WO2006109858A1

WO2006109858A1 - 糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法、糖鎖の質量分析法、及び糖タンパク質の質量分析法

Info

Publication number: WO2006109858A1
Application number: PCT/JP2006/307872
Authority: WO
Inventors: Satoshi Kimura; Akihiko Kameyama; Hisashi Narimatsu
Original assignee: Shimadzu Corporation; National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Priority date: 2005-04-13
Filing date: 2006-04-07
Publication date: 2006-10-19
Also published as: JPWO2006109858A1; TW200720437A; US20090057549A1

Abstract

膜に固相化された糖タンパク質を直接膜上でMALDI-TOF　MS分析するための、糖遊離酵素による膜上酵素反応方法:膜に固相化された糖タンパク質から切り出した糖を直接膜上でMALDI-TOF　MS分析するための糖の質量分析法:及び、膜に固相化された糖タンパク質を直接膜上でMALDI-TOF　MS分析するための糖タンパク質の質量分析法を提供する。支持体上に固相化された糖タンパク質に対し、糖鎖遊離酵素溶液を分注して糖鎖の切り出しを行い、切り出された糖鎖を得る方法であって、前記糖鎖遊離酵素溶液は、糖鎖遊離酵素を、実質的に揮発性成分からなる反応緩衝溶液中に含む溶液である、糖鎖の切り出し法。前記糖鎖の切り出し法を用いた、糖鎖の質量分析法及び糖タンパク質の質量分析法。

Description

明細書糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法、糖鎖の質量分析法、及び糖タンパク質の質量分析法技術分野

本発明は、糖タンパク質の構造解析法に関する。特に、本発明は、支持体上に固相化された糖タンパク質を、質量分析法により構造解析を行う方法に関する。背景技術

生体タンパク質は、その半数以上が糖鎖修飾を受けている。そのため、機能や疾患における変異を考慮したタンパク質構造解析においては、タンパク質本体と修飾糖鎖の両方を解析する必要がある。従来の糖タンパク質の解析法では、 2D— PAGEでの糖タンパク質を分離、糖タンパク質スポッ卜の切り出し、チューブ内での糖タンパク質のぺプチド消化又は糖鎖の切リ出し、ぺプチド消化物及び切リ出した糖鎖それぞれのカラムなどによる分離■精製、及び MS解析を基盤とした構造解析が行われる。

—方、最近では、国際公開第 98/47006号パンフレツトゃモレキュラー■ アンド■セルラー 'プロテオミクス、第 1巻、 2002年、 p. 490-499 において、 2 D— PAGE後に PVDF膜へ転写固定したタンパク質に対して、ピエゾ素子等のィンクジエツト技術を用いた微量分注装置による卜リプシンの微量分注、膜上酵素反応、マトリックスの分注を行い、直接膜上で MALD I— TOF—MS解析によるペプチド解析を行う、といった、微量分注テクノロジーによる一連の解析法力《報告されている。そして、上記の微量分注テクノロジーの応用例として、モレキュラー 'アンド -セルラー.プロテオミクス、第 1巻、 2002年、 p. 490— 499においては、以下のような糖タンパク質の構造解析を行っている。すなわち、 PVDF膜に転写固定された糖タンパク質に対しても同様に、電気泳動による展開、 Ro c h e社製のぺプチドー N—グリコシダーゼ F (PNGa s e F)のタンパク質スポッ卜へのプリントを行うことによる酵素反応、 1 μ Lの純水を用いたスポット中の Ν—グリカンの手動抽出、及び、 LC-ES I MSでの糖鎖解析を行っている。一方、糖鎖を抽出したタンパク質スポッ卜に対して純水を用いた洗浄（残存 PNGa s e Fの除去のため)、同スポッ卜へトリプシンの分注を行うことによる膜上酵素消化反応、マトリックスの分注を行い、直接ペプチド解析を行っている。このように、糖タンパク質の構造解析を行っている。特許文献 1 ：国際公開第 98/47006号パンフレツ卜

非特許文献 1 ：モレキュラー 'アンド 'セルラ一 ·プロテオミクス（Mo I e c u l a r &. C e l l u l a r P r o t e om i c s 、 ¾ 1 、 20

