CN113004430B

CN113004430B - 糖蛋白的糖链游离法

Info

Publication number: CN113004430B
Application number: CN202110214471.2A
Authority: CN
Inventors: 龟山昭彦; 豊田雅哲; 阪口碧
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2016-09-27
Filing date: 2017-09-26
Publication date: 2022-12-30
Anticipated expiration: 2037-09-26
Also published as: CN109983034A; EP3521319A1; KR20190038665A; US20190309003A1; EP3521319B1; JPWO2018062167A1; EP3521319C0; JP2020073670A; KR102100181B1; US11325935B2; JP6667856B2; WO2018062167A1; EP3521319A4; CN113004430A

Abstract

一种从糖蛋白游离出糖链的方法，其包括使包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液与所述糖蛋白接触而获得从所述糖蛋白游离出的糖链与所述反应液的混合液的工序。

Description

糖蛋白的糖链游离法

本申请是申请日为2017年9月26日、申请号为201780059475.X、发明名称为“糖蛋白的糖链游离法”的申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种糖蛋白的糖链游离法。本申请基于2016年9月27日于日本申请的专利申请2016-187961号主张优先权，并将其内容援引于此。

背景技术

以抗体医药等生物医药品为代表，大多数蛋白质键合有糖链。在生物医药品中，糖链被指出不仅影响其医药品的活性，还影响抗原性、代谢动力，糖链的分析在生物医药品开发中成为了重要的课题。并且，糖蛋白的糖链能够用作与疾病相关的生物标志物，但为了发现能够成为标志物的糖链，需要分析包含在多样本的生物试样中的糖蛋白的糖链。

并且，在厚生劳动省的《抗体医药品的品质评价指南》中记载有如下内容：从抗体医药品的投药量多的情况或非人型糖链含量根据生产中使用的细胞有可能变得比以往例多的情况考虑，在键合有非人型糖链的情况下，应明确其比例，并且考虑对安全性的影响。因此，在糖链分析中，需要注意不可忽略在人体中不存在的糖链结构，具体而言为N-羟乙酰神经氨酸或Galα1-3Gal结构等。

为了分析糖链，通常首先从糖蛋白游离出糖链，并进行脱盐、除蛋白质等后处理之后，利用质量分析仪分析该糖链，或者对游离出的糖链附加荧光标记并利用配备有荧光检测器的高速液相色谱法、毛细管电泳或它们的组合进行分析。从糖蛋白游离出糖链在任一情况下均成为第一阶段。糖链与蛋白质的键合可分为N-乙酰葡糖胺通过N-糖苷键与蛋白质的天冬酰胺残基的氨基连结的N键型糖链、N-乙酰半乳糖胺通过O-糖苷键与丝氨酸及苏氨酸残基的羟基连结的O键型糖链。为了从蛋白质游离出糖链，使用各自适合的方法。

为了游离出N键型糖链，能够利用PNGaseF或糖肽酶A等酶游离出糖链，但由于底物特异性分别不同，因此需要根据分析对象的生物种类区分使用酶。并且，通常为了提高酶反应的敏感性，预先实施对蛋白质进行改性或利用蛋白酶分解等前处理。

并且，还有通过化学反应游离糖链而不使用酶的方法。例如，在专利文献1中公开有一种将充分干燥的糖蛋白溶解于无水肼，并在100℃加热处理10小时以上的肼分解法，该方法主要用作游离N型糖链的方法。反应后减压蒸馏无水肼，进一步利用碳酸氢钠和乙酸酐进行乙酰化。由于肼还会将与糖链键合的N-乙酰基、N-甘脲基分解而转化为氨基，因此这是通过乙酰化还原的操作。因此，将原本键合有N-甘脲基等其他酰基的情况也全部作为N-乙酰体进行分析。

并且，例如，在专利文献2中还报告有利用水合肼的糖链游离。由于与肼相比，水合肼的处理比较容易且廉价，因此该方法用于大量处理糖蛋白的情况等。然而，该方法与肼分解法同样地需要反应后的肼蒸馏、再乙酰化等后处理。

关于O键型糖链的游离，未发现具有实用性的酶。因此，一直仅利用通过化学反应的游离。作为用于游离的化学反应，广泛使用在强碱水溶液中使糖链β脱离的方法。然而，游离出的糖链在碱的存在下会立即被分解，因此通常使用通过在硼氢化钠的共存下进行反应而将游离出的糖链立即还原为糖醇的方法。

在游离出的糖醇中，用于附加荧光标记的糖链侧的官能团即醛基被还原而转化为醇，因此无法附加荧光标记。因此，通常在将糖醇的所有羟基甲基化(完全甲基化)的基础上利用质量分析仪进行分析。

在专利文献3中公开有一种如下体系：在基于强碱的β脱离中，为了以保存醛基的状态获得O键型糖链，使碱溶液与试样溶液在流路内流动的同时进行短时间反应后立即进行中和处理。

作为以保存醛基的状态以化学方法游离出O键型糖链的其他方法，已知有上述肼分解法。反应后进行肼蒸馏、再乙酰化，并在附加荧光标记之后，利用HPLC等进行分析。

由于基于肼分解法的O键型糖链游离必定伴有糖链的分解，因此还报告有以尽可能抑制分解为目的，在反应体系内添加添加物等的方法。并且，由于基于强碱的β脱离也同样必定伴有分解，因此还对替代强碱使用弱碱的β脱离法进行了研究，并报告了使用浓氨水的方法，使用氨基甲酸铵的方法(专利文献4)等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平3-228000号公报。

专利文献2：日本特开2007-45889号公报。

专利文献3：日本专利第4283272号公报。

专利文献4：日本特开2015-107969号公报。

发明内容

从药物发现阶段至开发阶段直至生产为止，对生物医药品的糖链不均匀性进行监督控制在高品质的生物医药品的制药中逐渐成为重要的课题。要求在开发的各阶段随时、迅速地分析糖链，而不是如到目前为止进行的那样仅作为产品的品质管理分析糖链。并且，关于糖链的分析，在探索与各种疾病相关的病理标志物时，也需要迅速分析多样本的试样。而且，在多样本的分析中成本也成为极大的负担。

如上述，为了分析糖链，从蛋白质游离出糖链成为第一阶段，但以往，为了游离出糖链，包含前处理在内需要长时间。例如，利用酶游离出糖链时，预先利用二硫苏糖醇等还原剂处理蛋白质之后，通过利用碘乙酰胺等烷基化剂进行处理而改性，进一步利用胰蛋白酶等蛋白酶分解为肽之后，使糖链游离酶进行反应而游离出糖链，因此未能在医药品的生产现场采样当天分析糖链。

而且，游离出糖链的酶即PNGaseF、糖肽酶A的价格非常高，因此为了进行多样本的分析会发生相当大的成本负担。

并且，肼分解法需要完全的无水条件，即使在反应体系内混入少量的水，也会导致收率显著降低。因此，需要在预先将试样充分减压干燥的基础上使其反应。而且，反应时间为10小时以上，而且如果包括反应后肼的蒸馏、再乙酰化，则直至整个工序结束为止至少需要2天以上。而且，肼为具有致癌性的毒物，并且还为易爆性的化合物，因此在其处理上需要小心注意。

