KR20190038665A

KR20190038665A - 당단백질의 당쇄 유리법

Info

Publication number: KR20190038665A
Application number: KR1020197008572A
Authority: KR
Inventors: 아키히코 가메야마; 마사아키 도요다; 미도리 사카구치
Original assignee: 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지; 스미또모 베이크라이트 가부시키가이샤
Priority date: 2016-09-27
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2019-04-08
Also published as: CN113004430B; KR102100181B1; US11325935B2; EP3521319A4; EP3521319B1; WO2018062167A1; JP2020073670A; CN113004430A; JPWO2018062167A1; EP3521319A1; EP3521319C0; JP6667856B2; CN109983034A; US20190309003A1

Abstract

당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 방법으로서, 상기 당단백질에, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액을 접촉시켜, 상기 당단백질로부터 유리된 당쇄와 상기 반응액과의 혼합액을 얻는 공정을 포함하는 방법.

Description

당단백질의 당쇄 유리법

본 발명은, 당단백질의 당쇄 유리법에 관한 것이다. 본원은, 2016년 9월 27일에 일본에 출원된 특허출원 2016-187961호에 근거하여 우선권을 주장하고, 그 내용을 여기에 원용한다.

항체 의약 등의 바이오 의약품을 비롯하여, 단백질의 대부분에는 당쇄가 결합되어 있다. 바이오 의약품에 있어서 당쇄는 그 의약품의 활성에 영향을 줄 뿐만 아니라 항원성이나 동태에도 영향을 주는 것이 시사되어 있고, 당쇄의 분석은 바이오 의약품 개발에 있어서 중요한 과제가 되고 있다. 또, 당단백질의 당쇄는 질환 관련 바이오 마커로서 이용할 수 있지만, 마커가 될 수 있는 당쇄를 찾아내기 위해서는 다검체의 생체 시료에 포함되는 당단백질의 당쇄를 분석할 필요가 있다.

또, 일본 후생노동성의 "항체 의약품의 품질 평가를 위한 가이던스"에는, 항체 의약품은 투여량이 많은 점이나, 생산에 이용한 세포에 따라서는 비인간형 당쇄 함량이 종래의 예보다 많아질 가능성도 생각되는 점에서, 비인간형 당쇄가 결합되어 있는 경우는, 그 비율을 명확히 하는 것과 함께, 안전성에 대한 영향을 고려해야 한다고 되어 있다. 이로 인하여, 당쇄 분석에 있어서는, 인간에게 존재하지 않는 당쇄 구조, 구체적으로는 N글라이콜일뉴라민산이나 Galα1-3Gal 구조 등은 간과하지 않도록 주의가 필요하다.

당쇄를 분석하기 위해서는, 먼저 당단백질로부터 당쇄를 유리시키고, 탈염이나 제단백질 등의 후처리를 행한 후, 그 당쇄를 질량 분석계로 분석하거나, 또는 유리된 당쇄에 형광 표지를 부여하여 형광 검출기를 장비한 고속 액체 크로마토그래피나 캐필러리 전기 영동, 혹은 이들의 조합으로 분석하는 것이 일반적이다. 어느 경우에도 당단백질로부터 당쇄를 유리하는 것이 첫 단계가 된다. 당쇄와 단백질의 결합은, 단백질의 아스파라진 잔기의 아미노기에 N아세틸글루코사민이 N글라이코사이드 결합으로 연결되는 N결합형 당쇄와, 세린 및 트레오닌 잔기의 수산기에 N아세틸갈락토사민이 O글라이코사이드 결합으로 연결되는 O결합형 당쇄로 나눌 수 있다. 단백질로부터 당쇄를 유리시키기 위해서는, 각각에 적합한 방법이 이용된다.

N결합형 당쇄를 유리시키기 위해서는, PNGaseF나 글라이코펩티다제 A 등의 효소를 이용하여 당쇄를 유리시킬 수 있지만, 각각에 기질 특이성이 다르기 때문에 분석 대상의 생물종에 따라 효소를 구분할 필요가 있다. 또, 효소 반응의 감수성을 높이기 위하여 일반적으로는 사전에 단백질을 변성시키거나, 프로테아제로 분해하는 등의 전처리가 실시된다.

또, 효소를 이용하지 않고 화학 반응에 의하여 당쇄를 유리하는 방법도 있다. 예를 들면, 특허문헌 1에는, 충분히 건조시킨 당단백질을 무수 하이드라진에 용해시키고, 100℃에서 10시간 이상 가열 처리하는 하이드라진 분해법을 개시하고 있으며, 당해 방법은 주로 N형 당쇄를 유리하는 방법으로서 이용되고 있다. 반응 후는 무수 하이드라진을 감압 증류 제거하고, 다시 탄산 수소 나트륨과 무수 아세트산을 이용하여 아세틸화를 행한다. 이것은 하이드라진이, 당쇄에 결합되어 있는 N아세틸기나 N글라이콜일기도 분해하여 아미노기로 변환하기 때문에, 아세틸화함으로써 원래대로 되돌리는 조작이다. 따라서, 원래 N글라이콜일기 등 다른 아실기가 결합되어 있던 경우도, 모두 N아세틸체로서 분석된다.

또, 예를 들면 특허문헌 2에 있어서, 하이드라진-수화물을 이용한 당쇄 유리도 보고되어 있다. 이 방법은, 하이드라진-수화물은 하이드라진에 비하여 취급이 비교적 용이하고 저가이기도 하기 때문에, 대량으로 당단백질을 처리하는 경우 등에 이용된다. 그러나, 이 방법도 반응 후의 하이드라진 증류 제거, 재(再)아세틸화 등의 후처리는 하이드라진 분해법과 동일한 공정을 필요로 하는 것이다.

O결합형 당쇄의 유리에 대해서는, 실용성이 있는 효소가 발견되지 않았다. 이로 인하여 오로지 화학 반응에 의한 유리가 이용되고 있다. 유리하기 위한 화학 반응으로서는 강알칼리 수용액 중에서 당쇄를 β탈리시키는 방법이 널리 사용되고 있다. 그러나, 유리된 당쇄는 알칼리 존재하에서는 바로 분해되기 때문에, 통상은 수소화 붕소 나트륨 공존하에서 반응을 행함으로써, 유리된 당쇄를 즉시 알디톨로 환원하는 방법이 이용된다.

유리된 알디톨은 형광 표지를 부여하기 위한 당쇄 측의 관능기인 알데하이드기가 환원되어 알코올로 변화되어 있기 때문에, 형광 표지를 부여할 수 없다. 이로 인하여, 알디톨의 모든 수산기를 메틸화(완전 메틸화)시킨 후에 질량 분석계로 분석하는 것이 일반적이다.

특허문헌 3은, 강알칼리에 의한 β탈리에 있어서, 알데하이드기를 온존시킨 상태에서 O결합형 당쇄를 얻기 위하여, 유로 내를 유동시키면서 알칼리 용액과 시료 용액을 단시간만 반응시키고, 즉시 중화 처리하는 시스템을 개시하고 있다.

알데하이드기를 온존시킨 상태 그대로 O결합형 당쇄를 화학적으로 유리시키는 다른 방법으로서는, 상술한 하이드라진 분해법이 알려져 있다. 반응 후에는, 하이드라진 증류 제거, 재아세틸화를 행하고, 형광 표지를 부여한 후, HPLC 등을 이용하여 분석되고 있다.

하이드라진 분해법에 의한 O결합형 당쇄 유리는 반드시 당쇄의 분해를 수반하기 때문에, 분해를 조금이라도 억제하는 것을 목적으로 하여, 반응계 내에 첨가물을 첨가하는 등의 고안도 보고되어 있다. 또, 강알칼리에 의한 β탈리도 마찬가지로 반드시 분해를 수반하기 때문에, 강알칼리 대신에 약염기를 이용한 β탈리법도 검토되며, 농(濃)암모니아수를 이용하는 방법, 카밤산 암모늄을 이용하는 방법(특허문헌 4) 등이 보고되어 있다.

특허문헌 1: 일본 공개특허공보 평3-228000호 특허문헌 2: 일본 공개특허공보 2007-45889호 특허문헌 3: 일본 특허공보 제4283272호 특허문헌 4: 일본 공개특허공보 2015-107969호

바이오 의약품의 당쇄 불균일성을 창약 단계부터 개발 단계 그리고 제조에 이르기까지 모니터하여 제어하는 것은, 고품질의 바이오 의약품약 제조에 있어서 중요한 과제가 되고 있다. 지금까지 행해져 온 바와 같이 제품의 품질 관리로서만 당쇄를 분석하는 것이 아니라, 개발의 각 단계에서 수시로, 신속하게 당쇄를 분석할 것이 요구된다. 또, 다양한 질환에 관련된 병의 용태 마커를 탐색하는 데에 있어서도 당쇄의 분석은 다검체의 시료를 신속하게 분석하는 것이 필요하다. 그리고, 다검체의 분석에는 비용도 매우 큰 부담이 된다.

상술한 바와 같이 당쇄를 분석하기 위해서는 단백질로부터 당쇄를 유리하는 것이 첫 단계가 되지만, 종래, 당쇄를 유리하기 위해서는 전처리를 포함하여, 장시간을 필요로 하고 있었다. 예를 들면, 효소를 이용하여 당쇄를 유리하는 경우, 사전에 단백질을 다이싸이오트레이톨 등의 환원제로 처리한 후, 아이오도아세트아마이드 등의 알킬화제를 이용하여 처리함으로써 변성시키고, 다시 트립신 등의 프로테아제로 펩티드로 분해시킨 후에, 당쇄 유리 효소를 반응시켜 당쇄를 유리하기 때문에, 의약품의 제조 현장에서 시료를 채취한 그날에 당쇄를 분석할 수 없었다.

또한, 당쇄를 유리시키는 효소인 PNGaseF나 글라이코펩티다제 A는 매우 고가이며 다검체의 분석을 행하기 위해서는 상당한 비용 부담이 발생하고 있었다.

또, 하이드라진 분해법은 완전한 무수 조건이 필요하고, 반응계 내에 소량이라도 물이 혼입되면 현저한 수율의 저하를 초래한다. 이로 인하여, 사전에 시료를 충분히 감압 건조시킨 후에 반응시킬 필요가 있었다. 또한, 반응 시간은 10시간 이상이며, 반응 후에 하이드라진의 증류 제거, 재아세틸화까지 포함하면, 전체 공정이 종료할 때까지 적어도 2일 이상을 필요로 한다. 또한 하이드라진은 발암성을 갖는 독물이기도 하고, 또 역폭발성의 화합물이기도 하기 때문에, 그 취급에는 세심한 주의를 기울일 필요가 있었다.

