher de tipo I, quienes se trataron con enzima exógena (ß-glucocerebrosidasa) , preparada de la placenta (Ceredase™) o más recientemente, recombinantemente (Cerezyme™) . La glucocerebrosidasa no modificada derivada de fuentes naturales es una glicoproteina con cuatro cadenas de carbohidrato. Esta proteina no se dirige a las células fagociticas en el cuerpo y por lo tanto es de valor terapéutico limitado. En el desarrollo de la terapia actual para la enfermedad de Gaucher, los azúcares terminales sobre las cadenas de carbohidrato de la glucocerebrosidasa son secuencialmente removidos mediante el tratamiento con tres diferentes glicosidasas . Este tratamiento con glicosidasa da por resultado una- glicoproteina cuyos azúcares terminales consisten de residuos de mañosa. Puesto que los fagocitos tienen receptores de mañosa que reconocen las glicoproteinas y glucopéptidos con cadenas de oligosacáridos que terminan en residuos de mañosa, la remodelación del carbohidrato de la glucocerebrosidasa ha mejorado la dirección de la enzima a estas células Furbish y colaboradores, Biochem. Biophys . Acta 673:425, (1981)]. Como es indicado en la presente, la glicosilación desempeña una función crucial en la actividad de hGCD. Por lo tanto, la desglicosilación de hGCD expresada en líneas de células usando ya sea tunicamicina (células Sf9) o mutaciones puntuales que anulan todos los sitios de glicosilación (ambas de las células Sf9 y COS-1) da por resultado la pérdida completa de la actividad enzimática. Además, hGCD expresada en E. coli se encontró que es inactiva. La investigación adicional indicó el significado de los diversos sitios de glicosilación para la actividad de la proteina. Además de la función de la glicosilación en la actividad de la proteina actual, la enzima comercialmente producida, contiene modificaciones de secuencia de glicano que facilitan el suministro de fármaco especifico. Las proteínas glicosiladas son remodeladas después de la extracción para incluir solamente secuencias de glicano que contienen mañosa. La enzima GCD humana contiene 4 sitios de glicosilación y 22 lisinas. La enzima recombinantemente producida (Cerezyme™) difiere de la enzima placental (Ceredase™) en la posición 495 donde una arginina ha sido sustituida con una histidina. Además, la composición del oligosacárido difiere entre la GCDs recombinante y la GCD placental ya que la primera tiene más fucosa y residuos de N-acetil-glucosamina mientras que la segunda retiene una cadena de alto contenido de mañosa. Como es mencionado en lo anterior, ambos tipos de GCDs se tratan con tres diferentes glicosidasas (neuramidasa, galactosidasa y p-N acetil-glucosaminidasa) para exponer las mañosas terminales, que permite la dirección de las células fagociticas. Una preparación farmacéutica que comprende la enzima recombinantemente producida es descrita en US 5,549,892. Se debe observar que todas las referencias mencionadas son incorporadas en la presente por referencia como si se expusieran completamente en la presente.

Una desventaja asociada con el tratamiento de terapia de reemplazo de enzima lisosomal existente es que la bioactividad in vivo de la enzima es indeseablemente baja, por ejemplo, debido a la baja captación, que es reducida a los lisosomas de las células especificas donde el sustrato es acumulado y una vida media in vivo funcional corta en los lisosomas . Otra desventaja mayor de las enzimas recombinantes de GCD existentes es su costo, que puede colocar una carga económica pesada sobre los sistemas del cuidado de la salud. El alto costo de estas enzimas recombinantes resulta de un protocolo de purificación complejo, y las cantidades relativamente grandes del material terapéutico requerido para los tratamientos existentes. Por lo tanto, hay una necesidad urgente para reducir el costo de GCD de modo que esta terapia salvadora de vidas puede ser proporcionada a todos los que la requieren más favorablemente . Las proteínas para uso farmacéutico se han producido tradicionalnaente en sistemas de expresión de mamíferos o bacterianos. En la pasada década un nuevo sistema de expresión ha sido desarrollado en plantas. Esta metodología utiliza Agrobacterium, una bacteria capaz de insertar moléculas de DNA de una sola hebra (T-DNA) en el genoma de la planta. Debido a la simplicidad relativa de introducir genes para la producción en masa de proteínas y péptidos, esta metodología está llegando a ser cada vez más popular como un sistema de expresión de proteína alternativo (1) · Mientras que las modificaciones post-traduccionales no existen en sistemas de expresión bacterianos, los sistemas de expresión derivados de plantas facilitan estas modificaciones que se conocen cruciales para la expresión de la proteína y la actividad. Una de las diferencias principales entre el sistema de expresión de proteína de mamífero y de plantas es la variación de las cadenas laterales de azúcar de proteína, causada por las diferencias en las rutas biosintéticas . La glicosilación se mostró que tiene un efecto profundo sobre la actividad, plegamiento, estabilidad, solubilidad, susceptibilidad a las proteasas, proporción de evacuación de la sangre y potencial antigénico de las proteínas. Por consiguiente, cualquier producción de proteína en plantas debe tomar en consideración las ramificaciones potenciales de glicosilación de la planta. La glicosilación de la proteína se divide en dos categorías: modificaciones N-enlazadas y O-enlazadas (2). Los dos tipos difieren del aminoácido al cual la porción de glicano es unida - N-enlazado son unidos a los residuos Asn, mientras que O-enlazado son unidos a los residuos Ser o Thr. Además, las secuencias de glicano de cada tipo lleva características de distinción únicas. De los dos tipos, la glicosilación N-enlazada es la más abundante, y su efecto sobre la función de la proteina ha sido estudiado extensivamente. Los glicanos O-enlazados, por otra parte son relativamente escasos, y menos información está disponible considerando su efecto sobre las proteínas. Breve Descripción de la Invención La técnica antecedente no enseña o sugiere un dispositivo, sistema o método para producir selectivamente proteínas glicosiladas en cultivo de plantas. La técnica antecedente no enseña o sugiere tal dispositivo, sistema o método para producir proteínas con alto contenido de mañosa en cultivo de plantas . La técnica antecedente no enseña o sugiere un dispositivo, sistema o método para producir proteínas en cultivo de plantas a través del retículo endoplásmico (ER) . La técnica antecedente no enseña o sugiere tal dispositivo, sistema o método para producir proteínas en cultivo de plantas a través del retículo endoplásmico (ER) mientras que se sobrepasa el cuerpo de Golgi. La técnica antecedente también no enseña o sugiere tal dispositivo, sistema o método para producir proteínas en cultivo de plantas al usar una señal de ER para sobrepasar el cuerpo de Golgi . La presente invención supera estas desventajas de la técnica antecedente al proporcionar un dispositivo, sistema y método para producir proteínas glicosiladas en cultivo de plantas, particularmente proteínas que tienen glicosilación de alto contenido de mañosa, mientras que opcionalmente y de preferencia se dirige (y/o de otra manera se manipula el procesamiento de) tales proteínas con una señal ER. Sin desear que sea limitado por una sola hipótesis, se cree que tal dirección causa que las proteínas sobrepasen el cuerpo de Golgi y de esta manera retengan la glicosilación deseada, particularmente la glicosilación de alto contenido de mañosa. Se debe observar que el término "cultivo de plantas" como se utiliza en la presente incluye cualquier tipo de célula de planta transgénica y/o de otra manera genéticamente diseñada que es cultivada en cultivo. La ingeniería genética opcionalmente puede ser permanente o transiente. De preferencia, el cultivo caracteriza células que no son ensambladas para formar una planta completa, tal que por lo menos una estructura biológica de una planta no está presente. Opcionalmente y de preferencia, el cultivo puede caracterizar una pluralidad de diferentes tipos de células de plantas, pero de preferencia el cultivo caracteriza un tipo particular de célula de planta. Se debe observar que opcionalmente los cultivos de plantas que caracterizan un tipo particular de célula de planta pueden ser originalmente derivados de una pluralidad de diferentes tipos de tales células de plantas. Las células de plantas pueden ser cultivadas de acuerdo con cualquier tipo de método de cultivo adecuado, incluyendo pero no limitado, al cultivo sobre una superficie sólida (tal como un recipiente o placa de cultivo de plástico, por ejemplo) o en suspensión. La invención además se relaciona a vectores y métodos para la expresión y producción de- enzimas lisosomales de alto contenido de mañosa enzimáticamente activas usando raices de plantas transgénicas, particularmente en células de zanahoria. Más particularmente, la invención se relaciona a células hospederas, particularmente células de zanahoria suspendidas transgénicas, vectores y métodos para la expresión de alto rendimiento y la producción de Glucocerebrosidasa (GCD) de alto contenido de mañosa biológicamente activa. La invención además proporciona composiciones y métodos para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosomal. La presente invención también se relaciona a un dispositivo, sistema y método para proporcionar cantidades suficientes de enzimas lisosomales biológicamente activas, y particularmente GCD humana, para células deficientes. La presente invención también se relaciona a células hospederas que comprenden composiciones de nuevo vector que permiten la producción eficiente de genes que codifican enzimas lisosomales, tal como GCD. La presente invención tiene una necesidad por largo tiempo palpable para una tecnología económicamente viable para producir proteínas que tienen requerimientos de glicosilación particulares, tal como la glicosilación de alto contenido de mañosa de enzimas lisosomales tal como GCD por ejemplo. La presente invención es capaz de resolver esta necesidad palpable por largo tiempo al usar cultivo de células de plantas . Con el fin de explicar adicionalmente la presente invención, una explicación breve es ahora proporcionada de la ruta biosintética de las proteínas de alto contenido de mañosa. La ruta de biosíntesis básica de los glicanos de alto contenido de mañosa y N-enlazados complejos es altamente conservada entre todos los eucariotes . La biosíntesis comienza en el Retículo Endoplásmico (ER) con la transferencia del precursor de glicano a partir de un portador de lípido de dolicol a un residuo de Asn específico sobre la proteína mediante la oligosacaril transferasa. El precursor es subsecuentemente modificado en el ER mediante las glicosidadas I y II y una manosidasa hipotética para producir las estructuras de alto contenido de mañosa, similar al proceso que ocurre en los mamíferos. Modificaciones adicionales de la secuencia de glicano a las estructuras complejas e híbridas ocurren en el Golgi. Tales modificaciones incluyen la remoción de uno de los cuatro residuos de mañosa mediante a-manosidasa I, además de un residuo de N-acetilglucosamina, la remoción de los dos residuos de mañosa adicionales mediante a-manosidasa II, la adición de N-acetilglucosamina y opcionalmente, en esta etapa, residuos de xilosa y fucosa pueden ser adicionados para producir glicanos N-enlazados específicos de planta. Después de la transferencia de xilosa y fucosa al núcleo, los N-glicanos de tipo complejo pueden ser además procesados por la vía de la adición de fucosa y galactosa terminal. Las modificaciones adicionales pueden tomar lugar durante el transporte de la glicoproteína. Varios procedimientos son actualmente utilizados en la técnica antecedente para controlar y clasificar la glicosilación de proteína en las plantas, todos los cuales tienen deficiencias significantes, particularmente en comparación con la presente invención. Las modificaciones gruesas, tal como la inhibición completa de la glicosilación o la remoción de los sitios de glicosilación de la cadena de péptido es una estrategia. Sin embargo, este procedimiento puede dar por resultado defectos estructurales. Un procedimiento adicional implica la inactivación y la introducción de enzimas de procesamiento de carbohidrato específicas. Nuevamente, este procedimiento es difícil y también puede tener efectos per udiciales sobre las células de plantas mismas . La presente invención supera estas deficiencias de los procedimientos de la técnica antecedente al usar una señal ER y/o al bloquear la secreción del ER al cuerpo Golgi. Sin desear que sea limitado por una sola hipótesis, puesto que una estructura de alto contenido de mañosa de las enzimas lisosomales es preferida, si la secreción puede ser bloqueada y la proteina puede ser mantenida en el ER, estructuras de alto contenido de mañosa que ocurre de manera natural son obtenidas sin la necesidad para la remodelación. Como es indicado anteriormente, las proteínas transportadas por medio del sistema de endomembrana primero pasan al retículo endoplásmico . La señal de transporte necesaria para esta etapa es representada por una secuencia de señal en el extremo N-terminal de la molécula, el llamado péptido de señal. Tan pronto como este péptido de señal ha cumplido su función, que es insertar la proteína precursora unida a éste en el retículo endoplásmico, esta se divide proteoliticamente de la proteína precursora. En virtud de su función específica, este tipo de secuencia de péptido de señal se ha conservado en alto grado durante la evolución en todas las células vivas, sin considerar si son de bacterias, levaduras, hongos, animales o plantas. Muchas proteínas de plantas, que son insertadas en el retículo endoplásmico en virtud del péptido de señal no residen en el ER, sino son transportadas del retículo endoplásmico al Golgi y continúan pasando del Golgi a las vacuolas. Una clase de tales señales de clasificación para que este tráfico resida son las señales que residen en la parte C-terminal de la proteína precursora [Neuhaus y Rogers , (1998) Plant Mol. Biol. 38:127-144]. Las proteínas que contienen tanto un péptido de señal N-terminal para la inserción en el retículo endoplásmico y una señal de dirección vacuolar C-terminal se espera que contengan glicanos complejos, que es unido a estos en el Golgi [Lerouge y colaboradores (1998) Plant Mol. Biol. 38:31-48]. La naturaleza de tales señalas de clasificación C-terminal puede variar muy ampliamente. US 6,054,637 describe fragmentos de péptido obtenidos de la región de la quitinasa básica de tabaco, que es una proteína vacuolar que actúa como péptido de dirección vacuolar. ün ejemplo para una proteína vacuolar que contiene una señal de dirección C-terminal y glicanos complejos es la proteína de almacenamiento de faseolina de las semillas de frijol [Frigerio y colaboradores (1998) Plant Cell 10:1031-1042; Grigerio y colaboradores, (2001) Plant Cell 13:1109-1126] . El paradigma es que en todas las células eucarióticas las proteínas vacuolares pasan por medio del ER y el Golgi antes de permanecer en la vacuola como su destino final. De manera sorprendente, las células de raíces de plantas transformadas de la presente invención redujeron una GCD de alto contenido de mañosa inesperada. Venta osamente, este producto de alto contenido de mañosa se encontró que es biológicamente activo y por lo tanto no son necesarias etapas adicionales para su activación. Sin que se desee que sea limitada por una sola hipótesis, se presentarla que el uso de una señal ER con la proteina recombinante que es producida en el cultivo de célula de planta fueron capaces de superar el transporte al Golgi, y por consiguiente retener la glicosilación de alto contenido de mañosa deseada. Opcionalmente, cualquier tipo de mecanismo que es capaz de producir la glicosilación de alto contenido de mañosa, incluyendo cualquier tipo de mecanismo que sobrepasa el Golgi, puede ser usado de acuerdo con la presente invención. En un primer aspecto, la presente invención se relaciona a una célula hospedera que produce una proteina recombinante de alto contenido de mañosa de interés. Esta célula puede ser transformada o transfectada con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteina de interés o con un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico. Tal molécula de ácido nucleico comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina de interés operablemente enlazada a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección vacuolar. La primera secuencia de ácido nucleico puede ser opcionalmente además enlazada de manera operable a una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección al ER (retículo endoplásmico) . La célula hospedera de la invención se caracteriza en que la proteína de interés es producida mediante la célula en una forma altamente manosilada. La célula hospedera de la invención puede ser una célula eucariótica o procariótica . En una modalidad, la célula hospedera de la invención es una célula procariótica, de preferencia, una célula bacteriana, más de preferencia, una célula de Agrobacterium tumefaciens . Estas células se utilizan para infectar las células hospederas de plantas preferidas descritas enseguida. En otra modalidad preferida, la célula hospedera de la invención puede ser una célula eucariótica, de preferencia, una célula de planta, y mucho más de preferencia, una célula de raíz de planta seleccionada del grupo que consiste de las células de raíz transformadas de Agrobacterium rihzogenes célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria. En una modalidad preferida, la célula de raíz de planta es una célula de zanahoria. Se debe observar que las células de zanahoria transformadas de la invención son cultivadas en suspensión. Como es mencionado en lo anterior y descrito en los Ejemplos, estas células se transformaron con las células de Agrobacterium tumefaciens.