而且，在肼分解法中，由于N-甘脲基被分解，因此还存在不能分析N-羟乙酰神经氨酸的问题。在生物医药、糖链疾病标志物中，有时有无唾液酸之一的N-羟乙酰神经氨酸会成为问题，因此肼分解法未能以此类目的利用。

另一方面，游离O键型糖链时，不管是肼分解法还是碱β脱离法必定伴有导致在糖链的还原末端的N-乙酰半乳糖胺的3位键合的糖脱离的副反应(剥离反应)。即使为了抑制剥离，进行利用弱碱的β脱离法，还是存在不仅无法避免剥离，游离效率也显著降低的问题。并且，反应时间也需要16小时以上。

并且，在为了抑制剥离而使硼氢化钠共存的方法中，不能将标记剂附加在还原末端，因此未能利用HPLC等以高灵敏度分析。

从以上诸问题考虑，要求如下方法：为了分析糖链，利用安全且廉价的药品，并且不使用特别的体系而在短时间的处理时间内从蛋白质游离出N键型糖链与O键型糖链。

本发明人进行深入研究的结果发现，能够在羟胺的存在下，在水溶液中利用碱性催化剂从蛋白质游离出糖链，并完成了本发明。

即，本发明包括以下的方式。

[1]一种从糖蛋白游离出糖链的方法，其包括：使包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液与所述糖蛋白接触而获得从所述糖蛋白游离出的糖链与所述反应液的混合液的工序。

[2]如[1]所述的方法，其中所述反应液包含2～70％(w/w)的所述(a)羟胺类。

[3]如[1]或[2]所述的方法，其中所述反应液还包含(c)胺类。

[4]如[3]所述的方法，其中所述(c)胺类是从由氨水、甲胺水溶液、二甲胺水溶液、乙胺、二乙胺、乙醇胺、乙二胺、丁胺、吗啉、DABCO、邻氨基苯甲酸组成的组中选出的至少一种化合物。

[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中从所述糖蛋白游离出的糖链包含糖链肟。

[6]如[1]～[5]中任一项所述的方法，其中在使所述反应液与所述糖蛋白接触的工序中，所述反应液的pH在8～14的范围内。

[7]如[1]～[6]中任一项所述的方法，其中所述(a)羟胺类是从由羟胺、羟胺的盐、O-取代羟胺及O-取代羟胺的盐组成的组中选出的至少一种化合物。

[8]如[1]～[7]中任一项所述的方法，其中所述(b)碱性试剂是从由碱金属的氢氧化物、碱金属的弱酸盐、碱土类金属的氢氧化物、溶解于氨水溶液的碱土类金属的盐及有机碱组成的组中选出的至少一种。

[9]如权利要求8所述的方法，其中所述碱金属的氢氧化物为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾，所述碱金属的弱酸盐为碳酸氢钠或碳酸钠，所述碱土类金属的氢氧化物为氢氧化钙、氢氧化钡或氢氧化锶，所述碱土类金属的盐为乙酸钙、氯化钙、乙酸钡或乙酸镁，所述有机碱为1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、1,1,3,3-四甲基胍、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍或十六烷基三甲基氢氧化铵。

[10]如[1]～[9]中任一项所述的方法，其还包括：向所述混合液添加酮、醛或酸酐，将残留在所述混合液中的(a)羟胺类转化为酮肟、醛肟或酰胺的工序；使所述混合液与对糖链具有亲和性的固相接触而使从所述糖蛋白游离出的糖链吸附于所述固相的工序；以及从所述固相洗脱所述糖链的工序。

[11]一种糖链的分析方法，其是糖蛋白所具有的糖链的分析方法，所述分析方法包括：通过[1]～[10]中任一项所述的方法从糖蛋白游离出糖链的工序；以及对所游离出的糖链进行标记且包含糖链肟的标记的工序。

[12]一种试剂盒，其用于从糖蛋白游离出糖链，所述试剂盒包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂。

[13]如[12]所述的试剂盒，其还包含(c)胺类。

[14]如[12]或[13]所述的试剂盒，其还包含：酮、醛或酸酐；以及对糖链具有亲和性的固相。

[15]如[12]～[14]中任一项所述的试剂盒，其还包含用于实施[1]～[10]中任一项所述的方法的说明书。

[16]一种试剂盒，其用于从糖蛋白游离出糖链，所述试剂盒包含用于与(a)羟胺类并用的(b)碱性试剂和(c)胺类。

[17]如[16]所述的试剂，其还包含：酮、醛或酸酐；以及对糖链具有亲和性的固相。

[18]如[16]或[17]所述的试剂盒，其还包含用于实施[1]～[10]中任一项所述的方法的说明书。

[19]一种从糖蛋白游离出糖链的装置，其具备：保持收容包含糖蛋白的试样的容器的保持部、以及将试剂导入所述容器的试剂导入部，所述试剂导入部包括将包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液导入所述容器的反应液导入部。

[20]如[19]所述的装置，其中所述试剂导入部还包括：向所述容器导入酮的酮导入部、导入醛的醛导入部或导入酸酐的酸酐导入部。

[21]如[19]或[20]所述的装置，其还具备：固相保持部，保持包含对糖链具有亲和性的固相的容器。

本发明还能够包含以下的方式。

〔1〕一种从糖蛋白游离出糖链的方法，其涉及包括以下工序的方法：

使包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液与所述糖蛋白接触且所述(a)羟胺类以2～50％(w/w)包含在反应液中。

在此，本发明的从糖蛋白游离出糖链的方法在一实施方式中为

〔2〕上述〔1〕所述的方法，其特征在于，

所述反应液还包含(c)胺类。

并且，本发明的从糖蛋白游离出糖链的方法在一实施方式中为

〔3〕上述〔1〕或〔2〕所述的方法，其特征在于，

从所述糖蛋白游离出的糖链包含糖链肟。

〔4〕上述〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其特征在于，

在使所述反应液与所述糖蛋白接触的工序中，所述反应液的pH在8～14的范围内。

〔5〕上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其特征在于，

所述(a)羟胺类是从由羟胺及其盐类、以及O-取代羟胺及其盐类组成的组中选出的至少一种化合物。

〔6〕上述〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法，其特征在于，

所述(b)碱性试剂是从由碱金属氢氧化物、碱金属弱酸盐、碱土类氢氧化物、溶解于氨水溶液的碱土类的盐及有机碱组成的组中选出的至少一种。

并且，本发明的从糖蛋白游离出糖链的方法在一实施方式为

〔7〕上述〔6〕所述的方法，其特征在于，

所述碱金属氢氧化物、碱金属弱酸盐或碱土类氢氧化物是从由氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钙、氢氧化钡、氢氧化锶组成的组中选出的至少一种，

溶解于所述氨水溶液的碱土类的盐是从由乙酸钙、氯化钙、乙酸钡、乙酸镁组成的组中选出的至少一种。

〔8〕上述〔6〕所述的方法，其特征在于，

所述有机碱是从由1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯、1,1,3,3-四甲基胍、2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍、十六烷基三甲基氢氧化铵组成的组中选出的至少一种。

