JP2020056727A - 分析用試料の調製方法、分析方法および分析用試料の調製用キット - Google Patents
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Abstract
Description
さらに好ましい実施形態では、前記酸性溶液が加えられた後の前記反応溶液のpHは10以下である。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応の前に、前記糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行うことを備える。
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応は、脱水縮合剤を含むラクトン化反応溶液と前記試料とを接触させることにより行われる。
さらに好ましい実施形態では、前記アミド化反応で用いられる前記反応溶液は、アンモニアまたはアミンを含み、前記ラクトン化反応溶液は、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と反応させる求核剤をさらに含み、前記求核剤は、前記アミド化反応で用いられる前記反応溶液に含まれるアンモニアまたはアミンとは異なり、前記ラクトン化反応では、前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、前記シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の一部をラクトン化し、前記シアル酸の他の一部に前記求核剤の少なくとも一部を結合させる。
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応において、α2,3−シアル酸、α2,8−シアル酸、およびα2,9−シアル酸からなる群から選択される少なくとも一つの前記シアル酸がラクトン化される。
さらに好ましい実施形態では、前記ラクトン化反応では、前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、α2,3−シアル酸をラクトン化し、α2,6−シアル酸に前記求核剤の一部を結合させる。
さらに好ましい実施形態では、前記酸性溶液は、0.2重量%以上のトリフルオロ酢酸を含む溶液である。
本発明の好ましい実施形態による分析方法は、上述の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、調製した前記分析用試料を分析することとを備える。
さらに好ましい実施形態では、調製した前記分析用試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される。
本発明の好ましい実施形態による分析用試料の調製用キットは、酸性溶液を備え、上述の分析用試料の調製方法に用いられる。
第1実施形態の分析用試料の調製方法では、試料に含まれる糖鎖に対し、糖鎖に含まれるシアル酸の結合様式(linkage type)に応じた修飾を行う。この修飾は、2段階の反応により行われ、2段階目の反応でシアル酸のアミド化が行われた後、試料に含まれる糖鎖がHILIC用の担体を用いて精製される。
なお、上記ペプチド鎖の切断処理は、後述するステップS1003のラクトン化反応の後に行ってもよい。また、酵素的切断では無く、化学的切断等によりペプチド鎖を切断してもよい。
ステップS1001が終了したら、ステップS1003に進む。
ステップS1003において、試料を反応溶液(以下、ラクトン化反応溶液と呼ぶ)と接触させ、糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行う(以下、ラクトン化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップS1003のラクトン化反応を指す)。ラクトン化反応では、ラクトン化されにくいα2,6−シアル酸等のシアル酸の一部にラクトン化とは異なる修飾をすることが好ましく、以下でも当該修飾を行う例を説明する。ラクトン化反応において、α2,3−シアル酸、α2,8−シアル酸およびα2,9−シアル酸が好適にラクトン化される。