02年、 p. 490-499

発明の開示

発明の目的

上記微量分注テクノロジ一によるタンパク質の解析法では、一連の操作を膜上で行い、ケミカルプリンタ手法の有効性を報告している。

しかしながら、上記微量分注テクノ口ジーを応用した糖タンパク質の解析法では、糖鎖解析の際、 P VD F膜に存在する N—グリカンを水を用いて手動で抽出し、その抽出物を LC一 ES I MSで測定しているように、消化物の抽出や精製といった複雑な作業を伴う。このため、ケミカルプリンタを用いることのスループット性を生かしきれていない。また、上記方法においては、 PNGa s e F処理の際、 1 00mMリン酸ナトリウム緩衝溶液、 25mM EDTA、 p H 7. 2で緩衝された 5 unit// L濃度の酵素溶液を 50 O n Lプリントしている。酵素反応溶液に多量に含まれる EDT Aは、質量分析において糖鎖と重なる強いピークを生じることと、マトリックスの結晶化を妨げることとを考慮し、膜上での直接 MALD I— TO F— MS解析を行うことは困難である。このため、 LC一 ES I MS解析法を採用し、 EDTAを糖鎖からカラムで L C分離することによって、 MS解析を達成している。市販の PNGa s β F (Ro c h e社、タカラ社などから購入可能）では全てに前記と同様の緩衝溶液が含まれている。そこで PNGa s e Fの酵素反応を阻害せず、かつ MALD I -TOF MSに影響を与えることのない膜上酵素反応の条件を開発する必要がある。そこで本発明の目的は、膜に固相化された糖タンパク質を直接膜上で M A L D I一 TO F MS分析するための、糖鎖遊離酵素による膜上酵素反応方法；膜に固相化された糖タンパク質から切り出した糖鎖を直接膜上で MA LD I— TO F MS分析するための糖鎖の質量分析法：及び、膜に固相化された糖タンパク質を直接膜上で MA L D I -TO F MS分析するための糖タンパク質の質量分析法を提供することにある。

発明の概要

本発明者は、実質的に揮発性成分からなる反応緩衝溶液を用いることによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、以下の発明を含む。 < 1 > 支持体上に固相化された糖タンパク質に対して、糖鎖遊離酵素溶液を分注して糖鎖の切り出しを行い、切り出された糖鎖を得る方法であって、

前記糖鎖遊離酵素溶液は、実質的に揮発性成分からなる緩衝剤を含む反応緩衝溶液中に、糖鎖遊離酵素を含む溶液である、糖鎖の切り出し法。

<2> 前記糖鎖遊離酵素が、 N—グリカナーゼ又はグリコべプチダーゼ Aである、 <1 >に記載の糖鎖の切り出し法。

<3> 前記反応緩衝溶液が、（NH₄)HC0₃緩衝溶液、 CH₃CQ₂NH₄緩衝溶液、 (NH₄)₂C0₃緩衝溶液、及び N(CH₃CH₂)₃緩衝溶液から選ばれる、く 1 >又はく 2 >に記載の切り出し法。

<4> 前記固相化された糖タンパク質は、前記耱鎖遊離酵素以外のエンドグリコシダーゼ又はェキソグリコシダ一ゼによって処理されている、 < 1 >〜<3> のいずれかに記載の糖鎖の切リ出し法。

<5> < 1 >~< 4 >のいずれかに記載の方法によって得られた前記切り出された糖鎖を、同一支持体上で MALD I (マトリックス支援レーザ一脱離イオン化）質量分析により検出する、糖鎖の質量分析法。

<6> (1 ) < 1 >〜< 4 >のいずれかに記載の方法によって前記切り出された糖鎖を得る工程、

(2) 前記固相化された糖タンパク質に対して、タンパク質分解酵素溶液を分注してペプチドの断片化を行い、ペプチド断片を得る工程、及び

(3) 前記（1 ) で得られた前記切り出された糖鎖と前記（2) で得られたぺプチド断片とを、同一支持体上で MA LD I (マトリックス支援レーザー脱離ィオン化）質量分析により検出する工程を含む、糖タンパク質の質量分析法。本発明によると、膜に固相化された糖タンパク質を直接膜上で MA L D I— T OF MS分析することができる糖鎖遊離酵素による膜上酵素反応方法；膜に固相化された糖タンパク質から切り出した糖鎖を直接膜上で MA LD I— TO F MS分析することができる糖鎖の質量分析法；及び、膜に固相化された糖タンパク質を直接膜上で M A L D I -TO F MS分析することができる糖タンパク質の質量分析法を提供することができる。本発明によると、支持体上に固相化された糖タンパク質を直接質量分析に供することができ、糖鎖の抽出■精製の手間を省くことができるため、スループット性の高い質量分析法を提供することができる。図面の簡単な説明

図 1は、タンパク質スポッ卜への PNGa s e F溶液及びトリプシン

(Trypsin) 溶液のプリン小イメージである。

図 2は、ォバルブミンに対する PNGa s e Fのプリントで得られた糖鎖のマススぺクトル（a)、及び、 GlycoMod Searchによる N—グリカン（N-glycan) の同定結果（b) である。

図 3は、ォバルブミンに対するトリプシンのプリン卜で得られたぺプチド断片のマススぺクトル（a)、及び、 Mascot Searchによるタンパク質の同定結果（ b ) である。

図 4は、トランスフェリンに対する PNGa s e Fのプリントで得られた糖鎖のマススペクトル（a)、及び、 GlycoMod Searchによる N—グリカン

(N-glycan) の同定結果（b) である。

図 5は、トランスフェリンに対するトリプシンのプリントで得られたぺプチド断片のマススぺクトル（a)、及び、 Mascot Searchによるタンパク質の同定結果（b) である。 .