〔9〕上述〔1〕～〔6〕中任一项所述的方法，其特征在于，

所述(c)胺类是从由氨、甲胺、二甲胺、乙胺、二乙胺、乙醇胺、乙二胺、丁胺、吗啉、DABCO、邻氨基苯甲酸组成的组中选出的至少一种化合物。

并且，本发明在另一方式中为

〔10〕糖蛋白所具有的糖链的分析方法，其涉及包括以下工序的方法：

通过权利要求1至9中任一项所述的方法从糖蛋白游离出糖链的工序；以及

对游离出的糖链进行标记且包含糖链肟的标记的工序。

并且，本发明在另一方式中为

〔11〕一种用于从糖蛋白游离出糖链的试剂盒，

所述试剂盒包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂。

并且，本发明的用于从糖蛋白游离出糖链的试剂盒在一实施方式中为

〔12〕上述〔11〕所述的试剂盒，其特征在于，还包含(a)胺类。

〔13〕用于从糖蛋白游离出糖链的试剂盒，其特征在于，包含用于与(a)羟胺类并用的(b)碱性试剂和(c)胺类。

根据本发明的方法，通过使用安全且廉价的药品，能够抑制糖链的分解，并且能够在短时间的处理时间内从糖蛋白游离出糖链，并且，游离出的糖链能够作为包含糖链肟的混合物进行回收。

尤其，在从糖蛋白游离出N键型糖链方法中，以往在利用肼分解法时由于N-甘脲基被分解，因此未能分析N-羟乙酰神经氨酸，但根据本方法，能够抑制N-甘脲基的分解并且进行糖链的游离。

附图说明

图1表示在实施例1中从单克隆抗体(IgG)游离出的N键型糖链的HPLC色谱。

图2表示在实施例1中通过使用使N键型糖链游离的酶(PNGaseF)的方法，从单克隆抗体(IgG)游离出的N键型糖链的HPLC色谱。

图3表示在实施例2中从人血清IgG游离出的N键型糖链的HPLC色谱。

图4表示在实施例3中从牛胎球蛋白游离出的O键型糖链的HPLC色谱。

图5表示在实施例4中从牛脱铁转铁蛋白游离出的N键型糖链的HPLC色谱。

图6表示在实施例5中从辣根过氧化物酶游离出的N键型糖链的HPLC色谱。

图7表示在实施例6中从牛颌下腺粘蛋白游离出的O键型糖链的HPLC色谱。

图8(a)～图8(d)表示在实施例9～11中从牛胎球蛋白游离出的O键型糖链的HPLC色谱。图8(a)为实施例10的结果，图8(b)为实施例11的结果，图8(c)为实施例9(丙酮处理)的结果，图8(d)为实施例9(水杨醛处理)的结果。

图9表示在实施例12中从牛胎球蛋白游离出的O键型糖链的HPLC色谱。

图10是说明从糖蛋白游离出糖链的装置的一实施方式的示意图。

附图标记说明

100-装置；110-糖蛋白；120、170-容器；130-容器保持部；140-试剂导入部；141-导入部(反应液导入部、酮导入部、醛导入部、酸酐导入部、标记试剂导入部)；142、143、144-送液管；145、146、147-阀；150-罐；151-反应液；152-酮、醛、酸酐；153-标记试剂；160-固相保持部；171-固相；180-固液分离部；181-支架；182-传动轴；183-马达；190-容器移送部；195-温度调节部。

具体实施方式

在本说明书中，“糖蛋白”是指在蛋白质的氨基酸序列中，键合有O键型糖链或N键型糖链中的至少一种以上的蛋白质。能够适用本发明的糖蛋白，并无特别限制，可以是天然由来，也可以是合成的糖蛋白。

“糖链”中包含O键型糖链及N键型糖链。O键型糖链为在蛋白质的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的氨基酸残基中，通过各氨基酸侧链所含的-OH基键合有糖链的结构。并且，O键型糖链根据核的结构被分类为1至8种。并且，N键型糖链是指与蛋白质的天冬酰胺残基的侧链的酰胺基的氮原子键合的糖链。N键型糖链包含以甘露糖为基点形成分支的部分，例如有2条支链、3条支链、4条支链等。并且，N键型糖链根据其结构能够分类为基本型、高甘露糖型、混合型、复合型等。

在本发明中，O键型糖链及N键型糖链中任一个的糖链均能够作为从糖蛋白游离的对象。

[从糖蛋白游离出糖链的方法]

一实施方式中，本发明提供一种从糖蛋白游离出糖链的方法，其包括：使包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液与所述糖蛋白接触，而获得从所述糖蛋白游离出的糖链与所述反应液的混合液的工序。通过使包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液与糖蛋白接触，能够从该糖蛋白游离出糖链。

在此，所谓“使包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液与糖蛋白接触”，只要糖蛋白、(a)羟胺类及(b)碱性试剂最终成为接触的状态即可，不论其混合顺序如何。例如，可以首先向糖蛋白添加(a)羟胺类，然后添加(b)碱性试剂。或者也可以首先向糖蛋白添加(b)碱性试剂，然后添加(a)羟胺类。或者还可以首先混合(a)羟胺类和(b)碱性试剂，并对其添加糖蛋白。另外，在O键型糖链的情况下，为了抑制糖链的分解，优选先添加羟胺类。

在此，作为能够用于本实施方式的“(a)羟胺类”，能够举出羟胺、羟胺的盐、O-取代羟胺、O-取代羟胺的盐。具体而言，例如能够举出从由羟胺盐酸盐、羟胺水溶液、羟胺硫酸盐、羟胺磷酸盐、O-甲基羟胺盐酸盐、O-乙基羟胺盐酸盐、O-(四氢-2H-吡喃-2-基)羟胺、硝基苄基羟胺盐酸盐、O-叔丁基二甲基甲硅烷基羟胺、O-三甲基甲硅烷基羟胺组成的组中选出的至少一种化合物，但并不限于此。另外，可以组合使用上述化合物中的两种以上。在优选实施方式中，“(a)羟胺类”为羟胺水溶液。

反应液中的“(a)羟胺类”的最终浓度能够设为例如2～70％(w/w)，例如2～50％(w/w)的浓度范围。然而，并不限定于上述浓度范围，若为本领域技术人员，则能够根据作为对象的糖蛋白的种类、反应液中的其他成分(胺类、碱性试剂、其他添加剂)、反应条件(时间、温度等)等适当调整。

本发明人明确了：尤其在游离出O键型糖链时，优选“(a)羟胺类”的最终浓度尽可能高。因此，游离出O键型糖链时，“(a)羟胺类”的最终浓度可以在例如10～70％(w/w)，例如30～60％(w/w)的浓度范围，尤其优选为约50％(w/w)。

另外，游离出N键型糖链时，“(a)羟胺类”的最终浓度能够设为2～50％(w/w)，优选能够设为10～20％(w/w)。在更优选的实施方式中为10％(w/w)。

将羟胺用作“(a)羟胺类”时，若羟胺的浓度为大于2％(w/w)且50％(w/w)以下，则有获得充分的糖链回收量、羟胺也稳定的倾向。

并且，作为能够用于本实施方式的“(b)碱性试剂”，能够举出从由碱金属的氢氧化物、碱金属的弱酸盐、碱土类金属的氢氧化物、溶解于氨水的碱土类金属的盐及有机碱组成的组中选出的至少一种化合物。