또한 하이드라진 분해법으로는, N글라이콜일기가 분해되기 때문에, N글라이콜일뉴라민산의 분석을 할 수 없다는 문제도 있었다. 바이오 의약이나 당쇄 질환 마커에서는 사이알산의 일종인 N글라이콜일뉴라민산의 유무가 문제가 되는 경우가 있기 때문에, 이와 같은 목적으로는 하이드라진 분해법은 이용할 수 없었다.

한편, O결합형 당쇄를 유리하는 경우에는, 하이드라진 분해법에서도 알칼리β탈리법에서도 당쇄의 환원 말단의 N아세틸갈락토사민의 3위에 결합되어 있는 당이 탈리하는 부반응(필링 반응)을 반드시 수반한다. 그것을 억제하기 위하여 약염기를 이용한 β탈리법을 행해도 필링은 피할 수 없을 뿐만 아니라, 유리 효율도 현저하게 저하되는 문제가 있었다. 또, 반응 시간도 16시간 이상 걸렸다.

또, 필링을 억제하기 위하여 수소화 붕소 나트륨을 공존시키는 방법으로는, 표지제를 환원 말단에 부여할 수 없게 되기 때문에, HPLC 등으로 고감도로 분석할 수 없었다.

이상의 여러 문제로부터, 당쇄를 분석하기 위하여, 안전하고 또한 저가인 약품을 이용하며, 또 특별한 시스템을 이용하지 않고 단시간의 처리 시간으로 N결합형 당쇄와 O결합형 당쇄를 단백질로부터 유리시키는 방법이 요구되고 있었다.

본 발명자는 예의 검토한 결과, 하이드록실아민 존재하, 수용액 중에서 염기성 촉매를 이용하여 단백질로부터 당쇄를 유리할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성시켰다.

즉, 본 발명은 이하의 양태를 포함한다.

[1] 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 방법으로서, 상기 당단백질에, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액을 접촉시켜, 상기 당단백질로부터 유리된 당쇄와 상기 반응액과의 혼합액을 얻는 공정을 포함하는 방법.

[2] 상기 반응액이 상기 (a) 하이드록실아민류를 2~70%(w/w) 포함하는, [1]에 기재된 방법.

[3] 상기 반응액이 (c) 아민류를 더 포함하는, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.

[4] 상기 (c) 아민류가, 암모니아수, 메틸아민 수용액, 다이메틸아민 수용액, 에틸아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 에틸렌다이아민, 뷰틸아민, 모폴린, DABCO 및 안트라닐산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물인, [3]에 기재된 방법.

[5] 상기 당단백질로부터 유리된 당쇄가 당쇄 옥심을 포함하는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[6] 상기 당단백질에 상기 반응액을 접촉시키는 공정에 있어서, 상기 반응액의 pH가, 8~14의 범위 내인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[7] 상기 (a) 하이드록실아민류가, 하이드록실아민, 하이드록실아민의 염, O치환 하이드록실아민 및 O치환 하이드록실아민의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물인, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[8] 상기 (b) 염기성 시약이, 알칼리 금속의 수산화물, 알칼리 금속의 약산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물, 암모니아 수용액에 용해된 알칼리 토류 금속의 염 및 유기 염기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[9] 상기 알칼리 금속의 수산화물이, 수산화 리튬, 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨이고, 상기 알칼리 금속의 약산염이, 중탄산 나트륨 또는 탄산 나트륨이며, 상기 알칼리 토류 금속의 수산화물이, 수산화 칼슘, 수산화 바륨 또는 수산화 스트론튬이고, 상기 알칼리 토류 금속의 염이, 아세트산 칼슘, 염화 칼슘, 아세트산 바륨 또는 아세트산 마그네슘이며, 상기 유기 염기가, 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데스-7-엔, 1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]데스-5-엔, 7-메틸-1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]데스-5-엔, 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2-tert-뷰틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘 또는 세틸트라이메틸암모늄하이드록사이드인, 청구항 8에 기재된 방법.

[10] 상기 혼합액에 케톤, 알데하이드 또는 산무수물을 첨가하고, 상기 혼합액 중에 잔존하는 (a) 하이드록실아민류를 케톡심, 알독심 또는 아마이드로 변환하는 공정과, 상기 혼합액을, 당쇄에 친화성을 갖는 고상(固相)과 접촉시켜, 상기 고상에 상기 당단백질로부터 유리된 당쇄를 흡착시키는 공정과, 상기 고상으로부터 상기 당쇄를 용출시키는 공정을 더 포함하는, [1] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[11] 당단백질이 갖는 당쇄의 분석 방법으로서, [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법에 의하여 당단백질로부터 당쇄를 유리하는 공정과, 유리된 당쇄를 표지하는 공정이고, 당쇄 옥심의 표지를 포함하는 공정을 포함하는, 당쇄의 분석 방법.

[12] 당단백질로부터 당쇄를 유리하기 위한 키트로서, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 키트.

[13] (c) 아민류를 더 포함하는, [12]에 기재된 키트.

[14] 케톤, 알데하이드 또는 산무수물과, 당쇄에 친화성을 갖는 고상을 더 포함하는, [12] 또는 [13]에 기재된 키트.

[15] [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법을 행하기 위한 설명서를 더 포함하는, [12] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[16] 당단백질로부터 당쇄를 유리하기 위한 키트로서, (a) 하이드록실아민류와 병용하여 사용하기 위한 (b) 염기성 시약과 (c) 아민류를 포함하는 키트.

[17] 케톤, 알데하이드 또는 산무수물과, 당쇄에 친화성을 갖는 고상을 더 포함하는, [16]에 기재된 키트.

[18] [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법을 행하기 위한 설명서를 더 포함하는, [16] 또는 [17]에 기재된 키트.

[19] 당단백질을 포함하는 시료가 수용되는 용기를 유지하는 용기 유지부와, 상기 용기에 시약을 도입하는 시약 도입부를 구비하고, 상기 시약 도입부가, 상기 용기에 (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액을 도입하는 반응액 도입부를 포함하는, 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 장치.

[20] 상기 시약 도입부가, 상기 용기에 케톤을 도입하는 케톤 도입부, 알데하이드를 도입하는 알데하이드 도입부 또는 산무수물을 도입하는 산무수물 도입부를 더 포함하는, [19]에 기재된 장치.

[21] 당쇄에 친화성을 갖는 고상을 포함하는 용기를 유지하는 고상 유지부를 더 구비하는, [19] 또는 [20]에 기재된 장치.

본 발명은, 이하의 양태를 포함한다고 할 수도 있다.

〔1〕 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 방법으로서,

상기 당단백질에, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액을 접촉시키는 공정이며, 상기 (a) 하이드록실아민류가, 2~50%(w/w)로 반응액 중에 포함되는 공정을 포함하는 방법에 관한 것이다.

여기에서, 본 발명의 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 방법은, 일 실시형태에 있어서,

〔2〕 상기 〔1〕에 기재된 방법이며,

상기 반응액이 (c) 아민류를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또, 본 발명의 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 방법은, 일 실시형태에 있어서,

〔3〕 상기 〔1〕또는〔2〕에 기재된 방법이며,

상기 당단백질로부터 유리된 당쇄가 당쇄 옥심을 포함하는 것을 특징으로 한다.

〔4〕 상기 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 하나에 기재된 방법이며,

상기 당단백질에 상기 반응액을 접촉시키는 공정에 있어서, 상기 반응액의 pH가, 8~14의 범위 내인 것을 특징으로 한다.

〔5〕 상기 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 하나에 기재된 방법이며,

상기 (a) 하이드록실아민류가, 하이드록실아민 및 그 염류와 O치환 하이드록실아민 및 그 염류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물인 것을 특징으로 한다.

〔6〕 상기 〔1〕 내지 〔5〕 중 어느 하나에 기재된 방법이며,

상기 (b) 염기성 시약이, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 약산염, 알칼리 토류 수산화물, 암모니아 수용액에 용해한 알칼리 토류의 염, 및 유기 염기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 한다.

〔7〕 상기 〔6〕에 기재된 방법이며,

상기 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 약산염, 또는 알칼리 토류 수산화물이, 수산화 리튬, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨, 중탄산 나트륨, 탄산 나트륨, 수산화 칼슘, 수산화 바륨, 수산화 스트론튬으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나이고,

상기 암모니아 수용액에 용해된 알칼리 토류의 염이, 아세트산 칼슘, 염화 칼슘, 아세트산 바륨, 아세트산 마그네슘으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 한다.

〔8〕 상기 〔6〕에 기재된 방법이며,

상기 유기 염기가, 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데스-7-엔, 1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]데스-5-엔, 7-메틸-1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]데스-5-엔, 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2-tert-뷰틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 세틸트라이메틸암모늄하이드록사이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인 것을 특징으로 한다.

〔9〕 상기 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 하나에 기재된 방법이며,

상기 (c) 아민류가, 암모니아, 메틸아민, 다이메틸아민, 에틸아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 에틸렌다이아민, 뷰틸아민, 모폴린, DABCO 및 안트라닐산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물인 것을 특징으로 한다.

또, 본 발명은, 다른 양태에 있어서,

〔10〕 당단백질이 갖는 당쇄의 분석 방법이며,

청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의하여 당단백질로부터 당쇄를 유리하는 공정과,

유리된 당쇄를 표지하는 공정이고, 당쇄 옥심의 표지를 포함하는 공정을 포함하는, 당쇄의 분석 방법에 관한 것이다.

또, 본 발명은, 다른 양태에 있어서,

〔11〕 당단백질로부터 당쇄를 유리하기 위한 키트로서,

(a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 키트.

또, 본 발명의 당단백질로부터 당쇄를 유리하기 위한 키트는, 일 실시형태에 있어서,

〔12〕 상기 〔11〕에 기재된 키트로서,

(a) 아민류를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

〔13〕 당단백질로부터 당쇄를 유리하기 위한 키트로서,

(a) 하이드록실아민류와 병용하여 사용하기 위한 (b) 염기성 시약과 (c) 아민류를 포함하는 키트인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법에 의하면, 안전하고 또한 저가인 약품의 사용에 의하여, 당쇄의 분해를 억제하면서, 단시간의 처리 시간으로 당단백질로부터 당쇄를 유리시킬 수 있으며, 또 유리된 당쇄는, 당쇄 옥심을 포함하는 혼합물로서 회수하는 것이 가능하다.