図 6は、フエツインに対する P N G a s e Fのプリン卜で得られた糖鎖のマススぺクトルである。図 7は、シァリダ一ゼ処理を行ったフ Iツインに対する P N G a s e Fのプリントで得られた糖鎖のマススぺクトル（a )、及び、 GlycoMod Searchによる N—グリカン（N-glycan) の同定結果（b ) である。発明を実施するための形態

<糖鎖の切り出し法 >

本発明の糖鎖の切リ出し法では、支持体上に固相化された糖タンパク質の糖鎖の切り出しを行う。本発明の糖鎖の切り出し法は、切り出した糖鎖を直接膜上で質量分析する場合に特に有用に用いられる。支持体には、メンブレン、プレート、非磁性粒子、磁性粒子等から選ばれる少なくとも 1つが用いられる。メンブレンを用いる場合、糖タンパク質は、電気的にメンブレンに転写させて使用することができる。メンブレンとしては、ポリビニリデンジフルオリド（P V D F )、二トロセルロース、ポリアミド、ポリエチレン等の有機合成高分子及びその誘導体を挙げることができる。ポリアミドとしては、ナイロン等が挙げられる。プレートとしては、ガラス製プレート、樹脂製プレート、金属製プレート等が挙げられる、このようなプレートを用いる場合は、糖タンパク質を含む試料の電気泳動後のゲルや、糖タンパク質が転写されたメンブレンを、プレートの表面に接触させて使用することができる。本発明の糖鎖切り出し法が質量分析のために用いられる場合は、前記支持体には好ましくは金属製プレー例えば質量分析用サンプルプレー卜が用いられる。支持体として質量分析用サンプルプレートを用いた場合は、糖鎖切り出し後、同一支持体上で質量分析が可能となる点で好ましい。このとき、質量分析用サンプルプレート上に固相化された糖タンパク質は、糖タンパク質を含む試料を電気泳動したゲルと、質量分析用サンプルプレートとを接触させて得たものとすることができる。また、質量分析用サンプルプレートに、糖タンパク質を（電気泳動後のゲル等から）メンブレンに転写したものを貼り付ける等行うことによって固着させて得たものであっても良い。なお固着には導電性両面粘着テープ等を用いた固定を行うと良い。さらに、非磁性粒子を用いた支持体としては、ポリサッカライドゲルや合成ポリマー等を用いた支持体が用いられる。磁性粒子を用いた支持体としては、電気泳動後の被転写支持体としての支持体の基本構造に通電性の磁性金属を使用したもの等が用いられる。本発明において、支持体上に固相化された糖タンパク質の好ましい例としては、糖タンパク質を含む試料を電気泳動展開した後、 P V D F膜への転写を行い、転写された P V D F膜を質量分析用サンプルプレー卜に固着させたものが挙げられる。糖鎖遊離酵素としては特に限定はなく、例えば、ペプチド N—グリカナ一ゼゃグリコべプチダーゼ Aなどを用いることができる。前記糖鎖遊離酵素は、以下の条件を満たす反応緩衝溶液中に含まれた、糖鎖遊離酵素溶液として用いる。糖鎖遊離酵素溶液中の糖鎖遊離酵素の濃度としては特に限定されず、 1つの分注領域に所望の酵素量を含ませることができるように、当業者が適宜決定すればよい。例えば、 1つの分注領域に 5マイクロ Unitsの酵素量が含まれるようにする場合、分注量を 5 O nlとすれば、酵素溶液は 1 0 O mUnits/ml濃度に調製すればよい。本発明の反応緩衝溶液は、切り出した糖鎖を直接膜上で M A L D I質量分析する場合に、糖鎖のイオン化を妨げる成分、及び、マススぺクトル上で糖鎖由来ピ —クの検出を妨げる成分を実質的に含まない。糖鎖のイオン化を妨げる成分としては、リン酸ナトリゥ厶ゃリン酸カリゥムなどが挙げられる。これらの塩は通常緩衝剤として用いられることの多い成分であるが、不揮発性であるため、膜上に残存する。このため、膜上でのマトリックスの結晶化が阻害され、糖鎖のイオン化が妨げられる。さらに、界面活性剤も同様に糖鎖のイオン化を妨げる成分である。マススぺクトル上で糖鎖由来のピークの検出を妨げる成分としては、 E D T A や界面活性剤などが挙げられる。緩衝溶液中にこのような成分、例えば E D T A や界面活性剤を含んでいると、マススぺクトルにおいて強い E D T Aや界面活性剤のピークが検出され、一方で、糖鎖由来のピークはノイズに埋まってしまい、検出できなくなる。このため、糖鎖由来のピークの検出が妨げられる。従って、本発明の反応緩衝溶液には、緩衝剤として実質的に上記のような成分を含まない。すなわち、本発明の反応緩衝溶液に用いられる緩衝剤は、実質的に揮発性物質から選ばれる。ここで、実質的に上記のような成分を含まないとは、上記の成分が、糖鎖のイオン化を妨げない程度、又は糖鎖由来のピークの検出を妨げない程度に含まれることを許容するという意味である。例えば、糖鎖のィォン化を妨げる成分については、 1つの分注領域に含まれるトータル量として、例えばリン酸緩衝液の緩衝剤であれば 2 5 pico moleまで、 T r i s - H C I緩衝液の緩衝剤であれば 1 pico moleまでの微量が許容される。また、糖鎖由来のピークの検出を妨げる成分については、 1つの分注領域に含まれるトータル量として、例えば E D T Aや界面活性剤であれば 0 . 5 pico moleまでの微量が許容される。これら以外の不揮発性成分の許容量も、適宜定めることができる。このように、本発明の反応緩衝溶液は不揮発性成分をある程度含むことを許容するが、このような成分を全く含まない、揮発性成分のみからなる反応緩衝溶液であることが好ましい。実質的に揮発性物零からなる緩衝剤を含む本発明の反応緩衝溶液は、例えば、揮発性の弱酸一揮発性の共役塩基や、揮発性の弱塩基一揮発性の共役酸といった緩衝系を有する。本発明における揮発性とは、 0 . 1パスカル程度の減圧（平均的なロータリーポンプによる減圧に相当する）下において、室温（2 0〜3 7 °C)、 3 0分〜一昼夜で完全に気化する性質をいう。反対に、本発明における不揮発性とは、上記条件下において個体又は液体で存在する性質をいう。本発明の緩衝溶液は、以下の成分を含む。揮発性弱酸の成分としては、ギ酸、乳酸、グリコール酸、安息香酸、酢酸、プロピオン酸、ホウ酸等から 1種又は複数種が選ばれ：揮発性弱塩基の成分としては、アンモニア、メチルァミン、ジメチルァミン、トリメチルァミン、ァニリン、ピリジン等から 1種又は複数種が選ばれ；揮発性塩の成分としては、アンモニゥムイオン、ピリジニゥムイオン等；及び、炭酸水素イオン、酢酸イオン、フエノラ一卜イオン、ホウ酸イオン、安息香酸イオン等から 1種又は複数種が選ばれる。