JP5305284B2 - 糖化合物の質量分析法 - Google Patents
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前記糖化合物中の水酸基及びアミノ基をメチル化するメチル化工程と、
メチル化工程で得られた糖化合物の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基を選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換する酸加水分解工程と、
酸加水分解工程で得られた糖化合物を、アルデヒド基もしくはケトン基を標識する標識化合物、又は水酸基を標識する標識化合物により標識する標識工程と
を含むことを特徴とする前記方法。
前記糖化合物中の水酸基及びアミノ基をメチル化するメチル化工程と、
メチル化工程で得られた糖化合物の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基を選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換する酸加水分解工程と、
酸加水分解工程で得られた糖化合物を、アルデヒド基もしくはケトン基を標識する標識化合物、又は水酸基を標識する標識化合物により標識する標識工程と
標識工程により得られた標識化糖化合物を質量分析計により分析する工程と、
を含むことを特徴とする前記方法。
糖タンパク質からN-結合型糖鎖を、還元末端にN-グリコシルアミンを有する糖鎖として遊離させる遊離工程と、
遊離された糖鎖中の水酸基及びアミノ基をメチル化するメチル化工程と、
メチル化工程で得られた糖鎖の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基を選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基に変換する酸加水分解工程と、
酸加水分解工程で得られた糖鎖を、アルデヒド基を標識する標識化合物、又は水酸基を標識する標識化合物により標識する標識工程と
標識工程により得られた標識化糖鎖を質量分析計により分析する工程と、
を含むことを特徴とする前記方法。
糖化合物をN-グリコシルアミンを有する糖化合物に変換するアミノ化工程と、
アミノ化工程で得られたN-グリコシルアミンを有する糖化合物中の水酸基及びアミノ基をメチル化するメチル化工程と、
メチル化工程で得られた糖化合物の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基を選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換する酸加水分解工程と、
酸加水分解工程で得られた糖化合物を、アルデヒド基もしくはケトン基を標識する標識化合物、又は水酸基を標識する標識化合物により標識する標識工程と
標識工程により得られた標識化糖化合物を質量分析計により分析する工程と、
を含むことを特徴とする前記方法。
N-グリコシルアミンを有する糖化合物の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基を選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換することができる酸加水分解試薬と、
アルデヒド基もしくはケトン基を標識する標識用試薬、又は水酸基を標識する標識化合物と
を少なくとも備える、N-グリコシルアミンを有する糖化合物の、質量分析法における検出感度を高めるためのキット。
還元末端にN-グリコシルアミンを有する前記糖鎖中の水酸基及びアミノ基をメチル化することができるメチル化試薬と、
還元末端にN-グリコシルアミンを有する前記糖鎖の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基を選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基に変換することができる酸加水分解試薬と、
アルデヒド基を標識する標識用試薬、又は水酸基を標識する標識化合物と
を少なくとも備える、糖タンパク質のN-結合型糖鎖の分析用キット。
N-グリコシルアミンを有する糖化合物中の水酸基及びアミノ基をメチル化することができるメチル化試薬と、
N-グリコシルアミンを有する糖化合物の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基を選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換することができる酸加水分解試薬と、
アルデヒド基もしくはケトン基を標識する標識用試薬、又は水酸基を標識する標識化合物と
を少なくとも備える、糖化合物の分析用キット。
「N-グリコシルアミンを有する糖化合物」としては、典型的には、N-グリコシルアミンの単糖、及び、N-グリコシルアミンを還元末端に有する糖鎖が挙げられる。N-グリコシルアミンは、どのような糖に由来するものであってもよく、例えば、N-アセチル-D-グルコサミン、N-アセチル-D-ガラクトサミン、D-グルコース、D-ガラクトース、D-マンノース、L-フコース、D-グルクロン酸、L-イズロン酸、N-アセチル-ノイラミン酸、N-グリコリル-ノイラミン酸等の糖においてヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基がアミノ基により置換されたものが挙げられる。
