JPH03228000A - 糖タンパク質からの糖鎖の切り出し法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、糖タンパク質の糖鎖分析を行うに際して、前
処理としての糖タンパク質がらの糖鎖の切り出し法に関
する。

（従来の技術） 近年、生体由来の生理活性を有する糖タンパク質を医薬
、あるいは診断薬として利用する試みがなされている。

この対象となる糖タンパク質を生産する手段としては組
織からの抽出、細胞の大量培養、遺伝子操作による組み
替えタンパク質の大量生産などが挙げられる。これまで
、得られた糖タンパク質の生理活性の同一性として、ア
ミノ酸組成分析に代表されるように、そのポリペプチド
部分のみによって特徴付けることが一般に行われてきた
。しかし、最近、糖タンパク質の生理的発現において糖
鎖が重要な役割を果たしていることが明らかにされつつ
ある。

例えば、タンパク質の安定化、代謝におけるシグナル作
用、細胞内局所のシグナル作用、及びレセプターや標的
細胞に対する認識としてのシグナル作用などである。

このように、糖タンパク質を医薬或いは診断薬として有
効且つ特異的に利用するためには糖鎖構造を目的に沿っ
て規定することが重要となってくる。そのためには生産
された糖タンパク質糖鎖の構造の迅速な分析法が必要と
なってくる。

糖タンパク質糖鎖を分析するためには、まず糖鎖を糖タ
ンパク質から切り出すことが必要である。糖鎖の切り出
し方法としては、ヒドラジン分解法、［純生化学実験講
座４、複合糖質研究法Ｉ、１４１頁、東京化学同人］、
及びグリコペプチダーゼ（アーモンド由来）　　［Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ　、　Ｒｅｓ　、　Ｃｏｍ
ｍｕｎ　、、第７６巻、１１９４頁（１９７７）　］、
［Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、第８４巻、１４７６頁（１９
７８）　］、或いはＮ−グリカナーゼ［Ｊ　、Ｂｉｏｌ
、Ｃｈｅｍ、、第２５９巻、１０７００頁（１９８４）
　］などの酵素による切断法がある。切り出された糖鎖
は通常、ｌ・リチウム標識化や蛍光標識化されて分析に
供せられる。

（発明が解決しようとする課題） しかしながら、従来のヒドラジン分解法（無水ヒドラジ
ンと１００°Ｃで反応）及び酵素法は反応時間が１０時
間以」二と時間がかかる。更に酵素法では糖鎖の構造、
タンパク質の構造によって、切り出し効率が著しく影響
を受けるなどの問題点がある。

そこで本発明は、従来のヒドラジン分解を改良すること
により、より迅速で簡便な糖タンパク質からの糖鎖の切
り出し法を提供することにある。

（課題を解決する為の手段） 本発明は糖タンパク質からヒドラジン分解で糖鎖を切り
出す方法に関し、従来のヒドラジン分解よりも高温で短
時間に反応させることを特徴とする。

以下、本発明の詳細な説明する。

本発明者らは鋭意検討の結果、ヒドラジン分解の温度条
件を従来法より高温で処理することにより、糖鎖の切り
出しが従来法より短時間で終了することを見出した。

本発明でのヒドラジン分解の際の温度条件としては１１
０８Ｃ〜１５０°Ｃであり、好適には１３０°Ｃ〜１５
０°Ｃである。反応時間は１０分から２５時間である。

本発明の糖タンパク質は予め良く乾燥させておくことが
望ましい。反応後、公知の方法により、Ｎ−アセチル化
を行ない、さらにピリジルアミノ化やＡＢＥＥ　（パラ
アミノ安息香酸）化による標識化を行なった後にＨＰ　
Ｌ　Ｃ分析に供する。

本発明によれば、従来法と同様定量的にしかも短時間で
糖タンパク質から糖鎖を切り出すことが可能となった。

以下に、本発明の実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。

（実施例） 実施例１　　オブアルブミン糖鎖の分析■　オブアルブ
ミン糖鎖の切り出し オブアルブミン（シグマ社）２００μｇをよく乾燥させ
た後、無水ヒドラジン１００μｍを加えて、（ａ）　１
１０℃にて１５０分、（ｂ）　１３０°Ｃにて４５分、
（ｃ）　１５０℃にて１０分、それぞれの温度、時間条
件で反応を行った。反応後、減圧下ヒドラジンを揮発さ
せた残渣に２００μｍのトルエンを加え減圧乾固する操
作を数回繰り返し糖鎖の切り出しを行った。

■　オブアルブミン糖鎖の分析 ■で得られた試料に飽和炭酸水素すトリウム水溶液を２
００μｍ加えてから、２０μｍの無水酢酸を５回に分け
て１５分間隔で攪拌しながら加えて最後に３０分攪拌し
てＮ−アセチル化を行った。次に試料溶液をイオン交換
樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗｘ２）のカラムに通して脱塩し
、カラムは更に純水で数回洗浄した。この素通り画分と
洗液とを合せ、減圧乾固した。