En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico recombinante comprendida dentro de la célula hospedera de la invención, comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal que está en enlace operable con una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección vacuolar derivado del gen quitinasa A de tabaco básico. Este péptido de señal vacuolar tiene la secuencia de aminoácidos como es denotada por la SEQ ID NO: 2. La primera secuencia de ácido nucleico puede ser opcionalmente además enlazada en un enlace operable con una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección al ER (retículo endoplásmico) como es denotado por la SEO ID NO: 1. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico recombinante comprendida dentro de la célula hospedera de la invención además comprende un promotor que es funcional en células de plantas. Este promotor debe ser operablemente enlazado a la molécula recombinante de la invención . En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico recombinante opcionalmente puede comprender además un terminador operablemente enlazado que es de preferencia funcional en células de plantas. La molécula de ácido nucleico recombinante de la invención opcionalmente " puede comprender además elementos de control, de promoción y regulatorios adicionales y/o marcadores seleccionables . Se debe observar que estos elementos regula orlos están operablemente enlazados a la molécula recombinante. En una modalidad preferida, la proteina de alto contenido de mañosa de interés producida por las células hospederas de la invención puede ser una glicoproteína de alto contenido de mañosa que tiene residuos terminales de mañosa expuestos. Tal proteina de alto contenido de mañosa puede ser de conformidad con otras modalidades preferidas, una enzima lisosomal selecciona del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfinqomielinasa ácida, hexosaminidasa, oí-N-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. En una modalidad preferida, la enzima lisosomal puede ser la glucocerebrosidasa humana ¦ (GCD) . Después en la presente GCD recombinante, rGCD, rhGCD todos se refieren a varias formas de GCD humana recombinantes a menos que se indique de otra manera . Como es descrito previamente, la enfermedad de Gaucher, el desorden de almacenamiento lisosomal más prevalente, es causada por mutaciones puntuales en el gen hGCD (glucocerebrosidasa humana) (GBA) , que resulta de la acumulación de GlcCer en los lisosomas de macrófagos. La identificación de la deficiencia de GCD como la causa primaria de la enfermedad de Gaucher condujo al desarrollo de la terapia de reemplazo de enzima como una estrategia terapéutica para este desorden. Sin embargo, la glicosilación desempeña una función crucial en la actividad de hGCD y la captación a las células objetivo. Por lo tanto, de acuerdo con otras modalidades preferidas de la presente invención, hGCD adecuadamente glicosilada de preferencia se proporciona al controlar la expresión de hGCD en cultivo de célula de planta, opcionalmente y más de preferencia proporcionar una señal de ER y/o de otra manera al opcionalmente y más de preferencia bloquear la transformación al Golgi. Opcionalmente y de preferencia, la hGCD tiene por lo menos una cadena de oligosacárido que comprende un residuo de mañosa expuesto para el tratamiento o prevención de la enfermedad de Gaucher. Todavía adicionalmente, una modalidad particular, esta célula hospedera preferida es transformada o transfectada mediante una molécula de ácido nucleico recombinante que además comprende un promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor, un terminador de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens y el elemento incrementador traduccional omega de TMV (Virus de Mosaico de Tabaco) . De acuerdo con una modalidad preferida, esta molécula de ácido nucleico recombinante comprende la secuencia de ácido nucleico sustancialmente como es denotado por la SEQ ID NO: 13 y codifica una GCD alto contenido de mañosa que tiene una secuencia de aminoácidos sustancialmente como es denotada por la SEQ ID NO: 14. Se debe apreciar que la presente . invención además proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal biológicamente activa. En una modalidad preferida, el vector de expresión de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glucocerebrosidasa humana (GCD) de alto contenido de mañosa biológicamente activa. De preferencia, ese vector de expresión preferido comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que tiene la secuencia de ácido nucleico sustancialmente, como es denotada por la SEQ ID NO:13. En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona a una proteína de alto contenido de ma osa recombinante producida por la célula hospedera de la invención. En una modalidad preferida, esta proteina de alto contenido de mañosa puede ser una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-Nacetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, id ronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. Mucho más de preferencia, esta enzima lisosomai puede ser glucocerebrosidasa (GCD) humana. Todavía adicionalmente, la invención proporciona una enzima lisosomai de alto contenido de mañosa biológicamente activa, recombinantc, que tiene por lo menos una cadena de oligosacárido que comprende un residuo de mañosa expuesto. De acuerdo con una modalidad preferida, la enzima lisosomai recombinante de la invención puede enlazar un receptor de mañosa sobre una célula objetivo en un sitio objetivo. De preferencia, este sitio puede estar dentro de un sujeto que sufre de una enfermedad de almacenamiento lisosomai . Se debe observar que la enzima lisosomai recombinante tiene afinidad incrementada para la célula objetivo, en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosomai que ocurre de manera natural para la célula objetivo. En una modalidad especifica, la célula objetivo en el sitio objetivo puede ser una célula de Kupffer en el hígado del sujeto. En una modalidad preferida, la enzima lisosomai recombinante puede ser seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, -?-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. Mucho más de preferencia, esta enzima lisosomal recombinante es glucocerebrosidasa (GCD) . En un tercer aspecto, la invención se relaciona a un método para producir una proteina de alto contenido de mañosa. Por consiguiente, el método de la invención comprende las etapas de: (a) preparar un cultivo de células hospederas recombinantes transformadas o transfectadas con moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican una proteina recombinante de interés o con un vector de expresión que comprende las moléculas de ácido nucleico recombinantes; (b) cultivar este cultivo de células hospederas preparadas mediante la etapa (a) bajo condiciones que permiten la expresión de la proteina, en donde las células hospederas producen la proteina en una forma altamente manosilada; (c) recuperar la proteina de las células y cosechar las células del cultivo proporcionado en (a) ; y (d) purificar la proteina de la etapa (c) mediante un método de purificación de proteina adecuado. De acuerdo con una modalidad preferida, la célula hospedera usada por este método es la célula hospedera de la invención. En otra modalidad preferida, la proteina de alto contenido de mañosa producida por el método de la invención puede ser una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa que tiene por lo menos una cadena de oligosacárido que comprende un residuo de mañosa expuesto. Esta enzima recombinante puede enlazar un receptor de ma osa sobre una célula objetivo en un sitio objetivo. Más particularmente, la enzima recombinante producida por el método de la invención tiene afinidad incrementada para la célula objetivo, en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosomal de acuerdo de manera natural a la célula objetivo. Por consiguiente, la célula objetivo en el sitio objetivo puede ser la célula de Kupffer en el hígado del sujeto. En una modalidad específica, esta enzima lisosomal puede ser seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-acetilgalac osarainidasa, lipasa ácida, ct-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. Mucho más de preferencia, esta enzima lisosomal puede ser glucocerebrosidasa (GCD) . En otra modalidad preferida, la célula hospedera usada por el método de la invención puede ser una célula de raíz de planta seleccionada del grupo que consiste de célula de raíz transformada de Agrobacterium rihzogenes, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria. Mucho más de preferencia, la célula de raiz de planta es una célula de zanahoria. Debe ser particularmente observado que en el método de la invención, las células de zanahoria hospederas transformadas son cultivadas en suspensión. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona a un método para tratar a un sujeto que tiene enfermedad de almacenamiento lisosomal usando la enzima lisosomal recombinante exógena, que comprende: (a) proporcionar una forma biológicamente activa recombinante de enzima lisosomal purificada de células de raíz de planta transformadas, y capaz de dirigir eficientemente las células anormalmente deficientes en la enzima lisosomal. Esta enzima biológicamente activa recombinante tiene residuos de mañosa terminales expuestos sobre oligosacáridos adjuntos; y (b) administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la enzima lisosomal biológicamente activa recombinante al sujeto. En una modalidad preferida, la enzima lisosomal de alto contenido de mañosa recombinante usada por el método de la invención se puede producir mediante la célula hospedera de la invención. De preferencia, esta célula hospedera es una célula de zanahoria. En otra modalidad preferida, la enzima lisosomal usada por el método de la invención puede ser una enzima de alto contenido de mañosa que comprende por lo menos una cadena de oligosacárido que tiene un residuo de mañosa expuesto. Esta enzima recombinante puede enlazar a un receptor de mañosa sobre una célula objetivo en un sitio objetivo dentro de un sujeto. Mucho más de preferencia, esta enzima lisosomal recombinante tiene afinidad incrementada para estas células objetivo, en comparación con la afinidad correspondiente una enzima lisosomal que ocurre de manera natural a la célula objetivo. Más específicamente, la enzima lisosomal usada por el método de la invención puede ser seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrúsidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. De preferencia, esta enzima lisosomal es glucocerebrosidasa (GCD) . De acuerdo con una modalidad preferida, el método de la invención por lo tanto se propone para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosomal, particularmente en la enfermedad de Gaucher. En tal caso la célula objetivo en el sitio objetivo puede ser una célula de Kupffer en el higado del sujeto. La invención además proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosomal que comprende como un ingrediente activo una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa, recombinante como es definida por la invención. La composición de la invención opcionalmente además puede comprender un diluyente, portador, excipiente farmacéuticamente aceptable. En una modalidad especifica, la composición de la invención se propone para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher. Tal composición de preferencia puede comprender como un ingrediente activo una glucocerebrosidasa (GCD) humana de alto contenido de mañosa biológicamente activa, como es definido por la invención. La invención además se relaciona el uso de una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa directamente activa recombinante de la invención en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de la prevención de una enfermedad de almacenamiento lisosomal. Más particularmente, tal enfermedad puede ser la enfermedad de Gaucher. Por consiguiente, esta .enzima lisosomal biológicamente activa es una glucocerebrosidasa (GCD) humana de alto contenido de mañosa biológicamente activa, como es definido por la invención. De acuerdo con la presente invención, se proporciona una célula hospedera que produce una proteina recombinante de alto contenido de mañosa, que comprende un polinucleótido que codifica la proteina recombinante y una señal para causar que la proteina recombinante sea producida como una proteína de alto contenido de mañosa. De preferencia, el polinucleótido comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés operablemente enlazado a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal. Opcxonalmente, el péptido de señal comprende un péptido de señal de dirección al ER (retículo endoplásmicc) . De preferencia el polinucleótido además comprende una tercera secuencia de ácido nucleico para codificar un péptido de señal de dirección vacuolar. De preferencia, la señal causa que la proteína recombinante sea dirigida al ER. Más de preferencia, la señal comprende un péptido de señal para causar que la proteína recombinante sea dirigida al ER. Más de preferencia, el polinucleótido comprende un segmento de ácido nucleico para codificar el péptido de señal. Opcxonalmente y de preferencia, la señal causa que la proteína recombinante sobrepase el Golgi. De preferencia, la señal comprende un péptido de señal para causar que la proteína recombinante no sea dirigida al Golgi. Más de preferencia, el polinucleótido comprende un segmento de ácido nucleico para codificar el péptido de señal. Opcxonalmente y de preferencia, la célula hospedera es una de una célula eucariótica y una célula procariótica .

Opcionalmente, la célula procariótica es una célula bacteriana, de preferencia una célula de Agrobacterium tumefaciens. De preferencia, la célula eucariótica es una célula de planta. Más de preferencia, la célula de planta es una célula de raíz de planta seleccionada del grupo que consiste de células de raíz transformada de Agrobacterium rihzogenes, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria. Mucho más de preferencia, la célula de raíz de planta es una célula de zanahoria. De preferencia, el polinucleótido recombinante comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina de interés que está en enlace operable con una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección vacuolar derivado del gen quitinasa A de tabaco básico, el péptido de señal vacuolar que tiene la secuencia de aminoácido como es denotada por la SEQ ID NO: 2, en donde la primera secuencia de ácido nucleico está opcionalmente además enlazada de manera operable a una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección al ER (retículo endoplásmico) como es denotado por la SEQ ID NO:l. Más de preferencia, el polinucleótido recombinante además comprende un promotor que es funcional en células de plantas, en donde el promotor es operablemente enlazado a la molécula recombinante. Mucho más de preferencia, el polinucleótido recombinante además comprende un terminador que es funcional en células de plantas, en donde el terminador es operablemente enlazado a la molécula recombinante. También mucho más de preferencia, el polinucleótido recombinante opcionalmente además comprende elementos de control, de promoción y regulatorios adicionales y/o marcadores seleccionables, en donde los elementos regulatorios están operablemente enlazados a la molécula recombinante . De preferencia, la proteina de alto contenido de mañosa es una glicoproteina de alto contenido de mañosa que tiene glicosilación con por lo menos un residuo de mañosa expuesto. Más de preferencia, la proteina de alto contenido de mañosa es una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-acetilgalactosaminidasa r lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. Mucho más de preferencia, la enzima lisosomal es glucocerebrosidasa (GCD) humana. De preferencia, la GCD comprende la secuencia de aminoácidos sustancialmente como es denotada por la SEQ ID NO: 8, codificada por la secuencia de ácido nucleico como es denotada por la SEO ID NO: 7. Más de preferencia, la célula es transformada o transfectada con un polinucleótido recombinante o con un vector de expresión que comprende la molécula, el polinucleótido recombinante que además comprende un promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor, un terminador de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, y el elemento regulatorio es el elemento incrementador traduccional ornega de TMV (Virus de Mosaico de Tabaco) y que tiene la secuencia de ácido nucleico sustancialmente como es denotada por la SEQ ID NO: 13 que codifica la GCD que tiene la secuencia de aminoácido sustancialmente como es denotada por la SEQ ID NO:14. De acuerdo con modalidades preferidas, se proporciona una proteina de alto contenido de mañosa recombinante producida por la célula hospedera descrita en lo anterior . De preferencia, la proteina de alto contenido de mañosa es una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa.

Más de preferencia, la enzima lisosomal es glucocerebrosidasa (GCD) humana. De acuerdo con otras modalidades preferidas de la presente invención, se proporciona una enzima lisosomal de alto contenido de ma osa biológicamente activa recombinante que tiene por lo menos una cadena de oligosacárido que comprende un residuo de ma osa expuesto. De acuerdo con todavía otras modalidades preferidas, se proporciona una proteína recombinante, que comprende una primera porción que tiene actividad de péptido de señal y una segunda porción que tiene actividad de enzima lisosomal, la primera porción que causa que la segunda porción sea procesada en una célula de planta con por lo menos una cadena de oligosacárido que comprende un residuo de ma osa expuesto. De preferencia, la enzima lisosomal comprende una proteína para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Gaucher. Más de preferencia, la proteína comprende hGCD. De preferencia, la primera porción comprende un péptido de señal de dirección al ER de célula de planta. Más de preferencia, la enzima recombinante puede enlazar un receptor de mañosa en una célula objetivo en un sitio objetivo dentro de un sujeto que sufre de una enfermedad de almacenamiento lisosomal. Mucho más de preferencia, la enzima lisosomal recombinante tiene afinidad incrementada para la célula objetivo. En comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosomal que ocurre de manera natural para la célula objetivo. También mucho más de preferencia, la enzima lisosomal recombinante es seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, cigalactosidasa, glucocerebrosidasa, oí-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, -manosidasa y sialidasa. De preferencia, la enzima lisosomal recombinante es glucocerebrosidasa (GCD) . También de preferencia, la célula objetivo en el sitio objetivo es una célula de Kupffer en el hígado del sujeto. De acuerdo con todavía otras modalidades preferidas se proporciona una proteína de alto contenido de mañosa recombinante, producida en cultivo de células de plantas. De preferencia, la proteína caracteriza un péptido de señal de planta para dirigir una proteína al ER. Más de preferencia, el péptido de señal de planta comprende un péptido para dirigir la proteína al ER en un cultivo de célula de plantas de raíces. Mucho más de preferencia, el cultivo de célula de planta de raíces comprende células de zanahoria.

De acuerdo con todavía otras modalidades preferidas se proporciona una proteina GCD de alto contenido de mañosa recombinante, producida en cultivo de célula de plantas. De acuerdo con todavía otras modalidades preferidas se proporciona el uso de un cultivo de células de plantas para producir una proteína de alto contenido de mañosa. De acuerdo con otras modalidades preferidas se proporciona un método para producir una proteína de alto contenido de mañosa que comprende: preparar un cultivo de células hospederas recombinantes transformadas o transfectadas con un polinucleótido recombinante que codifica para una proteína recombinante; cultivar el cultivo de células hospederas bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína, en donde las células hospederas producen la proteína en una forma altamente manosilada. De preferencia, el cultivo de células hospederas es cultivado en suspensión. Más de preferencia, el método además comprende la purificación de la proteína. De acuerdo con otras modalidades preferidas, el método se realiza con la célula hospedera como es descrito previamente. De preferencia, la proteína de alto contenido de mañosa es una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa que tiene por lo menos una cadena de oligosacárido que comprende un residuo de mañosa expuesto. Más de preferencia, la enzima recombinante se enlaza a un receptor de mañosa sobre una célula objetivo en un sitio objetivo. Mucho más de preferencia, la enzima recornbinante tiene afinidad incrementada para la célula objetivo, en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosomal que ocurre de manera natural a la célula objetivo. De preferencia, la enzima lisosomal es seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-N-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. Más de preferencia, la enzima lisosomal es glucocerebrosidasa (GCD) . Mucho más de preferencia, la célula objetivo en el sitio objetivo es la célula de Kupffer en el higado del sujeto. De preferencia, la célula hospedera es una célula de raiz de planta seleccionada del grupo que consiste de célula de raiz transformada de Agrobacterium rlhzogen.es, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria. Más de preferencia, la célula de raiz de planta es una célula de zanahoria. Mucho más de preferencia, las células de zanahoria hospederas transformadas son cultivadas en suspensión. De acuerdo con todavía otras modalidades preferidas se proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene enfermedad de almacenamiento lisosomal usando la enzima lisosomal recombinante exógena, que comprende: proporcionar una forma biológicamente activa recombinante de enzima lisosomal purificada de células de raices de plantas transformadas, incapaces de dirigir eficientemente a las células anormalmente deficientes en la enzima lisosomal, en donde la enzima biológicamente activa recombinante tiene residuos de mañosa terminales expuestos sobre oligosacáridos adjuntos; y administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la enzima lisosomal biológicamente activa recombinante al sujeto. Este método opcionalmente puede ser realizado con cualquier célula hospedera y/o proteina como es descrito previamente. De preferencia, la enzima recombinante puede enlazar a un receptor de mañosa sobre una célula objetivo en un sitio objetivo dentro de un sujeto, más de preferencia, la enzima lisosomal recombinante tiene afinidad incrementada para la célula objetivo, en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosomal que ocurre de manera natural a la célula objetivo. Mucho más de preferencia, la enzima lisosomal es seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduranidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. También mucho más de preferencia, la enzima lisosomal es glucocerebrosidasa (GCD) . También mucho más de preferencia, la enfermedad de almacenamiento lisosomal es la enfermedad de Gaucher. También más de preferencia, la célula objetivo en el sitio objetivo en una célula de upffer en el higado del sujeto. De acuerdo con todavía otras modalidades preferidas se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosomal que comprende como un ingrediente activo una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa recombinante como es descrito en lo anterior, la composición que opcionalmente además comprende un diluyente, o portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. De preferencia, la enfermedad de almacenamiento lisosomal es la enfermedad de Gaucher. Más de preferencia, la enzima lisosomal recombinante es una glucocerebrosidasa (GCD) humana de alto contenido de mañosa biológicamente activa. De acuerdo con todavía otras modalidades preferidas se proporciona el uso de una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa recombinante como es descrita en lo anterior, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad de almacenamiento lisosomal. De preferencia, la enfermedad es la enfermedad de Gaucher. Más de preferencia, la enzima lisosomal biológicamente activa es una glucocerebrosidasa (GCD) humana de alto contenido de mañosa biológicamente activa. La invención será descrita por otra parte a partir de las siguientes figuras, que son ilustrativas solamente y no limitan al alcance de la invención que también es definida por las reivindicaciones adjuntas. Breve Descripción de las Figuras La invención es descrita en la presente, a manera de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos acompañantes, en donde: Figura 1?-1? 1A muestra el cásete de expresión resultante que comprende el promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor, el elemento incrementador traduccional omega de TMV (Virus de Mosaico de Tabaco) , señal de dirección al ER, la secuencia de GCD humana (también denotada por SEQ ID NO:7), la señal vacuolar y la secuencia de terminador de octopina sintasa de Agrobactezium. turnefaciens. IB muestra un mapa esquemático de la cadena principal del plásmido de pGreenlI. La Figura 2 muestra el análisis de manchado de Western de los extractos de células transformados de hGCD usando el anticuerpo especifico anti hGCD. Cerezyme Estándar (franja 1) se usó como un control positivo, el callo no transformado se usó como el control negativo (franja 2) varios extractos de callos seleccionados se muestran en las franjas 3-8. Las Figuras 3A-3C muestran la primera etapa de purificación de la rhGCD sobre una resina de intercambio catiónico fuerte (Macro-prep high-S support, Bio-Rad) , empacado a una columna XK (2.6x20 cm) . La columna se integró con un sistema de preparación AKTA (Amersham Pharmacia Biotech) que permite el monitoreo de la conductividad, el pH y la absorbencia a 280 nm. La elución de la rh-GCD se obtuvo con la solución reguladora de equilibrio que contiene NaCl 600 mM. La Fig. 3A representa una corrida estándar de esta etapa de purificación. Las fracciones recolectadas durante la corrida se inspeccionaron mediante el ensayo de actividad enzimática, como es mostrado por la Fig. 3B, y los tubos que exhiben actividad enzimática (en la elución máxima) se acumularon, la Fig. 3C muestra la mancha de azul de coomassie de las fracciones de elución analizadas para la actividad. Las Figuras 3D-3F muestran gráficas correspondientes para las figuras 3A-3C pero para la segunda columna . La Figura 4A-C: muestra la etapa de purificación final de la hGCD recombinante sobre una resina de interacción hidrofóbica (gel TSK, Toyopearl Phenyl-650C, Tosh Corp.), empacada en una columna XK (2.6x20 cm) . La columna se integró con un sistema de preparación ???? (Amersham Pharmacia Biotech) que permite el monitoreo de la conductividad, pH y absorbencia a 280 nm. La acumulación de elución de GCD de la columna previa se cargó a 6 ml/min seguido por el lavado con la solución reguladora de equilibrio hasta que la absorbencia UV alcanza la linea de base, la GCD pura se eluyó mediante la solución reguladora citrica 10 mM que contiene 50% de etanol. La Fig. 4A representa una corrida estándar de esta etapa de purificación. La Fig. 4B muestra las fracciones recolectadas durante la corrida que se inspeccionaron mediante el ensayo de actividad enzimática. La Figura 4C muestra la mancha de azul de coomassie de las fracciones de elución analizadas para la actividad. La Figura 5 muestra la actividad del hGCD recombinante después de la captación por los macrófagos perifonéales (Figuras. 5A-5C) , mientras que la Figura 5D muestra una mancha de Western de GCD recombinante de acuerdo con la presente invención. La Figura 6 muestra las estructuras de glicosilación comparativas para rGCD de acuerdo con la presente invención y aquella de Cerezyme™. La Figura 7 muestra estructuras de glicosilación para rGCD de acuerdo con la presente invención. La Figura 8 muestra las estructuras de glicosilación de N-glicano adicionales para rGCD de acuerdo con la presente invención. Déscripción Detallada de la Invención Las proteínas para uso farmacéutico se han producido tradicional mente en sistemas de expresión mamíferos o bacterianos . En los últimos cuantos años se encontró un sistema de nueva expresión prometedor en plantas. Debido a la simplicidad relativa de introducir nuevos genes y el potencial para la producción en masa de proteínas y péptidos, la preparación molecular' está llegando a ser cada vez más popular como un sistema de expresión de proteína. Una de las mayores diferencias entre el sistema de expresión de proteína de mamíferos y de plantas es la variación de las secuencias de glicosilación de la proteína, causadas por las diferencias en las rutas biosintéticas . La glicosilación se mostró que tiene un efecto profundo sobre la actividad, plegamiento, estabilidad, solubilidad, susceptibilidad a las proteasas, proporción de evacuación de la sangre y potencial antigénico de las proteínas. Por consiguiente, cualquier producción de proteína en plantas debe tomar en consideración las ramificaciones potenciales de la glicosilación de plantas. La porción de carbohidrato es una de las modificaciones post-traduccionales más comunes de las proteínas. La glicosilación de la proteína se divide en dos categorías: N-enlazada y O-enlazada. Los dos tipos difieren del aminoácido al cual la porción de glicano es unida en la proteína - N-enlazado son unidas a residuos de aminoácidos, mientras que O-enlazada son unidas a residuos de Ser o Thr. Además, las secuencias de glicano de cada tipo lleva características de distinción únicas. De los dos tipos, la glicosilación N-enlazada es la más abundante, y su efecto sobre las proteínas se ha estudiado extensivamente. Los glicanos O-enlazados, por otra parte son relativamente escasos, y menos información está disponible considerando su influencia en las proteínas. La mayoría de datos disponible sobre la glicosilación de proteína en plantas se enfoca sobre un N-enlazado, antes que glicanos O-enlazados. La presente invención describe en la presente un sistema de expresión de planta basado en células de planta transgénicas, que son de preferencia células de raíces, opcionalmente y de preferencia cultivadas en suspensión. Este sistema de expresión es particularmente diseñado para la producción eficiente de una proteína de alto contenido de mañosa de interés. El término "alto contenido de mañosa" incluye la glicosilación que tiene por lo menos un residuo de mañosa expuesto. Así, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona a una célula hospedera que produce una proteína recombinante de alto contenido de ma osa de interés. De preferencia, la proteina recombinante caracteriza un péptido de señal ER (retículo endoplásinico) , más de preferencia un péptido de señal de dirección al ER. Alternativamente o adicionalmente, la proteína recombinante caracteriza una señal que causa que la proteína sobrepase el Golgi. La señal de preferencia permite que la proteína recombinante caracterice la glicosilación de alto contenido de mañosa, más de preferencia al retener tal glicosilación, y mucho más de preferencia mediante la dirección al ER y/o al sobrepasar el Golgi. Como es descrito en mayor detalle en la presente, tal señal de preferencia es implementada como un péptido de señal, que más de preferencia forma parte de la secuencia de proteína, opcionalmente y más de preferencia a través de la ingeniería de la proteína para también caracterizar el péptido de señal como parte de la proteína. Se debe observar que la señal opcionalmente puede ser una señal de dirección, una señal de retención, una señal de evitación (sobrepaso) , o cualquier combinación de las mismas o cualquier otro tipo de señal capaz de proporcionar la estructura de glicosilación de alto contenido de mañosa deseada. Sin desear que sea limitado por una sola hipótesis, se presentaría que el uso de una señal de dirección al ER con la proteína recombinante que es producida en el cultivo de células de plantas fue capaz de superar la transportación al Golgi, y por consiguiente retener la glicosilación de alto contenido de mañosa deseada. Opcionalmente, cualquier tipo de mecanismo que es capaz de producir la glicosilación de alto contenido de mañosa, incluyendo cualquier tipo de mecanismo para sobrepasar el Golgi puede ser usado de acuerdo con la presente invención. Los péptidos de señal de dirección al ER son bien conocidos en la técnica; ellos son péptidos de señal N-terminales . Opcionalmente, cualquier péptido de señal de dirección al ER adecuados se puede utilizar con la presente invención . Una célula hospedera de acuerdo con la presente invención opcionalmente puede ser transformada o transfectada (permanentemente y/o transientemente) con una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica una proteina de interés o con un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico. Tal molécula de ácido nucleico comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina de interés, opcionalmente y de preferencia operablemente enlazada a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección vacuolar. Se debe observar que come se utiliza en la presente, el término "operablemente" enlazado no necesariamente se refiere al enlace físico. La primera secuencia de ácido nucleico opcionalmente puede y además de preferencia ser operablemente enlazado a una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección al ER (retículo endoplásmico) . La célula hospedera de la invención se caracteriza en que la proteína de interés se produce por la célula en una forma que incluye por lo menos un residuo de mañosa expuesto, pero es de preferencia una forma altamente manosilada. "Células", "células hospederas" o "células hospederas recombinantes" son términos usados intercambiablemente en la presente. Se entiende que tales términos se refieren no solamente a las células sujetas particulares sino a la progenie o progenie potencial de tal célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en la generación subsecuente debido a influencias de mutación no ambientales, tal progenie no puede ser, de hecho, a la célula de origen, pero es todavía incluido dentro del alcance del término como se utiliza en la presente. "Célula hospedera" como se utiliza en la presente se refiere a células que pueden ser transformadas recombinantemente con ??? desnudo o vectores de expresión construidos usando técnicas de DNA recombinante . Como se utiliza en la presente, el término "transíección" significa la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, ??? desnudo o un vector de expresión, en células recipientes mediante la transferencia del gen medida por ácido nucleico. "Transformación" como se utiliza en la presente, se refiere a un proceso en el cual el genotipo de la célula es cambiado como resultado de la captación celular de DNA o RNA exógeno y, por ejemplo, la célula transformada expresa una forma recombinante de la proteina deseada. Se debe apreciar que una resistencia al fármaco u otro marcador seleccionable se propone en parte para facilitar la selección de los transformantes. Adicionalmente, la presencia de un marcador seleccionable, tal como un marcador de resistencia a fármaco se puede usar para conservar la contaminación de los microorganismos de que se multipliquen en el medio cultivo. Tal cultivo puro de la células hospedera transformada será obtenida al cultivar las células bajo condiciones que son requeridas para supervivencia del fenotipo inducido. Como es indicado en lo anterior, las células hospederas de la invención pueden ser transfectadas o transformadas con una molécula de ácido nucleico. Como se utiliza en la presente, el término "ácido nucleico" se refiere a polinucleótidos tal como ácido desoxirribonucleico (DNA) y, donde es apropiado ácido ribonucleico (RNA) . Los términos también se deben entender para incluir, como equivalentes, análogos de ya sea RNA o DNA hechos de análogos nucleótidos y, como es aplicable a la modalidad que es descrita polinucleótidos de una sola hebra (tal como sentido o antisentido) y doble hebra. En todavía otra modalidad, la célula hospedera de la invención puede ser transfectada o transformada con un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico recombinante . "Vectores de expresión", como se utiliza en la presente, comprende vectores tales como plásmidos, virus, bacteriófago, fragmentos de DNA integrables y otros vehículos que permiten la integración de fragmentos de DNA en el genoma del hospedero. Los vectores de expresión son típicamente construcciones de DNA o RNA autoreplicantes que contienen el gen deseado o sus fragmentos, y elementos de control genético operablemente enlazados que son reconocidos en una célula hospedera adecuada y efectúan la expresión de los genes deseados. Estos elementos de control son capaces de efectuar la expresión dentro de un hospedero adecuado. Generalmente, los elementos de control genéticos pueden incluir un sistema de promotor procariótico o un sistema de expresión de promotor eucariótico. Tal sistema típicamente incluye un promotor transcripcional, un operador opcional para controlar el inicio de la transcripción, incrementadores de transcripción para elevar el nivel de la expresión de RNA como una secuencia que codifica un sitio de enlace de ribosoma adecuado, uniones de empalme de RNA, secuencias que terminan la transcripción y traducción y así sucesivamente. Los vectores de expresión usualmente contienen un origen de replicación que permite al vector replicarse independientemente de la célula hospedera.