これらの成分を適宜組み合わせ、糖鎖遊離酵素の反応至適 p Hに調整する。具体的な p Hとして、 7〜9、好ましくは 8 ~ 9に調製することができる。本発明の反応緩衝溶液は具体的には、（NH₄)HC0₃緩衝溶液、 CH₃C0₂NH₄緩衝溶液、（NH₄)₂C0₃緩衝溶液、 N(CH₃CH₂)₃を用いた緩衝溶液等から選ばれる。ここに挙げた緩衝溶液は、 1種又は複数種を混合して用いても良い。本発明で用いる反応緩衝溶液の濃度としては、 1 0〜5 0 m M程度、例えば 2 5 m M程度が好ましい。例えば、本発明において、市販の N—グリカナーゼを用いる場合は、以下の操作を行う。市販の N—グリカナーゼ（例えばタカラ社製 P N G a s e F ) は、 E D T A、リン酸ナトリウムを含んでいる。これらを限外濾過法などによって除去し、本発明の反応緩衝溶液、例えば 2 5 m M重炭酸アンモニゥ厶に交換した糖鎖遊離酵素溶液として用いる。このような糖鎖遊離酵素溶液を支持体上に滴下するために、微量分注装置を用いることができる、微量分注装置としては、インクジ Xット法において用いられるような、ピエゾ素子などを搭載した装置を用いることができる。このような装置としては、ケミカルプリンタ C H I P— 1 0 0 0 (島津製作所製）などが挙げられる。本発明において微量分注装置を用いると、一個のインクジヱット吐出部から 1 回の分注操作につき添加される液量を、例えば 1 0 0 p I程度に制御することができる。インクジェットの機構によっては、これよりさらに少ない量に制御することもできる。また、吐出を繰り返すことによって所望の液量を滴下することも可能である。特定の 1つの領域に対しては、例えばナノリツトルレベルの液量を分注することができる。また、微量分注装置を用いることによって、例えば 1 0 0 p I程度の吐出によつて 7 8 0 0 m ²程度の極小の分注範囲を生じる。この分注範囲は、インクジエツ卜の機構によってさらに小さい範囲に限局することもできる。従って、支持体上のターゲットとなる位置に性格に滴下を行うことが可能になる。本発明においては、具体的には、直径 0 . 5 m mよりも小さい分注範囲であることが好ましい。直径 0 . 5 mmよりも小さい分注範囲は、一個のプロテインスポットの約 2 0 %よりも小さい面積を占める程度の微小な領域である。さらに、インクジエツ卜吐出部の支持体上の相対位置を変えることにより分注位置をずらしていくことができるため、支持体上の異なるタンパク質スポッ卜について溶液を分注することもできる。なお、糖鎖遊離酵素溶液に限らず、後に記載する他の酵素溶液、親水化剤溶液、水、マトリックス溶液など、支持体上へ滴下される溶液は全て、この微量分注装置を用いて分注することができる。具体的には、分注する糖鎖遊離酵素溶液の量としては、展開に供した糖タンパク質の量にも依るが、 1つ分注領域あたり、 5マイクロ unitsより多くの、好ましくは 2 5マイクロ units以上の、例えば 2 5マイクロ unitsの糖鎖遊離酵素が含まれるように調節すると良い。このような量で、十分な酵素反応を起こすことができ、質量分析での検出ピークにおける 1 0 0 0ショッ卜の積算スぺクトルからは、 S/N比が良好に得られ、ノイズも少ない。糖鎖遊離酵素溶液の分注量の上限値としては特に限定されない。例えば、 5 0マイクロ unitsの糖鎖遊離酵素量でも、 2 5マイクロ unitsの糖鎖遊離酵素量のときとほとんど差がないくらいの上記の良好な結果が得られる。このように、糖鎖遊離酵素量を多くしてもマススぺクトルのノイズや S / N比において特に変化することはないため、分注量は当業者が適宜決定することができる。反対に、 5マイクロ units以下の糖鎖遊離酵素量では、質量分析で得られるスぺクトルにおいてノイズが高い結果になる。また、タンパク質スポットの親水化処理剤としては、 n—ォクチルー一 D—グルコピラノシドやポリビニルピロリドンを用いることができる。このうち、ポリビニルビロリドンは、安定して糖鎖切り出しの反応が起こり、再現性も高いことから好ましい。ポリビニルピロリドンとしては、ポリビニルピロリドン 3 6 0からポリビニルピロリドン 4 0の分子量のものを広く用いることができ、このような分子量のポリビニルピロリドンはどのようなものでも同様の良好な反応効果が得られる。親水化処理剤は、上述の緩衝溶液や揮発性有機溶媒に溶解して使用することができる。揮発性有機溶媒を用いる場合は、例えばメタノールを用いることができ、例えば 6 0 0/6 (v/v) 程度の水溶液として用いることができる。親水化処理剤の濃度としては、例えば、 0 . 1 ~ 5 (w/v) %で用いることができる。ポリビニルビロリドンの場合であれば、 0 . 2 5 (w/v) %程度を用いると良い。親水化処理剤溶液の使用量は、当業者が適宜決定すればよい。糖鎖の切り出し反応の条件としては、通常の条件を用いればよい。例えば、 2 0〜3 7 °Cで 3 0分〜一晚（例えば 1 7時間）反応させればよい。ここで、本発明の支持体上に固相化された糖タンパク質は、糖鎖遊離酵素による糖鎖切り出しの前に、予めエンドグリコシダ一ゼ処理又はェキソグリコシダ一ゼ処理が行われたものでも良い。なお、このように前処理として行われる場合に用いられるエンドグリコシダ一ゼは、前記の糖鎖遊離酵素とは異なるものである。例えば、酸性糖鎖を有する糖鎖については、上記エンドグリコシダ一ゼ処理又はェキソグリコシダ一ゼ処理を行ったほうが良い場合がある。酸性糖鎖は、そのマイナスチャージのためにポジティブモードの質量分析では検出が難しいものがある。そして、そのような酸性糖鎖は、ネガティブモードで質量分析しても検出のためには多量のサンプルが必要となることがある。そのような酸性糖鎖の場合は、上記エンドグリコシダーゼ処理又はェキソグリコシダーゼ処理を行うことが好ましい。この処理は、エンドグリコシダーゼ又はェキソグリコシダーゼを反応緩衝溶液中に含むグリコシダーゼ溶液を分注して酸性糖を加水分解することによって行われる。グリコシダーゼ溶液に用いられる反応緩衝溶液としては、上記の糖鎖の切リ出しで用いられるものと同じ条件を満たす反応緩衝溶液をグリコシダーゼの至適 p Hで用いてもよいし、通常用いられる反応緩衝溶液（すなわち、 E D T Aやリン酸塩を含む緩衝溶液）を用いても良い。例えば、ェンドグリコシダ一ゼ処理又はェキソグリコシダ一ゼ処理によって切断した糖鎖断片を、後に同一支持体上で質量分析する場合は、上記の糖鎖の切り出しで用いられるのと同じ条件を満たす反応緩衝溶液を用いる。