なお、ラクトン化されにくいα2,6−シアル酸等のシアル酸の修飾を行わない場合は、求核剤を含む必要はない。
脱水縮合剤は、カルボジイミドを含むことが好ましい。カルボジイミドを用いると、脱水縮合剤としてホスホニウム系脱水縮合剤(いわゆるBOP試薬)やウロニウム系脱水縮合剤を用いた場合に比べて、立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいからである。カルボジイミドの例としては、N,N’‐ジシクロへキシルカルボジイミド(DCC)、N‐(3‐ジメチルアミノプロピル)‐N’‐エチルカルボジイミド(EDC)、N,N’‐ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)、1‐tert‐ブチル‐3‐エチルカルボジイミド(BEC)、N,N’‐ジ‐tert‐ブチルカルボジイミド、1,3‐ジ‐p‐トルイルカルボジイミド、ビス(2,6‐ジイソプロピルフェニル)カルボジイミド、ビス(トリメチルシリル)カルボジイミド、1,3‐ビス(2,2‐ジメチル‐1,3‐ジオキソラン‐4‐イルメチル)カルボジイミド(BDDC)や、これらの塩が挙げられる。
脱水縮合剤による脱水縮合を促進させ、かつ副反応を抑制するために、カルボジイミドに加えて、求核性の高い添加剤を用いることが好ましい。求核性の高い添加剤としては、1‐ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)、1‐ヒドロキシ‐7‐アザ‐ベンゾトリアゾール(HOAt)、4‐(ジメチルアミノ)ピリジン(DMAP)、2‐シアノ‐2‐(ヒドロキシイミノ)酢酸エチル(CHA)、N‐ヒドロキシ‐スクシンイミド(HOSu)、6‐クロロ‐1‐ヒドロキシ‐ベンゾトリアゾール(Cl-HoBt)、N‐ヒドロキシ‐3,4‐ジヒドロ‐4‐オキソ‐1,2,3‐ベンゾトリアジン(HOOBt)等が好ましく用いられる。
求核剤として用いられるアミンは、炭素原子を2個以上含む第一級または第二級のアルキルアミンを含むことが好ましい。第一級のアルキルアミンは、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、ブチルアミン、sec‐ブチルアミン、tert‐ブチルアミン等が好ましい。第二級アルキルアミンは、ジメチルアミン、エチルメチルアミン、ジエチルアミン、プロピルメチルアミン、イソプロピルメチルアミン等が好ましい。α2,3−シアル酸のカルボキシ基のように立体障害が大きい部位に存在するカルボキシ基がアミド化されにくいようにする観点から、イソプロピルアミンのような分枝アルキル基(以下、「分枝」は炭化水素鎖の分枝を示す)を有するアミンを用いることが好ましい。ラクトン化反応溶液の求核剤にアミンを用いた場合、シアル酸の結合様式に基づいて、α2,6−シアル酸等の一部のシアル酸のカルボキシ基がアミド化される。
なお、求核剤は、上述の求核剤の塩を含んでもよい。
ラクトン化反応溶液の脱水縮合剤の濃度は、例えば、1mM〜5Mが好ましく、10mM〜3Mがより好ましい。カルボジイミドとHOAtやHOBt等の求核性の高い添加剤とを併用する場合は、それぞれの濃度が上記範囲であることが好ましい。ラクトン化反応溶液の求核剤の濃度は、0.01〜20Mが好ましく、0.1M〜10Mがより好ましい。ラクトン化反応の際の反応温度は、−20℃〜100℃程度が好ましく、−10℃〜50℃がより好ましい。試料とラクトン化反応溶液とを接触させる時間は、試料や試薬の濃度、反応温度等に基づいて調整されるが、例えば30分〜数時間程度である。
ラクトン化反応は、液相でも固相でも行うことができる。試料とラクトン化反応溶液とを接触させることができれば、ラクトン化反応を起こす際の試料の状態は特に限定されない。
ステップS1003が終了したら、ステップS1005に進む。