Los plásmidos son la forma más comúnmente utilizada de vector pero otras formas de vectores que sirven como una función equivalente y que son, o que llegan a ser, conocidos en la técnica son adecuados para el uso en la presente. Ver, por ejemplo, Pouwels y colaboradores, Cloning Vectors : a Laboratory Manual (1985 and supplements) , Elsevier, N. Y.; y Rodriquez y colaboradores, (eds.) Vectors: a Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses, Buttersworth, Boston, Mass (1988), que son incorporadas en la presente por referencia. En general, tales vectores contienen, además, genes específicos que son capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas . El uso de vectores de expresión virales procarióticos y eucarióticos para expresar los genes que codifican para los polipéptidos de la presente invención también son contemplados. Opcionalmente, el vector puede ser un vector de planta general (como es descrito con respecto a los ejemplos enseguida) . Alternativamente, el vector opcionalmente puede ser específico para células de raíz. En una modalidad preferida, la célula hospedera de la invención puede ser una célula eucariotica o procariótica. En una modalidad específica, la célula hospedera de la invención es una célula procariótica, de preferencia, una célula bacteriana, mucho más de preferencia una célula Agrobacterium tumefacíens. Estas células se usan para infectar las células hospederas de planta preferidas descrita enseguida . En otra modalidad preferida, la célula hospedera de la invención puede ser una célula eucariótica, de preferencia, una célula de planta, y mucho más de preferencia, una célula de raiz de planta seleccionada del grupo que consiste de células de raiz de planta transformada Agrobacterium rihzogenes, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria. En una modalidad preferida, la célula de raiz de planta es una célula de zanahoria. Se debe observar que las células de zanahoria transformadas de la invención son cultivadas en suspensión. Como es mencionado en la anterior y descrito en los ejemplos, estas células se transformaron con las células de Agrobacterium tumefacíens de la invención. Los vectores de expresión o moléculas de ácido nucleico recombinantes usadas para transfectar o transformar las células hospederas de la invención además pueden ser modificadas de acuerdo con métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica para adicionar, remover, o de otra manera modificar las secuencias de señal de péptidos para alterar la segmentación del péptido de señal o para incrementar o cambiar la dirección de la enzima lisosomal expresada a través del sistema de endomembrana de la planta.

Por ejemplo, pero no a manera de limitación, la construcción de expresión puede ser específicamente diseñada para dirigir la enzima lisosomal para secreción, o localización vacuolar, o retención en el retículo endoplásmico (ER) . En una modalidad, el vector de expresión o molécula de ácido nucleico recombinante puede ser diseñada para incorporar una secuencia de nucleótidos que codifica una señal que dirige la enzima lisosomal a la vacuola de planta. Por ejemplo, y no a manera de limitación, la molécula de ácido nucleico recombinante comprendida dentro de la célula hospedera de la invención, comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal que está enlace operable con una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección vacuolar derivado del gen quitinasa A de tabaco básico. Este péptido de señal vacuolar tiene la secuencia de aminoácidos como es denotada por la SEQ ID NO: 2. La primera secuencia de ácido nucleico puede ser opcionalmente además enlazada en un enlace operable con una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección al ER (retículo endoplásmico) como es denotado por la SEQ ID NO: 1. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico recombinante comprendida dentro de la célula hospedera de la invención además comprende un promotor que es funcional enb células de plantas. Este promotor debe ser operablemente enlazado a la molécula recombinante de la invención. El término "operablemente enlazado" se utiliza en la presente para indicar que una primera secuencia de ácido nucleico es operablemente enlazada con una segunda secuencia de ácido nucleico cuando la primera secuencia de ácido nucleico se coloca en una relación funcional con la segunda secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor es operablemente enlazado a una secuencia de codificación si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia de codificación. Opcionalmente y de preferencia, las secuencias de DNA operablemente enlazadas están contiguas (por ejemplo físicamente enlazadas) y a donde es necesario unen dos regiones de codificación de proteína, en la misma estructura de lectura. Así como una secuencia de DNA y una (s) secuencia (s) regulatoria (s) están conectadas de tal manera para permitir la expresión del gen cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo proteínas activadoras transcripcionales (son enlazadas a la(s) secuencia (s) regulatoria (s) . En otra modalidad, esta molécula de ácido nucleico recombinante opcionalmente puede comprender además un terminador operablemente enlazado que es de preferencia funcional en células de plantas . La molécula de ácido nucleico recombinante de la invención opcionalmente puede además comprender elementos de control, de promoción y regulatorios adicionales y/o marcadores selecciónateles . Se debe observar que estos elementos regulatorios son operablemente enlazados a la molécula recombinante. Los elementos regulatorios que se pueden usar en las construcciones de expresión incluyen promotores que pueden ser ya sea heterólogos u homólogos a la célula de planta. El promotor puede ser un promotor de planta o un promotor no de planta que es capaz de inducir altos niveles de transcripción de una secuencia enlazada en células de plantas y plantas. Ejemplos no limitativos de promotores de plantas que pueden ser utilizados efectivamente en practicar la invención incluyen el 35S de virus de mosaico de coliflor (CaMV) , rbcS el promotor para la proteina de enlace a/b de clorofila Adhl NOS y HMG2, o modificaciones o derivados de los mismos. El promotor puede ser ya sea constitutivo inducible. Por ejemplo, y no a manera de limitación, un promotor inducible puede ser un promotor que promueve la expresión o la expresión incrementada de la secuencia de nucleótidos de la enzima lisosomal después de la activación del gen mecánica (MGA) de la planta, tejido de planta o célula de planta. Los vectores de expresión usados para transfectar o transformar las células hospederas de la invención pueden ser adicionalmente modificados de acuerdo con métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica para incrementar optimizar la expresión del gen heterólogo en plantas y células de plantas. Tales modificaciones incluyen, pero no están limitados a, elementos regulatorios de mutación de DNA de mutación para incrementar la resistencia del promotor y/o alterar la proteina de interés. En una modalidad preferida, la proteina de alto contenido de mañosa de interés producida por la célula hospedera de la invención puede ser una glicoproteina de alto contenido de mañosa que tiene por lo menos un residuo de mañosa expuesto (por lo menos un residuo de mañosa terminal) . Tal proteina de alto contenido de mañosa puede ser de acuerdo con otra modalidad preferida, una enzima lisosomal seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-N-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, -galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, ct-manosidasa y sialidasa. El término ?? enzima lisosomal" como se utiliza en la presente con respecto a cualquier enzima de tal clase y producto producido en un sistema de expresión de planta descrito por la invención se refiere a un péptido recombinante expresado en la célula de planta transgénica a partir de una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima lisosomal humana o animal, un enzima lisosomal humana o animal modificada, un fragmento, derivado o modificación de tal enzima. Las enzimas lisosomales humanas o animales modificadas incluyen pero no están limitadas a enzimas lisosomales humanas o animales que tienen una o varias adiciones, supresiones y/o sustituciones de aminoácidos que ocurren de manera natural o artificialmente introducidos. Las enzimas lisosomales solubles comparten las etapas iniciales de la biosintesis con las proteínas secretorias, es decir, la síntesis sobre el ribosoma, el enlace del péptido de señal N-terminal a la superficie del retículo endopiásmico rugoso (ER) , transporte en el lumen del ER donde el péptido de señal es segmentado, y la adición de oligosacáridos ha residuos de asparagina específico (N-enlazados) seguido por modificaciones adicionales de la proteína naciente del aparato de Golgi [von Figura and Hasilik, Annu. Rev. Biochem. 55:167-193 (1986)]. Los oligosacáridos N-enlazados pueden ser complejos, diversos o heterogéneos que pueden contener residuos de alto contenido de mañosa. Las proteínas se someten al procesamiento adicional en un pos-ER, compartimiento de pre-Golgi y en el cis-Golgi para formar ya sea una señal de reconocimiento dependiente de oligosacárido de mañosa 6-fosfato N-enlazada (M-6-P) o independiente el oligosacárido de M-6-P N-enlazado para las enzimas localizadas lisosomales [Kornfeld & Mellman, Ann. Rev. Cell Biol. , 5:483-525 (1989); aplan y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 74:2026 (1977)]. La presencia de la señal de reconocimiento M 6-P da por resultado el enlace de la enzima a los receptores M-6-P (MPR) . Estas enzimas enlazadas permanecen en las células, son eventualmente empacadas en lisosomas, y asi son segregadas de las proteínas dirigidas para la secreción o ala membrana del plasma . En una modalidad preferida, la enzima lisosomal puede ser la glucocerebrosidasa (GCD) humana. Todavía adicionalmente, en una modalidad particular, esta célula hospedera preferida es transformada o transfectada mediante una molécula de ácido nucleico recombinante que además comprende un promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor, de preferencia, que tiene la secuencia de ácido nucleico como es denotado por la SEO ID NO: 9, un terminador de octopina sintasa de Agrobacterium tunaefaciens, de preferencia, que tiene la secuencia de ácido nucleico como es denotada por la SEQ ID NO: 12 y el elemento incrementador traduccional omega TMV (Virus de Mosaico de Tabaco) . De acuerdo con una modalidad preferida, esta molécula de ácido nucleico recombinante comprende las la secuencia de ácido nucleico sustancialmente como es denotado por SEQ ID NO: 13 y codifica una GCD de alto contenido de mañosa que tiene la secuencia de aminoácidos sustancialmente como es denotada por la SEQ ID NO: 14. Se debe apreciar que la presente invención además proporciona un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa. En una modalidad preferida del aspecto, el vector de expresión de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que codifica una glucocerebrosidasa (GCD) humana de alto contenido de mañosa biológicamente activa. De preferencia, este vector de expresión preferido comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que tiene la secuencia de ácido nucleico sustancialmente como es denotada por la SEQ ID NO: 13. De acuerdo con una modalidad especifica, un vector de expresión preferido utiliza el plásmido pGREEN II como es descrito por el siguiente Ejemplo 1. Además se debe observar, que la invención proporciona un cásete de expresión comprendido dentro del vector de expresión descrito en lo anterior. En un segundo aspecto, la presente invención se relaciona a una proteina de alto contenido de mañosa recombinante producida por la célula hospedera de la invención . En una modalidad preferida, esta proteina de alto contenido de mañosa puede ser una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-acetilgalactosamir.idasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. Mucho más de preferencia, la enzima lisosomal puede ser glucocerebrosidasa (GCD) humana. El término "biológicamente activo" se utiliza en la presente con respecto a cualquier enzima lisosomal recombinante producida en un sistema de expresión de planta para dar entender que la enzima lisosomal recombinante es capaz de hidrolizar ya sea el substrato natural o un análogo o substrato sintético de la enzima lisosomal humana o animal correspondiente, niveles detectables . Todavía adicionalmente, la invención proporciona una enzima lisosomal de alto contenido de ma osa biológicamente activa, recombinante que tiene por lo menos una cadena de oligosacárido que comprende un residuo de mañosa expuesto. De acuerdo con una modalidad preferida, la enzima lisosomal recombinante de la invención puede enlazar a un receptor de mañosa sobre una célula objetivo sobre un sitio objetivo. De preferencia, este sitio puede estar dentro de un sujeto que sufre de una enfermedad de almacenamiento lisosomal . Opcionalmente y más de preferencia, la enzima lisosomal recombinante tiene afinidad incrementada para la célula objetivo, en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosomal que ocurre de manera natural para objetivo. En una modalidad especifica, la célula objetivo en el sitio objetivo puede ser una célula de Kupffer en el hígado del sujeto. En una modalidad preferida, la enzima lisosomal recombinante puede ser seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, -?-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, -galactosidasa, glucocerebrosidasa, -L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. Mucho más de preferencia, esta enzima lisosomal recombinante es glucocerebrosidasa (GCD) . En un tercer aspecto, la invención se relaciona a un método para producir una proteína de alto contenido de mañosa. Por consiguiente, el método de la invención comprende las etapas de: (a) preparar un cultivo de células hospederas recoitibin ntes transformadas o transfectadas con moléculas de ácido nucleico recombinantes que codifican para una proteína recombinante de interés o con un vector de expresión que comprende las moléculas de ácido nucleico recombinantes; (b) cultivar el cultivo de células hospederas preparadas mediante la etapa (a) en suspensión bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína de alto contenido de mañosa, en donde las células hospederas producen la proteína en una forma altamente manosilada; (c) recolectar las células de cultivo proporcionado en (a) y recuperar la proteina de las células; y (d) purificar la proteina de la etapa (c) mediante un método de purificación de proteina adecuado. Opcionalmente y de preferencia, la proteina recombinante se puede producir mediante células de planta de cuerdo con la presente invención mediante el cultivo en un dispositivo descrito con respecto a la patente norteamericana No. 6,391,638, expedida el 21 de Mayo de 2002 e incorporada en la presente por referencia como si se expusiera completamente en la presente. Las condiciones para cultivar células de planta en suspensión con este dispositivo se describen con respecto a la solicitud de patente norteamericana intitulada "CELL/TISSUE CULTURING DEVICE, SYSTEM AND METHOD" por uno de los presentes inventores y de propiedad común con la presente solicitud, que es incorporada en la presente por referencia como se si expusiera completamente en la presente y que se presentó en el mismo dia como la presente solicitud. Un ejemplo particular y no limitativo para la recuperación y purificación de una proteina de alto contenido de mañosa de interés producido por el método de la i nvenc ón se puede encontrar en los siguientes ejemplos. Los ejemplos muestran que una h-GCD recombinante producida por la invención fue inesperadamente enlazada a la membrana interna de las células de zanahoria transformadas de la invención y no secretada al medio. rh-GCD soluble se puede separar de los desechos celulares y otros componentes insolubles de acuerdo con medios conocidos en la técnica tal como la filtración o precipitación. Por ejemplo, después de un ciclo de congelación-descongelación, las células se someten a rompimiento y la liberación de proteina solubles intracelulares, mientras que el h-GCD permanece enlazada a los restos de membrana insoluble. Esta mezcla de restos de membrana soluble e insoluble luego se centrifugó y la solución soluble se removió simplificando de esta manera la purificación. El h-GCD enlazada a la membrana luego se puede disolver mediante rotura mecánica en la presencia de un detergente moderado, inhibidores de proteasa y reactivo de oxidación de neutralización. La enzima soluble además se puede purificar usando técnicas de cromatografía, tal como las columnas de cromatografía de intercambio catiónico y de interacción hidrofóbica. Durante la producción de rh-GCD en el bio-reactor y el proceso de purificación la identidad de h-GCD, rendimiento, pureza y actividad de la enzima se pueden determinar por uno o más ensayos bioquímicos. Incluyendo pero no limitado a la detección de la hidrólisis del substrato de la enzima o un análogo de substrato, el análisis de electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida y análisis inmunológicos tal como ELISA y manchado de Western.