—方、ェンドグリコシダーゼ処理又はェキソグリコシダ一ゼ処理によって切断した糖鎖断片を、後に同一支持体上で質量分析しない場合は、通常の緩衝溶液を用いることができる。この場合は、グリコシダーゼ反応の後、水洗浄を行って、糖鎖断片を除去する。水洗浄においては、例えば 5分の水洗浄を 3回程度行うと良い。ェンドグリコシダーゼ処理又はェキソグリコシダ一ゼ処理の条件としては、通常の条件を用いればよい。例えば、 2 0 ~ 3 7 °Cで 3 0分〜一晚（例えば 1 7時間）反応させればよい。酸性糖としては代表的なものにシアル酸が挙げられる。シアル酸を有する糖鎖を含む糖タンパク質としては、フェツイン、トランスフェリン、 α 1—酸性糖タンパク質などが挙げられる。例えば、フェツインの N— glycanは 2本鎖と 3本鎖が知られており、多くの場合、糖鎖の末端全てにシァル酸が結合している。このように、フェツインは酸性を示すことから、質量分析においてポジティブモードでの検出を行うことが難しい。ネガティブモードでの検出を行うことも可能であるが、感度を高めるために多量のサンプルを用意することが必要な場合もある。そこで、フェツインの場合はシァリダーゼ処理を行うことが好ましい。シァリダ一ゼ処理については、シァリダーゼの活性が高いこと力、ら、ごく少量の滴下量を用いればよし、。例えば、 0. 1 %(v/v) 酢酸水溶液中に 0. 2 5 munitsのシァリダーゼを含むシァリダーゼ溶液を用いることができる。これによつて、糖鎖末端のシアル酸が加水分解される。遊離したシアル酸は検出をする必要がないため、水で洗浄することにより除去すると良い。この処理によって、後の質量分析が容易になる。 1酸性糖タンパク質については、シァル酸が結合している糖鎖が限定されているため、'シァリダーゼ処理無しでも検出できることがある。また、シアル酸が結合していてもその数は 1個である。 1個シアル酸が結合している程度の糖鎖であれば、シァリダ一ゼ処理無しでも質量分析でィォン化させることはあまり難しいことではない。従って、 a 1酸性糖タンパク質の場合は、シァリダーゼ処理は行っても良いし、行わなくとも良い。その必要性については、当業者が適宜決定すればよい。また、トランスフェリンについても、シァリダーゼ処理なしでも検出が可能である。従って、トランスフェリンについてもシァリダーゼ処理は行っても良いし、行わなくとも良い。その必要性については、当業者が適宜決定すればよい。

