JP2651942B2 - 糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法 - Google Patents
糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法Info
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- JP2651942B2 JP2651942B2 JP25456489A JP25456489A JP2651942B2 JP 2651942 B2 JP2651942 B2 JP 2651942B2 JP 25456489 A JP25456489 A JP 25456489A JP 25456489 A JP25456489 A JP 25456489A JP 2651942 B2 JP2651942 B2 JP 2651942B2
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- glycoprotein
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- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、糖タンパク質の糖鎖分析を行うに際して、
前処理としての糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法に
関する。
前処理としての糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法に
関する。
（従来の技術） 近年、生体由来の生理活性を有する糖タンパク質を医
薬、あるいは診断薬として利用する試みがなされてい
る。この対象となる糖タンパク質を生産する手段として
は組織からの抽出、細胞の大量培養、遺伝子操作による
組み替えタンパク質の大量生産などが挙げられる。これ
まで、得られた糖タンパク質の生理活性の同一性とし
て、アミノ酸組成分析に代表されるように、そのポリペ
プチド部分のみによって特徴付けることが一般に行われ
てきた。しかし、最近、糖タンパク質の生理的発現にお
いて糖鎖が重要な役割を果たしていることが明らかにさ
れつつある。例えば、タンパク質の安定化、代謝におけ
るシグナル作用、細胞内局所のシグナル作用、及びレセ
プターや標的細胞に対する認識としてのシグナル作用な
どである。
薬、あるいは診断薬として利用する試みがなされてい
る。この対象となる糖タンパク質を生産する手段として
は組織からの抽出、細胞の大量培養、遺伝子操作による
組み替えタンパク質の大量生産などが挙げられる。これ
まで、得られた糖タンパク質の生理活性の同一性とし
て、アミノ酸組成分析に代表されるように、そのポリペ
プチド部分のみによって特徴付けることが一般に行われ
てきた。しかし、最近、糖タンパク質の生理的発現にお
いて糖鎖が重要な役割を果たしていることが明らかにさ
れつつある。例えば、タンパク質の安定化、代謝におけ
るシグナル作用、細胞内局所のシグナル作用、及びレセ
プターや標的細胞に対する認識としてのシグナル作用な
どである。
このように、糖タンパク質を医薬或いは診断薬として
有効且つ特異的に利用するためには糖鎖構造を目的に沿
って規定することが重要となってくる。そのためには生
産された糖タンパク質糖鎖の構造の迅速な分析法が必要
となってくる。
有効且つ特異的に利用するためには糖鎖構造を目的に沿
って規定することが重要となってくる。そのためには生
産された糖タンパク質糖鎖の構造の迅速な分析法が必要
となってくる。
糖タンパク質糖鎖を分析するためには、まず糖鎖を糖
タンパク質から切り出すことが必要である。糖鎖の切り
出し方法としては、ヒドラジン分解法、［続生化学実験
講座４、複合糖質研究法Ｉ、141頁、東京化学同人］、
及びグリコペプチダーゼ（アーモンド由来）［Biochem.
Biophs.Res.Commun.、第76巻、1194頁（1977）］、［J.
Biochem.、第84巻、1476頁（1978）］、或いはＮ−グリ
カナーゼ［J.Biol.Chem.、第259巻、10700頁（1984）］
などの酵素による切断法がある。切り出された糖鎖は通
常、トリチウム標識化や蛍光標識化されて分析に供さら
れる。
タンパク質から切り出すことが必要である。糖鎖の切り
出し方法としては、ヒドラジン分解法、［続生化学実験
講座４、複合糖質研究法Ｉ、141頁、東京化学同人］、
及びグリコペプチダーゼ（アーモンド由来）［Biochem.
Biophs.Res.Commun.、第76巻、1194頁（1977）］、［J.