De acuerdo con una modalidad preferida, la célula hospedera usada por este método comprende la célula hospedera de la invención. En otra modalidad preferida, la proteína de alto contenido de mañosa producida por el método de la invención puede ser una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa que tiene por lo menos una cadena oligosacárido que comprende un residuo de mañosa expuesto. Esta enzima recombinante puede enlazar a un receptor de mañosa sobre una célula objetivo en un sitio objetivo. Más particularmente, la enzima recombinante producida por el método de la invención tiene actividad incrementada para la célula objetivo, en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosomal que ocurre de manera natural a la célula objetivo. Por consiguiente, la célula objetivo en el sitio objetivo puede ser una célula de Kupffer en el hígado del sujeto. En una modalidad específica, esta enzima lisosomal puede ser seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa, -L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa. Más preferiblemente, esta enzima lisosomal puede ser glucocerebrosidasa (GCD) . En otra modalidad preferida, la célula hospedera usada por el método de la invención puede ser una célula de raíz de planta seleccionada del grupo que consiste de célula de raíz transformada de Agrobacterium rihzogenes, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria. Muchos más de preferencia, la célula de raíz de planta es una célula de zanahoria. Debe ser particularmente observado que las células de zanahoria hospederas transformadas son cultivadas en suspensión. En un aspecto adicional, la presente invención se relaciona a un método para tratar a un sujeto, de preferencia un sujeto mamífero, que tiene enfermedad de almacenamiento lisosomal al usar la enzima lisosomal recombinante exógena. Como es divulgada y descrita, se va a entender que esta invención no está limitadas a los ejemplos particulares, etapas del proceso y los materiales divulgados en la presente ya que tales etapas del proceso y materiales pueden variar un poco. También se va a entender que la terminología utilizada en la presente se utiliza para el propósito de describir modalidades particulares solamente y no se propone para ser limitativa puesto que el alcance de la presente invención será limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas y equivalentes de las mismas. Por toda esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, la palabra "comprende" y variaciones tales como "comprendido" y "que comprende", será entendido que implica la inclusión de un número entero establecido o etapa de grupo de números enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas . Se debe observar que, como se utiliza en esta especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Los siguientes ejemplos son representativos de técnicas empleadas por los inventores en llevar a cabo los aspectos de la presente invención. Se debe apreciar que mientras que estas técnicas son ejemplares de modalidades preferidas para práctica de la invención, aquellos expertos en la técnica, en vista de la presente descripción reconocerán que se pueden hacer numerosas modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance propuesto de la invención. E emplos Procedimientos Experimentales : Vectores de plásmido * CE-T - Se construyó del plásmido CE obtenido de Prof. Galili [patente norteamericana 5,367,110 22 de Noviembre de (1994) ] . El plásmido CE se digirió con Salí. El extremo cohesivo Salí se hizo de extremo despuntado usando el fragmento grande de DNA polimerasa I. Luego el plásmido se digirió con PstI y se ligó a un fragmento de DNA que codifica para la señal de dirección al ER del gen endoquitinasa básico [Arabidopsis thalíana] ATGAAGACTAATCTTTTTCTCTTTCTCATCTTTTCA CTTCTCCTATCATTATCCTCGGCCGAATTC y la señal de dirección vacuolar de la quitinasa A del tabaco: GATCTTTTAGTCGATACTATG digerido con Smal y PstI. * pGREENII - obtenido de Dr. P. Mullineaux [Roger P. Hellens y colaboradores, (2000) Plant Mol. Bio. 42:819-832] . LA expresión del vector pGREEN II es controlada por el promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor, el elemento incrementador traduccional ornega de TMV (Virus de Mosaico de Tabaco) y la secuencia de terminador de octopina sintasa de Agrobacteriuin turnefaciens . cDNA hGCD - obtenido de ATCC (Número de Acceso 65696), GC-2.2 [GCS-2kb; lambda-EZZ-gamma3 Homo sapiens] que contiene beta ácido glucosidasa [glucocerebrosidasa] . Longitudes del inserto ( kb) : 2.20 ; Tejido: Célula WI-38 de fibroblasto. Construcción del plásmido de expresión El cDNA que codifica para hGCD (número de clon de ATTC 65696) se purificó usando el cebador delantero: 5' CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' y el cebador trasero: 5' CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3' . El producto de DNA de PCR purificado se digirió con las endonucleasas EcoRI y BglII (ver las secuencias de reconocimiento subrayadas en los cebadores) y se ligo en un vector intermediario que tiene un cásete de expresión E-T digerido con las mismas enzimas. El cásete de expresión se cortó y se eluyó del vector intermediario y se ligó en el vector binario pGREENII usando las enzimas de restricción Smal y Xbal, formando el vector de expresión final. La resistencia a la canamicina conferida por el gen NPTII inducido por el promotor obtenido junto con el vector pGREEN (Fig. IB) . El cásete de expresión resultante se presenta por la Fig. 1A. El plásmido resultante se secuenció para asegurar la fusión en la estructura correcta de las señales usando los siguientes cebadores de secuenciación: : 5' promotor 35S: 5' CTCAGAAGACCAGAGGGC 3' y el terminador 3': 5' CAAAGCGGCCATCGTGC 3' . Estahlscimlento dsl callo zanahoria y cultivos de suspensión de células El establecimiento del callo de zanahoria y los cultivos de suspensión de células se realizaron como es descrito previamente por Torres K. C. (Tissue culture techniques for horticular crops, páginas 111, 169) . Transformación de células de zanahoria y aislamiento de células transformadas La transformación de las células de zanahoria se realizó usando la transformación de Agrobacterium mediante una adaptación de un método descrito previamente [Wurteler E. S. y Bulka, K. Plant Sci. 61:253-262 (1989)]. Las células que crecen en el medio liquido se usaron por todo el proceso en lugar de los callos . la incubación y los tiempos de crecimiento se adaptaron para la transformación de células en el cultivo liquido. Brevemente, Agrobacteria se transformaron con el vector pGREEN II mediante electroporación [den Dulk-Ra, A. y Hooykaas, P. J. (1995) Methods Mol. Biol. 55:63-72] y luego se seleccionaron usando 30 mg/ml de antibiótico paromomicina . Las células de zanahoria se transformaron con Agrobacteria y se seleccionaron usando 60 mg/ml de antibiótico de paromomicina en el medio liquido. Clasi icación de células de zanahoria transformadas para el aislamiento de callos que expresan altos niveles de GCD 14 días después de la transformación, las células del cultivo se colocaron sobre el medio sólido en dilución de 3% de volumen de célula empacado para la formación de callos de agrupaciones individuales de células. Cuando los callos inhibidores alcanzaron 1-2 cm en diámetro, las células se homogeneizaron en solución reguladora de muestra de SDS y los extractos de proteina resultantes se separaron sobre SDS-PAGE [Laemmli ü., (1970) Nature 227:680-685] y se transfirieron en la membrana de nitrocelulosa (nitrocelulosa hybond C, 0.45 mieras. Número de Catálogo: RPN203C de Amersham Life Science) . El manchado de Western para la detección de GCD se realizó usando anticuerpos anti hGCD policlonales (descritos en la presente enseguida) . Los callos que expresan niveles significantes de GCD se expandieron y se transfirieron para el crecimiento en el medio liquido para la escala aumentada, purificación de proteína y análisis. Prepara,ción de anticuerpos policlonales 75 microgramos de GCD recombinante (Cerezyme™) se suspendieron en 3 mi de adyuvante de Freund completo y se inyectaron a cada uno de dos conejos. Cada conejo se le aplicó una inyección reforzadora después de dos semanas. Los conejos se sangraron aproximadamente 10 dias después de la inyección reforzadora y nuevamente en intervalos de una semana hasta que el titulo del anticuerpo comenzó de descender. Después de la remoción del coágulo el suero se dividió en alícuotas y se almacenó a -20°C. Escalación aumentada del crecimiento de cultivo en un bioreactor Un callo de aproximadamente 1 cm (en diámetro) de células de zanahoria genéticamente modificadas que contienen el gen rh-GCD se colocó sobre la placa de medio agar de 9 cm de diámetro Murashige and Skoog (MS) que contiene 4.4 gr/1 de medio MSD (Duchefa) , 9.9 mg/1 de tiamina HC1 (Duchefa) , 0.5 mg de ácido fólico (Sigma) 0.5 mg/1 de biotina (Duchefa), 0.8 g/1 de hidrolizado de Caseína (Ducifa) , azúcar 30 g/1 y hormonas 2-4 D (Sigma) . El callo se cultivó durante 14 dias a 25°C. El cultivo de células en suspensión se preparó al sub-cultivar el callo transformado en un medio liquido SD (Murashige & Skoog (1962) que contiene 0.2 mg/1 de ácido 2,4-dicloroacético) , como es bien conocido en la técnica. Las células en suspensión se cultivaron en un matraz Erlenmeyer de 250 mi (el volumen de trabajo inicia con 25 mi y después de 7 incrementa a 50 mi) a 25 °C con velocidad de agitación de 60 rpm. Subsecuentemente, el volumen de cultivo de células se incrementó a un matraz de Erlenmeyer de 1 L mediante la adición del volumen de trabajo de hasta 300 mi bajo las mismas condiciones. El inoculo del bio-reactor pequeño (10 L) [ver W098/13469] que contiene 4 L del medio MSD, se obtuvo mediante la adición de 400 mi de suspensión derivadas de dos Erlenmeyer de 1 L que se cultivaron durante siete dias . Después de la semana de cultivo 25 °C con 1 Lpm de flujo de aire, el medio MDS se seleccionó hasta 10 L y el cultivo se continuó bajo las mismas condiciones. Después de cinco dias adicionales de cultivo, la mayoría de las células se cosecharon y se recolectaron al pasar el medio de células a través de la red de 80 µ. El medio extra se exprimió y la torta de célula empacada se almacenó a -70 °C. Detalles adicionales del dispositivo de biorreactor se pueden encontrar con respecto a la patente norteamericana No. 6,391, 638, expedida el 21 de Mayo de 2002 e incorporada previamente por referencia. Purificación de la Proteína Con el fin de separar el medio de la GCD insoluble, la torta de células congeladas que contienen aproximadamente 100 g de células en peso húmedas se congeló, seguido por la centrifugación de las células congeladas a 17000 xg durante 20 min. a 4 °C . Los materiales insolubles y las células intactas se lavaron mediante la resuspensión en 100 mi de solución reguladora de lavado (fosfato de sodio 20 mM pH 7.2, EDTA 20 mM) , y luego se precipitó mediante la centrifugación a 17000 g durante 20 min. a 4°C. La rh-GCD (GCD humana recombinante) se extrajo y se solubilizó mediante la homogeneización de la pelotilla en 200 mi de solución reguladora de extracción (fosfato de soaio 20 mM pH 7.2, EDTA 20 mM, PMSF 1 mM, ácido ascórbico 20 mM, 3.8 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) , DTT 1 mM y Triton-x-100 al 1%) . El homogenado luego se agitó durante 30 min. a temperatura ambiente y se clarificó mediante la centrifugación a 17000 xg durante 20 min. a 4°C. La pelotilla se descartó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH 5.5 mediante la adición de ácido cítrico concentrado. La turbiedad generada después del ajuste del pH se clarificó mediante centrifugación bajo las mismas condiciones como se describieron anteriormente.

La purificación adicional se realizó mediante el procedimiento de columnas de cromatografía como sigue: 200 mi de medio clarificado se cargaron en 20 mi de resina de intercambio catiónico fuerte (Macro-Prep high-S support, Bio-Rad) equilibrada en solución reguladora de citrato de sodio 25 mM pH 5.5, empacado en una columna XK (2.6x20 cm) . La columna se integró con un sistema de preparación AKTA (prime system (Amersham Pharmacia Biotech) que permitió monitorear la conductividad, pH y la absorbencia a 280 nm. La muestra se cargó a 20 ml/min, después la columna se lavó con solución reguladora de equilibrio (solución reguladora de citrato de sodio 25 mM pH 5.5) a un gasto de flujo de 12 ml/min. hasta que la absorbencia de UV alcanzó la línea de base. La pre-elución de la rh-GCD se realizó con solución reguladora de equilibrio que contienen NaCl 200 mM y la elución se obtuvo con la solución reguladora de equilibrio que contiene NaCl 600 mM. Las fracciones recolectadas durante la corrida se inspeccionaron mediante el ensayo de actividad enzimática y los tubos que exhiben actividad enzimática (en el máximo de elución) se acumularon. Las muestras acumuladas se diluyeron (1:5) en agua que contiene etanol al 5% y el pH se ajustó a 6.0 con NaOH. La muestra que contiene la rh-GCD se aplicó sobre la segunda columna XK (1.6x20 cm) empacada con 10 mi de la misma resina como la columna previa. La resina en esta columna se equilibró con solución reguladora de citrato 20 mM H 6.0 que contiene etanol al 5%. Después de la carga de la muestra en la columna se lavó con la solución reguladora de equilibrio y la GCD se eluyó de la columna mediante la solución reguladora de elución (solución reguladora de citrato 20 mM pH 6.0, etanol al 5% y NaCl 1 M) . Las fracciones del máximo absorbente en la etapa de elución se acumularon y se aplicaron sobre una tercera columna. La etapa de purificación final se realizó sobre una columna XK (1.6x20 cm) empacada con 8 mi de resina de interacción hidrofóbica (gel TSK, Toyopearl Phenyl-650C, Tosoh Corp.). La resina se equilibró en solución reguladora de citrato 10 mM pH 6.0 que contiene etanol al 5%. La acumulación de elución de GCD de la columna previa se cargó en 6 ml/min. seguido por el lavado con solución reguladora de equilibrio hasta que el absorbente de ÜV alcanzó la línea de base. La GCD pura se eluyó mediante la solución reguladora cítrica 10 mM que contiene etanol al 50%, se acumuló y se almacenó a -20 °C. Daterminacíón de la concentración de proteína Las concentraciones de proteína en los extractos de célula y las fracciones se analizaron mediante el método de Lowry/Bradford (ensayo de proteína Bio Rad) [Bradford, M., Anal. Biochem. (1976) 72:248] usando un estándar de albúmina de suero bovino (fracción V Sigma) . Alternativamente, la concentración de muestras de proteínas homogéneas se determinó mediante la absorción a 280 nra, 1 mg/ml — 1.4 0. D280. La pureza se determinó mediante la relación de 280/260 nm. Ensayo de actividad de la enzima GCD La actividad enzimá ica de GCD se determinó usando p-nitrofenil-3-D-glucopiranósido (Sigma) como un substrato. La solución reguladora de análisis contuvo solución reguladora de fosfato-citrato 60 mM pH = 6, ß-mercaptoetanol 4 mM, EDTA 1.3 mM, Tritón X-100 al 0.15%, taurocolato de sodio al 0.125%. El ensayo se realizó en placas de ELISA de 96 cavidades, 0-50 microlitros de muestra se incubaron con 250 microlitros de solución reguladora de ensayo y el substrato se adicionó a la concentración final de 4 mM. La reacción se incubó a 37 °C durante 60 min. La formación del producto (p- nitrofenilo; pNP) se detectó mediante la absorbencia a 405 nm. La absorbencia a 405 nm se inspeccionó a t=0 y en el punto final. Después de 60 min., 6 microlitros de NaOH 5 N se adicionaron a cada cavidad y la absorbencia a 405 nm se inspeccionó nuevamente. La curva estándar de referencia analizada en paralelo, se utilizó para cuantificar of GCD in las concentración de GCD en las muestras probadas [Friedman y colaboradores, (1999) Blood, 93 (9) : 2807-16] . Análisis bioquímico: Proteól i sis en gel y análisis de espectrometría de masas Las bandas de proteína manchadas en el gel se cortaron con una hoja de afeitar limpia y las proteínas en el gel se redujeron con DTT 10 mM y se modificaron con yodoacetamida 100 mM en bicarbonato de amonio 10 mM. Las piezas se trataron con acetonitrilo al 50% en bicarbonato de amonio 10 mM para remover las manchas de las proteínas después por el secado de las piezas de gel. Las piezas de gel secas se rehidrataron con acetonitrilo al 10% en bicarbonato de amino 10 mM que contiene aproximadamente 0.1 µg de tripsina por muestra. Las piezas de gel se incubaron durante la noche a 37 °C a y los péptidos resultantes se recuperaron con acetonitrilo al 60% con trifluoroacetato al 0.1%. Los péptidos trípticos se resolvieron mediante la cromatografía de fase inversa sobre capilares de sílice fusionado de 0.1 X 300-mm (J&W, ID de 100 micrómetros) de relleno doméstico con R2 poroso (Perspectiva) . Los péptidos se eluyeron usando un gradiente lineal de 80 min. de 5 a 95% de acetonitrilo con ácido acético al 0.1% en agua a un gasto de flujo de aproximadamente 1 µ?/min. El líquido de la columna se electrorocío en un espectrómetro de masas de trampa iónica (LCQ, Finnegan, San José, CA) . La espectrometría de masas se realizó en el modo de ión positivo usando la exploración MS repetitivamente completa seguido por la disociación que induce la colisión (CID) del ión más dominante seleccionado de la primera exploración MS. Los datos de espectrometría de masas se compararon con la proteólisis simulada y la CID de las proteínas en la base de datos NR-NCBI usando el software Sequest [J. Eng y J. Yates, University of Washington and Finnegan, San José] . El amino terminal de la proteína se secuenció en el Secuenciador de Péptido 494A (Perkin Elmer) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cspts-clm de GCD de los a.czó£a.gos per!toneales La dirección y captación del GCD a los macrófagos es conocido que es mediado por el receptor de Manosa/N-acetilglucosmina y se puede determinar usando los macrófagos peritoneales inducidos con tioglicolato obtenidos de ratones, como es descrito por Stahl P. y Gordon S. [J. Cell Biol. (1982) 93 (l):49-56]. Brevemente, ratones (hembra, raza C57-B6) se inyectaron intraperitonealmente con 2.5 mi del medio de Bacto-tioglicolato al 2.4% w/o dextrosa (Difco Cat. No. 0363-17-2) . Después de 4-5 días, los ratones tratados se sacrificaron mediante la dislocación cervical y la cavidad peritoneal se enjuagó con solución salina regulada con fosfato. Las células se formaron en pelotillas mediante centrifugación (1G00 xg 10 min.) y se resuspendieron en D EM (Beit Haemek, Israel) que contiene suero de ternero fetal al 10%. Las células luego se colocaron en l-2xl05 célula/cavidad en placas de cultivo de 96 cavidades y se incubaron a 37 °C. Después de 90 minutos, las células no adherentes se lavaron tres veces usando PBS , y los macrófagos inherentes se incubaron durante 90 min. a 31°C, en el medio de cultivo que contiene cantidades especificas de rhGCD, que varió de 0 a 40 microgramos en volumen final de 200 microlitros, en la ausencia y la presencia de la levadura mannan (2-10,5 mg/ml) . Después de la incubación, el medio que contiene rGCD en exceso se removió, y las células se lavaron tres veces son PBS y luego se Usaron con solución reguladora de lisis (Tris 10 mM pH = 7.3, MgCl2 1 mM, NP-40 al 0.5% e inhibidores de proteasa) . La actividad del rGCD captada por las células se determinó al sujetar los Usados de células al ensayo de glicosidasa in vitro como es descrito en lo anterior. EJEMPLO 1 CONSTRUCCION DEL PLASMIDO DE EXPRESION Este Ejemplo describe la construcción de un plásmido de expresión ejemplar, utilizado con respecto a los Ejemplos enseguida, en más detalle. El cDNA codifica para el hGCD (número de clon de ATTC 65696) se amplificó usando el cebador delantero: 5 ' CAGAATTCGCCCGCCCCTGCA 3' (también denotado por la SEQ ID NO: 1) y el cebador trasero: 5 ' CTCAGATCTTGGCGATGCCACA 3' (también denotado por la SEQ ID NO: 2) . El producto de DNA de PCR purificado se digirió con las endonucleasas EcoRI y BglII (ver las secuencias de reconocimiento subrayadas en los cebadores) y se ligó en un vector intermediario que tiene un cásete de expresión CE-T digerido con las mismas enzimas. CE-T ER incluye la señal de dirección al ER MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEA (también denotado por la SEQ ID NO: 3) del gen de endoquitinasa básico [Arabidopsis thaliana] , y las señal de dirección vacuolar de la quitinasa A de tabaco A: DLLVDTM* (también denotado por la SEQ ID NO: 4) - El cásete de expresión se cortó y se eluyó del vector intermediario y se ligó en el vector binario pGREENII usando las enzimas de restricción SitiaI y Xbal, formando el vector de expresión final. La resistencia a la canamicina es conferida por el gen NPTII inducido por el promotor nos junto con el vector pGREEN (Fig. IB) . El cásete de expresión resultante es presentado por la Fig. 1A. El plásmido resultante se secuenció para asegurar la fusión en la estructura correcta de las señales usando los siguientes cebadores de secuenciación: Cebador del promotor 5' 35S: 5 ' CTCAGAAGACCAGAGGGC 3' (también denotado por la SEO ID NO: 5) y el terminador 3' : 5'CAAAGCGGCCATCGTGC 3' (también denotado por la SEO ID NO: 6) . La secuencia de codificación de hGCD clonada verificada es denotada por la SEQ ID NO: 7. EJEMPLO 2 TRANSFORMACION DE CELULAS DE ZANAHORIA Y CLASIFICACION DE CELULAS TRANSFORMADAS QUE EXPRESAN LA rhGCD Este Ejemplo describe un método ejemplar para transformar células de zanahoria de acuerdo con la presente invención, como se utiliza en los Ejemplos enseguida. La transformación de células de zanahoria se realizó mediante la transformación de Agrobacterium como es descrito previamente por [ urtele y Bulka (1989) ibid.] . Las células de zanahoria genéticamente modificadas se colocaron sobre el medio de agar de Murashige y Skoog (MS) con antibióticos para la selección de transformantes. Como es mostrado por la Fig. 2, los extractos preparados de los callos surgientes se probaron para la expresión de GCD mediante el análisis de manchado de Western usando el anticuerpo anti-hGCD y se compararon con el estándar de Cerezyme (control positivo) y los extractos de células no transformadas (control negativo) . De los diversos callos probados, un callo (número 22) se seleccionó para el crecimiento a gran escala y la purificación de proteina. El manchado de Western se realizó como sigue. Para este ensayo, proteínas de la muestra obtenida se separaron en la electroforesis de gel de SDS poliacrilamida y se transfirieron a nitrocelulosa . Para este propósito, los geles de SDS poliacrilamida se prepararon como sigue. Los geles de SDS consisten de un gel apilado y un gel de resolución (de acuerdo con Laemmli, UK 1970, Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriphage T4, Nature 227,680-685) . La composición de los geles de resolución fueron como sigue: acrilamida al 12% (Bio-Rad) , 4 microlitros de TEMED (?,?,?' ,?' -tetrametiletilendiamina; número de catálogo Sigma T9281) por 10 mi de solución de gel, SDS al 0.1%, Tris-HCl 375 mM, pH 8.8 y persulfato de amonio (APS), 0.1%. TEMED y persulfato de amonio se utilizaron en este contexto como iniciadores de radicales libres para la polimerización. Aproximadamente 20 minutos después de la iniciación de la polimerización, el gel apilado (acrilamida al 3%, DSD al 0.1%, Tris-HCl 126 mM, pH 6.8, APS al 0.1% y 5 microlitros de TEMED por 5 mi de solución en gel apilados) se vaciaron arriba del gel de resolución y un peine de 12 o 18 espacios se insertó para crear las cavidades para las muestras. Las cámaras del ánodo y cátodo se rellenaron con solución reguladora idéntica: La solución reguladora de Tris-glicina que contiene SDS (Biorad, número de catálogo 161-0772), pH 8.3. El material que contiene antigeno se trató con 0.5 volúmenes de solución reguladora de carga de muestra (30 mi de glicerol (número de catálogo Sigma G9012) , SDS al 9%, 15 mi de mercaptoetanol (número de catálogo Sigma M6250) , Tris-HCl 187.5 mM, pH 6.8, 500 microlitros de azul de bromofenilo, todos los volúmenes por 100 mi de solución reguladora de muestra) y la mezcla luego se calentó a 100 °C durante 5 minutos y se cargó sobre el apilado.