作为碱金属的氢氧化物，例如能够举出氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾，但并不限于此。

并且，作为碱金属的弱酸盐，例如能够举出碳酸氢钠、碳酸钠，但并不限于此。

并且，作为碱土类金属的氢氧化物，例如能够举出氢氧化钙、氢氧化钡、氢氧化锶，但并不限于此。

并且，作为溶解于氨水的碱土类的盐，例如能够举出乙酸钙、氯化钙、乙酸钡、乙酸镁，但并不限于此。

其中，尤其优选氢氧化锂。

并且，作为有机碱，例如能够举出DBU：1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(1,8-diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene)、TBD：1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(1,5,7-Triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene)、MTBD：7-甲基-1,5,7-三氮杂双环[4.4.0]癸-5-烯(7-Methyl-1,5,7-triazabicyclo[4.4.0]dec-5-ene)、TMG：1,1,3,3-四甲基胍(1,1,3,3-Tetramethylguanidine)、t-BuTMG：2-叔丁基-1,1,3,3-四甲基胍(2-tert-Butyl-1,1,3,3-tetramethylguanidine)、DBN：1,5-二氮杂双环[4.3.0]壬-5-烯(1,5-diazabicyclo[4.3.0]non-5-ene)、CTAH：十六烷基三甲基氢氧化铵(cetyltrimethylammoniumhydroxide)等，但并不限于此。另外，也可以组合使用上述化合物中的两种以上。在优选实施方式中，“有机碱”为有机强碱(pKa12以上)，具体而言，能够举出DBU、TMG、TBD、MTBD、CTAH。将这些DBU、TMG、TBD、MTBD、CTAH用作“有机碱”，从而能够通过基于有机溶剂的清洗来去除反应后的碱基，在这一方面优选。

反应液中的“(b)碱性试剂”的最终浓度例如能够设为2mM～2M的浓度范围。然而，并不限定于上述浓度范围，若为本领域技术人员，则能够根据作为对象的糖蛋白的种类、反应液中的其他成分(羟胺类、其他添加剂)、反应条件(时间、温度等)等适当调整。另外，例如，将氢氧化锂用作“(b)碱性试剂”时，能够设为6mM～1M，优选能够设为100mM～500mM。在更优选的实施方式中为100mM～200mM。若碱性试剂的浓度小于2mM，则在反应时间变长这一方面不优选，若超过2M，则在糖链的回收率降低这一方面不优选。

本实施方式所涉及的从糖蛋白游离出糖链的方法通过使包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液与糖蛋白接触而从糖蛋白游离出糖链。在此情况下，相对于该反应液以2～70％(w/w)的范围包含(a)羟胺类。

在此情况下，反应液中的(a)羟胺类与(b)碱性试剂的摩尔比优选设为1:1至300:1，更优选设为3:1至200:1。通过将(a)羟胺类与(b)碱性试剂的摩尔比设为上述范围，能够抑制游离出的糖链的分解反应。

并且，反应液的pH能够设在8～14的范围内，更优选设在10～13的范围内。

在使成为对象的糖蛋白与该反应液接触的工序中，温度、反应时间的条件只要能够从成为对象的蛋白质游离出糖链，则并无特别限定，本领域技术人员能够根据成为对象的糖蛋白、羟胺类、碱性试剂的种类、浓度等的条件适当设定。另外，温度例如能够设为室温～80℃。另外，N-甘脲基等若在高温条件下反应，则容易分解，因此将具有未知的糖链的糖蛋白作为对象时，优选设为50℃以下。并且，反应时间也能够根据条件设为约5分钟～16小时。

并且，本实施方式所涉及的从糖蛋白游离出糖链的方法在一实施方式中，还能够向反应液添加“(c)胺类”。作为能够用于本实施方式的“(c)胺类”，例如能够举出从由氨水、甲胺水溶液、二甲胺水溶液、乙胺、二乙胺、乙醇胺、乙二胺、丁胺、吗啉、DABCO、邻氨基苯甲酸组成的组中选出的至少一种化合物，但并不限于此。并且，可以组合使用上述化合物中的两种以上。在优选实施方式中，“(c)胺类”为氨水、吗啉、DABCO、邻氨基苯甲酸。通过将氨水、吗啉、DABCO、邻氨基苯甲酸等用作“(c)胺类”，在可抑制剥离、异构化、酰胺的分解这一方面优选。尤其，在使用pKa比氨低的吗啉、DABCO、邻氨基苯甲酸等时，在能够抑制作为游离出N键型糖链时的副反应的异构化这一方面优选。

反应液中的“(c)胺类”的最终浓度例如能够设为40mM～15M的浓度范围。然而，并不限定于上述浓度范围，若为本领域技术人员，则能够根据作为对象的糖蛋白的种类、反应液中的其他成分(羟胺类、碱性试剂、其他添加剂)、反应条件(时间、温度等)等适当调整。另外，例如，将氨水用作“(c)胺类”时，反应液中的氨的最终浓度能够设为2～25％(w/w)，优选能够设为10～20％(w/w)。在更优选的实施方式中为20％(w/w)。

[糖链的分析方法]

在一实施方式中，本发明提供一种糖蛋白所具有的糖链的分析方法，其包括通过上述方法从糖蛋白游离出糖链的工序和对游离出的糖链进行标记的工序。

对本实施方式的分析方法而言，在对游离出的糖链进行标记的工序中，也对糖链肟进行标记。详细内容将后述。

从糖蛋白游离出糖链之后的反应溶液能够利用公知的方法(例如，填充有石墨碳的固相萃取柱)进行脱盐处理，并用于分析反应溶液中所包含的糖链。

作为游离在溶液中的糖链的分析方法，能够适当采用公知的方法。例如，如在下述实施例中所采用，能够利用使用甲基吡啶硼烷与2-氨基苯甲酰胺的荧光标记法。

另外，通过上述方法游离出的糖链中，成为醛型的一部分形成糖链肟。即，在以往的方法中，在作为游离后的糖链的官能团的醛基被还原而转化为糖醇时，未能直接进行荧光标记。并且，在以往的方法中，在作为糖链的官能团的醛基通过肼转化为腙时，为了附加荧光标记，需要通过再乙酰化操作还原为原来的游离糖链。

相对于此，根据上述方法获得了游离成能够直接进行标记的糖链肟的糖链。即，根据本实施方式的方法，从糖蛋白游离出的糖链包含糖链肟。糖链肟能够直接进行标记。

因此，通过上述方法获得的游离糖链能够作为糖胺、糖链肟、在还原末端具有半缩醛性羟基的通常的糖链的混合物在溶液中获得，并能够将这些一并标记。

如上述，本发明人明确了：尤其在游离出O键型糖链时，优选(a)羟胺类的最终浓度尽可能高。

然而，糖蛋白与反应液的混合液包含高浓度的(a)羟胺类时，有在游离出糖链后的混合液中残留未反应的(a)羟胺类的情况。未反应的(a)羟胺类会阻碍糖链的荧光标记反应，因此优选去除。

因此，上述方法还可以包括去除未反应的(a)羟胺类的追加工序。即，上述方法还可以包括：向糖蛋白与反应液的混合液添加酮、醛或酸酐，将残留在混合液中的(a)羟胺类转化为酮肟、醛肟或酰胺的工序；使所述混合液与对糖链具有亲和性的固相接触而使从所述糖蛋白游离出的糖链吸附于所述固相的工序；以及，从所述固相洗脱所述糖链的工序。