<糖鎖の質量分法 >

本発明の糖鎖の質量分析法では、上述の糖鎖切リ出し法を用いる。すなわち、まず、支持体上に固相化された糖タンパク質に対して、上述の方法を行うことによって切り出された糖鎖を得る。次に、切り出された糖鎖について同一支持体上で M A L D I質量分析を行う。使用するマトリックス、マトリックスを溶解させるための溶媒、マトリックス濃度などについては、当業者が適宜決定することができる。糖鎖の加水分解を避けるため、 T F Aを含まない溶媒を用いることが好ましい。具体例としては、 2 5 <½ァセトニトリル水溶液を用いた 1 O m g/m I濃度の 2 , 5— D H Bなどが挙げられる。マトリックス溶液は、すでに述べたような微量分注装置を用い、切り出しのための糖鎖遊離酵素などを滴下した位置と同じ位置に対して滴下する。マトリックス溶液を乾燥させた後、 M A L D I質量分析装置によって測定を行い、糖鎖の同定を行う。本発明の糖鎖の質量分析法では、糖鎖の切り出しの工程において、すでに述べたような実質的に揮発性物質からなる反応緩衝溶液を用いたことで、イオン化が妨げられることなく、且つ糖鎖由来のピークの検出が妨げられることもない。このため、糖鎖の切り出しを行ったときと同一の支持体上で直接 M A L D I質量分析が可能となった。なお、得られるマススぺクトルにおいては、ペプチドに由来するシグナルは検出されない。ぐ糖タンパク質の質量分析法 >