La electroforesis se realizó a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo adecuado, por ejemplo 45-60 minutos usando una resistencia de corriente constante de 50-70 voltios seguido por 45-60 min. a 180-200 Voltios para geles de 13 por 9 cm en tamaño. Los antigenos luego se transfirieron a nitrocelulosa (Schleicher y Schuell, Dassel) . La transferencia de proteina se realizó sustancialmente como es descrito en la presente. El gel se localizó, junto con la nitrocelulosa adyacente, entre el papel de filtro hatmann 3 MM, conductor, material espumado grueso de 0.5 cm y los eléctrodos de alambre que conducen la corriente por medio de eléctrodos de platino. El papel de filtro, el material espumado y la nitrocelulosa se empaparon completamente con la solución reguladora de transferencia (solución reguladora de Tg de Biorad, número de catálogo 161-0771, diluido 10 veces con metanol y solución reguladora de agua (metanol al 20%) ) . La transferencia se realizó en 100 voltios durante 90 minutos a 4°C. Después de la transferencia, los sitios de enlaces libre sobre la nitrocelulosa se saturaron, a 4°C durante la noche con solución reguladora de bloqueo que contiene leche seca al 1% (Dairy America) y Tween 20 al 0.1% (Sigma Cat P1379) diluido con solución reguladora de fosfato (Riedel deHaen, número de catálogo 30435) . Las tiras de manchado se incubaron con un anticuerpo (dilución, 1:6500 en solución reguladora de fosfato que contiene leche seca al 1% y Tween 20 al 1.0% como en lo anterior, pH 7.5) a 37 °C durante 1 hora . Después de la incubación con el anticuerpo, la mancha se lavó tres veces en cada caso 10 minutos con PBS (solución reguladora de fosfato de sodio regulada con fosfato (Riedel deHaen, número de catálogo 30435) ) . Las tiras machadas luego se incubaron, a temperatura ambiente durante 1 h., con un anticuerpo secundario adecuado (anti-conejo de Cabra (molécula completa) HRP (Sigma cat # A-4914)), dilución 1:3000 en solución reguladora que contiene leche seca al 1% (Dairy America) y Tween 20 al 0.1% (Sigma Cat P1379) diluido con solución reguladora de fosfato (Riedel deHaen, número de catálogo 30435)). Después de haber lavado varias veces son PBS, las tiras manchadas se mancharon con los reactivos reveladores ECL (Amersham RPN 2209) . Después de sumergir las manchas en el reactivo ECL las manchas se expusieron a la película de rayos X FüJI Super RX 18x24, y se revelaron con el revelador FUJI-ANATOMIX y el fijador (FUJI-X fix cat# FIXRTU 1 de cada 2) . Las bandas que presentan proteínas que se enlazaron con el anticuerpo llegaron a ser visibles después del este tratamiento. Escala aumentada del crecimiento de cultivo en biorreactor s Los cultivos de suspensión de 22 callos se obtuvieron al sub-cultivar del callo transformado en un medio liquido. Las células se cultivaron en matraces Erlenmeyer de agitación, hasta que el volumen total fue suficiente para inocular el biorreactor (como es descrito en los procedimientos Experimentales) . Las células de zanahoria transgénicas genéticamente modificadas pueden ser cultivadas durante meses, y la cosecha de células se puede obtener en el ciclado de 5 a 7 dias (datos no mostrados) . En el séptimo día de cultivo, cuando la cantidad de producción de rh-GCD en célula de zanahoria está en el máximo, las células se cosecharon al pasar el cultivo a través de redes de malla 100. Se debe observar que las células pueden ser cosechadas por medios conocidos en la técnica tal como filtración o centrifugación. La torta de células empacada, que proporciona el material para la purificación de la h-GCD a la homogeneidad, puede ser almacenada a temperatura congelada. EJEMPLO 3 PURIFICACION DE LA PROTEINA HGCD ACTIVA RECOMBINANTE DE CELULAS DE ZANAHORIA TRANSFORMADAS h-GCD recombinante expresad en células de zanahoria transformadas se encontró que es enlazada a las membranas internas de la célula y no secretada al medio. Mecánicamente, el rompimiento celular deja la rGCD enlazada a los restos de membrana insoluble (datos no mostrados) . La rGCD se disolvió usando detergentes moderados y se separó de los restos celulares y otros componentes insolubles. La enzima soluble se purificó adicionalmente usando técnicas de cromatografía, incluyendo las columnas de cromatografía de intercambio catiónico de interacción hidrofóbica como es descrito en los procedimientos Experimentales. Con el fin de separar el medio de la GCD insoluble, la torta de célula congelada gue contiene aproximadamente 100 g de células en peso húmedo se congeló, seguido por la centrifugación a 17000 xg durante 20 min. a 4°C. Los materiales insolubles y las células intactas se lavaron mediante la re-suspensión en 100 mi de solución reguladora de lavado (fosfato de sodio 20 mM pH 7.2, EDTA 20 mM) y se precipitaron mediante la centrifugación a 17000 g durante 20 min. a 4°C. La rGCD se extrajo y se solubilizó mediante la homogenización de la pelotilla en 200 mi de solución reguladora de extracción (fosfato de sodio 20 mM pH 7.2, EDTA 20 mM, PMSF 1 mM, ácido ascórbico 20 mM, 3.8 g de polivinilpolipirrolidona (PVPP) , DTT 1 mM, Triton-x-100 al 1% (Sigma ) ) . El homogenado se tritura durante 30 min. a temperatura ambiente y se clarificó mediante la centrifugación a 17000 g durante 20 min. a 4°C. La pelotilla se descargó y el pH del sobrenadante se ajustó a pH 5.5 mediante la adición de ácido cítrico concentrado. La turbiedad generada después del ajuste del pH se clarificó mediante centrifugación bajo las mismas condiciones descritas anteriormente . La purificación adicional se realizó mediante columnas de cromatografía como sigue: en una primera etapa, 200 mi de extracto clarificado se cargaron en 20 mi de resina de intercambio catiónico fuerte (Macro-Prep high-S support, Bio-Rad) equilibrada en solución reguladora de citrato de sodio 25 mM pH 5.5, empacado en una columna X (2.6x20 cm) . La columna se integró con un sistema de preparación AKTA (Amersham Pharmacia Biotech) que permitió monitorear la conductividad, pH y absorbencia a 280 nir.. La muestra se cargó en 20 ml/min. , después la columna se lavó con solución reguladora de equilibrio (solución reguladora de citrato de sodio 25 mM pH 5.5) a un gasto de flujo de 12 ml/min. hasta que la absorbencia UV alcanzó la línea de base. La pre-elución de la rh-GCD se realizó con la solución reguladora de equilibrio que contiene NaCl 200 mM y la elución se obtuvo son la solución reguladora de equilibrio que contiene NaCl 600 mM. Las fracciones recolectadas durante la corrida se monitorearon mediante el ensayo de actividad enzimática y los tubos que exhiben actividad enzimática (en el máximo de elución) se acumularon. Las muestras acumuladas se diluyeron (1:5) en agua que contiene etanol al 5% y el pH se ajustó a 6.0 con NaOH. La Fig. 3A representa una corrida estándar de esta etapa de purificación. Las fracciones recolectadas durante la corrida se monitorearon mediante el ensayo de actividad enzimática como es mostrado por la Fig. 3B, y la Fig. 3C muestra la mancha de azul de coomassie de las fracciones de elución analizadas para la actividad. Las fracciones de elución que contiene el rGCD se aplicaron sobre una segunda columna XK (1.6x20 cm) empacada con 10 mi de la misma resina como en la columna previa, para una segunda etapa de purificación. La resina en esta columna se equilibró con solución reguladora de citrato 20 mM pH 6.0 que contiene etanol al 5%. Después de la carga de la muestra la columna se lavó con la solución reguladora de equilibrio y el rGCD se eluyó de la columna mediante la solución reguladora de elución (solución reguladora de citrato 20 mM pH 6.0, etanol al 5% y NaCl 1 M) . La Fig. 3D representa una corrida estándar de esta etapa de purificación. Las fracciones recolectadas durante la corrida se monitorearon mediante el ensayo de actividad enzimática, como es mostrado por la Fig. 3E, y la Fig. 3F muestra una mancha de azul de coomassie de las fracciones de elución analizadas para la actividad. Las fracciones del máximo absorbente en la etapa de elución se acumularon y se aplicaron sobre una tercera columna, para una tercera etapa purificación. La tercera etapa de purificación se realizó sobre una columna XK (1.6x20 cm) empacada con 8 mi de resina de interacción hidrofóbica (TSK gel, Toyopearl Phenyl- 650C, Tosoh Corp.). La resina se equilibró en solución reguladora de citrato 10 mM pH 6.0 que contiene etanol al 5%. La acumulación de la elución de GCD de la columna previa se cargó en 6 ml/min. seguido por el lavado con solución reguladora de equilibrio hasta que la absorbancia de UV alcanzó la línea de base. La GCD pura se eluyó mediante la solución reguladora cítrica 10 mm que contiene etanol al 50%, se acumuló y se almacenó a -20 °C. La Fig. 4A representa una corrida estándar de esta etapa de purificación. Las fracciones recolectadas durante la corrida se monitorearon mediante el ensayo de actividad de enzima (Fig. 4B) , y la Fig. 4C muestra la mancha de azul de coomassie de las fracciones de elución analizadas para la actividad. En una purificación por lotes de células que se procesaron, la proteína rGCD se purificó a un nivel más grande que 95%; si solamente se realizaron la primera y la tercera etapa la pureza se logra a un nivel de aproximadamente 80% (resultados no mostrados) . Análisis bioquímico Para validar la identidad del rhGCD purificada, se realizó el análisis Mass-Spec Mass-Spec (MSMS) . Los resultados obtenidos mostraron 49% de cobertura de la secuencia de proteína que igualó la secuencia de aminoácidos predícha, basada en el DNA del c sete de expresión, incluyendo el péptido guia y las secuencias de dirección. Captación y &ct±vidad del hGCD recombinante en ma.czó£&gos pexltoneales Para determinar si la rhGCD producida en zanahorias se ha glicosilado correctamente y puede someterse a la captación por células objetivo, y asi ser útil para el tratamiento de la enfermedad de Gaucher, la habilidad del rhGCD para enlazar y ser tomada por los macrofagos se analizó enseguida. La dirección del rhGCD a los macrofagos es mediada por el receptor de Manosa/N-acetllglucosaminA (Man/GlcNAc) y se puede determinar usando macrofagos perifonéales inducidos con tioglicolato . Como es mostrado por la Fig. 5, rGCD se somete a la captación por las células en un alto nivel. La Figura 5A muestra la captación de las células de rGCD de acuerdo con la presente invención con respecto a la concentración de mannan. La Figura 5? muestra la captación de niveles comparables con Cerezyme™ (esta preparación se realizó a 80% de pureza con solamente la primera y la tercera etapa del proceso de purificación descrito en lo anterior) . Las Figuras 5B y 5C muestran que la captación de rGCD está a un nivel más alto que el Cerezyme™, ya que esta preparación se realizó a mayor que 95% de pureza con todas las tres etapas del proceso de purificación descrito en lo anterior.

Con respecto a la Figura 5C, claramente el por ciento de actividad especifica de la actividad total, inhibida por 4 mg/ml de mannan, es más alto para el GCD de la presente invención (rGCD o GCD humano recombinante) que para el producto actualmente disponible del mercado como sigue: GCD (CB-mixl, que es el rGCD de la presente invención) -75% Cerezyme -65%. Además, como es mostrado por las figuras, la adición de mannan claramente inhibió el enlace de rGCD por las células. En la concentración de 2 mg/ml de mannan, el enlace de rGCD fue inhibido por 50%. Estos resultados muestran que aún sin el remodelamiento de las estructuras de glicano, la rhGCD expresada y purificada de células de zanahoria transformadas puede someterse a la captación a las células de macrófago objetivo específicamente a través de los receptores Man/GlcNAc. Además, este rhGCD recombinante es enzimáticamente activa. La Figura 5D muestra que la rhGCD también es reconocida por un anticuerpo anti-GCD en un manchado de Western; rGCD se refiere a la proteína de acuerdo con la presente invención, mientras que GCD estándar (mostrada en 5, 10 y 25 ng por franja) es GCD comercialmente adquirida (Cerezyme®) . EJEMPLO 4 PRUEBA DE TOXICOLOGIA El material obtenido de acuerdo con el procedimiento de purificación anterior se probó de acuerdo con los protocolos de prueba de toxicologia estándares (Guidance for Industry on Single Dose .Acute Toxicity Testing for Pharmaceuticals, Center for Drug Evaluation and Research (CDER) PT 1 (61 FR 43934, 26 de Agosto de 1996) and by ICH 3 (M) Non-clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Triáis for Pharmaceuticals CPMP/ICH/286/95 modification, 16 de Noviembre de 2000) . Los ratones inyectaron como sigue. Una dosis inicial de 1.8 mg/kg (dosis clínica) fue seguida por dosis de 9 y 18 mg/kg. Los grupos de prueba incluyeron seis ratones (ICR CD-1; 3 machos y 3 hembras) para recibir la rGCD (en un portador líquido que contiene la solución reguladora de citrato 25 mM, NaCl 150 mM, Tween 80 al 0.01%, etanol al 5%) de acuerdo con la presente invención, y otros seis ratones se trataron con el portador solamente como un grupo de control, los ratones luego se observaron por 14 días y se les aplicó la eutanasia. Ninguno de los ratones murieron antes de la eutanasia programada. Ninguno de los ratones mostraron cualquiera de los efectos significantes del tratamiento. No se encontraron descubrimientos patológicos notables y/o cambios en el peso del cuerpo en cualquiera de los ratones. EJEMPLO 5 2¾2I¾LISIS DE GLICOSIIACION Se realizó el análisis de las estructuras de glicano presentes sobre la rGCD producida como es descrito con respecto a los Ejemplos previos. Como es descrito en mayor detalle enseguida, los resultados indican que la mayoría de glicanos contienen residuos de ma osa terminales así como estructuras de alto contenido de mañosa. Ventajosamente, este producto de alto contenido de mañosa se encontró que es biológicamente activo, y por lo tanto no fueron necesarias etapas adicionales para su activación. Los siguientes métodos se usaron para determinar la estructura de glicosilación de la hGCD recombinante producida de acuerdo con los Ejemplos dados anteriormente. Brevemente, los enlaces de monosacárido para tanto N- y O-glicanos se determinaron al usar una hidrólisis y estrategia de GC-MS. Este método estima el tipo de enlace de los carbohidratos al péptido y la composición de monosacárido general de una glicoproteína . Basado en el conocimiento previo y también las relaciones entre varios monosacáridos, este método puede sugerir los tipos de glicanos sobre la glicoproteína . Esta información es importante para estimar las posibles estructuras de glicano presentes sobre la proteína. Otro método caracterizó el análisis . de oligosacárido de la población de N-glicano. Se realizaron la FAB-MS y MALDI-TOF MS, después de la digestión de las alícuotas de las muestras con tripsina y N glicosidasa F de péptido (PNGaseF) y la permetilación de los glicanos. Este método se utiliza para desunir y aislar los carbohidratos N-enlazados de la glicoproteina enzimáticamente digerida. Las masas de las poblaciones de glicano en la mezcla de glicano aisladas son determinadas y sus masas son comparadas con aquellas de las estructuras conocidas a partir de las bases de datos y en vista del análisis de composición de monosacárido . Las estructuras propuestas se basan también en los patrones de glicosilación del organismo de fuente. Otro método incluyó analizar la población de 0-glicano después de la eliminación reductora de los glicopéptidos trípticos y tratados con PNGasa F la desalificación y permetilación. Los 0-glicanos no son liberados por PNGasa F, por lo tanto, los glicanos gue permanecen enlazados a los péptidos son más probablemente glicanos 0-enlazados . Estos glicanos son liberados mediante la eliminación reductora y su masa analizada. El análisis de composición de monosacáridos (resumido enseguida) reveló una distribución característica de hexosas, hexosaminas y pentosas características de la glicosilación de la planta. Las relaciones entre GlcNac y Mañosa, sugieren que las estructuras N-enlazadas característica son la población de glicanos predominante. El análisis Espectrométrico de Masas de los N-glicanos de la hGCD producida como as descrito anterior indica que la población de N-glicano predominante tiene la composición de monosacárido Pent . deoxiHex. Hex3. HexNAc2. Materiales y Métodos El análisis se realizó usando una combinación de cromatografía de gases - espectrometría de masas (GO-MS) , Bombardeo Atómico Rápido-Espectrometría de Masas (FAB-MS) y la Extracción Retardada-Ionización de Desorción de Láser Asistida con Matriz-Tiempo de Vuelo Espectrometría de Masas - (DE-MALDI-TOF MS) . Para el análisis de oligosacárido, la población de N-glicano se analizó mediante FAB-MS y MALDI-TOF MS después de la digestión de las alícuotas de las muestras con tripsina y N-glicosidasa F de péptido (PNGasaF) y la permetilación de los glicanos. La población de O-glicano se analizó después de la eliminación reductora de los glicopéptidos trípticos y tratados con PNGasa F, desalificación y permetilación. Los enlaces de monosacárido para tanto N- y 0-glicanos se determinaron usando una hidrólisis, estrategia de GC-MS de derivación. DESCRIPCION EXPERIMENTAL Muestra Los frasquitos de muestra recibidos se les dieron los números de muestra únicos como sigue (Tabla 1) : Tabla 1 Producto Húmero de referencia Glucocerebrosidasa. Cuatro 62995 tubos que contienen 1 mi de 62996 muestra cada uno en una 62997 concentración establecida de 62998 0.8 mg/ml en Solución Reguladora de citrato 25 mM pH 6.0 Tween 80 al 0.01% Las muestras se almacenaron entre -10 y -30 °C hasta que se requirieron. Química de la proteína Diálisis de muestras intactas Un frasquito que (contiene 1 mi de proteina como una concentración establecida de 0.8 mg/ml) se inyectó en un cásete de diálisis Slide-A-Lyzer (corte de peso molecular 10 kDa) y se dializó a 4°C durante un periodo de 24 horas contra agua, el agua que es cambiada 3 veces. Después de la diálisis, la muestra se removió del cásete y se liofilizó. Digestión de tripsina de las muestras intactas para la precipitación de oligosacárido La muestra liofilizada, dializada se resuspendió en solución reguladora de bicarbonato de amonio 50 mM ajustada a pH 8.4 con amoniaco acuoso al 10% y se digirió con tripsina tratada con TPCK durante 4 horas a 37 °C de acuerdo con SOPs B001 y B003. La reacción se terminó al colocar en un bloque de calentamiento a 95°C durante 2 minutos seguido por la liofilización. Química del carbohidrato Digestión del péptido N-glicosidasa A Las mezclas de péptido/glicopéptido tripticamente segmentadas de la muestra de glicoproteinas se trataron con la enzima péptido N-glicosidasa A (PNGasaA) en solución reguladora de acetato de amonio, pH 5.5 a 37 °C durante 15 horas. La reacción se detuvo mediante la deshidratación por congelación. Los productos resultantes se purificaron usando un cartucho Cíe Sep-Pak. Eliminación reductora La fracción Sep-Pak que contiene los glicopéptidos enlazados potenciales se disolvió en una solución de 10 mg/ml de borohidruro de sodio en hidróxido de sodio 0.05 M y se incubó a 45 °C durante 16 horas. La reacción se determinó mediante la adición de ácido acético glacial. Desalificación del material reductoramente eliminado La desalificación usando cuentas Dowex se realizó de acuerdo con SOP B022. La muestra se cargó sobre la columna y se eluyó usando 4 mi de ácido acético acuoso al 5%. La fracción colectada se liofilizó. Permetilación de carbohidratos liberados Los carbohidratos N-enlazados que eluyen en la fracción Sep-Pak de ácido acético acuoso al 5% y los glicanos O-enlazados potenciales liberados por la eliminación reductora, se permetilaron usando el procedimiento de hidróxido de sodio (NaOH) yoduro de metilo (Mel) (SOP B018) . Una porción de la mezcla de glicano N-enlazado permetilada se analizó mediante FAB-MS y MALDI-TOF MS y el resto se sometió al análisis de enlace. Análisis de Enlace del carbohidrato N-enlazado Derivación Las muestras de glicano permetiladas obtenidas después de la digestión triptica y con PNGasa A o la eliminación reductora se hidrolizaron (TFA 2 M, 2 horas a 120°C) y se redujeron (borodeuteriuro de sodio (NaBD ) en NH4OH 2 M, 2 horas a temperatura ambiente, SOP B025) . El borato producido en la descomposición del borodeuteriuro se removió mediante 3 adiciones de una mezcla de metanol en ácido acético glacial (90:10) seguido por la liofilización. Las muestras luego se acetilaron usando anhídrido acético (1 hora a 100 °C). Las muestra acetiladas se purificaron mediante la extracción con cloroformo. Los acetatos de alditol parcialmente metilados luego se examinaron mediante la cromatografía de gases/espectrometría de masas (GC/MS) . Mezclas estándares de acetato de alditol parcialmente metilados y un blanco también se corrieron bajo las mismas condiciones. Cromatografía de Gas Liquido/Espectrometría de Masas (GC/MS) Una alícuota (1 µ?) de las muestras de carbohidrato derivas disueltas en hexano, se analizaron mediante GC/MS usando un espectrómetro de masas Perkin Elmer Turbomass Gold con una cromatografía de gases Autosystem XL y un sistema de datos Dell bajo las siguientes condiciones: Cromatografía de Gas Columna: DB5 Inyección: Sobre la columna Temperatura del Inyector: 40 °C Programa: 1 minuto a 40 °C luego 70°C/minuto a 100 °C, mantener a 100 CC durante 1 minuto, luego 8°C/minuto a 290°C, finalmente mantenido a 290 °C durante 5 minutos. Gas portador: Helio Espectrometría de Masas Voltaje de Ionización: 70eV Modo de Adquisición: Exploración Intervalo de Masa: 35-450 Daltons Resolución de MS : Unidad Análisis de azúcar de la glucocerebrosidasa intacta Derivación Una alícuota equivalente a 500 µg de glucocerebrosidasa se liofilizó con 10 µg de Arabitol como estándar interno. Este luego se metanolizó durante la noche a 80 °C y se secó bajo nitrógeno. Los monosacáridos liberados se re-N-acetilaron usando una solución de metanol, piridina y anhídrido acético, se secaron bajo nitrógeno nuevamente y se convirtieron a sus derivados de trimetilsililo (TMS) de acuerdo con SOP B023. Los derivados de TMS se redujeron en volumen bajo nitrógeno, se disolvieron en 2 mi de hexano y se sonicaron durante 3 minutos. Las muestras luego se dejaron equilibrar a 4°C durante la noche. Un blanco que contiene 10 µ? de Arabitol y una mezcla de monosacárido estándar que contiene 10 µg cada una de Fucosa, Xilosa, Mañosa, Galactosa, Glucosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, ácido N-acetilneuraminico y Arabitol se prepararon en paralelo. Los derivados de TMS luego se examinaron mediante la cromatografía de gases/espectrometria de masas (GC/MS) . Cromatografia de Gas Líquido/Espectrometría de Masa (GC/MS) Una alícuota (1 µ?) de la muestra de carbohidrato derivada disuelta en hexano, se analizó mediante GC/MS usando un espectrómetro de masas Perkin Elmer Turbomass Gold con una cromatografía de gases Autosystem XL y un sistema de datos Dell bajo las siguientes condiciones: Cromatografía de Gases Columna: DB5 Inyección: Sobre la columna Temperatura del Inyector: 40 °C Programa: 1 minuto a 90°C luego 25°C/minuto a 140°C, 5°C/minuto a 220°C, finalmente 10°C/minuto a 300°C y mantenida a 300 °C durante 5 minutos. Gas Portador: Helio Espectrometría de Masas Voltaje de Ionización: 70eV Modo de Adquisición: Exploración Intervalo de Masa: 50-620 Daltons Resolución de MS : Unidad Extracción Retardada Ionización de Desorción de Láser Asistida con Matriz Espectrometría de Masas (DE-MALDI-MS) y Bombardeo Atómico Rápido-Espectrometría de Masas (F&B-MS) La espectrometría de masas MALDI-TOF se realizó usando un Espectrómetro de Masas de Desorción de Láser de Estación de investigación de Bioespectrometría Voyager STR acoplado con la Extracción Retardada (DE) . Los glxcanos permetilados secos se redisolvieron en metanol : agua · (80:20) y se analizaron usando una matriz de ácido 2 , 5-dihidroxibenzoico . Bradiquinina, Angiotensina y ACTH se usaron como calibrantes externos. Los análisis espectrométricos de masas de Bombardeo Atómico Rápido de Ión Positivo se llevaron a cabo sobre el espectrómetro de masas M-Scan' s VG AutoSpecE que opera en Vacc = 8kV para un intervalo de masa de 4500 en sensibilidad completa con una resolución de aproximadamente 2500. Una Pistola Iónica de Cesio se uso para generar espectros que operan en 30 kV. Los espectros se registraron en un sistema de datos VAX 3100 M76 usando el software Opus. Los glicanos permetilados secos se disolvieron en metanol y se cargaron sobre un objetivo previamente embarrado con 2-4 µ? de tioglicerol como matriz antes de la inserción en la fuente. KE5SULTADOS Y DISCUSION Análisis de azúcar TMS de la Glucocerebrosidasa Clasificación del oligosacárido N-enlazado La glicoproteina intacta se sometió a diálisis seguido por la digestión con tripsina y los productos liofilizados se digirieron usando PNGasa A y luego se purificaron usando un Ci8 Sep-Pak. La fracción de ácido acético acuoso al 5% (que contiene oligosacárido N-enlazado) se permetiló y los espectros de masa FAB se obtuvieron usando una porción del oligosacárido derivado en un intervalo de masa bajo para los iones de fragmentos y los espectros de masas de DE-MALDI-TOF se obtuvieron usando una porción de los oligosacáridos derivados en un intervalo de masa alto para iones moleculares. Análisis de N-glicanos a partir de la glucocerebrosidasa La Tabla 1 lista los iones de fragmentos predominantes presentes en los espectros FAB y los iones moleculares presentes en los espectros de MALDI . La región iónica molecular (mostrada en el Appendix III) contiene una señal predominante en m/z 1505.8 (consistente con un ión cuasimolcular [M+Na]+ para una estructura que tiene la composición Pent . deoxiHex. He 3. Hex Ac2) . Un intervalo de iones cuasimoleculares menos intensos también se detectó consistente con las estructuras complejas y de alto contenido de ma osa. Las estructuras de alto contenido de mañosa se detectaron en el intervalo en tamaño de Hex5.HexNAc2 a m/z 1579.8 a Hex8.HexNAc2 a m/z 2193.0. Las señales complejas se produjeron de N-glicanos procesados menos extensivamente m/z 1331.7 (consistente con un ión cuasimolecular [M+Na]+ para una estructura que tiene la composición Pent . Hex3. HexNAo2) o de N-glicanos más grandes por ejemplo m/z 1751.0 (consistente con un ión cuasimolecular [M+Na]+ para una estructura que tiene la composición Pent . deoxiHex . Hex3.HexNA.c3) , m/z 2375.4 (consistente con un ión cuasimolecular [M+Na] + para una estructura que tiene la composición Pent . deoxiHex2. Hex . HexN c4) y m/z 2753.6 (consistente con un ión cuasimolecular [M+Na] + para una estructura que tiene la composición Pent . deoxiHex3. Hex5. HexNAc4) . El espectro de masas FAB proporciona información que considera . las estructuras de antena mediante la forma virtual de iones de fragmento en la región de masa baja del espectro (datos no mostrados) . Las señales se detectaron identificando hexosa (en m/z 219) y HexNAc (en m/z 260) como monosacáridos terminales no reductores en los N-glicanos.