특히, N결합형 당쇄를 당단백질로부터 유리하는 방법에 있어서는, 종래, 하이드라진 분해법에서는, N글라이콜일기가 분해되기 때문에, N글라이콜일뉴라민산의 분석을 할 수 없었지만, 본 방법에 의하면, N글라이콜일기의 분해를 억제하면서, 당쇄의 유리를 행할 수 있다.

도 1은 실시예 1에 있어서, 모노클로날 항체(IgG)로부터 유리시킨 N결합형 당쇄의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 실시예 1에 있어서, N결합형 당쇄를 유리하는 효소(PNGaseF)를 이용한 방법에 의하여 모노클로날 항체(IgG)로부터 유리시킨 N결합형 당쇄의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 3은 실시예 2에 있어서, 인간 혈청 유래 IgG로부터 유리시킨 N결합형 당쇄의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 실시예 3에 있어서, 소 페투인으로부터 유리시킨 O결합형 당쇄의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 실시예 4에 있어서, 소 아포트랜스페린으로부터 유리시킨 N결합형 당쇄의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 6은 실시예 5에 있어서, 서양 고추냉이 퍼옥시다제로부터 유리시킨 N결합형 당쇄의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 실시예 6에 있어서, 소 턱밑샘 뮤신으로부터 유리시킨 O결합형 당쇄의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 8의 (a)~(d)는, 실시예 9~11에 있어서, 소 페투인으로부터 유리시킨 O결합형 당쇄의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. (a)는 실시예 10의 결과이고, (b)는 실시예 11의 결과이며, (c)는 실시예 9(아세톤 처리)의 결과이고, (d)는 실시예 9(살리실알데하이드 처리)의 결과이다.
도 9는 실시예 12에 있어서, 소 페투인으로부터 유리시킨 O결합형 당쇄의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 10은 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 장치의 일 실시형태를 설명하는 모식도이다.

본 명세서에 있어서, "당단백질"이란, 단백질의 아미노산 배열 중에, O결합형 당쇄, 또는 N결합형 당쇄가 적어도 하나 이상 결합되어 있는 단백질을 말한다. 본 발명을 적용 가능한 당단백질은, 특별히 제한되지 않으며, 천연 유래여도 되고, 합성한 것이어도 된다.

"당쇄"에는, O결합형 당쇄, 및 N결합형 당쇄가 포함된다. O결합형 당쇄는, 단백질의 세린(Ser) 또는 트레오닌(Thr)의 아미노산 잔기에 있어서, 각 아미노산 측쇄에 포함되는 -OH기를 통하여 당쇄가 결합된 구조이다. 또, O결합형 당쇄는, 코어의 구조에 따라 1~8종으로 분류된다. 또, N결합형 당쇄는, 단백질의 아스파라진 잔기의 측쇄의 아마이드기의 질소 원자에 결합되는 당쇄를 가리킨다. N결합형 당쇄는 마노스를 기점으로 하여 분기를 형성하고 있는 것이 포함되고, 예를 들면 2분기쇄, 3분기쇄, 4분기쇄 등이 있다. 또, N결합형 당쇄는, 그 구조에 따라, 기본형, 고(高)마노스형, 하이브리드형, 복합형 등으로 분류할 수 있다.

본 발명에 있어서는, O결합형 당쇄 및 N결합형 당쇄 중 어느 당쇄도 당단백질로부터의 유리의 대상으로 할 수 있다.

[당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 방법]

일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 방법으로서, 상기 당단백질에, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액을 접촉시켜, 상기 당단백질로부터 유리된 당쇄와 상기 반응액과의 혼합액을 얻는 공정을 포함하는 방법을 제공한다. 당단백질을, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액과 접촉시킴으로써, 당해 당단백질로부터 당쇄를 유리할 수 있다.

여기에서, "당단백질에, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액을 접촉시킨다"란, 최종적으로, 당단백질, (a) 하이드록실아민류, 및 (b) 염기성 시약이 접촉한 상태가 되면 되고, 그 혼합의 순서는 상관없다. 예를 들면, 먼저 당단백질에 (a) 하이드록실아민류를 첨가하고, 그 후 (b) 염기성 시약을 첨가해도 된다. 혹은, 먼저 당단백질에 (b) 염기성 시약을 첨가하고, 그 후 (a) 하이드록실아민류를 첨가해도 된다. 혹은, 먼저 (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 혼합하고, 이것에 당단백질을 첨가해도 된다. 또한, O결합형 당쇄의 경우에는, 당쇄의 분해를 억제하기 위하여 하이드록실아민류를 먼저 첨가하는 것이 바람직하다.

여기에서, 본 실시형태에 사용할 수 있는 "(a) 하이드록실아민류"로서는, 하이드록실아민, 하이드록실아민의 염, O치환 하이드록실아민, O치환 하이드록실아민의 염을 들 수 있다. 구체적으로는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면 하이드록실아민 염산염, 하이드록실아민 수용액, 하이드록실아민 황산염, 하이드록실아민 인산염, O메틸하이드록실아민 염산염, O에틸하이드록실아민 염산염, O-(테트라하이드로-2H-피란-2-일)하이드록실아민, 나이트로벤질하이드록실아민 염산염, O-tert- 뷰틸다이메틸실릴하이드록실아민, O-트라이메틸실릴하이드록실아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 들 수 있다. 또한, 상술한 화합물의 2개 이상을 조합하여 사용해도 된다. 바람직한 실시형태에 있어서, "(a) 하이드록실아민류"는, 하이드록실아민 수용액이다.

반응액 중의 "(a) 하이드록실아민류"의 최종 농도는, 예를 들면 2~70%(w/w), 예를 들면 2~50%(w/w)의 농도 범위로 할 수 있다. 그러나, 상술한 농도 범위에 한정되지 않고, 당업자라면, 대상으로 하는 당단백질의 종류나 반응액 중의 다른 성분(아민류, 염기성 시약, 그 외의 첨가제), 반응 조건(시간, 온도 등) 등에 따라 적절히 조정할 수 있다.

발명자들은, 특히 O결합형 당쇄를 유리시키는 경우에는, "(a) 하이드록실아민류"의 최종 농도는 가능한 한 높은 편이 바람직하다는 것을 명확히 했다. 따라서, O결합형 당쇄를 유리시키는 경우에는 "(a) 하이드록실아민류"의 최종 농도는, 예를 들면 10~70%(w/w), 예를 들면 30~60%(w/w)의 농도 범위이면 되고, 특히 약 50%(w/w)가 적합하다.

또한, N결합형 당쇄를 유리시키는 경우에는, "(a) 하이드록실아민류"의 최종 농도는, 2~50%(w/w)로 할 수 있고, 바람직하게는, 10~20%(w/w)로 할 수 있다. 보다 바람직한 실시형태에 있어서는, 10%(w/w)이다.

"(a) 하이드록실아민류"로서, 하이드록실아민을 이용하는 경우, 하이드록실아민의 농도가, 2%(w/w) 초과 50%(w/w) 이하이면, 충분한 당쇄 회수량이 얻어지고, 하이드록실아민도 안정되는 경향이 있다.

또, 본 실시형태에 사용할 수 있는 "(b) 염기성 시약"으로서는 알칼리 금속의 수산화물, 알칼리 금속의 약산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물, 암모니아수에 용해한 알칼리 토류 금속의 염, 및 유기 염기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 들 수 있다.

알칼리 금속의 수산화물로서는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면 수산화 리튬, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨을 들 수 있다.

또, 알칼리 금속의 약산염으로서는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면 중탄산 나트륨, 탄산 나트륨을 들 수 있다.

또, 알칼리 토류 금속의 수산화물로서는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면 수산화 칼슘, 수산화 바륨, 수산화 스트론튬을 들 수 있다.

또, 암모니아수에 용해한 알칼리 토류의 염으로서는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면 아세트산 칼슘, 염화 칼슘, 아세트산 바륨, 아세트산 마그네슘을 들 수 있다.

이들 중에서도, 특히 수산화 리튬이 바람직하다.

또, 유기 염기로서는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면 DBU: 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데스-7-엔(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene), TBD: 1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]데스-5-엔(1,5,7-Triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene), MTBD: 7-메틸-1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]데스-5-엔(7-Methyl-1,5,7-triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene), TMG: 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(1,1,3,3-Tetramethylguanidine), t-BuTMG: 2-tert-뷰틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(2-tert-Butyl-1,1,3,3-tetramethylguanidine), DBN: 1,5-다이아자바이사이클로[4.3.0]논-5-엔(1,5-diazabicyclo[4.3.0]non-5-ene), CTAH: 세틸트라이메틸암모늄하이드록사이드(cetyltrimethylammonium hydroxide) 등을 들 수 있다. 또한, 상술한 화합물의 2개 이상을 조합하여 사용해도 된다. 바람직한 실시형태에 있어서, "유기 염기"는, 유기 강염기(pKa 12 이상)이며, 구체적으로는, DBU, TMG, TBD, MTBD, CTAH를 들 수 있다. 이들 DBU, TMG, TBD, MTBD, CTAH를 "유기 염기"로서 이용함으로써, 유기 용매에 의한 세정으로 반응 후의 염기의 제거가 가능해지는 점에 있어서, 바람직하다.

반응액 중의 "(b) 염기성 시약"의 최종 농도는, 예를 들면 2mM~2M의 농도 범위로 할 수 있다. 그러나, 상술한 농도 범위에 한정되지 않고, 당업자라면, 대상으로 하는 당단백질의 종류나 반응액 중의 다른 성분(하이드록실아민류, 그 외의 첨가제), 반응 조건(시간, 온도 등) 등에 따라 적절히 조정할 수 있다. 또한, 예를 들면 "(b) 염기성 시약"으로서, 수산화 리튬을 이용할 때에는, 6mM~1M로 할 수 있고, 바람직하게는, 100mM~500mM로 할 수 있다. 보다 바람직한 실시형태에 있어서는, 100mM~200mM이다. 염기성 시약의 농도가, 2mM 미만이면 반응 시간이 장시간이 되는 점에 있어서 바람직하지 않고, 2M를 초과하면 당쇄의 회수율이 저하되는 점에 있어서 바람직하지 않다.