メチル化工程は、前記糖化合物中の水酸基及びアミノ基をメチル化する工程である。メチル化工程では糖化合物上の全ての水酸基及びアミノ基をメチル化することが好ましい。糖化合物上の全ての水酸基及びアミノ基をメチル化することは特に「完全メチル化」とよばれる。このとき、N-グリコシルアミンのアノマー炭素上のアミノ基はN,N-ジメチルアミンに、水酸基はメチルエーテルにそれぞれ変換される。メチル化反応の反応スキームの一例を以下に模式的に示す。
酸加水分解工程は、メチル化工程後の上記糖化合物のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基を選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換する工程である。酸加水分解工程の反応スキームの一例を以下に模式的に示す。
標識工程は、酸加水分解工程で得られた上記糖化合物を、アルデヒド基もしくはケトン基を標識する標識化合物、又は水酸基を標識する標識化合物により標識する工程である。上記の酸加水分解工程により、上記糖化合物の還元末端に水酸基及びアルデヒド基もしくはケトン基が形成されることから、標識化が可能となる。
上記の手順によりメチル化及び標識化がされた糖化合物を質量分析法により分析する。
質量分析計は、マトリクス支援レーザー脱離イオン化方式、エレクトロスプレーイオン化方式を備えるものであればどのような形式のものでも利用できる。好ましくは、マトリクス支援レーザー脱離イオン化方式を備える質量分析計、具体的にはMALDI-TOF型、MALDI-FT-ICR型、MALDI-Q-TOF型、MALDI-QIT-TOF型、MALDI-TOF/TOF型などが利用できる。
本発明はまた、N-グリコシルアミンを有する糖化合物の、質量分析法における検出感度を高めるためのキット、糖タンパク質のN-結合型糖鎖の分析用キット、及び糖化合物の分析用キットに関する。
特許文献3の方法に従い、牛由来アシアロフェツインからグリコシルアミンを含む混合物を調製した。簡単に説明すると、牛由来アシアロフェツイン(60μg)を20 mMリン酸緩衝液(pH 8.0)にアンモニアを加えてpH8.6に調製した溶液に溶解し、その溶液にアスパラギンのアミノ基と糖鎖の結合を加水分解する酵素であるペプチドN-グリカナーゼF(PNGaseF)溶液(1U/mL)を25 μL添加し、37℃にて2時間、放置した。その後、固相抽出カートリッジ(Oasis HLB: Waters)にて反応液を20mM リン酸緩衝液(pH9.0)1mLを用いてろ過し、ろ液をガラスバイアルに集め、減圧下にて濃縮乾燥した。
1%の水を含むジメチルスルホキシド200 μLに水酸化ナトリウム(300 mg)を添加し、メノウ乳鉢上でよくすり潰して得られた泥状物の25 μLをグリコシルアミン混合物を含むガラスバイアル中に加えた。さらに、25 μLのヨウ化メチルを加え、室温で15分間、振とうした。その後、1 mLの水を反応液に加えた後、100% 酢酸にて反応液のpHを4-6に調整し、10分間静置した。ついで、固相抽出カートリッジ(Oasis HLB)を用いて生成物を固相担体に吸着させ、水でよく洗浄後、80% アセトニトリルにて溶出した。得られた溶液を減圧下にて濃縮乾燥した。
完全メチル化されたグリコシルアミン混合物を50% アセトニトリル水溶液の2% 酢酸溶液に溶解し、50℃にて30分間静置したのち、減圧下にて濃縮乾燥した。
得られた残渣を、95% アセトニトリル水溶液の5% 酢酸溶液に溶解したGirard’s Reagent T(1 mg/mL)溶液(10 μL)に溶解し、80℃にて1時間静置した。
マトリックス支援レーザー脱離イオン化 飛行時間型質量分析計(MALDI-TOF MS)用のターゲットプレートに0.5 μLのマトリクス溶液(2,5-dihydroxy benzoic acid, 10 mg/mL in 30% EtOH)を滴下し、風乾した。得られたマトリクスの結晶上に、上述のように標識化剤とともに加熱混合したグリコシルアミン誘導体の0.5 μLを重層し、乾燥後、MALDI-TOF MSにて質量分析スペクトルを測定した。
従来の完全メチル化法で得られる糖誘導体との質量分析計における感度の比較を行うため、出発原料である糖タンパク質の量をそろえて、本発明の方法と従来の完全メチル化法によりそれぞれ修飾を行い、得られた修飾物をそれぞれ段階的に希釈して感度の比較を行った。牛由来アシアロフェツイン60μgからPNGaseFによって遊離させた糖鎖を従来法によって完全メチル化した。得られた完全メチル化糖鎖を50μlのアセトニトリルに溶解し、この溶液を基準として100倍希釈、1000倍希釈した溶液のそれぞれ0.5μlをMALDIプレートに乗せて質量分析スペクトルを測定した。
図1に示すスペクトルは対照実験において、300レーザーショットの積算により得られたものであり、上段が100倍希釈、下段が1000倍希釈の溶液から得られたスペクトルである。図2は、牛由来アシアロフェツイン60μgから本発明の方法によってGirard’s Reagent Tで標識化されたメチル化糖鎖誘導体を50μlのアセトニトリルに溶解し、この溶液を基準として100倍希釈、1000倍希釈した溶液のそれぞれ0.5μlをMALDIプレートに乗せて質量分析スペクトルを測定したものである。図2に示すスペクトルは300レーザーショットの積算により得られたものであり上段が100倍希釈、下段が1000倍希釈の溶液から得られたスペクトルである。図1のm/z 2519と図2のm/z 2596のシグナルはともにアシアロフェツイン上の主要な糖鎖である3本鎖N-グリカン(NA3)に由来するものである。対照実験において通常の方法で完全メチル化した糖鎖は1000倍希釈ではほとんど見えていないが(図1下段)、本方法を用いて修飾を行った標識化完全メチル化糖鎖ははっきりとスペクトルを確認することができた(図2下段)。このように標識化剤を付与された完全メチル化糖鎖の質量分析における感度上昇を確認できた。