Tabla. 2 : Masas o servadas en los espectros permetilados de Glueoeerebrosidasa (número de referencia 62996) después de la digestión Triptica y con Péptido N- glicosidasa A Señales Asignación Posible observadas (m/z) Masa Baja 219 Hex+ 228 HexNAc+ (- metano1 ) 260 HexNAc+ Masa Alta 1032.4 Pent . Hex3. HexNAc+ 1171.5 Hex3. HexNAc2OMe + Na+ 1299.6 Eliminación de fucosa de m/z 1505.8 1331.6 Pent .Hex3.HexNAc2OMe + Na+ 1345.6 deoxiHex. Hex3. HcxNAc2OMe + Na+ 1505.7 Pent . deoxiHex. Hex3. HexNAc2OMe + Na+ 1579.8 Hex5. HexNAc20Me + Na+ 1709.9 Pent . deoxiHex. Hex4. HexNAc2OMe + Na+ 1750.9 Pent . deoxiHex . Hex3. HexNAc3OMe + Na+ 1783.9 Hex6.HexNAc2O e + Na+ 1989.0 Hex7.HexNAc2OMe + Na+ 1997.0 Pent . deoxiHex . Hex3. HexNAc4OMe + ' Na+ 2027.0 No asignado 2099.0 No asignado 2130.0 Pent. deoxiHex2.Hex4.HexNAC30Me + Na+ 2193.1 Hex8. HexNAc2OMe + Na+ 2375.2 Pent. deoxiHex2. Hex4. HexNAc4OMe + Na+ 2753.4 Pent . deoxiHex3. Hexs . HexNAc4OMe + Na+ Todas las masas en la columna uno son monoisotópicas a menos que establezca de otra manera. Los números de masa no pueden relacionarse directamente con los datos en bruto ya que el software frecuentemente asigna números de masa a los máximos de isótopo 13C particularmente para masas arriba de 1700 Da. Análisis del enlace de N-glicanos de la Glucocerebrosidasa El análisis de enlace se realizó en los carbohidratos N-enlazados liberados después de la digestión con PNGasa A, la purificación con Sep-Pak y la permetilación. Un cromatógrama complejo se obtuvo con algunos máximos de impureza que se originan de la derivación de los reactivos. La comparación del tiempo de retención en los espectros con mezclas estándares permitió asignaciones provisionales de los máximos que contienen azúcar listados en la Tabla 3. Tabla 3 : Tiempos de retención de monosacáridos variadamente enlazados detectados como sus acetatos de alditol parcialmente metilados en el análisis de GC-MS de Glucocerohrosidasas (número de referencia 62996) después de la digestión Triptica y con Péptido N-glicosidasa A Compuestos Tiempo de Retención de Observado (mins) Glucocerebrosidasa (62996) Xilosa 10.41 Terminal Fucosa 10.84 Terminal Mañosa 12.29 (mayor) Terminal Galactosa 12.55 Terminal Mañosa 2- 13.40 enlazada Glucosa 4- 13.58 enlazada Mañosa 2 , 6- 14.91 enlazada Mañosa 3 , 6- 15.08 enlazada Mañosa 15.87 2,3, 6- enlazada GlcNAc 4- 16.73 enlazada GICNAc 3,4- 17.59 enlazada 4.3 Clasificación de oligosaeárido O-enlazado La eliminación reductora se llevó a cabo en la fracción de 2-propanol al 60% (fracción de glicopéptido 0-enlazado) de la purificación Sep-Pak de Glucocerebrosidasa después de las digestiones con tripsina y PNGasa A. La muestra se desalificó después de la terminación de la reacción, y después de la remoción del borato, se permetiló . Los espectros de masa FAB se obtuvieron usando una porción del oligosaeárido derivado en un intervalo de masa baja para iones de fragmento y los espectros de masa de DE-MALDI-TOF se obtuvieron usando una porción de los oligosacáridos derivados en un intervalo de masa alta para iones moleculares. NO se observaron señales consistentes con la presencia de glicanos O-enlazados (datos no mostrados) .

Análisis de Enlace de los O-glicanos a partir de la glucocerebrosidasa El análisis de enlace se llevó a cabo en los productos de la eliminación reductora después de la permetilación. No se observaron señales consistentes con la presencia de glicanos O-enlazados típicos (datos no mostrados) . La Figura 6 muestra algunas estructuras de glicano ejemplares como una comparación entre GCD obtenido de células CHO (ovario de hámster Chino) , que son células mamíferas (Cerezyme™) y la GCD de la presente invención, a partir de células de zanahoria. Como es mostrado, la remodelación de estas estructuras es requerida para obtener residuos de mañosa expuestos para Cerezyme™. En contraste, tales residuos de mañosa expuestos se obtienen directamente para la GCD obtenida de células de planta de acuerdo con la presente invención, sin requerir manipulación adicional, por ejemplo con glicosilasas . La Figura 7 representa la estructura de glicano principal encontrada en rGCD. La Figura 7 muestra la estructura propuesta de: a) la población de oligosacárido predominante encontrada en hGC expresada en la suspensión de células de zanahoria (1505.7 m/z) ; b) núcleo N-enlazado típico; c) núcleo N-enlazado de planta Fucosilada. Los glicanos N-enlazados se acoplan a la proteína por vía de Aspargina y a través del extremo de reducción del residuo GlcNac (GN) en la parte derecha de los diagramas. N patrones de glicosilación de plantas, residuos de Fucosa pueden ser parte de la estructura del núcleo, enlazadas al primer GlcNac usando un enlace alfa (1-3) glicosidico, mientras que las estructuras mamiferas típicamente usan el enlace alfa (1-6) glicosidico . Las Figuras 8A-8D muestran todas las estructuras posibles para los N-glicanos sobre la proteina rGCD de acuerdo con la presente invención. La estructura de glicano dominante que se identificó es la estructura de glicano del núcleo encontrada en la mayoría de las glicoproteinas de plantas de guisantes, arroz, maíz y otras plantas comestibles. Esta estructura contiene un residuo de xilosa de núcleo así como una alfa- (1,3) -fucosa de núcleo. El trabajo hecho por Bardor y colaboradores, (33) muestra que 50% de los donadores no alérgicos tienen anticuerpos específicos para la xilosa de núcleo en sus sueros y 25% tienen anticuerpos específicos para la alfa- (1, 3) -fucosa de núcleo. Sin embargo, todavía . tiene que ser estudiado si tales anticuerpos podrían introducir limitaciones al uso de glicoproteinas biofarmacéuticas derivadas de plantas. Las poblaciones de glicano menores del hGCD producida como es descrito en lo anterior fueron estructuras principalmente de alto contenido de mañosa Hex4HexNAc2 a Hex8HexNAc2. Entre las estructuras complejas se exhiben estructuras tales como Pent . decxiHex2. Hex4. HexNAc3 y Pent . deoxiHex3. Hex5. HexNAc3. Pent . Hex3. HexNAc2 se detectó en proporciones más pequeñas. Los monosacáridos terminales mayores son hexosa (Mañosa o Galactosa) y N-acetilhexosamina, que es consistente con la presencia de estructuras de alto contenido de mañosa y estructuras complejas parcialmente procesadas. Con respecto a la clasificación de oligosacárido O-enlazado, no se observaron señales que sean consistentes con los glicanos O-enlazados típicos. La GCD es conocida en la técnica que no tiene oligosacáridos O-enlazados, tal que estos resultados son consistentes con la glicosilación conocida de la GCD a partir de otros sistemas de células, incluyendo la GCD nativa y la GCD recombinante producida en sistemas de cultivo de mamífero. Sin embargo, en la composición de monosacárido, se detectaron señales consistentes con Arabinosa. Un punto importante con respecto a la presente invención es que el análisis de la composición de N-glicano de la proteína hGCD mostró que la mayoría de los N-glicanos terminan con residuos de mañosa. Estos están de acuerdo con el requerimiento para los N-glicanos que terminan en mañosa que llevan a la captación del hGCD terapéutica mediante el receptor de mañosa del macrófago. Sin embargo, nada de GCD nativa y GCD recombinante producida en células mainíferas es de alto contenido de mañosa. Por lo tanto, la presente invención supera una desventaja significante de las proteínas hGCD comercialmente producidas, que es que estas proteínas son modificadas para terminar con azúcares de ma osa distinto a la proteína producida como es descrito en lo anterior. EJEMPLO 6 TRATAMIENTO CON LA PRESENTE INVENCION La proteína recombinante producida de acuerdo con la presente invención de preferencia comprende una proteína adecuadamente glicosilada producida por un cultivo de células de plantas, que es de preferencia una enzima lisosomal por ejemplo, y/o una proteína glicosilada de alto contenido de mañosa . De acuerdo con modalidades preferidas en la presente, la proteína producida de acuerdo con la presente invención es adecuada para el tratamiento de una enfermedad asociadas con lisosomas, tal como una enfermedad de almacenamiento lisosomal por ejemplo. El método de tratamiento opcionalmente y de preferencia comprende: (a) proporcionar una forma biológicamente activa recombinante de la enzima lisosomal purificada de células de raíces de plantas transformadas y capaces de dirigir eficientemente a las células anormalmente deficientes en la enzima lisosomal. Esta enzima biológicamente activa recombinante tiene residuos de mañosa terminales expuestos sobre los oligosacáridos adjuntos; y (b) administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la enzima lisosomal biológicamente activa recombinante, o de la composición que comprende la misma al sujeto. En una modalidad preferida, la enzima lisosomal de alto contenido de mañosa recombinante usada por el método de la invención se puede producir por la célula hospedera de la invención. De preferencia, esta célula hospedera es una célula de zanahoria . Por "sujeto mamífero" o "paciente mamífero" se propone cualquier mamífero para el cual se desea la terapia génica, incluyendo humano, bovino, equino, canino y sujetos felinos, mucho más de preferencia, un sujeto humano. Se debe observar que el término "tratamiento" también incluye la aminoración o alivio de una condición patológica y/o uno o más síntomas de la misma, la curación de tal condición o la prevención de la génesis de tal condición. En otra modalidad preferida, la enzima lisosomal usada por el método de la invención puede ser una enzima de alto contenido de mañosa que comprende por lo menos una cadena de oligosacárido que tiene un residuo de mañosa expuesto. Esta enzima recombinante puede enlazar a un receptor de mañosa sobre una célula objetivo en un sitio objetivo dentro de un sujeto. Más de preferencia, esta enzima lisosomal recombinante tiene afinidad incrementada para esta células objetivo, en comparación con afinidad correspondiente de una enzima lisosomal que ocurre de manera natural a la célula objetivo. Por lo tanto, cada dosis es dependiente de la dirección efectiva de las células anormalmente deficientes en GCD y cada dosis de tal forma de GCD es sustancialmente menor que la dosis de la GCD que ocurre de manera natural que de otra manera seria administrada de una manera similar para lograr el efecto terapéutico. De acuerdo con modalidades preferidas de la presente invención, la proteina es adecuada para el tratamiento de enfermedades de almacenamiento lisosomal, tal que la presente invención también comprende un método para tratar tales enfermedades . Las enfermedades de almacenamiento lisosomal son un grupo de arriba de 40 desórdenes que son el resultado de defectos en genes que codifican enzimas que descomponen los productos desecho de glicolipido o polisacárido dentro de los lisosomas de las células. Los productos enzimáticos, por ejemplo, azucares y lipidos luego se reciclan en nuevos productos. Cada uno de estos desórdenes resulta de un atributo autosomal heredado o recesivo X-enlazado que afecta los niveles de enzimas en el lisosoma. Generalmente, no hay actividad biológica o funcional de las enzimas afectadas de las células y los tejidos de individuos afectados. En tales enfermedades la deficiencia y la función de la enzima crea una deposición sistémica progresiva de lipido o substrato de carbohidrato en lisosomas en las células del cuerpo, eventualmente causando la pérdida de la función del órgano y la muerte. La etiología genética, las manifestaciones clínicas, la biología molecular y la posibilidad de las enfermedades de almacenamiento lisosomal son detalladas en Scriver y colaboradores, [Scriver y colaboradores, eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7- Edición, Volumen II, McGra Hill, (1995) ] . Ejemplos de enfermedades de almacenamiento lisosomal (y sus enzimas deficientes asociadas) incluyen pero no . están limitadas a la enfermedad de Fabry (a-galactosidasa) , enfermedad de Farber (ceramidasa) , enfermedad de Gaucher (glucocerebrosidasa) , Gm) gangliosidosis (ß-galactosidasa) , enfermedad de Tay-Sachs (ß-hexosaminidasa) , enfermedad de Niemann-Pick (esfingomielinasa) , enfermedad de Schindler (a-?-acetilgalactosaminidasa) , síndrome de Hunter (iduronato-2-sulfatasa) , síndrome de Sly (ß-glucuronidasa) , síndromes de Hurler y Hurler/Scheie (iduronidasa) y síndrome de I-Cell/San Filipo (transportador de mañosa 6-fosfato) . La enfermedad de Gaucher es la enfermedad de almacenamiento lisosomal más común en humanos, con la más alta frecuencia encontrada en la población Judía Askenazi.