본 실시형태에 관한 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 방법은, 당단백질에 대하여, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액을 접촉시킴으로써 당단백질로부터 당쇄를 유리시킨다. 이때, (a) 하이드록실아민류는, 당해 반응액에 대하여, 2~70%(w/w)의 범위로 포함되어 있다.

이때, 반응액 중의 (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약과의 몰비는, 1:1~300:1로 하는 것이 바람직하고, 3:1~200:1로 하는 것이 보다 바람직하다. (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약과의 몰비를 상기 범위로 함으로써, 유리된 당쇄의 분해 반응을 억제할 수 있다.

또, 반응액의 pH는, 8~14의 범위 내로 할 수 있고, 10~13의 범위 내로 하는 것이 보다 바람직하다.

대상이 되는 당단백질과 당해 반응액을 접촉시키는 공정에 있어서, 온도나 반응 시간의 조건은, 대상이 되는 단백질로부터 당쇄를 유리할 수 있는 한 특별히 한정되지 않고, 대상이 되는 당단백질, 하이드록실아민류, 염기성 시약의 종류나 농도 등의 조건에 따라 당업자는 적절히 설정할 수 있다. 또한, 온도는, 예를 들면 실온~80℃로 할 수 있다. 또한, N글라이콜일기 등은, 고온에서 반응시키면 분해되기 쉽기 때문에, 미지의 당쇄를 갖는 당단백질을 대상으로 하는 경우는, 50℃ 이하로 하는 것이 바람직하다. 또, 반응 시간도 조건에 따라 약 5분~16시간으로 할 수 있다.

또, 본 실시형태에 관한 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 방법은, 일 실시형태에 있어서, 반응액에 "(c) 아민류"를 더 첨가할 수 있다. 본 실시형태에 사용할 수 있는 "(c) 아민류"로서는, 이하에 한정되지 않지만, 예를 들면 암모니아수, 메틸아민 수용액, 다이메틸아민 수용액, 에틸아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 에틸렌다이아민, 뷰틸아민, 모폴린, DABCO 및 안트라닐산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 들 수 있다. 또한, 상술한 화합물의 2개 이상을 조합하여 사용해도 된다. 바람직한 실시형태에 있어서, "(c) 아민류"는, 암모니아수, 모폴린, DABCO, 안트라닐산이다. 암모니아수, 모폴린, DABCO, 안트라닐산 등을 "(c) 아민류"로서 이용함으로써, 필링, 이성화(異性化)나 아마이드의 분해가 억제되는 점에 있어서, 바람직하다. 특히, 암모니아보다 pKa가 낮은 모폴린이나 DABCO, 안트라닐산 등을 이용한 경우에는, N결합형 당쇄를 유리할 때의 부반응인 이성화를 억제할 수 있는 점에 있어서 바람직하다.

반응액 중의 "(c) 아민류"의 최종 농도는, 예를 들면 40mM~15M의 농도 범위로 할 수 있다. 그러나, 상술한 농도 범위에 한정되지 않고, 당업자라면, 대상으로 하는 당단백질의 종류나 반응액 중의 다른 성분(하이드록실아민류, 염기성 시약, 그 외의 첨가제), 반응 조건(시간, 온도 등) 등에 따라 적절히 조정할 수 있다. 또한, 예를 들면 "(c) 아민류"로서, 암모니아수를 이용할 때에는, 반응액 중의 암모니아의 최종 농도를 2~25%(w/w)로 할 수 있고, 바람직하게는, 10~20%(w/w)로 할 수 있다. 보다 바람직한 실시형태에 있어서는, 20%(w/w)이다.

[당쇄의 분석 방법]

일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 당단백질이 갖는 당쇄의 분석 방법으로서, 상술한 방법에 의하여 당단백질로부터 당쇄를 유리하는 공정과, 유리된 당쇄를 표지하는 공정을 포함하는, 당쇄의 분석 방법을 제공한다.

본 실시형태의 분석 방법에서는, 유리된 당쇄를 표지하는 공정에 있어서, 당쇄 옥심도 표지된다. 상세에 대해서는 후술한다.

당단백질로부터 당쇄를 유리시킨 후의 반응 용액은, 공지의 방법(예를 들면, 그래파이트 카본을 충전한 고상 추출 카트리지)을 이용하여, 탈염 처리를 행하고, 반응 용액 중에 포함되는 당쇄의 분석에 이용할 수 있다.

용액 중에 유리되어 있는 당쇄의 분석 방법으로서는, 적절히 공지의 방법을 채용할 수 있다. 예를 들면, 하기 실시예에서 채용하는 것처럼, 피콜린보레인과 2-아미노벤즈아마이드를 이용한 형광 표지법을 이용할 수 있다.

또한, 상술한 방법에 의하여 유리된 당쇄는, 알데하이드형이 된 일부가 당쇄 옥심을 형성한다. 즉, 종래의 방법에 있어서는, 유리 후 당쇄의 관능기인 알데하이드기가 환원되어 알디톨로 변환된 경우, 직접 형광 표지할 수 없었다. 또, 종래의 방법에 있어서, 당쇄의 관능기인 알데하이드기가 하이드라진에 의하여 하이드라존으로 변환된 경우, 형광 표지를 부여하기 위해서는 재아세틸화 조작에 의하여 원래의 유리 당쇄로 되돌릴 필요가 있었다.

이것에 대하여, 상술한 방법에 의하면, 직접 표지 가능한 당쇄 옥심으로서 유리된 당쇄를 얻을 수 있다. 즉, 본 실시형태의 방법에 의하여 당단백질로부터 유리된 당쇄는 당쇄 옥심을 포함한다. 당쇄 옥심은 직접 표지할 수 있다.

따라서, 상술한 방법에 의하여 얻어진 유리 당쇄는, 글라이코실아민, 당쇄 옥심, 환원 말단에 헤미아세탈성 수산기를 갖는 통상의 당쇄 혼합물로서 용액 중에 얻을 수 있고, 이들을 모아서 표지할 수 있다.

그런데, 상술한 바와 같이 발명자들은, 특히 O결합형 당쇄를 유리시키는 경우에는, (a) 하이드록실아민류의 최종 농도는 가능한 한 높은 편이 바람직하다는 것을 명확히 했다.

그러나, 당단백질과 반응액과의 혼합액이, 고농도의 (a) 하이드록실아민류를 포함하는 경우, 당쇄를 유리한 후의 혼합액에 미반응의 (a) 하이드록실아민류가 잔존하는 경우가 있다. 미반응의 (a) 하이드록실아민류는, 당쇄의 형광 표지 반응을 저해하기 때문에, 제거하는 것이 바람직하다.

따라서, 상술한 방법은, 미반응의 (a) 하이드록실아민류를 제거하는 추가 공정을 더 포함하고 있어도 된다. 즉, 상술한 방법은, 당단백질과 반응액과의 혼합액에, 케톤, 알데하이드 또는 산무수물을 첨가하여, 혼합액 중에 잔존하는 (a) 하이드록실아민류를 케톡심, 알독심 또는 아마이드로 변환시키는 공정과, 상기 혼합액을, 당쇄에 친화성을 갖는 고상과 접촉시켜, 상기 고상에 상기 당단백질로부터 유리된 당쇄를 흡착시키는 공정과, 상기 고상으로부터 상기 당쇄를 용출시키는 공정을 더 포함하고 있어도 된다.

(a) 하이드록실아민류에 케톤을 반응시킴으로써 케톡심으로 변환시킬 수 있다. 또, (a) 하이드록실아민류에 알데하이드를 반응시킴으로써 알독심으로 변환시킬 수 있다. 또, (a) 하이드록실아민류에 산무수물을 반응시킴으로써 아마이드로 변환시킬 수 있다.

케톤으로서는, 아세톤, 메틸에틸케톤, 메틸아이소뷰틸케톤, 4-하이드록시뷰탄온 등을 사용할 수 있다. 또, 알데하이드로서는, 살리실알데하이드, 벤즈알데하이드, 4-하이드록시벤즈알데하이드 등을 사용할 수 있다. 또, 산무수물로서는 무수 아세트산, 무수 석신산 등을 사용할 수 있다.

이어서, 상기의 혼합액으로부터 당쇄를 회수한다. 구체적으로는, 상기의 혼합액을 당쇄에 친화성을 갖는 고상과 접촉시켜, 상기 고상에 상기 당단백질로부터 유리된 당쇄를 흡착시키고, 이어서, 상기 고상으로부터 상기 당쇄를 용출시킴으로써, 상기의 혼합액으로부터 당쇄의 회수할 수 있다.

이상의 조작에 의하여, 당단백질로부터 유리된 당쇄로부터, 미반응의 (a) 하이드록실아민류를 제거할 수 있다.

당쇄에 친화성을 갖는 고상은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 그래파이트 카본, 결정성 셀룰로스, 실리카, 모노리스 실리카 등의 친수성 담체 등을 들 수 있고, 특히 모노리스 실리카가 적합하다. 모노리스 실리카란, 3차원 그물코 구조를 갖는 필터상의 다공질 연속체 실리카이며, 종래의 입자상 실리카와 비교하여 통액성이 양호하고, 데드 볼륨이 적은 등의 장점이 있다. 모노리스 실리카는, 칼럼상의 용기에 고정되어 있어도 되고, 예를 들면 멀티 웰 플레이트에 고정되어 있어도 된다.

모노리스 실리카의 포어 사이즈는, 서로 연속한 미세 구멍(스루 포어) 직경이 1~100μm인 것이 바람직하고, 1~50μm인 것이 보다 바람직하며, 1~30μm인 것이 더 바람직하고, 1~20μm인 것이 특히 바람직하다.

케톤, 알데하이드 또는 산무수물을 첨가한 혼합액을, 친수성 담체가 고정된 칼럼 또는 멀티 웰 플레이트에 주입하여, 자연 낙하, 흡인, 가압, 원심 등의 방법에 의하여 통과시킨 후, 세정액으로 세정하고, 용출액을 첨가하여 당쇄를 용출시키면 된다.

친수성 담체에 어플라이하는, 케톤, 알데하이드 또는 산무수물을 첨가한 혼합액은, 90체적% 이상의 유기 용매를 포함하는 것이 바람직하고, 95체적% 이상의 유기 용매를 포함하는 것이 더 바람직하다. 유기 용매로서는, 아세토나이트릴, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 헥세인, 아세트산 에틸, 염화 메틸렌, 테트라하이드로퓨란 등을 이용할 수 있지만, 아세토나이트릴이 특히 바람직하다.