試料残渣は常法通りにピリジルアミノ化［純生化学講座
４、複合糖質研究法Ｉ、１４５〜１４９頁、東京化学同
人］によって蛍光標識してから５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−
１５で精製した後ＨＰ　Ｌ　Ｃにて分析した。

第１図に反応条件（Ｃ）で切り出した糖鎖の蛍光標識化
合物のクロマトグラムを示した。カラムはＳｈｉｍａｐ
ａｋ　ＣＬＣ−ＯＤＳ　（内径０．６Ｘ　１５ｃｍ）　
　（呂律製作所）を１５５°Ｃの恒温槽中で用い、溶媒
は１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ３，８）中、ｎ−ブタノ
ールの０１から０．２５％の直線濃度勾配を６０分間で
かけ、流量を１．０ｍｌ／ｍｉｎとした。

なお、対照として従来法によるヒドラジン分解（オブア
ルブミン２００μｇ１無水ヒドラジン１００μ］、１０
０°Ｃ１１０時間）で切り出した糖鎖のＨＰ　Ｌ　Ｃの
クロマトグラムを第２図に示した。

（ａ）　１１０°Ｃで１５０分、（ｂ）　１３０°Ｃで
４５分、（Ｃ）１５０℃で１０分、のいずれの条件で切
り出された糖鎖のクロマトグラムも従来法で切り出した
糖鎖のクロマトグラムと同一であった。

実施例２　　　ＩｇＧ糖鎖の分析 ■　ＩｇＧ糖鎖の切り出し ＩｇＧ（シグマ社）２００μｇをよく乾燥させた後、無
水ヒドラジン１００μｍを加えて、１３０°Ｃにて４５
分反応させた後、減圧下ヒドラジンを揮発させた。残渣
に２００μ↓のトルエンを加え減圧乾固する操作を数回
繰り返し糖鎖の切り出しを行った。

■　ＩｇＧ糖鎖の分析 ■で得られた試料に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を２
００μｌ加えてから、これに２０μｍの無水酢酸を５回
に分けて１５分間隔で攪拌しながら加えて最後に３０分
攪拌してＮ−アセチル化を行なった。次に試料溶液をイ
オン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ５０Ｗｘ２）のカラムに通し
て脱塩し、カラムは更に純水で数回洗浄した。この素通
り画分と洗液とを合せ、減圧乾固した。試料残渣は常法
通りにピリジルアミノ化によって蛍光標識してから５ｅ
ｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１５で精製した後、Ｉ（Ｐ　Ｌ　Ｃ
にて分析した。第３図にそのクロマトグラムを示した。

カラムはＳｈｉｍａｐａｋ　ＣＬＣ−ＯＤＳ　（内径０
．６Ｘ１５ｃｍ）（呂律製作所）を５５°Ｃの恒温槽中
で用い、溶媒は１０ｍＭリン酸緩衝液（ＰＨ３，８）中
、ｎ−ブタノールの０１から０２５％の直線濃度勾配を
６０分間でかけ、流量を１　、０ｍｌ／ｍｊｎ　、とじ
た。

なお、対照として従来法によるヒドラジン分解で切り出
した糖鎖のＨＰ　Ｌ　Ｃのクロマトグラムを第４図に示
した。

第３図、第４図に示すように、従来法と全く同じクロマ
トグラムが得られた。

（発明の効果） 以」二、詳細に説明した通り、本発明によれば、糖タン
パク質からの糖鎖の切り出しを短時間で行なうことが可
能となり、糖タンパク質の糖鎖の分析時間を短縮するこ
とが可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は反応条件（ｃ）　　（１５０°Ｃ１１０分）で
切り出したオブアルブミン糖鎖の蛍光標識化物の１−Ｉ
　Ｐ　Ｌ　Ｃのクロマトグラム、第２図は従来法（１０
０℃、１０時間）で切り出したオブアルブミン糖鎖の蛍
光標識化物のＨＰ　Ｌ　Ｃのクロマトグラムである。 第３図は反応条件が１３０°Ｃ１４０分で切り出したＩ
ｇＧ糖鎖の蛍光標識化物のＩ−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃのクロマ
トグラム、第４図は従来法（１００℃、１０時間）で切
り出したＩｇＧ糖鎖の蛍光標識化物のＨＰＬＣのクロマ
トグラムである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）糖タンパク質から糖鎖をヒドラジン分解で切り出
   す際に、無水ヒドラジンとの反応を１１０℃以上の高温
   で行なうことを特徴とする糖タンパク質からの糖鎖の切
   り出し法。（２）無水ヒドラジンとの反応が１１０℃以
   上で且つ糖鎖が分解しない程度の温度と時間であること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載の糖鎖の切り出
   し法。