Aproximadamente 5,000 a 10,000 gentes en los Estados Unidos son afectadas con esta enfermedad [Grabowski, Adv. Hura. Genet. 21:377-441 (1993)]. La enfermedad de Gaucher resulta de una deficiencia en la glucocerebrosidasa (hGCD; glucosilceramidasa) . Esta deficiencia conduce a una acumulación del substrato de la enzima, glucoccrebrosida, en las células reticuloendoteliales de la médula ósea, bazo y hígado, dando por resultado complicaciones esqueléticas significantes tal como la expansión de la médula ósea y deterioro del hueso, y también hiperesplenismo, hepatomegalia, trombocitopenia, anemia y complicaciones del pulmón [Grabowski, (1993) ibid. ; Lee, Prog. Clin. Biol . Res. 95:177-217 (1982)]. Más específicamente, la enzima lisosomal usada por el método de la invención puede ser seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, -galactosidasa, glucocerebrosidasa, a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa o sialidasa. De preferencia, donde la enfermedad tratada es la enfermedad de Gaucher, la enzima lisosomal usado por el método de la invención es glucocerebrosidasa (GCD) . La proteína de la presente invención se puede usar para producir una composición farmacéutica. Así, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona una composición farmacéutica que incluye, como un ingrediente activo de la misma, una proteina y un portador farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente una "composición farmacéutica" se refiere a la preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en la presente, tal como una proteina recombi nante, con otros componentes químicos tales como fármacos tradicionales, portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de una proteína o célula a un organismo. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden manufacturar mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezclado, disolvimiento, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización. En una modalidad preferida, el término "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia regulatoria del gobierno federal o del gobierno del estado o listado en la Farmacología de los Estados Unidos u otra farmacopea generalmente reconocida para el uso en animales, y más particularmente en humanos. Después en la presente, las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" se utilizan intercambiablemente y se refieren a un portador o un diluyente aprobado que no cause irritación significante a un organismo y que no anula la actividad biológica y las propiedades del conjugado administrado. El término "portador" se refiere a un diluyente, adyuvante, excipiente o vehículo con el cual la sustancia terapéutica es administrada. Tales portadores farmacéuticos pueden ser líquidos estériles, tales como agua o aceites, incluyendo de aquellos de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tal como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua es un portador preferido cuando la composición farmacéutica se administra intravenosamente. Las soluciones salinas y las soluciones de dextrosa y glicerol acuosas también se pueden emplear como portadores líquidos, particularmente para soluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche descremada deshidratada, glicerol, propilenglicol, agua, etanol y los similares. La composición si se desea también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsificantes, o agentes reguladores del pH. Estas composiciones pueden tomar la forma de soluciones, suspensiones, emulsiones, tabletas, pildoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y los similares. La composición se puede formular como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales tales como triglicéridos . La formulación oral puede incluir portadores estándares tales como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, etc. Ejemplos de portadores farmacéuticos adecuados se describen en "Remington' s Pharnaceutical Sciences" by E. W. Martin. Tales composiciones contendrán una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteina, de referencia en forma purificada, junto con una cantidad adecuada de portador para proporcionar la forma para la administración apropiada al paciente. La formulación debe ser adecuada para el modo de administración. En la presente el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte adicionada a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente los procesos y las administración de los ingredientes activos. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azucares y tipos de almidones, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles . Las técnicas adicionales para formulación y administración de ingredientes activos se pueden encontrar en "Remington' s Pharmaceutical Sciences, "Mack Publishing Co., Easton, PA, la más última edición, que es incorporada en la presente por referencia como se expusiera completamente en la presente . Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente también pueden comprender portadores o excipientes sólidos o en fase gel adecuados. Ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen, pero no están limitados a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azucares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles . Las rutas adecuadas para la administración pueden incluir, por ejemplo, el suministro oral, rectal, transmucosal, transdérmico, intestinal o parenteral, incluyendo las inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares así como las inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o infraoculares. Las composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con la presente invención así se pueden formular de una manera convencional usando uno o más portadores farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que, se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la ruta de administración elegida. Para la inyección, los ingredientes activos de la invención se pueden formular en soluciones acuosas, de preferencia en soluciones reguladoras fisiológicamente compatibles, tal como la solución de Hank, solución de Ringer o la solución reguladora salina fisiológica. Para la administración transmucosal, se utilizan penetrantes en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica. Para la administración oral, los ingredientes activos opcionalmente pueden ser formulados a través de la administración de las células completas que producen una proteina de acuerdo con la presente invención, tal como GCD por ejemplo. Los ingredientes activos también se pueden formular al combinar los ingredientes activos y/o las células con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten que los ingredientes activos de la invención sean formulados como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, emulsiones, suspensiones y los similares, para la ingestión oral en un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral se pueden hacer usando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos después de la adición de auxiliares adecuados si es deseado para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenadores tales como azucares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tal como polivinilpi rrolidona (PVP) . Si se desea, se pueden adicionar agentes desintegrantes, tal como polivinil pirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio. Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden utilizar soluciones de azúcar concentrada que pueden opcionalmente contener goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol , polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Se pueden adicionar materiales colorantes o pigmentos a las tabletas o recubrimientos de gragea para la identificación y caracterizar diferentes combinaciones de dosis de ingrediente activo . Las composiciones farmacéuticas, que se pueden usar oralmente, incluyen las cápsulas formadas por presión hechas de gelatina así como cápsulas selladas, blandas hechas de queratina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas formadas por presión pueden contener los ingredientes activos en mezcla con rellenador tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En cápsulas blandas, los ingredientes activos pueden ser disueltos o suspendidos en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden adicionar estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deben estar en dosis adecuadas para las rutas elegida de administración. Para la administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional. Para la administración por inhalación, los ingredientes activos para el uso de acuerdo con la presente invención son convenientemente suministrados en la forma de una presentación de rocío en aerosol a partir de un envase presurizado o nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede ser determinada al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para el uso en un inhalador o insuflador pueden ser formuladas para contener una mezcla de polvo del ingrediente activo y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón. Los ingredientes activos descritos en la presente se pueden formular para la administración parenteral, por ejemplo, mediante la inyección de bolo o la infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo en ampolletas o en contenedores de muítidosis con opcionalmente, un conservador adicionado. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos y pueden contener agentes formulatorios tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adici onalmente las suspensiones de los ingredientes activos se pueden preparar como suspensiones de inyección aceitosas apropiadas . Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de ajonjolí, o ásteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas . Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias, que incrementan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. En una modalidad preferida, la composición se formula de acuerdo con procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa a seres humanos. Típicamente, las composiciones farmacéuticas para la administración intravenosa son soluciones en solución reguladora acuosa isotónica, estéril. Generalmente, los ingredientes se suministran ya sea por separado o se mezclan conjuntamente en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado libre de agua en un contenedor herméticamente sellado tal como una ampolleta o sachette indicando la cantidad de agente activo. Donde la composición va ser administrada mediante infusión, esta puede ser suministrada con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico estéril. Donde la composición va ser administrada mediante infusión, esta puede ser administrada con una botella de infusión que contiene agua o solución salina de grado farmacéutico, estéril. Donde la composición es administrada mediante inyección, una ampolleta de agua estéril para inyección o solución salina se puede proporcionar, de modo que los ingredientes pueden ser mezclados antes de la administración. Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden formular como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones tales como aquellos derivados de ácido clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y aquellas formadas con cationes tales como aquellas derivadas de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc. Los ingredientes activos de la presente invención también se pueden formular en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, usando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos. Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente también pueden comprender sólidos adecuados de portadores y excipientes en fase de gel. Ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen, pero no están limitados a, carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares, almidones derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles . La ruta tópica es opcionalmente realizada, y es asistida por un portador tópico. El portador tópico es uno que es generalmente adecuado para la administración del ingrediente activo tópico e incluye cualquiera de tales materiales conocidos en la técnica. El portador tópico se selecciona para proporcionar una composición en la forma deseada, por ejemplo, como un portador liquido o no liquido, loción, crema, pasta, gel, polvo, ungüento, solvente, diluyente liquido, gotas y los similares, y puede estar comprendido de un material de ya sea origen que ocurre de manera natural o sintético. Es esencial, claramente, que el portador seleccionado no afecte adversamente el agente activo otros componentes de la formulación tópica, y que sea estable con respecto a todos los componentes de la formulación tópica. Ejemplos de portadores tópicos adecuados para el uso en la presente incluyen agua, alcoholes y otros solventes orgánicos no tóxicos, glicerina, aceite mineral, silicona, jalea de petróleo, lanolina, ácidos grasos, aceites vegetales, parábenos, ceras y los similares . Las formulaciones preferidas en la presente son ungüentos incoloros sin olor, líquidos, lociones, cremas y geles . Los ungüentos son preparaciones semisólidas que típicamente se basan sobre petrolato u otros derivados de petróleo. La base de ungüento específica que es utilizada, como será apreciado por aquellos expertos en la técnica es una que proporcionará el suministro de ingredientes activos óptimo, y, de preferencia, proporcionará otras características deseadas también, por ejemplo emoliencia o los similares. Como con otros portadores o vehículos, una base de ungüento debe ser inerte, estable no irritante y no sensibilizante. Como es explicado en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19- Edición (Easton, Pa . : Mack Publishing Co., 1995), en las páginas 1399-1404, las bases de ungüento pueden ser agrupadas en cuatro clases: bases oleaginosas; bases emulsificables; bases de emulsión; y bases solubles en agua. Las bases de ungüento oleaginoso incluyen, por ejemplo, aceiies vegetales, grasas obtenidas de animales e hidrocarburos semisólidos obtenidos del petróleo. Las bases de ungüento emulsificable, también conocidas como bases de ungüento absorbente, contienen poco o nada de agua e incluyen, por ejemplo, sulfato de hidroxies tearina, lanolina anhidra y petrolato hidrofilico. Las bases de ungüento de emulsión son ya sea emulsiones de agua en aceite (W/O) o emulsiones de aceite en agua (O/W) e incluyen, por ejemplo, alcohol cetilico, monoestearato de glicerilo, lanolina y ácido esteárico. Las bases de ungüento solubles en agua preferidas se preparan a partir de polietilenglicoles de peso molecular variable; nuevamente, la referencia se puede hacer a Remington: The Science and Practice of Pharmacy para información adicional. Las lociones son preparaciones que son aplicadas a la superficie de la piel sin fricción, y son típicamente preparaciones líquidas o semilíquidas, en las cuales las partículas sólidas, incluyendo el agente activo están presentes en una base de agua o de alcohol. Las lociones son usualmente suspensiones de sólidos y pueden comprender una emulsión aceitosa liquida del tipo de aceite en agua. Las lociones son formulaciones preferidas en la presente para tratar áreas grandes del cuerpo, debido a la facilidad de aplicación de una composición más fluida. Generalmente, es necesario que la materia insoluble en una loción sea finamente dividida. Las lociones típicamente contendrán agentes de suspensión para producir mejores suspensiones asi como ingredientes activos útiles para localizar y mantener el agente activo en contacto con la piel, por ejemplo, meti1celulosa, carboximeti1celulosa de sodio o los similares. Las cremas que contienen los ingredientes activos seleccionados son, como es conocidos en la técnica, emulsiones viscosas líquidas o simisólidas, ya sea de aceite en agua o agua en aceite. Las bases de crema son lavables con agua y contienen una fase aceitosa, un emulsificante y una fase acuosa. La fase de aceite, también algunas veces llamada la fase "interna", está generalmente comprendida de petrolato y un alcohol graso tal como alcohol cetílico o estearílico ; la fase acuosa usualmente, aunque no necesariamente, excede la fase de aceite en volumen, y generalmente contiene un humectante. El emulsificante en una formulación de crema, como es explicado en Remington, supra, es generalmente un surfactante no iónico, aniónico, catiónico o anfotérico. Las formulaciones en gel son preferidas para la aplicación al cuero cabelludo. Como será apreciado por aquellos que trabajan en el campo de la formulación de ingredientes activos tópicos, los geles son sistemas semisólidos, de tipo de suspensión. Los geles en una sola fase contienen Tíacromo1éculas orgánicas distribuidas de manera sustancial uniformemente a través de liquido portador, que es típicamente acuoso, pero también, de preferencia, contiene un alcohol y, opcionalmente, un aceite. Varios aditivos, conocidos para aquellos expertos en la técnica pueden ser incluidos en las formulaciones tópicas de la invención. Por ejemplo, los solventes se pueden utilizar para solubilizar ciertas sustancias de ingredientes activos. Otros aditivos opcionales incluyen mej oradores de permeación de la piel, opacificantes, ar.ti-oxidantes, agentes de gelificación, agentes de espesamiento, estabilizantes y los similares. Las composiciones tópicas de la presente invención también se pueden suministrar a la piel usando parches o artículos de tipo dérmico convencionales, en donde la composición de ingredientes activos está contenida dentro de una estructura laminada, que sirve como un dispositivo de suministro de fármaco que es fijado a la piel. En tal estructura, la composición de ingredientes activos es contenida en una capa, o "depósito" que implica una capa de respaldo superior. La estructura laminada puede contener un solo depósito o puede contener múltiples depósitos. En una modalidad, el depósito comprende una matriz polimérica de un material adhesivo de contacto farmacéutica aceptable que sirve para fijar el sistema a la piel durante el suministro de los ingredientes activos. Ejemplos de materiales adhesivos de contacto a la piel adecuados incluyen, pero no están limitados a, polietilenos , polisiloxanos, poliisobutilenos, poliacrilatos, poliuretanos y los similares . El adhesivo polimérico particular seleccionado dependerá de los ingredientes activos particulares, vehículo, etc., es decir, el adhesivo debe ser compatible con todos los componentes de la composición que contiene ingredientes activos. Alternativamente, el depósito que contiene los ingredientes activos y al adhesivo de contacto a la piel están presente como capas separadas y distintas, con el adhesivo que implica el depósito que, en este caso, puede ser ya sea una matriz polimérica como es descrito en lo anterior, o puede ser un depósito de liquido o hidrogel, o puede tomar alguna otra forma . La capa de respaldo en estos laminados, que sirve como la superficie superior del dispositivo, funciona como el elemento estructural primario de la estructura laminada y proporciona al dispositivo con mucha de su flexibilidad. El material seleccionado para el material de respaldo debe ser seleccionado de modo que sustancialmente impermeable a los ingredientes activos y a cualquiera de los otros componentes de la composición que contienen los ingredientes activos, previniendo de esta manera la pérdida de cualquiera de los componentes a través de la superficie superior del dispositivo. La capa de respaldo puede ser ya sea oclusiva o no oclusiva dependiendo de si se desea que la piel llegue a ser hidratada durante el suministro de los ingredientes activos. El respaldo de preferencia se hace de una lámina o película de un material elastomérico de preferencia flexible. Ejemplos de polímeros que son adecuados para la capa de respaldo incluyen polietileno, polipropileno y poliésteres. Durante el almacenamiento y antes del uso, la estructura laminada incluye un revestimiento de liberación. Inmediatamente antes del uso, esta capa es removida del dispositivo para exponer la superficie basal del mismo, ya sea el depósito de ingredientes activos o una capa adhesiva de contacto separada de modo que el sistema puede ser fijado a la piel. El revestimiento de liberación se debe hacer de un material impermeable a los ingredientes activos/vehículo. Tales dispositivos pueden ser fabricados usando técnicas convencionales, conocidas en la técnica, por ejemplo al fundir una mezcla fluida de adhesivo, los ingredientes activos y el vehículo sobre la capa de respaldo, seguido por la laminación del revestimiento de liberación. De manera similar, la mezcla adhesiva puede ser fundida sobre el revestimiento de liberación, seguido por la laminación de la capa de respaldo. Alternativamente, el depósito de ingredientes activos se puede preparar en la ausencia de ingredientes activos o excipiente, y luego cargar mediante el "empapamiento" en una mezcla de ingredientes activos/vehículo . Como con las formulaciones tópicas de la invención, la composición de ingredientes activos contenida dentro de los depósitos de ingredientes activos de estos sistemas laminados pueden contener un número de componentes . En alguno casos, los ingredientes activos pueden ser suministrados "puros" es decir, en la ausencia de líquido adicional. La mayoría de los casos, sin embargo, los ingredientes activos serán disueltos, dispersados o suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable, típicamente un solvente o gel. Otros componentes que pueden estar presentes, incluyen conservadores, estabilizantes, surfactantes y los similares. Se debe observar que la proteína de la invención, tal como una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa, de preferencia se administra al paciente en necesidad en una cantidad efectiva. Como se utiliza en la presente, "cantidad efectiva" significa una cantidad necesaria para lograr un resultado deseado. Por ejemplo, una cantidad efectiva de la composición de la invención puede ser seleccionada para ser útil para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosomal .

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito compuesto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de ingrediente activo efectiva para prevenir, aliviar o aminorar los síntomas de la enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que es tratado. La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está bien dentro de la capacidad de aquellos expertos en la técnica, especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada en la presente. Para cualquier ingrediente activo usado en los métodos de la invención, la cantidad terapéuticamente efectiva o dosis puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos de actividad en animales. Por ejemplos, una dosis se puede formular en modelos de animales para alcanzar un intervalo de concentración en circulación que incluyen la IC50 como es determinado mediante los ensayos de actividad. . La toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en la presente se pueden determinar mediante procedimiento farmacéuticos estándares en animales experimentales, por ejemplo, al determinar la IC50 y la LD50 (dosis letal que causa la muerte en 50% de los animales probados) para un ingrediente activo sujeto. Los datos obtenidos de estos ensayos de actividad y estudios en animales se pueden utilizar en la formulación de una gama de dosificación para el uso en humanos. Por ejemplo, las dosis terapéuticamente efectivas adecuadas para el tratamiento de desordenes genéticos pueden determinadas a partir de los experimentos con modelos animales de estas enfermedades. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. La formulación exacta ruta de administración y dosificación pueden ser elegidas por el profesional individual en vista de las condiciones del paciente, (Ver por ejemplo, Fingí y colaboradores, 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Capitulo 1 página 1) . La cantidad de dosificación y el intervalo se pueden ajusfar individualmente para proporcionar niveles en el plasma de la porción activa que son suficientes para mantener los efectos de modulación, llamada la concentración efectiva mínima (MEC) . La MEC variará para cada preparación, pero opcionalmente, puede ser estimada a partir de datos de animales enteros. Los intervalos de dosificación también pueden determinar usando el valor MEC. Las preparaciones opcionalmente pueden ser administradas usando un régimen, que mantiene los niveles en el plasma arriba de la MEC para 10-90% del tiempo, preferible entre 30-90% y mucho más de preferencia 50-90%. Dependiendo de la severidad y la responsividad de la condición que es tratada, la dosificación también puede ser una administración individual de una composición de liberación lenta descrita anteriormente en la presente, con el curso del tratamiento que dura de varios días a varias semanas o hasta que la curación es efectuada o se alcanza la disminución del estado de la enfermedad. Las composiciones de la presente invenció se pueden presentar, si es deseado, en un paquete o dispositivo suministrador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contiene el ingrediente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, lámina delgada de metal o de plástico, tal como un paquete de ampollas. El paquete o el dispositivo suministrador puede ser acompañado por instrucciones para la administración. El paquete o surtidor también puede ser acompañado por una notificación asociada con el contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, o uso o venta de sustancias farmacéuticas, esta notificación que es reflectiva de la aprobación de la agencia de la forma de las composiciones para la administración humana o veterinaria. Tal notificación, por ejemplo, puede ser de etiquetación aprobada por la U. S. Food and Drug Administration para prescripción de fármacos o de un inserto de producto aprobado. Las composiciones que comprenden un ingrediente activo de la invención formulada en un portador farmacéutico compatible también pueden ser preparadas, colocadas en un contenedor apropiado y etiquetadas para el tratamiento de una condición indicada. Como se utiliza en la presente, el término "modular" incluye sustancialmente inhibir, hacer lenta o revertir la progresión de una enfermedad, sustancialmente aminorando los síntomas clínicos de una enfermedad o condición, o sustancialmente previniendo la aparición de síntomas clínicos de una enfermedad o condición. Un "modulador" por lo tanto incluye un agente que puede modular una enfermedad o condición. LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NO: 1 Secuencia de aminoácidos del Péptido de Señal ER: MKTNLFLFLIFSLLLSLSSAEF SEQ ID NO: 2 Secuencia de aminoácidos de la señal de dirección Vacuolar de la quitinasa A de Tabaco A: DLLVDTM SEQ ID NO: 3 Secuencia de ácido nucleico del cebador Delantero: cagaattcgcccgcccctgca SEQ ID NO: 4 Secuencia de ácido nucleico del cebador Trasero: ctcagatcttggcgatgccaca SEQ ID NO: 5 Secuencia de ácido nucleico del cebador delantero del promotor 35S: ctcagaagaccagagggct SEQ ID NO: 6 Secuencia de ácido nucleico del cebador hacia atrás desde el terminado : caaagcggccatcgtgc SEQ ID NO: 7 Secuencia de ácido nucleico del cDNA de GCD humano usado para las construcciones de la invención gcccgccc ctgcatccct aaaagcttcg gctacagctc ggtggtgtgt gtctgcaatg ccacatactg tgactccttt gaccccccga cctttcctgc ccttggtacc ttcagccgct atgagagtac acgcagtggg cgacggatgg agctgagtat ggggcccatc caggctaatc acacgggcac aggcctgcta ctgaccctgc agccagaaca gaagttccag aaagtgaagg gatttggagg ggccatgaca gatgctgctg ctctcaacat ccttgccctg tcaccccctg cccaaaattt gctacttaaa tcgtacttct ctgaagaagg aatcggatat aacatcatcc gggtacccat ggccagctgt gacttctcca tccgcaccta cacctatgca gacacccctg atgatttcca gttgcacaac ttcagcctcc cagacgaaga taccaagctc aagatacccc tgattcaccg agccctgcag ttggcccagc gtcccgtttc actccttgcc agcccctgga catcacccac ttggctcaag accaatggag cggtgaatgg gaaggggtca ctcaagggac agcccggaga catctaccac cagacctggg ccagatactt tgtgaagttc ctggatgcct atgctgagca caagttacag ttctgggcag tgacagctga aaatgagcct tctgctgggc tgttgagtgg ataccccttc cagtgcctgg gcttcacccc tgaacatcag cgagacttca ttgcccgtga cctaggtcct accct.cgc.na acagtactca ccacaatgtc cgcctactca tgctggatga ccaacgcttg ctgctgcccc actgggcaaa ggtggtactg acagacccag aagcagctaa atatgttcat ggcattgctg tacattggta cctggacttt ctggctccag ccaaagccac cctaggggag acacaccgcc tgttccccaa caccatgctc tttgcctcag aggcctgtgt gggctccaag ttctgggagc agagtgtgcg gctaggctcc tgggatcgag ggatgcagta cagccacagc atcatcacga acctcctgta ccatgtggtc ggctggaccg actggaacct tgccctgaac cccgaaggag gacccaattg ggtgcgtaac tttgtcgaca gtcccatcat tgtagacatc accaaggaca cgttttacaa acagcccatg ttctaccacc ttggccactt cagcaagttc attcctgagg gctcccagag agtggggctg gttgccagtc agaagaacga cctggacgca gtggcactga tgcatcccga tggctctgct gttgtggtcg tgctaaaccg ctcctctaag gatgtgcctc ttaccatcaa ggatcctgct gtgggcttcc tggagacaat ctcacctggc tactccattc acacctacct gtggcatcgc cag SEQ ID NO: 8 Secuencia de aminoácidos de la glucocerebrosidasa A R P C I P K S F G Y S S V V C V C N A T Y C D S F D P P T F P A L G T F S R Y E S T R S G R R M E L S M G P I Q A N H T G T G L L L T L Q P E Q K F Q K V K G F G G A M T D A A A L N I L A L S P P A Q N L L L S y F S E E G V R L L M L N D Q R L L L P H W A V L T D P E A A K Y V H G I A V H W Y L D F L A P A K A t L G E T H R L F P N T M L F A S E A C V G S K F W E Q S V R L G S W D R G M Q y S H S I I T N L L Y H V V G T D W N L ? L N P E G G P N W V R N F V D S P I I V D I T K D T F Y K Q P M F Y H L G H F S K F I P E G S Q R V G L V A S 0 K N D L D A V A L M H P D G s A V V V V L N R S S K D V P L T I D P A V G F L E T I S P G y S I H T Y L w H R 0 SEQ ID NO: 9 Secuencia de ácido nucleico del promotor 35S Ttttcacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctg tcacttcatcgaaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgat aaaggaaaggctatcgttcaagatgcctctaccgacagtggtcccaaagatggacccccac ccacgaggaacatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattg atgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagaccct tcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggac SEQ ID NO: 10 Secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido de señal ER atgaagactaatctttttctctttctcatcttttcacttctc ctatcattatcctcggccgaa tc SEQ ID NO: 11 Secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de dirección vacuolar gatcttttagtcgatactatg SEQ ID NO: 12 Secuencia de ácido nucleico del terminador taatttcatgatctgttttgttgtattcccttgcaatgcagggcctagggctatgaAtaaagttaatgt gtgaatgtgtgaatgtgtgattgtgacctgaagggatcacgactataatcgtttataataaacaaagactttg tcccaaaaaccccccccccngcaga SEQ ID NO: 13 Secuencia de ácido nucleico del cásete de expresión de la invención ttttcacaaagggtaatatcgggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcacttcatcg aaaggacagtagaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggctatcgttca agatgcctctaccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggaacatcgtggaaaaagaaga cgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccaGtgacgtaagggatgacgcacaat cccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagaggacaggcttcttgag atccttcaacaattaccaacaacaacaaacaacaaacaacattacaattactatttacaattacagtcga gggatccaaggagatataacaatgaagactaatctttttctctttctcatcttttcacttctcctatcattatcc tcggccgaattcgcccgcccctgcatccctaaaagcttcggctacagctcggtggtgtgtgtctgcaatgcc acatactgtgactcctttgaccccccgacctttcctgcccttggtaccttcagccgctatgagagtacacgca gtgggcgacggatggagctgagtatggggcccatccaggctaatcacacgggcacaggcctgctactgac cctgcagccagaacagaagttccagaaagtgaagggatttggaggggccatgacagatgctgcígctctc aacatccttgccctgtcaccccctgcccaaaatttgctacttaaatcgTacttctctgaagaaggaatcgga tataacatcatccgggtacccatggccagctgtgacttctccatccgcacctacacctatgcagacacccct gatgatttccagttgcacaacttcagcctcccagaggaagataccaagctcaagatacccctgattcaccg agccctgcagttggcccagcgtcccgtttcactccttgccagcccctggacatcacccacttggctcaagac caatggagcggtgaatgggaaggggtcactcaagggacagcccggagacatctaccaccagacctgggc cagatactttgtgaagttcctggatgcctatgctgagcacaagttacagttctgggcagtgacagctgaaaa tgagccttctgctgggctgttgeigtggataccccttccagtgcctgggcttcacccctgaacatcagcgagac ttcattgcccgtgacctaggtcctaccctcgccaacagtactcaccacaatgtccgcctactcatgctggatg accaacgcttgctgctgccccactgggcaaaggtggtactgacagacccagaagcagctaaatatgttcat ggcattgctgtacattggtacctggactttctggctccagccaaagccaccctaggggagacacaccgcct gttccccaacaccatgctcttlgcctcagaggcctgtgtgggctccaagttctgggagcagagtgtgcggcta ggctcctgggatcgagggatgcagtacagccacagcatcatcacgaacctcctgtaccatgtggtcggctg gaccgactggaaccttgccctgaaccccgaaggaggacccaattgggtgcgtaactttgtcgacagtccca tcattgtagacatcaccaaggacacgttttacaaacagcccatgttctaccaccttggccacttcagcaagt tcattcctgagggctcccagagagtggggctggttgccagtcagaagaacgacctggacgcagtggcactg atgcatcccgatggctctgctgttgtggtcgtgctaaaccgctcctctaaggatgtgcctcttaccatcaagg atcctgctgtgggcttcctggagacaatctcacctggctactccattcacacctacctgtggcatcgccaag atcttttagtcgatactatgtaatttcatgatctgttttgttgtattcccttgcaatgcagggcctagggctatga Ataaagttaatgtgtgaatgtgtgaatgtgtgattgtgacctgaagggatcacgactataatcgtttataata aacaaagactttgtcccaaaaaccccccccccngcaga SEQ ID NO: 14 Secuencia de aminoácidos de la proteina recombinante de la invención M K T N L F L F L I F S L L L S L S S A E F A R P C I P K S F G Y S S V V C V C N A T Y C D S F D P P T F P A L G T F S R Y E S T R S G R R M E L S M G P I Q A N H T G T G L L L T L Q P E Q F Q K V K G F G G A M T D A A A L N I L A L S P P A Q N L L L K SY F S E E G I G Y N I IR V P M A S C D F S 1 R T Y T Y A D T P D D F Q L H N F S L P E E D T L K I P L I H R A L Q L A Q R P V S L L A S P W T S P T W L K T N G A VN G K G S L K G Q P G D I Y H Q T W A R Y F V K F L D A Y A E H K L Q F W A V TA E N E P S A G L L S G Y P F Q C L G F T P E H Q R D F I A R D L G P T L A N S T H H N V R L L M L D D Q R L L L P H WA KVVLT D P EAAKYV H G I A V H WY L D F LA PA KAT L G ET H R L F P NT M L FA S EA CVG S K FWE Q SVRL G S D R GM Q Y S H S I IT N L LY HVV GWTD W N LA L N P E G G P N W V R N FV D S PI I V D I T K D T FY Q P M FY H L G H F S K F I P E G S Q RV G LVA S Q N D L D A VA L M H PD G SA V VVV L N RS S K D VP LTI K D P A V G F L E T I S P GY S I HTY LW H R Q D LLV D T M Otras Modalidades Se va a entender que mientras que la invención se ha descrito en conjunción con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior se propone para ilustrar y no para limitar el alcance de la invención, que es definido por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. REFERENCIAS 1. Ma, J. K. C. , Drake, P. M. W. y Christou, P. (2003) Nature revíews 4,794-805 2. Lerouge, P . , Gabanes-Macheteau, M, Rayón, C, Fischette- Laine, A. C, Gomord, V, Faye, L. (1998) Plant Mol Biol 38, 31-48 3. Lee, R. E. (1982) Prog Clin Biol Res 95, 177-217 4. Grabowski, G. (1993) Adv Hum Genet. 21, 377-441 5. Grabowski, G. A. y Hopkin, R. J. (2003) Annual Review of Genomics and Human Genética 4, 403-436 6. Sorge, J. W. , C, Westwood, B . , Beutler, E. (1985) Proc Nati Acad Sci EÜA. 82, 7289-7293 7. Berg-Fussitian, A., Grace, M. , Ioanncu, Y. y Grabowski, G. (1993) J. Biol. Chem. 268, 14861-14866 8. Grace, M., Grabowski, GA. (1990) Biochem Biophys Res Commun 168, 771-777 9. Grace, M. , Newman, K. , Scheinker, V., Berg-Fussman, A. y Grabowski, G. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2283-2291 10. Barton, N. W. , Brady, R. 0., Dambrosia, J. M. , Di Bisceglie, A. M. , Doppelt, S. 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Claims

REIVINDICACIONES 1. üna célula hospedera, caracterizada porque produce una proteina recombinante de alto contenido de mañosa, que comprende un polinucleótido que codifica la proteina recombinante y una señal para causar que la proteina recombinante sea producida como una proteina de alto contenido de mañosa.
2. La célula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polinucleótido comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina de interés operablemente enlazada a una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal.
3. La célula de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el péptido de señal comprende un péptido de señal con dirección al ER (retículo endoplásmico) .
4. La célula de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el polinucleótido además comprende una tercera secuencia de ácido nucleico para codificar un péptido de señal ce dirección vacuolar.
5. La célula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la señal causa que la proteina recombinante sea dirigida al ER.
6. La célula de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la señal comprende un péptido de señal para causar que la proteína recombinante sea dirigida al ER.
7. La célula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el polinucleótido comprende un segmento de ácido nucleico para codificar el péptido de señal .
8. La célula de conformidad con la reivindicación 1 o cualquiera de las reivindicaciones 3-7, caracterizada porque la señal causa que la proteina recombinante sobrepase el Golgi.
9. La célula de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la señal comprende un péptido de señal para causar que la proteina recombinante no sea dirigida al Golgi.
10. La célula de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el polinucleótido comprende un segmento de ácido nucleico para codificar el péptido de señal .
11. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la célula hospedera es cualquiera de una célula eucariótica y una célula procariótica.
12. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la célula procariótica es una célula bacteriana, de preferencia una célula de Agrobacterium tumefaciens .
13. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula eucariótica es una célula de planta.
14. la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la célula de planta es una célula de raiz de planta seleccionada del grupo que consiste de célula de raiz transformada de Agrohacterium rihzogenes, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria.
15. la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la célula de raiz de planta es una célula de zanahoria.
16. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el polinucleótido recombinante comprende una primera secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina de interés que está en enlace operable con una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal de dirección vacuolar derivado del gen quitinasa A de tabaco básico, el péptido de señal vacuolar que tiene la secuencia de aminoácidos como es denotada por la SEQ ID NO: 2, en donde la primera secuencia de ácido nucleico está opcionalmente además operablemente enlazada a una tercera secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de señal con dirección al ER (retículo endoplásmico) como es denotada por la SEQ ID NO: 1.
17. la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el polinucleótido recombinante además comprende un promotor que es funcional en células de plantas, en donde el promotor está operablemente enlazado a la molécula recombinante.
18. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el polinucleótido recombinante además comprende un terminador que es funcional en células de plantas, en donde el terminador está operablemente enlazado a la molécula recombinante.
19. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el polinucleótido recombinante opcionalmente además comprende elementos de control, de promoción y regulatorios adicionales y/o marcadores seleccionables, en donde los elementos regulatorios están operablemente enlazados a la molécula recombinante .
20. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la proteina de alto contenido de ma osa es una glicoproteina de alto contenido de mañosa que tiene glicosilacion con por lo menos un residuo de mañosa expuesto.
21. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque la proteina de alto contenido de mañosa es una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa y sialidasa.
22. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la enzima lisosomal es glucocerebrosidasa (GCD) humana.
23. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la GCD comprende la secuencia de aminoácidos sustancialmente como es denotada por la SEO ID NO: 8, codificada por la secuencia de ácido nucleico como es denotada por la SEQ ID NO: 7.
24. La célula hospedera de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la célula es transformada o transfectada con un polinucleótido recombinante o con un vector de expresión que comprende la molécula, el polinucleótido recombinante que además comprende un promotor 35S del Virus de Mosaico de Coliflor, un terminador de octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens y el elemento regulatorio es el elemento incrementador traduccional ornega de T V (Virus del Mosaico del Tabaco) y que tiene la secuencia de ácido nucleico sustancialmente como es denotada por la SEQ ID NO: 13 que codifica la GCD que tiene la secuencia de aminoácidos sustancialmente como es denotada por la SEQ ID NO: 14.
25. Una proteína de alto contenido de mañosa recombinante, caracterizada porque se produce mediante la célula hospedera de conformidad con la reivindicación 1 a 24.
26. La proteína de alto contenido de mañosa recombinante de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la proteína de alto contenido de mañosa es una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-galactosaminidasa, lipasa ácida, o¡-galactosidasa, glucocerebrosidasa a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, oí-manosidasa y sialidasa.
27. La proteína recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizada porque la enzima lisosomal es glucocerebrosidasa (GCD) humana.
28. Una enzima lisosomal de alto contenido de ma osa biológicamente activa recombinante, caracterizada porque tiene por lo menos una cadena de oligosacárido que comprende un residuo de mañosa expuesto.
29. Una proteína recombinante, caracterizada porque comprende una primera porción que tiene actividad de péptido de señal y una segunda porción que tiene actividad de enzima lisosomal, la primera porción que causa que la segunda porción sea procesada en una célula de planta con por lo menos una cadena de oligosacárido que comprende un residuo de mañosa expuesto.
30. La proteína de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la enzima lisosomal comprende una proteína para el tratamiento o la prevención de la enfermedad de Gaucher.
31. La proteína de conformidad con las reivindicaciones 29 y 30, caracterizada porque la proteína comprende hGCD.
32. La proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 29-31, caracterizada porque la primera porción comprende un péptido de señal con dirección al ER de célula de planta.
33. La enzima lisosomal recom inante de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque la enzima recombinante puede enlazar a un receptor de mañosa sobre una célula objetivo en un sitio objetivo dentro de un sujeto que sufre de una enfermedad de almacenamiento lisosomal.
34. La enzima lisosomal recombinante de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque la enzima lisosomal recombinante tiene afinidad incrementada para la célula objetivo, en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosomal que ocurre de manera natural para la célula objetivo.
35. La enzima lisosomal recombinante de conformidad con la reivindicación 34, caracterizada porque la enzima lisosomal recombinante es seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-?-galactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, a-manosidasa o sialidasa.
36. La enzima lisosomal recombinante de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada porque la enzima lisosomal recombinante es glucocerebrosidasa (GCD) .
37. La enzima lisosomal recombinante de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada porque la célula objetivo en el sitio objetivo es una célula de Kupffer en el hígado del sujeto.
38. Una proteína de alto contenido de mañosa recombinante, caracterizada porque se produce en cultivo de células de plantas.
39. La proteína de alto contenido de mañosa recombinante de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende un péptido de señal de planta para la dirección de una proteína al ER.
40. La proteína de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el péptido de señal de planta comprende un péptido para la dirección de la proteína al ER en un cultivo de células de plantas de raíces.
41. La proteína de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada porque el cultivo de células de plantas de raices comprende células de zanahoria.
42. Una proteina hGCD de alto contenido de mañosa recombinante, caracterizada porque se produce en cultivo de células de plantas.
43. Uso de un cultivo de células de plantas, caracterizado porque es para producir una proteina de alto contenido de mañosa.
44. Un método para producir una proteina de alto contenido de mañosa, caracterizado porque comprende: preparar un cultivo de células hospederas recombinantes transformadas o transfectadas con un polinucleótido recombinante que codifica para una proteina recombinante; cultivar el cultivo de células hospederas bajo condiciones que permiten la expresión de la proteina, en donde las células hospederas producen la proteina en una forma altamente manosilada.
45. El método de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el cultivo de células hospederas se cultiva en suspensión.
46. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque además comprende: purificar la proteina.
47. El método de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque la célula hospedera es como se define por cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.
48. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 46 o 47, caracterizado porque la proteina de alto contenido de mañosa es una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa que tiene por lo menos una cadena de oligosacárido que comprende un residuo de mañosa expuesto.
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque la enzima recombinante se enlaza a un receptor de ma osa sobre una célula objetivo en un sitio obj etivo .
50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la enzima recombinante tiene afinidad incrementada para la célula objetivo, en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosomal que ocurre de manera natural a la célula objetivo.
51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la enzima lisosomal es seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-N-galactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, or-manosidasa y sialidasa.
52. La molécula del método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque la enzima lisosomal es glucocerebrosidasa (GCD) .
53. El método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la célula objetivo en el sitio objetivo es la célula de Kupffer en el hígado del sujeto.
54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la célula hospedera es una célula de raíz de planta seleccionada del grupo que consiste de célula de raíz transformada de Agrobacte ium rihzogenes, célula de apio, célula de jengibre, célula de rábano picante y célula de zanahoria.
55. El método de conforinidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la célula de raíz de planta es una célula de zanahoria.
56. El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque las células de zanahoria hospederas transformadas son cultivadas en suspensión.
57. Un método para tratar a un sujeto que tiene enfermedad de almacenamiento lisosomal usando la enzima lisosomal recombinante exógena, caracterizado porque comprende : (a) proporcionar una forma biológicamente activa recombinante de la enzima lisosomal purificada de células de raíces de plantas transformadas, y capaz de dirigirse eficientemente a las células anormalmente deficientes en la enzima lisosomal, en donde la enzima biológicamente activa recombinante tiene residuos de mañosa terminales expuestos sobre oligosacáridos adjuntos; y (b) administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de la enzima lisosomal biológicamente activa recombinante al sujeto.
58. El método de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la célula hospedera es como se define por cualquiera de las reivindicaciones 1-24.
59. El método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque la célula hospedera es una célula de zanahoria .
60. El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque la enzima lisosomal es una enzima de alto contenido de mañosa que comprende por lo menos una cadena de oligosacárido que tiene un residuo de mañosa expuesto .
61. El método de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque la enzima recombinante puede enlazar a un receptor de mañosa sobre una célula objetivo en un sitio objetivo dentro de un sujeto.
62. El método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la enzima lisosomal recombinante tiene afinidad incrementada para la célula objetivo, en comparación con la afinidad correspondiente de una enzima lisosomal que ocurre de manera natural a la célula objetivo.
63. El método de conformidad con la reivindicación 62, caracterizado porque la enzima lisosomal es seleccionada del grupo que consiste de glucocerebrosidasa (GCD) , esfingomielinasa ácida, hexosaminidasa, a-N-galactosaminidasa, lipasa ácida, a-galactosidasa, glucocerebrosidasa a-L-iduronidasa, iduronato sulfatasa, of-manosidasa o sialidasa.
64. El método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque la enzima lisosomal es glucocerebrosidasa (GCD) .
65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque la enfermedad de almacenamiento lisosomal es la enfermedad de Gaucher.
66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la célula objetivo en el sitio objetivo es una célula de Kupffer en el hígado del sujeto.
67. üna composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad de almacenamiento lisosomal, caracterizada porque comprende como un ingrediente activo una enzima lisosomal de alto contenido de mañosa biológicamente activa recombinante como es definida por cualquiera de las reivindicaciones 25-42, la composición que opcionalmente además comprende un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
68. La composición de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque la enfermedad de almacenamiento lisosomal es la enfermedad de Gaucher.
69. La composición de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque la enzima lisosomal recombinante es glucocerebrosidasa (GCD) humana de alto contenido de mañosa biológicamente activa.
70. Uso de una enzima lisosomal de alto contenido de ma osa biológicamente activa recombinante como es definida por cualquiera de las reivindicaciones 25-42, caracterizado porque es para la manufactura de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad de almacenamiento lisosomal.
71. El uso de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la enfermedad es la enfermedad de Gaucher.
72. El uso de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la enzima lisosomal biológicamente activa es una glucocerebrosidasa (GCD) humana de alto contenido de mañosa biológicamente activa.