能够通过使酮与(a)羟胺类反应而转化为酮肟。并且，能够通过使醛与(a)羟胺类反应而转化为醛肟。并且，能够通过使酸酐与(a)羟胺类反应而转化为酰胺。

作为酮，能够使用丙酮、甲乙酮、甲基异丁酮、4-羟基丁酮等。并且，作为醛，能够使用水杨醛、苯甲醛、4-羟基苯甲醛等。并且，作为酸酐，能够使用乙酸酐、琥珀酸酐等。

接着，从上述混合液回收糖链。具体而言，通过使上述混合液与对糖链具有亲和性的固相接触而使从所述糖蛋白游离出的糖链吸附于所述固相，接着从所述固相洗脱所述糖链，由此能够从上述混合液回收糖链。

通过以上操作，能够从由糖蛋白游离出的糖链去除未反应的(a)羟胺类。

对糖链具有亲和性的固相，并无特别限制，例如可举出石墨碳、结晶纤维素、二氧化硅、整体二氧化硅等亲水性载体等，尤其优选整体二氧化硅。整体二氧化硅是指具有3维网状结构的滤网状的多孔质连续体二氧化硅，相较于以往的粒子状二氧化硅，具有通液性良好，死体积少等优点。整体二氧化硅可以固定于柱状的容器，例如可以固定于多孔板。

关于整体二氧化硅的孔径，优选相互连续的细孔(通孔)径为1～100μm，更优选为1～50μm，进一步优选为1～30μm，尤其优选为1～20μm。

将添加了酮、醛或酸酐的混合液注入固定有亲水性载体的柱或多孔板，并通过自然落下、抽吸、加压、离心等方法使其通过之后，用清洗液清洗，并添加洗脱液而洗脱糖链即可。

施用于亲水性载体的添加有酮、醛或酸酐的混合液优选包含90体积％以上的有机溶剂，更优选包含95体积％以上的有机溶剂。作为有机溶剂，能够使用乙腈、甲醇、乙醇、2-丙醇、己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃等，尤其优选乙腈。

优选将添加有酮、醛或酸酐的混合液施用于亲水性载体之后，用清洗液清洗亲水性载体。清洗液优选包含90体积％以上的有机溶剂和10体积％以下的水，更优选包含95体积％以上的有机溶剂和5体积％以下的水。作为清洗液中包含的有机溶剂，能够使用乙腈、甲醇、乙醇、2-丙醇、己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃等，尤其优选乙腈。可以使用组成不同的清洗液，例如可以在用100％乙腈清洗之后，用乙腈:水＝95:5(v/v)的混合液清洗。

在清洗操作之后，向亲水性载体中添加洗脱液并洗脱糖链。洗脱液优选包含10体积％以上的水，更优选包含50体积％以上的水，尤其优选水。作为洗脱液所包含的除水以外的成分，优选为从乙腈及以甲醇、乙醇、丙醇、丁醇为代表的醇中选出的有机溶剂。洗脱的糖链能够供于荧光标记反应。

[试剂盒]

在一实施方式中，本发明提供一种用于从糖蛋白游离出糖链的试剂盒，所述试剂盒包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂。并且，本实施方式的试剂盒在一方式的方式中是除(a)羟胺类和(b)碱性试剂以外还包含(c)胺类的试剂盒。并且，本实施方式的用于从糖蛋白游离出糖链的试剂盒在另一实施方式中为包含用于与(a)羟胺类并用的(b)碱性试剂和(c)胺类的试剂盒。

除此以外，本实施方式的试剂盒还能够包含在从糖蛋白游离出糖链的工序中使用的试剂((a)羟胺类、(c)胺类、其他添加物等)、酮、醛或酸酐、在糖链的纯化中使用的载体(对糖链具有亲和性的固相)、在糖链的分析中使用的试剂(荧光试剂等)、检测设备、记载有从糖蛋白游离出糖链的方法的具体步骤的说明书等。

[装置]

在一实施方式中，本发明提供一种从糖蛋白游离出糖链的装置，其具备：保持收容包含糖蛋白的试样的容器的保持部、以及将试剂导入所述容器的试剂导入部，所述试剂导入部包括将包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液导入所述容器的反应液导入部。另外，以下说明的装置的结构仅仅是一个例子，本实施方式的装置并不受该结构的限定。

图10是说明本实施方式的装置的示意图。装置100具备保持收容包含糖蛋白的试样110的容器120的容器保持部130和将试剂导入容器120的试剂导入部140，试剂导入部140包括将包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液151导入容器120的反应液导入部141。

容器保持部130用于保持收容包含糖蛋白的试样110的容器120。容器保持部130保持容器120的方式并无特别限定，例如可举出使容器的大部分嵌入容器保持部130的保持穴或保持孔的方式。此外，可举出将容器保持部的卡合凸部(卡合凹部)卡合在容器的卡合凹部(卡合凸部)而保持的方式、用容器保持部的夹持部夹持容器而保持的方式等。

试剂导入部140用于将试剂导入由容器保持部130保持的容器120的内部或由后述固相保持部160保持的容器170的内部。试剂导入部140至少包括将包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液151导入容器120的反应液导入部141。

试剂导入部140还可以包括向容器120导入酮的酮导入部、导入醛的醛导入部或导入酸酐的酸酐导入部。

在图10的例子中，试剂导入部140具备：收容有反应液151、酮、醛或酸酐152、标记试剂153的罐150；输送由罐150收容的各试剂的送液管142、143、144；控制各试剂的送液的阀145、146、147；以及将各试剂导入容器120或容器170的内部的导入部141。在图10的例子中，导入部141兼作反应液导入部、酮导入部、醛导入部或酸酐导入部、标记试剂导入部。反应液151包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂。

试剂导入部140将试剂导入容器120或容器170的内部的方式并无特别限定，例如，可举出从储存有待送液的液体的送液源151、152、153经由管状部件送液至容器120或容器170的内部的方式。此外，可举出将采集到管状部件中的液体注入反应容器内的方式等。

反应液导入部、酮导入部或醛导入部、标记试剂导入部可以构成为各自独立的构成部件，也可以构成为同一构成部件。

装置100还可以具备保持包含对糖链具有亲和性的固相171的容器170的固相保持部160。固相保持部160的结构可以与容器保持部130的结构相同。并且，装置100还可以具备对容器170的收容物进行固液分离的固液分离部180。装置100包含固液分离部180时，固液分离部180从容器170中包含的收容物分离出固体和液体。在此，实质上，固体是固相10及被其吸附的糖链。

作为固液分离部180的具体的分离形式，并无特别限定，可以为离心、减压、加压中的任一种。在图10的例子中，固液分离部180的分离形式为离心。固液分离部180具备保持容器170的支架181、传动轴182、马达183。

如图10的例子，固液分离部180可以构成为独立于固相保持部160的构成部件。此时，装置100可以包含将容器170从固相保持部160自动移送至固液分离部180的容器移送部190。容器移送部190可以构成为包含以把持及放开且移动容器170的方式动作的臂、以及控制该臂的动作的臂控制部。

通过使固液分离部180动作，液体被回收至容器170的下部。因此，例如能够将吸附于固相171的糖链洗脱而回收至容器170的下部。

装置100还可以具备调节容器120或170的收容物的温度的温度调节部195。装置100包含温度调节部195时，温度调节部195至少具有加热功能即可。温度调节部195能够将容器120或170加热至所需温度。

装置100的能够动作的构成部分(例如，导入部141、臂190、固液分离部180、温度调节部195)中的至少任一个可以进行自动控制，优选全部可以进行自动控制。由此，能够更加迅速地由糖蛋白制备糖链。