케톤, 알데하이드 또는 산무수물을 첨가한 혼합액을 친수성 담체에 어플라이한 후, 친수성 담체를 세정액으로 세정하는 것이 바람직하다. 세정액은 90체적% 이상의 유기 용매와 10체적% 이하의 물을 포함하는 것이 바람직하고, 95체적% 이상의 유기 용매와 5체적% 이하의 물을 포함하는 것이 더 바람직하다. 세정액에 포함되는 유기 용매로서는, 아세토나이트릴, 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 헥세인, 아세트산 에틸, 염화 메틸렌, 테트라하이드로퓨란 등을 이용할 수 있지만, 아세토나이트릴이 특히 바람직하다. 조성이 다른 세정액을 이용해도 되고, 예를 들면 100% 아세토나이트릴로 세정한 후, 아세토나이트릴:물=95:5(v/v)의 혼합액으로 세정해도 된다.

세정 조작 후, 친수성 담체에 용출액을 첨가하여, 당쇄를 용출한다. 용출액은 10체적% 이상의 물을 포함하는 것이 바람직하고, 50체적% 이상의 물을 포함하는 것이 보다 바람직하며, 물이 특히 바람직하다. 용출액에 포함되는 물 이외의 성분으로서는, 아세토나이트릴, 및 메탄올, 에탄올, 프로판올, 뷰탄올로 대표되는 알코올로부터 선택되는 유기 용매인 것이 바람직하다. 용출한 당쇄는, 형광 표지 반응에 제공할 수 있다.

[키트]

일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 당단백질로부터 당쇄를 유리하기 위한 키트로서, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 또, 본 실시형태의 키트는, 일 형태의 형태에 있어서, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약에 더하여, (c) 아민류를 더 포함하는 키트이다. 또, 본 실시형태의 당단백질로부터 당쇄를 유리하기 위한 키트는, 다른 일 실시형태에 있어서, (a) 하이드록실아민류와 병용하여 사용하기 위한 (b) 염기성 시약과 (c) 아민류를 포함하는 키트이다.

본 실시형태의 키트는, 그 외에, 당단백질로부터 당쇄를 유리하는 공정에 사용되는 시약((a) 하이드록실아민류, (c) 아민류, 그 외의 첨가물 등), 케톤, 알데하이드 또는 산무수물, 당쇄의 정제에 사용하는 담체(당쇄에 친화성을 갖는 고상), 당쇄의 분석에 사용하는 시약(형광 시약 등)이나 검출 기기, 당단백질로부터 당쇄를 유리하는 방법의 구체적인 절차를 기재한 설명서 등을 더 포함할 수 있다.

[장치]

일 실시형태에 있어서 본 발명은, 당단백질을 포함하는 시료가 수용되는 용기를 유지하는 용기 유지부와, 상기 용기에 시약을 도입하는 시약 도입부를 구비하고, 상기 시약 도입부가, 상기 용기에 (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액을 도입하는 반응액 도입부를 포함하는, 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 장치를 제공한다. 또한, 이하에 설명하는 장치의 구성은 어디까지나 일례이며, 본 실시형태의 장치는 이 구성에 구속되는 것은 아니다.

도 10은, 본 실시형태의 장치를 설명하는 모식도이다. 장치(100)는, 당단백질을 포함하는 시료(110)가 수용되는 용기(120)를 유지하는 용기 유지부(130)와, 용기(120)에 시약을 도입하는 시약 도입부(140)를 구비하고, 시약 도입부(140)가, 용기(120)에 (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액(151)을 도입하는 반응액 도입부(141)를 포함한다.

용기 유지부(130)는, 당단백질을 포함하는 시료(110)가 수용되는 용기(120)를 유지하기 위한 것이다. 용기 유지부(130)가 용기(120)를 유지하는 양태는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 용기 유지부(130)의 유지 구멍에 용기의 대부분을 감입시켜 유지하는 양태를 들 수 있다. 이 외에도, 용기 유지부의 계합 볼록부(계합 오목부)에 용기의 계합 오목부(계합 볼록부)를 계합시켜 유지하는 양태, 용기 유지부의 협지부로 용기를 협지 유지하는 양태 등을 들 수 있다.

시약 도입부(140)는, 용기 유지부(130)에 유지된 용기(120)의 내부, 또는 후술하는 고상 유지부(160)에 유지된 용기(170)의 내부에 시약을 도입하기 위한 것이다. 시약 도입부(140)는, 적어도 용기(120)에 (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액(151)을 도입하는 반응액 도입부(141)를 포함한다.

시약 도입부(140)는, 용기(120)에 케톤을 도입하는 케톤 도입부, 알데하이드를 도입하는 알데하이드 도입부, 또는 산무수물을 도입하는 산무수물 도입부를 더 포함하고 있어도 된다.

도 10의 예에서는, 시약 도입부(140)는, 반응액(151), 케톤, 알데하이드, 또는 산무수물(152), 표지 시약(153)을 수용한 탱크(150)와, 탱크(150)가 수용한 각 시약을 송액하는 송액관(142, 143, 144)과, 각 시약의 송액을 제어하는 밸브(145, 146, 147)와, 각 시약을 용기(120) 또는 용기(170)의 내부에 도입하는 도입부(141)를 구비하고 있다. 도 10의 예에서는, 도입부(141)는, 반응액 도입부, 케톤 도입부, 알데하이드 도입부 또는 산무수물 도입부, 표지 시약 도입부를 겸하고 있다. 반응액(151)은, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하고 있다.

시약 도입부(140)가 용기(120) 또는 용기(170)의 내부에 시약을 도입하는 양태는 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 송액해야 할 액체가 저류되어 있는 송액원(151, 152, 153)으로부터 관상 부재를 통하여 용기(120) 또는 용기(170)의 내부로 송액하는 양태를 들 수 있다. 이 외에도, 관상 부재 중에 채취한 액체를 반응 용기 내에 주입하는 양태 등을 들 수 있다.

반응액 도입부, 케톤 도입부 또는 알데하이드 도입부, 표지 시약 도입부는, 별개로 독립한 구성 부재로서 구성되어 있어도 되고, 동일한 구성 부재로서 구성되어도 된다.

장치(100)는, 당쇄에 친화성을 갖는 고상(171)을 포함하는 용기(170)를 유지하는 고상 유지부(160)를 더 구비하고 있어도 된다. 고상 유지부(160)의 구조는 용기 유지부(130)의 구조와 동일해도 된다. 또, 장치(100)는, 용기(170)의 수용물을 고액 분리하는 고액 분리부(180)를 더 구비하고 있어도 된다. 장치(100)가 고액 분리부(180)를 포함하는 경우, 고액 분리부(180)는, 용기(170) 중에 포함되는 수용물로부터 고체와 액체를 분리한다. 여기에서 고체는, 실질적으로는 고상(10) 및 그것에 흡착된 당쇄이다.

고액 분리부(180)의 구체적인 분리 형식으로서는 특별히 한정되지 않고, 원심, 감압, 가압 중 어느 것이어도 된다. 도 10의 예에서는, 고액 분리부(180)의 분리 형식은 원심이다. 고액 분리부(180)는, 용기(170)를 유지하는 랙(181)과, 드라이브 샤프트(182)와, 모터(183)를 구비하고 있다.

도 10의 예와 같이, 고액 분리부(180)는, 고상 유지부(160)로부터 독립한 구성 부재로서 구성되어 있어도 된다. 이 경우, 장치(100)는, 고상 유지부(160)로부터 고액 분리부(180)로, 용기(170)를 자동 이송시키는 용기 이송부(190)를 포함하고 있어도 된다. 용기 이송부(190)는, 용기(170)를 파지 및 개방하고, 또한 이동시키도록 작동하는 암과, 당해 암의 작동을 제어하는 암 제어부를 포함하여 구성되어 있어도 된다.

고액 분리부(180)를 작동시킴으로써, 액체가 용기(170)의 하부에 회수된다. 따라서, 예를 들면 고상(171)에 흡착된 당쇄를 용출 용기(170)의 하부에 회수할 수 있다.

장치(100)는, 용기(120 또는 170)의 수용물의 온도를 조절하는 온도 조절부(195)를 더 구비하고 있어도 된다. 장치(100)가 온도 조절부(195)를 포함하는 경우, 온도 조절부(195)는, 적어도 히터 기능을 갖고 있으면 된다. 온도 조절부(195)는, 용기(120 또는 170)를, 필요한 온도로 가온할 수 있다.

장치(100)는, 작동할 수 있는 구성 부분(예를 들면, 도입부(141), 암(190), 고액 분리부(180), 온도 조절부(195)) 중 적어도 어느 하나, 바람직하게는 모두가 자동 제어되어도 된다. 이로써, 당단백질로부터의 당쇄의 조제를 보다 신속하게 행할 수 있다.

실시예

이하의 실시예는, 예시만을 의도한 것이며, 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.

재료나 시약은 특별히 설명하지 않는 한, 시판되고 있거나, 또는 당해 기술분야에서 관용의 수법, 공지 문헌의 절차에 따라 입수 또는 조제한 것이다.

[실시예 1]

<모노클로날 항체(IgG1)의 당쇄 분석>

(N결합형 당쇄 유리 반응)

모노클로날 항체(IgG1, 40μg)를 아세트산 칼슘으로 포화시킨 25% 암모니아 수용액 30μL에 용해시키고, 50% 하이드록실아민 수용액을 20μL 첨가하여 혼합한 후, 드래프트 중, 히트 블록을 이용하여 80℃에서 1시간 가열했다. 그 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각하여 1N 염산으로 반응액을 중화시켰다.

(유리된 당쇄의 분석)

그래파이트 카본을 충전한 고상 추출 카트리지(하이퍼셉(HyperSep) 하이퍼카브(Hypercarb) 25mg, 써모 사이언티픽사제)를 이용하여 중화시킨 반응액을 탈염하고, 이어서 피콜린보레인과 2-아미노벤즈아마이드를 이용하여 당쇄를 형광 표지했다. 형광 표지 당쇄는 세파덱스(Sephadex) G-15(GE 헬스케어사제)로 정제한 후, HPLC로 분석했다. 도 1에 그 크로마토그램을 나타냈다. 도 1 중, 가로축은 용출 시간을 나타내고, 세로축은 형광 강도(상댓값)를 나타낸다.