Biochem.、第84巻、1476頁（1978）］、或いはＮ−グリ
カナーゼ［J.Biol.Chem.、第259巻、10700頁（1984）］
などの酵素による切断法がある。切り出された糖鎖は通
常、トリチウム標識化や蛍光標識化されて分析に供さら
れる。
（発明が解決しようとする課題） しかしながら、従来のヒドラジン分解法（無水ヒドラ
ジンと100℃で反応）及び酵素法は反応時間が10時間以
上と時間がかかる。更に酵素法では糖鎖の構造、タンパ
ク質の構造によって、切り出し効率が著しく影響を受け
るなどの問題点がある。
ジンと100℃で反応）及び酵素法は反応時間が10時間以
上と時間がかかる。更に酵素法では糖鎖の構造、タンパ
ク質の構造によって、切り出し効率が著しく影響を受け
るなどの問題点がある。
そこで本発明は、従来のヒドラジン分解を改良するこ
とにより、より迅速で簡便な糖タンパク質からの糖鎖の
切り出し法を提供することにある。
とにより、より迅速で簡便な糖タンパク質からの糖鎖の
切り出し法を提供することにある。
（課題を解決する為の手段） 本発明は糖タンパク質からヒドラジン分解で糖鎖を切
り出す方法に関し、従来のヒドラジン分解よりも高温で
短時間に反応させることを特徴とする。
り出す方法に関し、従来のヒドラジン分解よりも高温で
短時間に反応させることを特徴とする。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明者らは鋭意検討の結果、ヒドラジン分解の温度
条件を従来法より高温で処理することにより、糖鎖の切
り出しが従来法より短時間で終了することを見出した。
条件を従来法より高温で処理することにより、糖鎖の切
り出しが従来法より短時間で終了することを見出した。
本発明でのヒドラジン分解の際の温度条件としては11
0℃〜150℃であり、好適には130℃〜150℃である。反応
時間は10分から2.5時間である。本発明の糖タンパク質
は予め良く乾燥させておくことが望ましい。反応後、公
知の方法により、Ｎ−アセチル化を行ない、さらにピリ
ジルアミノ化やABEE（パラアミノ安息香酸）化による標
識化を行なった後にHPLC分析に供する。
0℃〜150℃であり、好適には130℃〜150℃である。反応
時間は10分から2.5時間である。本発明の糖タンパク質
は予め良く乾燥させておくことが望ましい。反応後、公
知の方法により、Ｎ−アセチル化を行ない、さらにピリ
ジルアミノ化やABEE（パラアミノ安息香酸）化による標
識化を行なった後にHPLC分析に供する。
本発明によれば、従来法と同様定量的にしかも短時間
で糖タンパク質から糖鎖を切り出すことが可能となっ
た。
で糖タンパク質から糖鎖を切り出すことが可能となっ
た。
以下に、本発明の実施例を示し、本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。
（実施例） 実施例１ オブアルブミン糖鎖の分析 オブアルブミン糖鎖の切り出し オブアルブミン（シグマ社）200μｇをよく乾燥させ
た後、無水ヒドラジン100μｌを加えて、（ａ）110℃に
て150分、（ｂ）130℃にて45分、（ｃ）150℃にて10
分、それぞれの温度、時間条件で反応を行った。反応
後、減圧下ヒドラジンを揮発させた残渣に200μｌのト
ルエンを加え減圧乾固する操作を数回繰り返し糖鎖の切
り出しを行った。
た後、無水ヒドラジン100μｌを加えて、（ａ）110℃に
て150分、（ｂ）130℃にて45分、（ｃ）150℃にて10
分、それぞれの温度、時間条件で反応を行った。反応
後、減圧下ヒドラジンを揮発させた残渣に200μｌのト
ルエンを加え減圧乾固する操作を数回繰り返し糖鎖の切
り出しを行った。
オブアルブミン糖鎖の分析 で得られた試料に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を
200μｌ加えてから、20μｌの無水酢酸を５回に分けて1
5分間隔で攪拌しながら加えて最後に30分攪拌してＮ−
アセチル化を行った。次に試料溶液をイオン交換樹脂
（Dowex50Wx2）のカラムに通して脱塩し、カラムは更に
純水で数回洗浄した。この素通り画分と洗液とを合せ、
減圧乾固した。
200μｌ加えてから、20μｌの無水酢酸を５回に分けて1
5分間隔で攪拌しながら加えて最後に30分攪拌してＮ−
アセチル化を行った。次に試料溶液をイオン交換樹脂
（Dowex50Wx2）のカラムに通して脱塩し、カラムは更に
純水で数回洗浄した。この素通り画分と洗液とを合せ、
減圧乾固した。
試料残渣は常法通りにピリジルアミノ化［続生化学講