实施例

以下实施例仅以例示为目的，并不限定本发明的技术范围。

只要无特别指明，材料、试剂为市售品或按照在该技术领域中惯用的方法、公知文献的步骤获得或制备。

[实施例1]

＜单克隆抗体(IgG1)的糖链分析＞

(N键型糖链游离反应)

将单克隆抗体(IgG1、40μg)溶解于用乙酸钙饱和的25％氨水溶液30μL中，添加50％羟胺水溶液20μL并进行混合之后，在通风室中，使用加热块以80℃加热了1小时。然后，立即在冰浴中冷却并用1N盐酸中和了反应液。

(游离出的糖链的分析)

利用填充有石墨碳的固相萃取柱(HyperSep Hypercarb 25mg，赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific Inc.)制造)对经中和后的反应液进行脱盐，接着利用甲基吡啶硼烷和2-氨基苯甲酰胺对糖链进行了荧光标记。利用Sephadex G-15(GE医疗(GEHealthcare)制造)纯化之后，通过HPLC分析了荧光标记糖链。在图1示出了其色谱。在图1中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示荧光强度(相对值)。

[比较例1]

为了与以往的方法进行比较，利用酶(PNGaseF)进行了糖链游离反应。将单克隆抗体(IgG1、40μg)溶解于包含100mM二硫苏糖醇和0.5％SDS的500mM Tris-HCl缓冲液(pH8.6)40μL中，并以80℃加热了10分钟。然后，冷却至室温后，添加5％Nonidet P-40(40μL)和蒸馏水15μL，进一步添加PNGaseF 5μL(16mU，宝生物公司(Takara bio Inc.))，并以37℃孵育了16小时。然后，立即在冰浴中冷却并用1N盐酸中和了反应液。然后，供于固相萃取柱SepPakC18(50mg，沃特世公司(Waters Corp.))，并用蒸馏水进行了清洗。将滤液和清洗液合并，并通过实施例1中记载的方法，经过基于固相萃取柱(HyperSep Hypercarb 25mg)的脱盐处理、基于2-氨基苯甲酰胺的荧光标记、基于Sephadex G-15(GE医疗制造)的纯化而供于HPLC。在图2示出了其色谱。在图2中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示荧光强度(相对值)。如图1及图2所示，明确了通过本实施例的方法可获得与以往方法相同的色谱。

[实施例2]

＜人血清IgG的糖链分析＞

(N键型糖链游离反应)

将人血清IgG(200μg)的水溶液20μL加入样品管，向该管添加50％羟胺水溶液10μL，接着添加25％氨水溶液25μL和1.2M氢氧化锂5μL并进行混合之后，在通风室中，利用加热块以50℃加热了1小时。然后，立即在冰浴中冷却并用1N盐酸中和了反应液。

(游离出的糖链的分析)

以与实施例1相同的方法，对反应液进行脱盐后，对糖链进行荧光标记并利用HPLC进行了分析。在图3示出了其色谱。在图3中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示荧光强度(相对值)。其结果，获得了与到目前为止所报告的从人血清IgG游离出的糖链的分析结果相同的结果。

[实施例3]

＜牛胎球蛋白的糖链分析＞

(O键型糖链游离反应)

将牛胎球蛋白(20μg)溶解于蒸馏水38.5μL中，添加50％羟胺10μL和二氮杂双环十一碳烯1.5μL并进行混合之后，在通风室中，利用加热块以60℃加热了5分钟。然后，立即在冰浴中冷却并用1N盐酸中和了反应液。

(游离出的糖链的分析)

通过与实施例1相同的方法，对反应液进行脱盐后，对糖链进行荧光标记并利用HPLC进行了分析。在图4示出了其色谱。在图4中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示荧光强度(相对值)。其结果，获得了与到目前为止所报告的从牛胎球蛋白游离出的糖链的分析结果相同的结果。

[实施例4]

＜牛脱铁转铁蛋白的糖链分析＞

(N键型糖链游离反应)

将牛脱铁转铁蛋白(200μg)的水溶液20μL加入样品管中，向该管添加50％羟胺水溶液20μL，接着添加1.0M氢氧化锂10μL并进行混合之后，在通风室中，利用加热块以50℃加热了1小时。然后，立即在冰浴中冷却并用1N盐酸中和了反应液。

(游离出的糖链的分析)

通过与实施例1相同的方法，对反应液进行脱盐后，对糖链进行荧光标记并利用HPLC进行了分析。在图5示出了其色谱。在图5中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示荧光强度(相对值)。其结果，明确了也能够分析含有N-羟乙酰神经氨酸的糖链。

[实施例5]

＜辣根过氧化物酶的糖链分析＞

(N键型糖链游离反应)

将包含辣根过氧化物酶(200μg)的水溶液20μL加入样品管中，向该管添加50％羟胺水溶液20μL，接着添加1.0M氢氧化锂10μL并进行混合之后，在通风室中，利用加热块以50℃加热了1小时。然后，立即在冰浴中冷却并用1N盐酸中和了反应液。

(游离出的糖链的分析)

通过与实施例1相同的方法，对反应液进行脱盐后，对糖链进行荧光标记并利用HPLC进行了分析。在图6示出了其色谱。在图6中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示荧光强度(相对值)。其结果，明确了也能够分析在还原末端的N-乙酰葡糖胺的3位具有岩藻糖的N键型糖链。

[实施例6]

＜牛颌下腺粘蛋白的糖链分析＞

(O键型糖链游离反应)

混合牛颌下腺粘蛋白(50μg)的水溶液20μL、50％羟胺20μL及二氮杂双环十一碳烯10μL之后，在通风室中，利用加热块以60℃加热了5分钟。然后，立即在冰浴中冷却并用1N盐酸中和了反应液。

(游离出的糖链的分析)

通过与实施例1相同的方法，对反应液进行脱盐后，对糖链进行荧光标记并利用HPLC进行了分析。在图7示出了其色谱。在图7中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示荧光强度(相对值)。其结果，获得了与到目前为止所报告的结果相同的结果。

[实施例7]

＜在各种条件下的N键型糖链游离反应＞

对包含(a)羟胺类、(b)碱性试剂和/或(c)胺类的反应液，进行了变更试剂的种类、浓度、温度条件、反应时间等各种条件的各种试验。将各试验例的条件及产量示于表1A及表1B。另外，在试验例1～6中，糖蛋白使用了200μg的人血清(human serum)IgG，在试验例7～80中使用了40μg的单克隆抗体M-L001。并且，各试剂的浓度表示最终浓度，产量表示HPLC中的所有糖链峰的面积值的合计。并且，结果“A”表示获得了与使用PNGaseF的以往方法几乎相等的结果，“B”表示获得了与使用PNGaseF的以往方法相比产量为一半以下的结果，“C”表示除原来的糖链以外还检测到已分解的糖链的峰的结果，“D”表示几乎未能分析糖链。

表1A

表1B

(1)为了确认并用氢氧化锂和氨的影响，实施了试验例1、2。其结果，与未添加氨的试验例2相比，在并用了氢氧化锂和氨的试验例1中，产量显著增加。

(2)在试验例4～6中，作为碱性试剂，比较了碱土类金属的钙盐或氢氧化钙的使用。其结果，任意钙化合物均获得了良好的结果，尤其，使用氢氧化钙时的产量最高。另外，若与氢氧化锂相比，则产量本身虽有下降，但实现了对分解反应之一的异构化(差向异构化)的抑制。