Claims (7)
- N-グリコシルアミンを有する糖化合物の、質量分析法における検出感度を高める方法であって、
前記糖化合物中の水酸基及びアミノ基をメチル化するメチル化工程と、
メチル化工程で得られた糖化合物の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基のみを選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換する酸加水分解工程と、
酸加水分解工程で得られた糖化合物を、アルデヒド基もしくはケトン基を標識する標識化合物、又は水酸基を標識する標識化合物により標識する標識工程と
を含むことを特徴とする前記方法。 - N-グリコシルアミンを有する糖化合物の質量分析計による分析方法であって、
前記糖化合物中の水酸基及びアミノ基をメチル化するメチル化工程と、
メチル化工程で得られた糖化合物の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基のみを選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換する酸加水分解工程と、
酸加水分解工程で得られた糖化合物を、アルデヒド基もしくはケトン基を標識する標識化合物、又は水酸基を標識する標識化合物により標識する標識工程と
標識工程により得られた標識化糖化合物を質量分析計により分析する工程と、
を含むことを特徴とする前記方法。 - 糖タンパク質のN-結合型糖鎖の分析方法であって、
糖タンパク質からN-結合型糖鎖を、還元末端にN-グリコシルアミンを有する糖鎖として遊離させる遊離工程と、
遊離された糖鎖中の水酸基及びアミノ基をメチル化するメチル化工程と、
メチル化工程で得られた糖鎖の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基のみを選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基に変換する酸加水分解工程と、
酸加水分解工程で得られた糖鎖を、アルデヒド基を標識する標識化合物、又は水酸基を標識する標識化合物により標識する標識工程と
標識工程により得られた標識化糖鎖を質量分析計により分析する工程と、
を含むことを特徴とする前記方法。 - 糖化合物の質量分析計による分析方法であって、
糖化合物をN-グリコシルアミンを有する糖化合物に変換するアミノ化工程と、
アミノ化工程で得られたN-グリコシルアミンを有する糖化合物中の水酸基及びアミノ基をメチル化するメチル化工程と、
メチル化工程で得られた糖化合物の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基のみを選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換する酸加水分解工程と、
酸加水分解工程で得られた糖化合物を、アルデヒド基もしくはケトン基を標識する標識化合物、又は水酸基を標識する標識化合物により標識する標識工程と
標識工程により得られた標識化糖化合物を質量分析計により分析する工程と、
を含むことを特徴とする前記方法。 - N-グリコシルアミンを有する糖化合物中の水酸基及びアミノ基をメチル化することができるメチル化試薬と、
N-グリコシルアミンを有する糖化合物の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基のみを選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換することができる酸加水分解試薬と、
アルデヒド基もしくはケトン基、又は水酸基を標識する質量分析用増感剤と
を少なくとも備える、質量分析法におけるN-グリコシルアミンを有する糖化合物の糖鎖高感度検出用キット。 - 糖タンパク質からN-結合型糖鎖を、還元末端にN-グリコシルアミンを有する糖鎖として遊離させるための酵素と、
還元末端にN-グリコシルアミンを有する前記糖鎖中の水酸基及びアミノ基をメチル化することができるメチル化試薬と、
還元末端にN-グリコシルアミンを有する前記糖鎖の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基のみを選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基に変換することができる酸加水分解試薬と、
アルデヒド基を標識する標識用試薬、又は水酸基を標識する標識化合物と
を少なくとも備える、質量分析法における糖タンパク質の糖鎖高感度検出用キット。 - 糖化合物をN-グリコシルアミンを有する糖化合物に変換させるための試薬と、
N-グリコシルアミンを有する糖化合物中の水酸基及びアミノ基をメチル化することができるメチル化試薬と、
N-グリコシルアミンを有する糖化合物の還元末端のアノマー炭素に結合したメチル化されたアミノ基のみを選択的に酸加水分解してヘミアセタール水酸基又はヘミケタール水酸基に変換することができる酸加水分解試薬と、
アルデヒド基もしくはケトン基、又は水酸基を標識する質量分析用増感剤と
を少なくとも備える、質量分析法における糖化合物の糖鎖高感度検出用キット。
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