[비교예 1]

종래의 방법과 비교하기 위하여 효소(PNGaseF)를 이용하여 당쇄 유리 반응을 행했다. 모노클로날 항체(IgG1, 40μg)를 100mM 다이싸이오트레이톨과 0.5% SDS를 포함하는 500mM 트리스 염산 완충액(pH8.6) 40μL에 용해시키고, 80℃에서 10분간 가열했다. 그 후, 실온까지 냉각한 후, 5% 노니데트(Nonidet) P-40(40μL)과 증류수 15μL를 첨가하고, 추가로 PNGaseF를 5μL(16mU, 다카라 바이오사(Takara bio Inc.)) 첨가하여 37℃에서 16시간 인큐베이트했다. 그 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각하고 1N 염산으로 반응액을 중화시켰다. 그 후, 고상 추출 카트리지 셉팍(SepPak) C18(50mg, 워터스 코퍼레이션(Waters Corp.))에 제공하고, 증류수로 세정했다. 여과액과 세정액을 합하여, 실시예 1에 기재한 방법에 의하여 고상 추출 카트리지(하이퍼셉 하이퍼카브 25mg)로 탈염 처리, 2-아미노벤즈아마이드에 의한 형광 표지, 세파덱스 G-15(GE 헬스케어사제)에 의한 정제를 거쳐 HPLC에 제공했다. 도 2에 그 크로마토그램을 나타냈다. 도 2 중, 가로축은 용출 시간을 나타내고, 세로축은 형광 강도(상댓값)를 나타낸다. 도 1 및 도 2에 나타내는 바와 같이, 본 실시예의 방법에 의하여, 종래법과 동일한 크로마토그램이 얻어지는 것이 명확해졌다.

[실시예 2]

<인간 혈청 유래 IgG의 당쇄 분석>

(N결합형 당쇄 유리 반응)

인간 혈청 유래 IgG(200μg)의 수용액 20μL를 샘플 튜브에 넣고, 그 튜브에 50% 하이드록실아민 수용액을 10μL 첨가하며, 이어서 25% 암모니아 수용액 25μL와 5μL의 1.2M 수산화 리튬을 첨가하여 혼합한 후, 드래프트 중, 히트 블록을 이용하여 50℃에서 1시간 가열했다. 그 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각하여 1N 염산으로 반응액을 중화시켰다.

(유리된 당쇄의 분석)

실시예 1과 동일한 방법에 의하여, 반응액을 탈염 후, 당쇄를 형광 표지하여 HPLC로 분석했다. 도 3에 그 크로마토그램을 나타냈다. 도 3 중, 가로축은 용출 시간을 나타내고, 세로축은 형광 강도(상댓값)를 나타낸다. 그 결과, 지금까지 보고되어 있는, 인간 혈청 유래 IgG로부터 유리시킨 당쇄의 분석 결과와 동일한 결과가 얻어졌다.

[실시예 3]

<소 페투인의 당쇄 분석>

(O결합형 당쇄 유리 반응)

소 페투인(20μg)을 증류수 38.5μL에 용해시키고, 50% 하이드록실아민 10μL와 다이아자바이사이클로운데센 1.5μL를 첨가하여 혼합한 후, 드래프트 중, 히트 블록을 이용하여 60℃에서 5분간 가열했다. 그 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각하여 1N 염산으로 반응액을 중화시켰다.

(유리된 당쇄의 분석)

실시예 1과 동일한 방법에 의하여, 반응액을 탈염 후, 당쇄를 형광 표지하여 HPLC로 분석했다. 도 4에 그 크로마토그램을 나타냈다. 도 4 중, 가로축은 용출 시간을 나타내고, 세로축은 형광 강도(상댓값)를 나타낸다. 그 결과, 지금까지 보고되어 있는, 소 페투인으로부터 유리시킨 당쇄의 분석 결과와 동일한 결과가 얻어졌다.

[실시예 4]

<소 아포트랜스페린의 당쇄 분석>

(N결합형 당쇄 유리 반응)

소 아포트랜스페린(200μg)의 수용액 20μL를 샘플 튜브에 넣고, 그 튜브에 50% 하이드록실아민 수용액을 20μL 첨가하며, 이어서 1.0M 수산화 리튬을 10μL 첨가하여 혼합한 후, 드래프트 중, 히트 블록을 이용하여 50℃에서 1시간 가열했다. 그 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각하여 1N 염산으로 반응액을 중화시켰다.

(유리된 당쇄의 분석)

실시예 1과 동일한 방법에 의하여, 반응액을 탈염 후, 당쇄를 형광 표지하여 HPLC로 분석했다. 도 5에 그 크로마토그램을 나타냈다. 도 5 중, 가로축은 용출 시간을 나타내고, 세로축은 형광 강도(상댓값)를 나타낸다. 그 결과, N글라이콜일뉴라민산을 함유하는 당쇄도 분석할 수 있는 것이 명확해졌다.

[실시예 5]

<서양 고추냉이 퍼옥시다제의 당쇄 분석>

(N결합형 당쇄 유리 반응)

서양 고추냉이 퍼옥시다제(200μg)를 포함하는 수용액 20μL를 샘플 튜브에 넣고, 그 튜브에 50% 하이드록실아민 수용액을 20μL 첨가하며, 이어서 1.0M 수산화 리튬을 10μL 첨가하여 혼합한 후, 드래프트 중, 히트 블록을 이용하여 50℃에서 1시간 가열했다. 그 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각하여 1N 염산으로 반응액을 중화시켰다.

(유리된 당쇄의 분석)

실시예 1과 동일한 방법에 의하여, 반응액을 탈염 후, 당쇄를 형광 표지하여 HPLC로 분석했다. 도 6에 그 크로마토그램을 나타냈다. 도 6 중, 가로축은 용출 시간을 나타내고, 세로축은 형광 강도(상댓값)를 나타낸다. 그 결과, 환원 말단의 N아세틸글루코사민의 3위에 푸코스를 갖는 N결합형 당쇄의 분석도 가능하다는 것이 명확해졌다.

[실시예 6]

<소 턱밑샘 뮤신의 당쇄 분석>

(O결합형 당쇄 유리 반응)

소 턱밑샘 뮤신(50μg)의 수용액 20μL와 50% 하이드록실아민 20μL와 다이아자바이사이클로운데센 10μL를 혼합한 후, 드래프트 중, 히트 블록을 이용하여 60℃에서 5분간 가열했다. 그 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각하여 1N 염산으로 반응액을 중화시켰다.

(유리된 당쇄의 분석)

실시예 1과 동일한 방법에 의하여, 반응액을 탈염 후, 당쇄를 형광 표지하여 HPLC로 분석했다. 도 7에 그 크로마토그램을 나타냈다. 도 7 중, 가로축은 용출 시간을 나타내고, 세로축은 형광 강도(상댓값)를 나타낸다. 그 결과, 지금까지 보고되어 있는 것과 동일한 결과가 얻어졌다.

[실시예 7]

<각종 조건하에 있어서의 N결합형 당쇄 유리 반응>

(a) 하이드록실아민류, (b) 염기성 시약, 및/또는 (c) 아민류를 포함하는 반응액에 대하여, 시약의 종류나 농도, 온도 조건, 반응 시간 등의 각종 조건을 변경한 각종 시험을 행했다. 각 시험예의 조건 및 수량(收量)을 표 1A 및 표 1B에 나타낸다. 또한, 시험예 1~6에 있어서, 당단백질은 인간 혈청(human serum) IgG 200μg을 이용하고, 시험예 7~80에 있어서는, 모노클로날 항체 M-L001 40μg을 이용했다. 또, 각 시약의 농도는 종농도(終濃度)를 나타내고, 수량은, HPLC에 있어서의 전체 당쇄 피크의 면적값의 합계를 나타낸다. 또, 결과의 "A"는 PNGaseF를 이용한 종래법과 거의 동등한 결과가 얻어진 경우를 나타내고, "B"는 PNGaseF를 이용한 종래법에 비하여 수량이 절반 이하의 결과가 얻어진 경우를 나타내며, "C"는 본래의 당쇄에 첨가하여 분해시킨 당쇄의 피크가 검출된 결과를 나타내고, "D"는 당쇄를 거의 분석할 수 없었던 경우를 나타낸다.

[표 1A]

[표 1B]

(1) 시험예 1, 2는, 수산화 리튬과 암모니아의 병용의 영향을 확인하기 위하여 행했다. 그 결과, 암모니아를 첨가하지 않은 시험예 2와 비교하여, 수산화 리튬과 암모니아를 병용한 시험예 1에서는, 수량이 현저하게 증가했다.

(2) 시험예 4~6에서는, 염기성 시약으로서 알칼리 토류 금속의 칼슘염 또는 수산화 칼슘의 사용을 비교했다. 그 결과, 어느 칼슘 화합물도 양호한 결과를 얻을 수 있고, 특히 수산화 칼슘이 수량이 가장 높았다. 또한, 수산화 리튬과 비교하면, 수량 자체는 낮아졌지만, 분해 반응의 일종인 이성화(에피메리제이션)를 억제할 수 있었다.

(3) 시험예 8~14에서는, 하이드록실아민류의 농도 조건을 변경하여 비교를 행했다. 그 결과, 하이드록실아민은, 0.5%, 150mM에서는 효과를 얻을 수 없었다. 한편, 2%, 600mM로부터 유리된 당쇄의 안정화의 효과를 얻을 수 있었다.

(4) 시험예 15~20에서는, 반응 시간의 조건을 변경하여 비교를 행했다. 그 결과, 암모니아와 아세트산 칼슘을 이용한 80℃의 조건하에 있어서는, 반응 시간이 2시간 정도에 있어서, 가장 바람직한 결과가 얻어졌지만, 2시간을 초과하면 유리된 당쇄의 분해가 진행되는 것을 알 수 있었다.

(5) 시험예 21~26에서는, 염기성 시약(알칼리 촉매)을 변경하여 비교를 행했다. 그 결과, 약알칼리에서도 당쇄의 유리를 행할 수 있고, 각 염기성 시약에 있어서 바람직한 수량 및 결과를 얻을 수 있었다.

(6) 시험예 27~32에서는, 염기성 시약 중 각종 암모니아수에 용해한 알칼리 토류 금속의 염 또는 수산화물을 이용하여 비교를 행했다. 그 결과, 아세트산 마그네슘 이외에는 양호한 결과를 얻을 수 있었다.

