JP4568551B2 - 糖たん白質糖鎖の分析方法及び非標識糖鎖の製造方法 - Google Patents
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(1)グリコシルアミンの遊離
先ず、糖たん白質を、N−グリコシダーゼF(PNGase F)を用いる酵素的遊離法によりグリコシルアミン型の糖鎖を得る。より具体的な条件の例を示すと、試料となる糖たん白質を、20mMリン酸バッファーに1〜10mg/mL程度になるように溶解し、この溶液100μLに対し、1unit/μLのPNGaseFを、10μL(10 unit)加え、37℃で保温することにより、酵素的にN−結合型糖鎖をグリコシルアミン型糖鎖として遊離させる。緩衝液のpHは、最終的に得られる標識糖鎖の回収量に極めて重要であるので、pH6.0〜pH9.0の、好ましくはpH8.0からpH9.0の適当なpHの緩衝液を使用して酵素反応を実施する。酵素反応時間は、1時間〜24時間(より好ましくは2〜5時間程度)で良好な結果が得られる。
このようにして得られた遊離のグリコシルアミンを含む酵素反応溶液に、20mMリン酸バッファー(pH8.5)又は精製水を加え全量を400μLとした後、5mg/mLのFmoc−Clアセトン溶液の200μLを加えて、37℃で1時間放置後、クロロホルムを300μL加え激しく攪拌し、層分離後、過剰のFmocを含むクロロホルム層を捨てる。このクロロホルムによる抽出操作をさらに2回繰り返し、標識されたグリコシルアミン(N−結合型糖鎖)を含む水層を直接HPLC−FLDによる分析に供するか、又は減圧乾固し適量の水に溶解して一部をHPLC−FLDによる分析に供する。
HPLC−FLDによるFmoc標識糖鎖のプロファイル分析法としては、以下のような条件が例示される。
分析カラム:昭和電工Shodex Asahipak NH2P−50 4E 4.6 mm×250 mm
移動相A:2%酢酸アセトニトリル溶液
移動相B:5%酢酸3%トリエチルアミン水溶液
溶出条件:グラジエント、0分(20%B)→10分(20%B)→90分(90%B)→90.1分(95%B)→105分(30%B)→105.1分(20%B)→120分(20%B)
カラム温度:50℃
検出:励起波長266 nm、蛍光波長310 nm
前記実施形態1の方法により、糖たん白質から遊離されHPLCにより分取された蛍光標識糖鎖(グリコシルアミン)を用い、以下の方法により非標識糖鎖標準品を製造する。すなわち、HPLCにより分取された1フラクションである、蛍光標識糖鎖を含む水溶液(20μL)にジメチルホルムアミド30μL及びモルホリン20μLを加え37℃で10分以上静置する。その後ジエチルエーテル500μLを加え激しく攪拌し、遠心後水層を回収して乾固すると、非標識糖鎖が定量的に回収される。
還元末端に複数のシアル酸を有する主に3本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるフェツイン(ウシ由来)を糖たん白質試料として、実施形態1に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図1(b)に示す。なお同じフェツインより還元アミノ化法により得られた2−アミノ安息香酸標識糖鎖を注入量として5倍量用いて分析した結果を図1(a)に示した。本発明の方法(実施形態1)は、還元アミノ化法の場合より、数倍の感度であり、かつ同様な分離パターン、同様な定量性が得られた。
実施形態2に述べた方法に従い、実施例1により得られたFmoc化糖鎖(HPLCの溶出液)の脱Fmoc化を実施した。結果を図1(c)に示す。Fmoc化糖鎖を検出する波長において、Fmoc糖鎖溶出範囲に全くピークが認められなかったことから、脱Fmoc化反応は完全に行われ、非標識糖鎖が得られたことが示された。さらにこの非標識糖鎖を2−アミノ安息香酸で標識し、2−アミノ安息香酸標識糖鎖を検出する波長においてHPLC分析を実施した。結果を図1(d)に示す。2−アミノ安息香酸標識糖鎖の糖鎖プロファイルが得られたことから、図1(c)の試料中に非標識糖鎖が存在したことが示された。
実施例1と同様の操作で得られたクロマトグラムにおいて、最大ピークの相当するフラクションを回収した(図1(b)のピークA)。このピークは、シアル酸を3残基有する3本分枝型糖鎖であることが知られており、単一の構造である。このFmoc化糖鎖を実施の形態2の方法により、脱Fmoc化操作を行った。これにより、シアル酸を3残基有する3本分枝型糖鎖の非標識体が得られた。これを確認するためにさらにこの糖鎖を2−アミノ安息香酸で標識し、2−アミノ安息香酸標識糖鎖を検出する波長においてHPLC分析した。この結果、フェツイン由来2−アミノ安息香酸標識糖鎖のクロマトグラム(図1(d))における当該ピークと同様の保持時間に単一のピークを得た(図1(e))。このことより、フェツイン中に含まれるシアル酸を3残基有する3本分枝型糖鎖の非標識体が高純度で調製されていたことが示された。