(3)在试验例8～14中，变更羟胺类的浓度条件而进行了比较。其结果，羟胺在0.5％、150mM的条件下未能获得效果。另一方面，从2％、600mM起获得了游离出的糖链的稳定化的效果。

(4)在试验例15～20中，变更反应时间的条件而进行了比较。其结果，可知在使用了氨和乙酸钙的80℃的条件下，在反应时间为2小时左右时获得了最优选的结果，但若超过2小时，则游离出的糖链会进行分解。

(5)在试验例21至26中，变更碱性试剂(碱催化剂)而进行了比较。其结果，用弱碱也实现了糖链的游离，并在各碱性试剂的情况下获得了优选产量及结果。

(6)在试验例27～32中，在碱性试剂中使用溶解于各种氨水中的碱土类金属的盐或氢氧化物，进行了比较。其结果，除使用乙酸镁的情况以外均获得了良好的结果。

(7)在试验例33～38中，变更胺而进行了比较。其结果，在使用甲胺、二甲胺的情况下，产量增加，但另一方面促进了异构化、酰胺的分解(脱酰胺)。乙二胺及乙醇胺的使用抑制了异构化，并且增加了产量。

(8)在试验例39～42中，使用具有低pKa的各种胺而进行了比较。其结果，在使用DABCO及吗啉的情况下，获得了良好的产量及结果。尤其，在DABCO的情况下完全未发现脱酰胺。

(9)在试验例43～48中，变更KOH的浓度(2mM～2M)而进行了比较。其结果，获得了KOH的浓度越高越优选的结果。

(10)在试验例49、50中，将DBU用作碱性试剂而与氢氧化锂进行了比较。其结果，使用DBU时获得了比氢氧化锂更优选的产量。

(11)在试验例51至54中，变更DBU存在下的羟胺类的浓度而进行了比较。其结果，到羟胺的浓度达到至少10％为止，获得了与浓度相应地优选的产量及结果。

(12)在试验例55～57中，对在DBU存在下、50℃条件下的反应时间(60分钟～240分钟)的变更进行了比较。其结果，最优选为1小时，在1小时以上的反应时间的情况下，反应时间越延长，产量及结果变得越差。

(13)在试验例58～61中，对室温条件下的反应时间进行了比较。其结果，在室温条件下反应速度慢，获得使用酶的反应的一半量左右的产量时用了16小时。

(14)在试验例62、63中，作为羟胺类，在DMSO中对羟胺盐酸盐的使用进行了比较、研究(在表中未显示DMSO)。其结果，确认了在将DMSO设为溶剂时几乎未进行反应。

(15)在试验例64～67中，对除DBU以外的各种有机碱的使用进行了比较。其结果，除DBU与氨的组合以外，均获得了非常良好的产量及结果。

(16)在试验例68～71中，对DBU的浓度的变更进行了比较。其结果，DBU的浓度越高，获得了越优选的产量及结果。具体而言，通过使用100mM以上的DBU获得了优异的效果。

(17)在试验例72～75中，对除DBU以外的各种有机碱的使用进行了比较。其结果，质子海绵(Proton sponge)未能获得优选产量。使用除质子海绵以外的有机碱时，获得了优选产量及结果。

(18)在试验例76～79中，对不存在胺类的条件下的DBU的浓度的变更进行了比较。其结果，通过使用100mM以上的DBU获得了优异的效果。

(19)在试验例80中，研究了4％十六烷基三甲基氢氧化铵。其结果，获得了良好的产量及结果。

[实施例8]

＜在各种条件下的O键型糖链游离反应＞

对包含(a)羟胺类、(b)碱性试剂和/或(c)胺类的反应液，进行了变更试剂的种类、浓度、温度条件、反应时间等各种条件的各种试验。将各试验例的条件及产量示于表2A及表2B。另外，在试验例1～52中，作为糖蛋白使用了牛胎球蛋白20μg。并且，各试剂的浓度表示最终浓度，产量表示HPLC中的所有糖链峰的面积值的合计。并且，结果“A”表示糖链产量为2000以上且剥离产物为20％以下，“B”表示剥离产物为20％以上或糖链产量为1000以上且2000以下，“C”表示糖链产量为200以上且1000以下，“D”表示糖链产量为200以下。

表2A

表2B

(1)在试验例3、4中，对将氨用作碱性试剂时钙的有无进行了比较。其结果，通过钙的存在，产量增加，从而成为优选结果。

(2)在试验例5、6中，在无碱的条件下或使用比氨更弱的碱而进行了比较。其结果，可知比氨更强的碱性对糖链的游离来说必不可少。

(3)在试验例7～10中，进行了基于碱强度的不同的比较。其结果，在任意试验例中均获得了优选结果。并且，通过设为强碱条件，产量增加。

(4)在试验例11至14中，对强碱条件下的温度的变化进行了比较。其结果，到60～75℃为止，随着温度的上升，产量增加，获得了非常优选的结果。另一方面，在90℃也获得了优选结果，但产量略微下降，剥离开始增加。

(5)在试验例15～18中，对强碱条件下的氨浓度的变化进行了比较。其结果，在强碱条件下，O键型糖链的游离无需氨的存在。

(6)在试验例19中，对羟胺的有无所产生的影响进行了比较。其结果，在不存在羟胺的条件下，大部分糖链产生了剥离。

(7)在试验例20～26中，对在邻氨基苯甲酸的存在下变更反应时间时的影响进行了比较。并且，在21～26中，向反应液添加有DMSO。其结果，在添加邻氨基苯甲酸时需要DMSO，在试验例的条件下到反应时间30分钟为止，实现了剥离被加以抑制的O键型糖链的游离。另一方面，在30分钟以上时产生剥离，在1小时以上时，生成了与剥离不同的分解物。

(8)在试验例27、28中，研究了代替LiOH使用高浓度KOH的情况。其结果，在高浓度的KOH的情况下，完全未能够游离出O键型糖链。

(9)在试验例29、30中，对碱(KOH、NaOH)进行了研究。其结果，在任意碱的情况下，作为游离出的O键型糖链，二唾液酸糖链均少，在LiOH的情况下示出了更优选的结果。

(10)在试验例31、32中，对DABCO的效果的进行了研究。其结果，通过添加DABCO，产量虽减少，但实现了对剥离的抑制。

(11)在试验例33、34中，对作为碱性试剂的DBU与LiOH进行了比较。其结果，使用DBU的试验产量更佳，并且二唾液酸糖链的量也相对多。

(12)在试验例35～38中，对使用了200mM DBU、10％羟胺时的反应时间的长度进行了比较。其结果，在室温条件下，O键型糖链的游离反应会随时间的经过而发生进展。并且，即使在4小时的反应后，也几乎不存在剥离的糖链。

(13)在试验例40～44中，研究了其他有机碱的使用。其结果，使用TMG、t-BuTMG、TBD、MTBD中的任一个时均实现了O键型糖链的游离，尤其使用TMD、TBD、MTBD时获得了更优选的产量及结果。

(14)在试验例45～47中，对DBU的浓度进行了研究。其结果，DBU的浓度越高产量越增加。

(15)在试验例48～51中，对羟胺的浓度进行了研究。其结果，通过使羟胺的量比DBU相对多，抑制了剥离。

(16)在试验例52中，示出将4％十六烷基三甲基氢氧化铵用作碱性试剂的试验结果。获得了良好的产量及结果。

[实施例9]