(7) 시험예 33~38에서는, 아민을 변경하여 비교를 행했다. 그 결과, 메틸아민, 다이메틸아민은, 수량이 증가하는 한편, 이성화나 아마이드의 분해(디아미데이션)가 촉진되었다. 에틸렌다이아민, 및 에탄올아민의 사용은, 이성화를 억제하면서, 수량을 증가시킬 수 있었다.

(8) 시험예 39~42에서는, 저pKa를 갖는 각종 아민을 이용하여 비교를 행했다. 그 결과, DABCO 및 모폴린에 있어서는, 양호한 수량 및 결과를 얻을 수 있었다. 특히, DABCO는, 디아미데이션을 전혀 확인할 수 없었다.

(9) 시험예 43~48에서는, KOH의 농도를 변경(2mM~2M)하여 비교를 행했다. 그 결과, KOH의 농도가 높은 편이 바람직한 결과를 얻을 수 있었다.

(10) 시험예 49, 50에서는, 염기성 시약으로서의 DBU를 이용하여, 수산화 리튬과 비교했다. 그 결과, DBU를 이용한 편이, 수산화 리튬보다 바람직한 수량을 얻을 수 있었다.

(11) 시험예 51~54에서는, DBU 존재하에 있어서의 하이드록실아민류의 농도를 변경하여 비교를 행했다. 그 결과, 하이드록실아민의 농도가 적어도 10%가 될 때까지는 농도 의존적으로 바람직한 수량 및 결과를 얻을 수 있었다.

(12) 시험예 55~57에서는, DBU 존재하, 50℃에 있어서의 반응 시간(60분~240분)의 변경에 대하여 비교했다. 그 결과, 1시간이 가장 바람직하고, 1시간 이상의 반응 시간에서는, 반응 시간이 늘어날수록, 수량 및 결과가 나빠졌다.

(13) 시험예 58~61에서는, 실온에 있어서의 반응 시간에 대하여 비교했다. 그 결과, 실온에서는 반응 속도가 낮아, 효소를 이용한 반응의 반량 정도의 수량을 얻는 데에 16시간을 필요로 했다.

(14) 시험예 62, 63에서는, 하이드록실아민류로서, 하이드록실아민 염산염의 사용에 대하여 DMSO 중에서 비교, 검토했다(표 중에는, DMSO의 표시 없음). 그 결과, DMSO를 용매로 한 경우에는 반응이 거의 진행되지 않는 것이 판명되었다.

(15) 시험예 64~67에서는, DBU 이외의 각종 유기 염기의 사용에 대하여 비교했다. 그 결과, DBU와 암모니아와의 조합 이외에는, 모두 매우 양호한 수량 및 결과를 얻을 수 있었다.

(16) 시험예 68~71에서는, DBU의 농도의 변경에 대하여 비교했다. 그 결과, DBU는, 농도가 높은 편이 바람직한 수량 및 결과를 얻을 수 있었다. 구체적으로는, 100mM 이상의 DBU를 이용함으로써 우수한 효과를 얻을 수 있었다.

(17) 시험예 72~75에서는, DBU 이외의 각종 유기 염기의 사용에 대하여 비교했다. 그 결과, 양성자 스펀지(Proton sponge)로는, 바람직한 수량을 얻을 수 없었다. 양성자 스펀지 이외의 유기 염기로는, 바람직한 수량 및 결과를 얻을 수 있었다.

(18) 시험예 76~79에서는, 아민류 비존재하에 있어서의 DBU의 농도의 변경에 대하여 비교했다. 그 결과, 100mM 이상의 DBU를 이용함으로써 우수한 효과를 얻을 수 있었다.

(19) 시험예 80에서는, 4% 세틸트라이메틸암모늄 수산화물을 검토했다. 그 결과, 양호한 수량 및 결과를 얻을 수 있었다.

[실시예 8]

<각종 조건하에 있어서의 O결합형 당쇄 유리 반응>

(a) 하이드록실아민류, (b) 염기성 시약, 및/또는 (c) 아민류를 포함하는 반응액에 대하여, 시약의 종류나 농도, 온도 조건, 반응 시간 등의 각종 조건을 변경한 각종 시험을 행했다. 각 시험예의 조건 및 수량을 표 2A 및 표 2B에 나타낸다. 또한, 시험예 1~52에 있어서는, 당단백질로서 소 페투인 20μg을 이용했다. 또, 각 시약의 농도는 종농도를 나타내고, 수량은 HPLC에 있어서의 전체 당쇄 피크의 면적값의 합계를 나타낸다. 또, 결과의 "A"는 당쇄 수량이 2000 이상이고, 또한 필링 산물이 20% 이하인 것을 나타내며, "B"는 필링 산물이 20% 이상 또는 당쇄 수량이 1000 이상 2000 이하인 것을 나타내고, "C"는 당쇄 수량이 200 이상 1000 이하인 것을 나타내며, "D"는 당쇄 수량이 200 이하인 것을 나타낸다.

[표 2A]

[표 2B]

(1) 시험예 3, 4는, 암모니아를 염기성 시약으로서 이용한 경우에 있어서의 칼슘의 유무의 비교를 행했다. 그 결과, 칼슘의 존재에 의하여 수량이 증가하여 바람직한 결과가 되었다.

(2) 시험예 5, 6은, 염기 없이 또는 암모니아보다 약한 염기를 이용하여 비교를 행했다. 그 결과, 암모니아보다 강한 염기성이 당쇄의 유리에는 필요 불가결하다는 것을 알 수 있었다.

(3) 시험예 7~10은, 알칼리의 강도의 차이에 의한 비교를 행했다. 그 결과, 어느 시험예에서도 바람직한 결과를 얻을 수 있었다. 또, 강알칼리 조건하로 함으로써, 수량이 증가했다.

(4) 시험예 11~14에서는, 강알칼리 조건하에서의 온도의 변화에 대하여 비교했다. 그 결과, 60~75℃까지는, 온도의 상승에 따라 수량이 증가하여, 매우 바람직한 결과가 얻어졌다. 한편, 90℃에서도 바람직한 결과는 얻어졌지만, 수량이 약간 저하되고, 필링이 증가하기 시작했다.

(5) 시험예 15~18에서는, 강알칼리 조건하에서의 암모니아 농도의 변화에 대하여 비교했다. 그 결과, 강알칼리 조건하에 있어서는, O결합형 당쇄의 유리에 암모니아의 존재는 불필요했다.

(6) 시험예 19에서는, 하이드록실아민의 유무의 영향에 대하여 비교했다. 그 결과, 하이드록실아민 부존재의 조건에서는, 당쇄의 대부분이 필링을 일으키고 있었다.

(7) 시험예 20~26에서는, 안트라닐산 존재하에서 반응 시간을 변경했을 때의 영향에 대하여 비교했다. 또, 21~26에서는 반응액에 DMSO를 첨가하고 있다. 그 결과, 안트라닐산을 첨가하는 경우에는 DMSO가 필요하고, 시험예의 조건에 있어서 반응 시간 30분까지는, 필링을 억제한 O결합형 당쇄의 유리를 행할 수 있었다. 한편, 30분 이상에서는 필링이 발생하고, 1시간 이상에서는, 필링과는 다른 분해물이 발생하고 있었다.

(8) 시험예 27, 28에서는, LiOH 대신에, 고농도 KOH의 사용을 검토했다. 그 결과는, 고농도의 KOH로는 전혀 O결합형 당쇄를 유리시킬 수 없었다.

(9) 시험예 29, 30에서는, 알칼리(KOH, NaOH)의 검토를 행했다. 그 결과, 어느 알칼리도, 유리한 O결합형 당쇄로서 다이사이알릴 당쇄가 적어, LiOH가 바람직한 결과를 나타냈다.

(10) 시험예 31, 32에서는, DABCO의 효과의 검토를 행했다. 그 결과, DABCO의 첨가에 의하여 수량은 감소하지만, 필링을 억제할 수 있었다.

(11) 시험예 33, 34에서는, 염기성 시약으로서의 DBU와 LiOH와의 비교를 행했다. 그 결과, DBU를 사용한 시험이, 수량이 양호하고, 또 다이사이알릴 당쇄의 양도 상대적으로 많은 결과가 되었다.

(12) 시험예 35~38은, 200mM DBU, 10% 하이드록실아민을 이용했을 때의 반응 시간의 길이에 대하여 비교했다. 그 결과, 실온에서도 O결합형 당쇄의 유리 반응은 시간의 경과마다 진행되었다. 또, 4시간의 반응 후여도, 필링한 당쇄는 거의 없었다.

(13) 시험예 40~44에서는, 다른 유기 염기의 사용을 검토했다. 그 결과, TMG, t-뷰틸 TMG, TBD, MTBD 모두 O결합형 당쇄의 유리를 행할 수 있고, 특히 TMD, TBD, MTBD가 보다 바람직한 수량 및 결과를 얻을 수 있었다.

(14) 시험예 45~47에서는, DBU의 농도에 대하여 검토했다. 그 결과, DBU의 농도가 높은 것이, 수량이 증가했다.

(15) 시험예 48~51에서는, 하이드록실아민의 농도의 검토를 행했다. 그 결과, 하이드록실아민의 양은 DBU보다 상대적으로 많게 함으로써 필링을 억제하는 것이 가능했다.

(16) 시험예 52는, 염기성 시약으로서, 4% 세틸트라이메틸암모늄 수산화물을 이용한 시험 결과를 나타낸다. 양호한 수량 및 결과를 얻을 수 있었다.

[실시예 9]

<모노리스 실리카에 의한 시약 제거를 조합한 소 페투인의 O결합형 당쇄 분석>

(50% 하이드록실아민을 이용한 O형 당쇄 유리 반응)

소 페투인(20μg)을 50% 하이드록실아민 50μL에 용해시키고, 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데스-7-엔(DBU) 10μL를 첨가하여 혼합한 후, 드래프트 중, 히트 블록을 이용하여 60℃에서 20분간 가열했다. 그 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각하여 1N 염산으로 반응액을 중화시켰다.