ステップS1005において、試料を、反応溶液(以下、アミド化反応溶液と呼ぶ)と接触させ、ラクトン化反応によりラクトン化されたシアル酸をアミド化するアミド化反応(以下、アミド化反応と記載した場合、特に言及が無い限り、ステップS1005のアミド化反応を指す)が行われる。発明者は、従来行われていた、加水分解によりラクトンを開環してからカルボキシ基をアミド化する技術的な常識とは全く異なり、ラクトンを迅速に直接アミド化する方法を見出した。この反応は無水条件下でも好適に行われるため、加水分解とは異なる反応であり、アミノ基とラクトンとの相互作用に基づくアミノリシスと考えられる。以下では、無水条件下でも可能な、アンモニア、アミンまたはこれらの塩によるラクトンの開環およびアミド化をアミノリシスと呼ぶ。
第2求核剤としてアミンを用いる場合、当該アミンは、第一級アミンが好ましく、直鎖炭化水素基を有する第一級アミンがより好ましく、直鎖アルキル基を有する第一級アミンがさらに好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンは、直鎖アルキル基を有する第一級アミンとしては、炭素数が10以下の第一級アミンが好ましく、炭素数が7以下の第一級アミンがより好ましく、メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミンがさらに好ましく、メチルアミンが最も好ましい。アミド化反応溶液に含まれるアミンが分枝を有しない直鎖状の構造を有していたり、炭素数が少ない方が、より効率的にラクトン化されたシアル酸がアミド化されるため好ましい。
なお、アミド化反応溶液は、上述のアンモニアまたはアミンの塩を含んでもよい。
アミド化反応には脱水縮合剤は必要でなく、含まなくてよい。好ましくは、アミド化反応は、試料をアミド化反応溶液と接触させることのみにより行われ、簡便な操作でラクトン化されたシアル酸が安定化される。
なお、アミド化反応には脱水縮合剤は必要ではないが、アミド化反応溶液に脱水縮合剤が含まれていてもよい。例えば、ステップS1003で試料に加えたラクトン化反応溶液を除去しないで、アンモニア、アミンまたはこれらの塩を加えることにより、試料を含むアミド化反応溶液を調製してもよい。この場合、ラクトン化反応溶液の除去を行わない分、操作が簡素化される。
アミド化反応溶液におけるアンモニア、アミンおよびこれらの塩の濃度は、0.1M(Mはmol/l)以上が好ましく、0.3M以上がより好ましく、0.5M以上がさらに好ましく、1.0M以上がさらに好ましく、3.0M以上が最も好ましい。好適な例として、アミド化反応溶液は、アンモニアまたは第一級アミン、特にメチルアミンを含み、当該アンモニア、またはメチルアミン等の第一級アミンの濃度は、0.1M以上が好ましく、0.3M以上がより好ましく、0.5M以上がさらに好ましく、1.0M以上がさらに好ましく、3.0M以上が最も好ましい。アミド化反応溶液のアミン等の濃度が高いほど、より確実にラクトン化されたシアル酸のアミド化を行うことができる。アミド化反応溶液におけるアミンの濃度は、適宜50%以下等にすることができる。
アミド化反応溶液の溶媒は、水系溶媒でも有機溶媒でもよいが、ラクトンの加水分解を防いで迅速なアミド化を確実に起こす観点から水含有量が少ない方が好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、水含有量を抑える脱水操作が加えられた脱水溶媒が好ましく、無水溶媒がさらに好ましい。アミド化反応溶液の溶媒は、メタノールおよびアセトニトリル(ACN)の少なくとも一つを含むことが好ましい。
なお、アミド化反応溶液は水(H2O)を相当量含んでいてもよく、アミド化反応溶液の溶媒は水でもよい。
アミド化反応溶液のpHは、7.7以上であり、8より大きいことが好ましく、10より大きいことがより好ましく、12以上がさらに好ましい。アミド化反応溶液のpHが高くなる程、より迅速かつ確実にラクトンがアミド化されるため好ましい。
アミド化反応は、数秒〜数分以内に完了する。従って、アミド化反応によりラクトンをアミド化するために、試料をアミド化反応溶液と接触させる時間(以下、反応時間と呼ぶ)は、1時間未満が好ましく、30分未満がより好ましく、15分未満がさらに好ましく、5分未満がさらに好ましく、1分未満が最も好ましい。好適には、試料をアミド化反応溶液で洗浄したり、担体等に保持されている試料に対して一時的に通液するだけでもよい。このように、アミド化反応は短時間に完了するため、不安定なラクトンが分解し糖鎖の解析における定量性が損なわれることを防ぐことができる。また、アミド化反応の反応時間を短く設定することで、より効率的に試料の解析を行うことができる。