本発明の糖タンパク質の質量分析法では、上述の糖鎖の切リ出し法を用いる。

すなわち、まず、支持体上に固相化された糖タンパク質に対して、上述の方法を行うことによって切り出された糖鎖を得る。

—方で、支持体上に固相化された糖タンパク質について、タンパク質分解酵素溶液を滴下することによってペプチド断片を得る。このとき、糖鎖の質量分析の対象として用いたタンパク質のスポッ卜と同じスポット内であって、前記の糖鎖切り出しのための糖鎖遊離酵素溶液を分注した位置と異なる位置に、タンパク質消化酵素を分注する。消化の条^^としては、特に限定することなく、当業者が適宜決定することができる。糖鎖切り出しを行った位置と、タンパク質消化を行った位置とに、すでに述べたようなマトリックス溶液を滴下し、乾燥させる。切り出された糖鎖について、 M A L D I質量分析装置によって測定を行い、糖鎖の同定を行う。ぺプチドについても M A L D I質量分析装置によって測定を行い、 P M F分析によリぺプチドの同定を行う。本発明の糖タンパク質の質量分析法では、糖鎖の切り出しの工程において、すでに述ベたような実質的に揮発性物質からなる反応緩衝溶液を用いたことで、糖鎖の質量分析においては、イオン化が妨げられることなく、且つ糖鎖由来のピークの検出が妨げられることもない。このため、糖鎖の切り出しを行ったときと同一の支持体上で直接 M A L D I質量分析が可能となった。なお、得られる糖鎖のマズスぺクトルにおいては、ぺプチドに由来するシグナルは検出されない。なお、本発明において質量分析を行う場合は、 M S及び M S/M S以上の多段階 M S を行うこと力できる。多段階 M Sを行う場合は、試料量などを当業者が適宜調節することによって行えばよい。実施例

以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

<実験例 1〉

標準糖タンパク質 4種（ォバルブミン、アジア口フェツイン、トランスフェリン、 1一酸性糖タンパク）のそれぞれ 4 O p m o Iを、 1次元の電気泳動（S D S— P A G E) によってゲル上に展開した。分離された各糖タンパク質を、ゲルから PVDF支持体上に電気的に転写した。 D i r e c t B l u e 71を用いて染色を行った後、両面導電テープを用いてメンブレンを MALD I一 TO Fターゲットプレートに直接貼リ付けた。このようにして、メンブレン上に固相化された各糖タンパク質を得た。

PNGa s e F (タカラ社製）を限外ろ過し、緩衝溶液を 25 m M重炭酸アンモニゥ厶水溶液と交換し、 PNG a s e F溶液を得た。別途トリプシン溶液を用意した。 PNG a s e F溶液とトリプシン溶液とを、メンブレン上に固相化された各糖タンパク質スポットへ、 CH I P— 1 000 (島津製作所製）を用いてプリント（分注）した。プリント後のメンブレンにおいて、 1一酸性糖タンパク（ 1 -AGP) 及びォバルブミンのスポット部分を拡大したものを図 1に示す。 PN G a s e F溶液とトリプシン溶液とを重ならないようにプリントすることによつて、図 1のように、 1つのタンパク質スポットにっき、 2つの PNG a s e F溶液のプリント領域と 2つのトリプシン溶液のプリント領域を得た。全てのプリン卜領域は、直径 0. 5mm以下にコントロールした。マトリックス溶液（1 0mg/mし 2, 5— DHB) を、各プリント位置（糖鎖切り出し位置及びペプチド消化位置）へ重ねてプリントした。乾燥後、膜上で直接 MA L D I— Q I T— TO F質量分析装置 A X I MA-Q I T (島津製作所製）を用いて分析を行った。本実施例で得られたマススぺクトルのうち、ォバルブミンに対する PNG a s e Fのプリントで得られた糖鎖のマススペクトルを図 2 (a) に示す。また、図 2 (a) のマススペクトル中 *印でマークしたピーク（(m/z)=1257.5, 1419.6, 1 663.7, 1745.8, 1866.8) Iこっしゝての GlycoMod Search (http://au.expasy.org/too ls/glycomod/) による同定結果を図 2 (b) に示す。ォバルブミンに対するトリプシンのプリントで得られたぺプチド断片のマススぺクトルを図 3 (a) に示す。また、図 3 (a) のマススぺクトル中 *印でマークしたピークについての Mascot Search