(50% 하이드록실아민을 이용한 반응으로 유리된 당쇄의 회수)

중화시킨 반응액에 아세톤 200μL 또는 살리실알데하이드 200μL를 각각 첨가하여 교반했다. 또한, 상기의 반응액에 아세토나이트릴 16mL를 첨가하고, 사전에 아세토나이트릴로 평형화시킨 모노리스 실리카(실리카 모노리스 스핀 칼럼, 클린업 칼럼(Cleanup column), 스미토모 베이크라이트사제)에 전체량 어플라이하며, 이어서 아세토나이트릴 1.2mL로 세정했다. 이어서, 10% 아세트산 100μL를 이용하여 모노리스 실리카로부터 당쇄를 용출시켜, 900μL의 순수와 혼합한 후, 실시예 1과 동일하게 하여 그래파이트 카본 카트리지에 의한 탈염 처리를 행하여, 0.1% 트라이플루오로아세트산(TFA)을 포함하는 50% 아세토나이트릴 1mL로 당쇄를 용출하고, 감압 건고했다.

(유리 당쇄의 분석)

건고한 당쇄를 10% 아세트산 25μL에 용해시키고, 피콜린보레인과 2-아미노벤조산을 이용하여 당쇄를 형광 표지했다. 형광 표지 당쇄는, 모노리스 실리카(실리카 모노리스 스핀 칼럼, 클린업 칼럼, 스미토모 베이크라이트사제)로 과잉의 시약을 제거한 후, HPLC로 분석했다.

[실시예 10]

<10% 하이드록실아민을 이용한 O결합형 당쇄 유리 반응>

소 페투인(20μg)을 10% 하이드록실아민 50μL에 용해시키고, DBU 10μL를 첨가하여 혼합한 후, 드래프트 중, 히트 블록을 이용하여 60℃에서 20분간 가열했다. 그 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각하여 1N 염산으로 반응액을 중화시켰다.

(유리 당쇄의 회수)

실시예 1과 동일하게 하여, 그래파이트 카본을 충전한 고상 추출 카트리지(하이퍼셉 하이퍼카브 25mg, 써모 사이언티픽사제)를 이용하여 중화시킨 반응액을 탈염 처리하여, 0.1% TFA를 포함하는 50% 아세토나이트릴 1mL로 당쇄를 용출하고, 감압 건고했다.

(유리 당쇄의 분석)

실시예 9와 동일하게 하여 당쇄를 형광 표지하고, HPLC로 분석했다.

[실시예 11]

<50% 하이드록실아민을 이용한 O결합형 당쇄 유리 반응>

소 페투인(20μg)을 50% 하이드록실아민 50μL에 용해시키고, DBU 10μL를 첨가하여 혼합한 후, 드래프트 중, 히트 블록을 이용하여 60℃에서 20분간 가열했다. 그 후, 즉시 빙욕 중에서 냉각하여 1N 염산으로 반응액을 중화시켰다.

(유리 당쇄의 회수)

(유리 당쇄의 분석)

도 8의 (a)~(d)는, 실시예 9~11에서 형광 표지한 당쇄를 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다. 도 8의 (a)~(d) 중, 가로축은 용출 시간을 나타내고, 세로축은 형광 강도(상댓값)를 나타낸다.

도 8의 (a)는 실시예 10의 결과이고, 도 8의 (b)는 실시예 11의 결과이며, 도 8의 (c)는 실시예 9(아세톤 처리)의 결과이고, 도 8의 (d)는 실시예 9(살리실알데하이드 처리)의 결과이다. 그 결과, 하이드록실아민을 50%의 농도로 이용하여, 아세톤 또는 살리실알데하이드 처리를 실시한 후에 모노리스 실리카에 의한 정제 처리를 거침으로써 필링을 억제하고, 또한 보다 높은 수량으로 당쇄를 분석할 수 있는 것이 명확해졌다.

[실시예 12]

<모노리스 실리카로부터의 당쇄 회수법의 검토>

(50% 하이드록실아민을 이용한 O결합형 당쇄 유리 반응)

중화시킨 반응액에 아세톤 200μL를 첨가하여 교반했다. 또한, 상기의 반응액에 아세토나이트릴 20mL를 첨가하고, 사전에 아세토나이트릴로 평형화시킨 모노리스 실리카(실리카 모노리스 스핀 칼럼, 클린업 칼럼, 스미토모 베이크라이트사제)에 전체량 어플라이하며, 이어서 아세토나이트릴 1.2mL로 세정했다.

(당쇄의 회수 및 분석)

이어서, 10% 아세트산 25μL를 모노리스 실리카에 첨가하고, 용액을 회수했다. 또한, 피콜린보레인과 2-아미노벤조산의 혼합액 25μL를 모노리스 실리카에 첨가 후, 용액을 회수하여, 앞의 용액과 혼합하고 50℃에서 3시간 반응시켜, 당쇄를 형광 표지했다. 형광 표지 당쇄는, 모노리스 실리카(실리카 모노리스 스핀 칼럼, 클린업 칼럼, 스미토모 베이크라이트사제)로 과잉의 시약을 제거한 후, HPLC로 분석했다.

도 9는 실시예 12에서 형광 표지한 당쇄를 HPLC로 분석한 결과를 나타내는 크로마토그램이다. 도 9 중, 가로축은 용출 시간을 나타내고, 세로축은 형광 강도(상댓값)를 나타낸다. 그 결과, 당쇄의 회수 방법을 변경해도, 목적의 당쇄 피크가 얻어지는 것이 확인되었다.

산업상의 이용 가능성

100…장치
110…당단백질
120, 170…용기
130…용기 유지부
140…시약 도입부
141…도입부(반응액 도입부, 케톤 도입부, 알데하이드 도입부, 산무수물 도입부, 표지 시약 도입부)
142, 143, 144…송액관
145, 146, 147…밸브
150…탱크
151…반응액
152…케톤, 알데하이드, 산무수물
153…표지 시약
160…고상 유지부
171…고상
180…고액 분리부
181…랙
182…드라이브 샤프트
183…모터
190…용기 이송부
195…온도 조절부

Claims

당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 방법으로서, 상기 당단백질에, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액을 접촉시켜, 상기 당단백질로부터 유리된 당쇄와 상기 반응액과의 혼합액을 얻는 공정을 포함하는 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 반응액이 상기 (a) 하이드록실아민류를 2~70%(w/w) 포함하는 방법.
청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 반응액이 (c) 아민류를 더 포함하는 방법.
청구항 3에 있어서,
상기 (c) 아민류가, 암모니아수, 메틸아민 수용액, 다이메틸아민 수용액, 에틸아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 에틸렌다이아민, 뷰틸아민, 모폴린, DABCO 및 안트라닐산으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 당단백질로부터 유리된 당쇄가 당쇄 옥심을 포함하는 방법.
청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
상기 당단백질에 상기 반응액을 접촉시키는 공정에 있어서, 상기 반응액의 pH가, 8~14의 범위 내인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (a) 하이드록실아민류가, 하이드록실아민, 하이드록실아민의 염, O치환 하이드록실아민 및 O치환 하이드록실아민의 염으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
상기 (b) 염기성 시약이, 알칼리 금속의 수산화물, 알칼리 금속의 약산염, 알칼리 토류 금속의 수산화물, 암모니아 수용액에 용해된 알칼리 토류 금속의 염 및 유기 염기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나인, 방법.
청구항 8에 있어서,
상기 알칼리 금속의 수산화물이, 수산화 리튬, 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨이고,
상기 알칼리 금속의 약산염이, 중탄산 나트륨 또는 탄산 나트륨이며,
상기 알칼리 토류 금속의 수산화물이, 수산화 칼슘, 수산화 바륨 또는 수산화 스트론튬이고,
상기 알칼리 토류 금속의 염이, 아세트산 칼슘, 염화 칼슘, 아세트산 바륨 또는 아세트산 마그네슘이며,
상기 유기 염기가, 1,8-다이아자바이사이클로[5.4.0]운데스-7-엔, 1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]데스-5-엔, 7-메틸-1,5,7-트라이아자바이사이클로[4.4.0]데스-5-엔, 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘, 2-tert-뷰틸-1,1,3,3-테트라메틸구아니딘 또는 세틸트라이메틸암모늄하이드록사이드인, 방법.
청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 혼합액에 케톤, 알데하이드 또는 산무수물을 첨가하고, 상기 혼합액 중에 잔존하는 (a) 하이드록실아민류를 케톡심, 알독심 또는 아마이드로 변환하는 공정과,
상기 혼합액을, 당쇄에 친화성을 갖는 고상과 접촉시켜, 상기 고상에 상기 당단백질로부터 유리된 당쇄를 흡착시키는 공정과,
상기 고상으로부터 상기 당쇄를 용출시키는 공정을 더 포함하는 방법.
당단백질이 갖는 당쇄의 분석 방법으로서,
청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의하여 당단백질로부터 당쇄를 유리하는 공정과,
유리된 당쇄를 표지하는 공정이고, 당쇄 옥심의 표지를 포함하는 공정을 포함하는 당쇄의 분석 방법.
당단백질로부터 당쇄를 유리하기 위한 키트로서, (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 키트.
청구항 12에 있어서,
(c) 아민류를 더 포함하는 키트.
청구항 12 또는 청구항 13에 있어서,
케톤, 알데하이드 또는 산무수물과, 당쇄에 친화성을 갖는 고상을 더 포함하는 키트.
청구항 12 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 방법을 행하기 위한 설명서를 더 포함하는 키트.
당단백질로부터 당쇄를 유리하기 위한 키트로서, (a) 하이드록실아민류와 병용하여 사용하기 위한 (b) 염기성 시약과 (c) 아민류를 포함하는 키트.
청구항 16에 있어서,
케톤, 알데하이드 또는 산무수물과, 당쇄에 친화성을 갖는 고상을 더 포함하는 키트.
청구항 16 또는 청구항 17에 있어서,
청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 방법을 행하기 위한 설명서를 더 포함하는 키트.
당단백질을 포함하는 시료가 수용되는 용기를 유지하는 용기 유지부와, 상기 용기에 시약을 도입하는 시약 도입부를 구비하고,
상기 시약 도입부가, 상기 용기에 (a) 하이드록실아민류와 (b) 염기성 시약을 포함하는 반응액을 도입하는 반응액 도입부를 포함하는, 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 장치.
청구항 19에 있어서,
상기 시약 도입부가, 상기 용기에 케톤을 도입하는 케톤 도입부, 알데하이드를 도입하는 알데하이드 도입부 또는 산무수물을 도입하는 산무수물 도입부를 더 포함하는, 장치.
청구항 19 또는 청구항 20에 있어서,
당쇄에 친화성을 갖는 고상을 포함하는 용기를 유지하는 고상 유지부를 더 구비하는 장치.