本実施形態の分析用試料の調製方法では、アミド化反応は液相で行われる。
ステップS1005が終了したら、ステップS1007に進む。
ステップS1007において、アミド化反応後の反応溶液にpHを低下させるための酸性溶液(以下、酸性溶液と記載した場合、ステップS1007で反応溶液に加える酸性溶液のことを指す)を加え、当該反応溶液のpHを所定の値以下にする。この所定の値は、10以下が好ましく、8以下がより好ましい。当該所定の値は、ステップS1009で用いるHILIC用のカラムに適したpHも好ましく、特に当該カラムの製造者等が推奨するpH(以下、推奨pHと呼ぶ)の範囲から選択することもより好ましい。本実施形態では、pHが7未満を酸性とし、pHが7を超える場合を塩基性とする。酸性溶液のpHは、6以下がより好ましく、4以下がさらに好ましい。
ステップS1007が終了したら、ステップS1009に進む。
ステップS1009において、HILIC用のカラムにステップS1007でpHが調節された反応溶液が導入され、当該カラム内のHILIC用の担体を用いて糖鎖を精製する。この操作の後、分析用試料が取得される。pHが調節された反応溶液がHILIC用のカラムに導入され、糖鎖が担体に吸着された後は、適宜通液により洗浄が行われ、水や水系溶液等のカラムへの導入により、水または極性溶媒の濃度を上げることで糖鎖を含む試料が溶出される。
なお、HILIC用のカラムは、分析用試料がLC/MSの分析カラムに導入される前の試料の濃縮等に用いられるトラップカラムを用いてもよい。また、HILIC用の担体を試料の入った容器に導入して吸着を行うバッチ式の方法で精製を行ってもよい。
ステップS1009が終了したら、ステップS1011に進む。
ステップS1011が終了したら、処理を終了する。
糖ペプチドまたは糖タンパク質にラクトン化反応溶液およびアミド化反応溶液を加え、上述のようにシアル酸を修飾した場合、糖ペプチドまたは糖タンパク質に含まれるアミノ酸の側鎖や、主鎖の末端にあるアミノ基やカルボキシ基との間で分子内脱水縮合等の副反応が起こる場合がある。この場合、分析対象の糖鎖に対応するマススペクトルのピークが分かれてしまい、解析が難しくなってしまう問題があった。
本実施形態の分析用試料の調製方法に好適に用いられる分析用試料の調製用キット(以下、調製用キットと呼ぶ)が提供される。調製用キットは、上述のアミド化反応後の反応溶液のpHの調節に用いられる酸性溶液を含めばその内容は特に限定されず、試薬や、試薬以外の質量分析に用いられる任意の消耗品を含むことができる。調製用キットを用いて分析用試料を調整することにより、より効率的に分析用試料を調整することができる。
(1)本実施形態の分析用試料の調製方法は、試料と塩基性の反応溶液とを接触させ、糖鎖に含まれるラクトン構造をアミド化するアミド化反応を行うことと、アミド化反応に供した後の反応溶液に酸性溶液を加えることと、酸性溶液が加えられた後の反応溶液に含まれる試料を、HILIC用の担体を用いて精製することと、を備える。これにより、アミド化反応およびHILICに供した試料について、試料の回収率が向上したり夾雑物が減少したりし、精度よく分析することができる。
(変形例1)
上述の実施形態では、ラクトン化反応によりラクトン化されたシアル酸を、アミド化反応によりアミド化した。しかし、アミド化反応を行った後、HILIC用の担体を用いて試料を精製するのであれば、アミド化反応の前の処理は、特に限定されない。例えば、ラクトン化反応を行わずにアミド化反応を行い、試料に元々含まれるラクトン化されたシアル酸を検出してもよい。また、ラクトン化反応をシアル酸の結合様式非特異的に行ってもよい。
<ラクトン化反応およびアミド化反応>