(http://www.matrixscience.com/search_form_select.html)によるタンパク質の同定結果を図 3 (b) に示す。図 3 (b) が示すように、最も高いスコアでォバルブミン（Ovalbumin(chiken)；矢印）がヒットした。トランスフェリンに対する PNG a s e Fのプリン卜で得られた糖鎖のマススベクトルを図 4 (a) に示す。また、図 4 (a) のマススペクトル中 *印でマークしたピーク（(m/z)=1663.7， 1976.9, 2289.9) についての GlycoMod Searchによる同定結果を図 4 (b) に示す。トランスフェリンに対するトリプシンのプリン卜で得られたぺプチド断片のマススペクトルを図 5 (a) に示す。また、図 5 (a) の Mascot Searchによるタンパク質の同定結果を図 5 (b) に示す。図 5 (b) が示すように、最も高いスコアでトランスフェリン（transferrin(human)；矢印）がヒットした。このように、全ての糖タンパク質について、糖部分は既報で示された N—グリカンが検出され、タンパク質部分は高スコアで同定が確認された。

ぐ実施例 2 >

まず、シアル酸を有するフェツイン 40 pmo Iを用い、実施例 1と同様にして糖鎖について質量分析を行った。得られたマススペクトルを図 6に示す。図 6 が示すように、パックグラウンドノイズのみで、糖鎖のシグナルは得られなかつた。次に、シアル酸を有するフェツイン 40 pmo I を用い、シァリダーゼ（ノィラミニダーゼ、ナカライテクス社製）（0. 25 mユニット量、 0. 1%酢酸水溶液）をプリン卜してシアル酸を切断する反応を行し、、メンブレンを純水で洗浄（5分 X 3回 ) し、乾燥させ、その後に PNGa s e F処理を行った以外は、実施例 1と同様に行つて糖鎖について質量分析を行った。得られたマススぺクトルを図 7 (a) に示す。また、図 7 (a) のマススぺクトル中 *印でマークしたピーク（(m/z)= 1663.7, 2028. 9) についての GlycoMod Searchによる同定結果を図 7 (b) に示す。図 7 (b) が示すように、シアル酸を切断することによって糖鎖由来のシグナルを得ることができた。上記実施例においては、ォバルブミン、ァシァ口フェツイン、トランスフェリン、 1—酸性糖タンパク、及びフェツインを解析すべき糖タンパク質とし、糖鎖遊離酵素として N—グリカナーゼを、反応緩衝溶液として重炭酸アンモニゥム水溶液を用いて解析を行った。しかし、本発明は、上記以外の糖タンパク質、 N ーグリカナーゼ以外の糖鎖遊離酵素、及び、重炭酸アンモニゥム水溶液以外の反応緩衝溶液にも適用される。そのため、これら実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、特許請求の範囲の均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範困内のものである。

Claims

請求の範囲

1 . 支持体上に固相化された糖タンパク質に対し、糖鎖遊離酵素溶液を分注して糖鎖の切リ出しを行い、切り出された糖鎖を得る方法であって、

2 . 前記糖鎖遊離酵素が、 N—グリカナーゼ又はグリコべプチダーゼ Aである、請求の範囲第 1項に記載の糖鎖の切り出し法。

3 . 前記反応緩衝溶液が、（NH₄)HC0₃緩衝溶液、 CH₃C0₂NH₄緩衝溶液、 (NH₄)₂C0₃緩衝溶液、及び N(CH₃CH₂)₃緩衝溶液から選ばれる、請求の範囲第 1 項に記載の糖鎖の切り出し法。

4 . 前記固相化された糖タンパク質は、前記糖鎖遊離酵素以外のエンドグリコシダーゼ又はェキソグリコシダーゼによって処理されている、請求の範囲第 1項に記載の糖鎖の切リ出し法。

5 . 請求の範囲第 1 ~ 4項のいずれか 1項に記載の方法によって得られた前記切り出された糖鎖を、同一支持体上で M A L D I (マトリックス支援レーザ一脱離イオン化）質量分析により検出する、糖鎖の質量分析法。

6 . ( 1 ) 請求の範囲第 1〜 4項のいずれか 1項に記載の方法によって前記切り出された糖鎖を得る工程、

( 2 ) 前記固相化された糖タンパク質に対して、タンパク質分解酵素溶液を分注してぺプチドの断片化を行い、ぺプチド断片を得る工程、及び (3) 前記（1 ) で得られた前記切り出された糖鎖と前記（2) で得られたぺプチド断片とを、同一支持体上で MA L D I (マトリックス支援レーザー脱離ィオン化）質量分析により検出する工程を含む、糖タンパク質の質量分析法。