座４、複合糖質研究法Ｉ、145〜149頁、東京化学同人］
によって蛍光標識してからSephadex G−15で精製した後
HPLCにて分析した。第１図に反応条件（ｃ）で切り出し
た糖鎖の蛍光標識化合物のクロマトグラムを示した。カ
ラムはShimapak CLC−ODS（内径0.6×15cm）（島津製作
所）を155℃の恒温槽中で用い、溶媒は10mMリン酸緩衝
液（PH3.8）中、ｎ−ブタノールの0.1から0.25％の直線
濃度勾配を60分間でかけ、流量を1.0ml/min.とした。
座４、複合糖質研究法Ｉ、145〜149頁、東京化学同人］
によって蛍光標識してからSephadex G−15で精製した後
HPLCにて分析した。第１図に反応条件（ｃ）で切り出し
た糖鎖の蛍光標識化合物のクロマトグラムを示した。カ
ラムはShimapak CLC−ODS（内径0.6×15cm）（島津製作
所）を155℃の恒温槽中で用い、溶媒は10mMリン酸緩衝
液（PH3.8）中、ｎ−ブタノールの0.1から0.25％の直線
濃度勾配を60分間でかけ、流量を1.0ml/min.とした。
なお、対照として従来法によるヒドラジン分解（オブ
アルブミン200μｇ、無水ヒドラジン100μｌ、100℃、1
0時間）で切り出した糖鎖のHPLCのクロマトグラムを第
２図に示した。
アルブミン200μｇ、無水ヒドラジン100μｌ、100℃、1
0時間）で切り出した糖鎖のHPLCのクロマトグラムを第
２図に示した。
（ａ）110℃で150分、（ｂ）130℃で45分、（ｃ）150
℃で10分、のいずれの条件で切り出された糖鎖のクロマ
トグラムも従来法で切り出した糖鎖のクロマトグラムと
同一であった。
℃で10分、のいずれの条件で切り出された糖鎖のクロマ
トグラムも従来法で切り出した糖鎖のクロマトグラムと
同一であった。
実施例２ IgG糖鎖の分析 IgG糖鎖の切り出し IgG（シグマ社）200μｇをよく乾燥させた後、無水ヒ
ドラジン100μｌを加えて、130℃にて45分反応させた
後、減圧下ヒドラジン揮発させた。残渣に200μｌのト
ルエンを加え減圧乾固する操作を数回繰り返し糖鎖の切
り出しを行った。
ドラジン100μｌを加えて、130℃にて45分反応させた
後、減圧下ヒドラジン揮発させた。残渣に200μｌのト
ルエンを加え減圧乾固する操作を数回繰り返し糖鎖の切
り出しを行った。
IgG糖鎖の分析 で得られた試料に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を
200μｌ加えてから、これに20μｌの無水酢酸を５回に
分けて15分間隔で攪拌しながら加えて最後に30分攪拌し
てＮ−アセチル化を行なった。次に試料溶液をイオン交
換樹脂（Dowex50Wx2）のカラムに通して脱塩し、カラム
は更に純水で数回洗浄した。この素通り画分と洗液とを
合せ、減圧乾固した。試料残渣は常法通りにピリジルア
ミル化によって蛍光標識してからSephadex Ｇ−15で精
製した後、HPLCにて分析した。第３図にそのクロマトグ
ラムを示した。カラムはShimapak CLC−ODS（内径0.6×
15cm）（島津製作所）を55℃の恒温槽中で用い、溶媒10
mMリン酸緩衝液（PH3.8）中、ｎ−ブタノールの0.1から
0.25％の直線濃度勾配を60分間でかけ、流量を1.0ml/mi
n.とした。
200μｌ加えてから、これに20μｌの無水酢酸を５回に
分けて15分間隔で攪拌しながら加えて最後に30分攪拌し
てＮ−アセチル化を行なった。次に試料溶液をイオン交
換樹脂（Dowex50Wx2）のカラムに通して脱塩し、カラム
は更に純水で数回洗浄した。この素通り画分と洗液とを
合せ、減圧乾固した。試料残渣は常法通りにピリジルア
ミル化によって蛍光標識してからSephadex Ｇ−15で精
製した後、HPLCにて分析した。第３図にそのクロマトグ
ラムを示した。カラムはShimapak CLC−ODS（内径0.6×
15cm）（島津製作所）を55℃の恒温槽中で用い、溶媒10
mMリン酸緩衝液（PH3.8）中、ｎ−ブタノールの0.1から
0.25％の直線濃度勾配を60分間でかけ、流量を1.0ml/mi
n.とした。
なお、対照として従来法によるヒドラジン分解で切り
出した糖鎖のHPLCのクロマトグラムを第４図に示した。
出した糖鎖のHPLCのクロマトグラムを第４図に示した。
第３図、第４図に示すように、従来法と全く同じクロ
マトグラムが得られた。
マトグラムが得られた。
（発明の効果） 以上、詳細に説明した通り、本発明によれば、糖タン
パク質からの糖鎖の切り出しを短時間で行なうことが可