試料として、増田化学工業から購入したPA化糖鎖PA059(図2(A)に構造を示した)を用意した。PA059は、α2,3−シアル酸を2つ含む2本鎖糖鎖であり、以下ではPAm059と呼ぶ。試料を200 fmolエッペンドルフチューブ内に乾固し、その後、イソプロピルアミンを含む20μLのラクトン化反応溶液(2M イソプロピルアミン塩酸塩、500mM EDC-HCl、500mM HOBt)を加え、2000rpmで攪拌しながら1時間反応させた(これにより、α2,6−シアル酸はイソプロピルアミドに、α2,3−シアル酸はラクトン体に変換される。PAm059の2つのシアル酸はα2,3−シアル酸であるためラクトン化される)。ラクトン化反応後、反応溶液に20μLの20% メチルアミン水溶液を添加し、ボルテックスミキサーにより攪拌しアミド化反応を行った(これにより、ラクトン化されたα2,3−シアル酸はアミノリシスによりメチルアミド化される)。
アミド化反応後の反応溶液に140μLのACNを加え希釈した後、遠心用の前処理用カラムであるHILIC Tip (GL-Tip Amide, GL Science特注品、同社のInertsil Amide分析カラムと同じ担体(以下、単にInertsil Amideと呼ぶ)が充填されたもの)を用いて過剰試薬を除いた。Inertsil Amideはシリカゲルにアミド基(カルバモイル基)を化学修飾させた担体であり、HPLCに用いる場合の推奨pHは2〜7.5である。ACNで希釈した上記反応溶液をGL-Tip Amideに加え、4000xgで遠心することで通液し糖鎖を担体に吸着させた。その後、90% ACN 0.1% TFA溶液100μLを2回通液させることで洗浄し、20μL H2Oを2回、20μL 90% ACN 0.1% TFA溶液を1回通液して糖鎖を溶出させ、溶出液をSpeedVac(サーモフィッシャーサイエンティフィック)で乾固した。その後、乾固した試料を再溶解した溶液をStage Tip Carbonに通液して脱塩操作を行った。Stage Tip Carbonは、エムポアディスクカーボン(3M製)を、直径約1mmに切り抜き、200μLのチップに詰めたカーボンカラムである。
Stage Tip Carbonからの溶出液に内部標準として4本鎖中性糖鎖のPA004(Takara Bio、図2(B)に構造を示した)を200 fmol添加し、試料と共に乾固させた。その後、試料を5μLの水に再溶解し、うち1μLをμFocus MALDI plate 700μm (Hudson Surface Technologies)に滴下した。滴下した試料に2mMのリン酸二水素アンモニウムを含む3AQ/CA(3-アミノキノリン/p-クマル酸)マトリックス溶液を0.75μL加え、プレートごと75℃に加熱し残存溶媒を除去した。その後、飛行時間型質量分析計(AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos) を用いて、MALDIでイオン化し負イオンモードで測定を行った。
比較例1の実験系では試料の回収率を正確に評価することができない。そのため、ラクトンの形成やアミノリシスによって変化しないPA化中性糖鎖を用いて評価を行った。HILIC用のカラムから溶出した溶出液に対して内部標準(I.S.)としてPA011(Takara Bio、図2(C)に構造を示した)を加え、内部標準との相対強度で回収率を評価した。
試料としては4本鎖糖鎖のPA004(Takara Bio)を100fmolエッペンドルフチューブ内に乾固した。次いで上記ラクトン化反応溶液を20μL加えて攪拌しながら1時間反応させた後、アミド化反応溶液として20% メチルアミン水溶液を20μL加えてボルテックスミキサーにより攪拌しアミノリシスが起こる条件にした。
HILIC Tipで精製する前に希釈する際、3つに分けた試料に(a)ACN、(b)4% TFAを含むACN、(c)5% TFAを含むACNをそれぞれ140μLずつ加えた。希釈後のpHをpH試験紙を用いて調べたところ、(a)は12以上、(b)は8程度、(c)は3程度であった。この溶液をHILIC Tipで精製した後、Stage Tip Carbonにて脱塩処理し、SpeedVacにて乾固した。
その後、5μLの水に再溶解し、うち1μLをμFocus MALDI plate 700μm (Hudson Surface Technologies)に滴下した。滴下した試料に2mMのリン酸二水素アンモニウムを含む3AQ/CAマトリックス溶液を0.75μL加え、プレートごと75℃に加熱し残存溶媒を除去した。その後、飛行時間型質量分析計(AXIMA-Resonance, Shimadzu/Kratos) を用いて、MALDIでイオン化し負イオンモードで測定を行った。