還元末端に複数のシアル酸を有する主に4本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるa1−酸性糖たん白質(ヒト由来)を試料として、実施形態1に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図3(a)に示す。a1−酸性糖たん白質に特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
還元末端に複数のシアル酸を有する主に2本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるトランスフェリン(ヒト由来)を糖たん白質試料として、実施形態1に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図3(b)に示す。トランスフェリンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
還元末端に複数のシアル酸を有する主に2本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるフィブリノーゲンを糖たん白質試料として、実施形態1に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図3(c)に示す。フィブリノーゲンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
マンノース5〜9残基を含む高マンノース型糖鎖及び還元末端に複数のシアル酸を有する主に3本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られるチログロブリンを糖たん白質試料として、実施形態1に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図3(d)に示す。チログロブリンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
還元末端にほとんどシアル酸を有しない主に2本分枝型の複合型糖鎖をもつことが知られる市販抗体医薬品であるイムノグロブリンGを糖たん白質試料として、実施形態1に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図4(a)に示す。組み換え体イムノグロブリンGに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
還元末端にシアル酸を有しない主に高マンノース型及び混合型糖鎖をもつことが知られる卵白アルブミンを鶏卵白から精製したものを糖たん白質試料として、実施形態1に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図4(b)に示す。卵白アルブミンに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
マンノース5〜9残基を含む高マンノース型糖鎖を有することが知られるリボヌクレアーゼBを糖たん白質試料として、実施形態1に述べた方法に従い、糖鎖プロファイル分析を実施した。結果を図4(c)に示す。リボヌクレアーゼBに特徴的な糖鎖プロファイルが得られた。
Claims (7)
- pH6−9に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりN−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行う工程、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をHPLC−FLDにより分析する工程を有することを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析方法。
- 糖たん白質よりのN−結合型糖鎖の遊離が、ペプチドN−グリコシダーゼFを用いて行われることを特徴とする請求項1に記載の糖たん白質糖鎖の分析方法。
- グリコシルアミンのアミノ基に対する蛍光標識を、Fmoc−Clを用いて行うことを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の糖たん白質糖鎖の分析方法。
- 蛍光標識が行われる水溶液に、水に不溶な有機溶媒を添加して混合、撹拌後、水層と有機溶媒層を分離し、分離された有機溶媒層を除去する工程をさらに有することを特徴とする請求項1ないし請求項3のいずれかに記載の糖たん白質糖鎖の分析方法。
- pH6−9に保たれた水溶液中で、糖たん白質よりN−結合型糖鎖を遊離し、遊離されたグリコシルアミン型糖鎖のアミノ基に対し蛍光標識を行い、この蛍光標識されたグリコシルアミン型糖鎖をHPLC−FLDにより分析するとともに分取し、分取された所定フラクション中のグリコシルアミン型糖鎖より蛍光性官能基を脱離することを特徴とする非標識糖鎖の製造方法。
- アミノ基を蛍光標識する試薬、及び標識の脱離のための試薬を含むことを特徴とする糖たん白質糖鎖の分析用キット。
- さらに、標準糖たん白質を含むことを特徴とする請求項6に記載の糖たん白質糖鎖の分析用キット。
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