能となり、糖タンパク質の糖鎖の分析時間を短縮するこ
とが可能となった。
パク質からの糖鎖の切り出しを短時間で行なうことが可
能となり、糖タンパク質の糖鎖の分析時間を短縮するこ
とが可能となった。
第１図は反応条件（ｃ）（150℃、10分）で切り出した
オブアルブミン糖鎖の蛍光標識化物のHPLCのクロマトグ
ラム、第２図は従来法（100℃、10時間）で切り出した
オブアルブミン糖鎖の蛍光標識化物のHPLCのクロマトグ
ラムである。 第３図は反応条件が130℃、40分で切り出したIgG糖鎖の
蛍光標識化物のHPLCのクロマトグラム、第４図は従来法
（100℃、10時間）で切り出したIgG糖鎖の蛍光標識化物
のHPLCのクロマトグラムである。
オブアルブミン糖鎖の蛍光標識化物のHPLCのクロマトグ
ラム、第２図は従来法（100℃、10時間）で切り出した
オブアルブミン糖鎖の蛍光標識化物のHPLCのクロマトグ
ラムである。 第３図は反応条件が130℃、40分で切り出したIgG糖鎖の
蛍光標識化物のHPLCのクロマトグラム、第４図は従来法
（100℃、10時間）で切り出したIgG糖鎖の蛍光標識化物
のHPLCのクロマトグラムである。
Claims (2)
- 【請求項１】糖タンパク質から糖鎖をヒドラジン分解で
切り出す際に、無水ヒドラジンとの反応を110℃以上の
高温で行なうことを特徴とする糖タンパク質からの糖鎖
の切り出し法。 - 【請求項２】無水ヒドラジンとの反応が110℃以上で且
つ糖鎖が分解しない程度の温度と時間であることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載の糖鎖の切り出し法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25456489A JP2651942B2 (ja) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | 糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25456489A JP2651942B2 (ja) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | 糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03228000A JPH03228000A (ja) | 1991-10-08 |
| JP2651942B2 true JP2651942B2 (ja) | 1997-09-10 |
Family
ID=17266802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25456489A Expired - Lifetime JP2651942B2 (ja) | 1989-09-29 | 1989-09-29 | 糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2651942B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4507682B2 (ja) * | 2004-04-26 | 2010-07-21 | 三菱化学株式会社 | 糖鎖分離方法、検体分析方法、液体クロマトグラフィー装置、並びに糖鎖分析方法及び糖鎖分析装置 |
| JP2007045889A (ja) * | 2005-08-08 | 2007-02-22 | Kagawa Univ | 糖タンパク質からの糖鎖の調製方法 |
| JPWO2015186690A1 (ja) * | 2014-06-03 | 2017-04-20 | 学校法人北里研究所 | 無水ヒドラジンによる、糖タンパク質からのＯ−結合型糖鎖のβ脱離反応における、脱離した糖鎖の分解抑制剤、キット及び方法 |
| KR102100181B1 (ko) | 2016-09-27 | 2020-04-13 | 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지 | 당단백질의 당쇄 유리법 |
-
1989
- 1989-09-29 JP JP25456489A patent/JP2651942B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03228000A (ja) | 1991-10-08 |
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