比較例2として、比較例1および実施例1で用いたアミド担体とは異なるアミド担体を用いて精製を行った場合でも夾雑物に対応するシグナルが観測される例を示す。実施例1における(a)(クエンチなし条件)と同様の方法で、HILIC用のカラムとしてInertsil Amide担体を含むチップ(カラムA)を用いた場合とInertSustain Amide担体(GL Science)を含むチップ(カラムB)を用いた場合とで比較した。InertSustain Amideは、シリカゲルにアミド基(カルバモイル基)を化学修飾させた担体であり、HPLCに用いる場合の推奨pHは2〜8.5である。
Claims (11)
- 試料に含まれる糖鎖の分析を行うための分析用試料の調製方法であって、
前記試料と塩基性の反応溶液とを接触させ、前記糖鎖に含まれるラクトン構造をアミド化するアミド化反応を行うことと、
前記アミド化反応に供した後の前記反応溶液に酸性溶液を加えることと、
前記酸性溶液が加えられた後の前記反応溶液に含まれる前記試料を、親水性相互作用クロマトグラフィ用の担体を用いて精製することと、
を備える分析用試料の調製方法。 - 請求項1に記載の分析用試料の調製方法において、
前記酸性溶液が加えられた後の前記反応溶液のpHは10以下である分析用試料の調製方法。 - 請求項1または2に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応の前に、前記糖鎖に含まれるシアル酸の少なくとも一部をラクトン化するラクトン化反応を行うことを備える分析用試料の調製方法。 - 請求項3に記載の分析用試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応は、脱水縮合剤を含むラクトン化反応溶液と前記試料とを接触させることにより行われる分析用試料の調製方法。 - 請求項4に記載の分析用試料の調製方法において、
前記アミド化反応で用いられる前記反応溶液は、アンモニアまたはアミンを含み、
前記ラクトン化反応溶液は、前記糖鎖に含まれる前記シアル酸と反応させる求核剤をさらに含み、
前記求核剤は、前記アミド化反応で用いられる前記反応溶液に含まれるアンモニアまたはアミンとは異なり、
前記ラクトン化反応では、前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、前記シアル酸の結合様式に基づいて、前記シアル酸の一部をラクトン化し、前記シアル酸の他の一部に前記求核剤の少なくとも一部を結合させる、分析用試料の調製方法。 - 請求項3から5までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応において、α2,3−シアル酸、α2,8−シアル酸、およびα2,9−シアル酸からなる群から選択される少なくとも一つの前記シアル酸がラクトン化される分析用試料の調製方法。 - 請求項5に記載の分析用試料の調製方法において、
前記ラクトン化反応では、前記試料に前記ラクトン化反応溶液を加え、α2,3−シアル酸をラクトン化し、α2,6−シアル酸に前記求核剤の一部を結合させる、分析用試料の調製方法。 - 請求項1から7までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法において、
前記酸性溶液は、0.2重量%以上のトリフルオロ酢酸を含む溶液である分析用試料の調製方法。 - 請求項1から8までのいずれか一項の分析用試料の調製方法により分析用試料を調製することと、
調製した前記分析用試料を分析することと
を備える分析方法。 - 請求項9に記載の分析方法において、
調製した前記分析用試料は、質量分析およびクロマトグラフィの少なくとも一つにより分析される分析方法。 - 酸性溶液を備え、
請求項1から8までのいずれか一項に記載の分析用試料の調製方法に用いられる、分析用試料の調製用キット。
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