＜结合基于整体二氧化硅的试剂去除的牛胎球蛋白的O键型糖链分析＞

(使用50％羟胺的O型糖链游离反应)

将牛胎球蛋白(20μg)溶解于50％羟胺50μL中，添加1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)10μL并进行混合之后，在通风室中，利用加热块以60℃加热了20分钟。然后，立即在冰浴中冷却并用1N盐酸中和了反应液。

(在使用50％羟胺的反应中游离出的糖链的回收)

向经中和后的反应液分别添加丙酮200μL或水杨醛200μL并进行了搅拌。而且，向上述反应液添加乙腈16mL，并全量施用到预先用乙腈平衡化的整体二氧化硅(二氧化硅整体离心柱，Cleanup column，住友电木株式会社(Sumitomo Bakelite Company Limited)制造)，接着用乙腈1.2mL进行了清洗。接着，利用10％乙酸100μL从整体二氧化硅洗脱糖链，与900μL的纯水混合之后，与实施例1同样地进行基于石墨碳柱的脱盐处理，利用包含0.1％三氟乙酸(TFA)的50％乙腈1mL洗脱糖链，并进行了减压干燥固化。

(游离糖链的分析)

将干燥固化的糖链溶解于10％乙酸25μL中，利用甲基吡啶硼烷和2-氨基苯甲酸对糖链进行了荧光标记。利用整体二氧化硅(二氧化硅整体离心柱，Cleanup column，住友电木株式会社制造)去除过量的试剂之后，利用HPLC分析了荧光标记糖链。

[实施例10]

＜使用10％羟胺的O键型糖链游离反应＞

将牛胎球蛋白(20μg)溶解于10％羟胺50μL中，添加10μL的DBU并进行混合之后，在通风室中，利用加热块以60℃加热了20分钟。然后，立即在冰浴中冷却并用1N盐酸中和了反应液。

(游离糖链的回收)

与实施例1同样地，利用填充有石墨碳的固相萃取柱(HyperSep Hypercarb 25mg，赛默飞世尔科技公司制造)对经中和后的反应液进行脱盐处理，并利用包含0.1％TFA的50％乙腈1mL洗脱糖链，并进行了减压干燥固化。

(游离糖链的分析)

与实施例9同样地，对糖链进行荧光标记，并利用HPLC进行了分析。

[实施例11]

＜使用50％羟胺的O键型糖链游离反应＞

将牛胎球蛋白(20μg)溶解于50％羟胺50μL中，添加10μL的DBU并进行混合之后，在通风室中，利用加热块以60℃加热了20分钟。然后，立即在冰浴中冷却并用1N盐酸中和了反应液。

(游离糖链的回收)

(游离糖链的分析)

图8(a)～图8(d)是表示在实施例9～11中利用HPLC对经荧光标记后的糖链进行分析的结果的色谱。图8(a)～图8(d)中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示荧光强度(相对值)。

图8(a)为实施例10的结果，图8(b)为实施例11的结果，图8(c)为实施例9(丙酮处理)的结果，图8(d)为实施例9(水杨醛处理)的结果。其结果，明确了通过以50％的浓度利用羟胺，并在实施丙酮或水杨醛处理的基础上经过基于整体二氧化硅的纯化处理能够抑制剥离，且能够以更高产量分析糖链。

[实施例12]

＜从整体二氧化硅回收糖链的方法的研究＞

(使用50％羟胺的O键型糖链游离反应)

(在使用50％羟胺的反应中游离出的糖链的回收)

向经中和后的反应液中添加丙酮200μL并进行了搅拌。而且，向上述反应液中添加乙腈20mL，并全量施用到预先用乙腈平衡化的整体二氧化硅(二氧化硅整体离心柱，Cleanup column，住友电木株式会社制造)，接着用乙腈1.2mL进行了清洗。

(糖链的回收及分析)

接着，将10％乙酸25μL添加至整体二氧化硅中，并回收了溶液。而且，将甲基吡啶硼烷与2-氨基苯甲酸的混合液25μL添加至整体二氧化硅之后，回收溶液，与之前的溶液混合并在50℃使其反应3小时，对糖链进行了荧光标记。利用整体二氧化硅(二氧化硅整体离心柱，Cleanup column，住友电木株式会社制造)去除过量的试剂之后，利用HPLC分析了荧光标记糖链。

图9是表示在实施例12中利用HPLC对经荧光标记后的糖链进行分析的结果的色谱。在图9中，横轴表示洗脱时间，纵轴表示荧光强度(相对值)。其结果，确认了即使变更糖链的回收方法，也获得了目标糖链峰。

根据本发明的方法，通过使用安全且廉价的药品，能够抑制糖链的分解，并且在短时间的处理时间内从糖蛋白游离出糖链，并且，游离出的糖链能够作为包含糖链肟的混合物进行回收。

Claims

1.一种从糖蛋白游离出糖链的方法，其中，包括：

使包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液与所述糖蛋白接触而获得从所述糖蛋白游离出的糖链与所述反应液的混合液的工序，

所述糖链是通过O-糖苷键与蛋白质连结的O键型糖链，

所述(b)碱性试剂为1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯、氢氧化锂、1,1,3,3-四甲基胍、或十六烷基三甲基氢氧化铵，

所述反应液包含质量百分比为2～70％的所述(a)羟胺类，

所述(b)碱性试剂为1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯时，所述反应液中的所述(b)碱性试剂的浓度为超过200mM且2.0M以下，

所述(b)碱性试剂为氢氧化锂时，所述反应液中的所述(b)碱性试剂的浓度为超过100mM且2.0M以下，

所述(b)碱性试剂为1,1,3,3-四甲基胍或十六烷基三甲基氢氧化铵时，所述反应液中的所述(b)碱性试剂的浓度为2mM以上且2.0M以下。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述反应液还包含(c)胺类。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，

所述(c)胺类是从由氨水和邻氨基苯甲酸组成的组中选出的至少一种化合物。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，

从所述糖蛋白游离出的糖链包含糖链肟。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，

所述(a)羟胺类是从由羟胺、羟胺的盐、O-取代羟胺及O-取代羟胺的盐组成的组中选出的至少一种化合物。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，还包括：

向所述混合液中添加酮、醛或酸酐，将残留在所述混合液中的(a)羟胺类转化为酮肟、醛肟或酰胺的工序；

使所述混合液与对糖链具有亲和性的固相接触而使从所述糖蛋白游离出的糖链吸附于所述固相的工序；以及

从所述固相洗脱所述糖链的工序。

8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，

所述(b)碱性试剂为1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，所述反应液中的(b)碱性试剂的浓度为600mM以上且2.0M以下。

9.一种糖链的分析方法，其是糖蛋白所具有的糖链的分析方法，所述分析方法包括：

通过权利要求1至7中任一项所述的方法从糖蛋白游离出糖链的工序；以及

对所游离出的糖链进行标记且包含糖链肟的标记的工序。

10.一种试剂盒，其是用于通过权利要求1至7中任一项所述的方法从糖蛋白游离出糖链的试剂盒，其中，所述试剂盒包含所述(a)羟胺类和所述(b)碱性试剂。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其中，还包含(c)胺类。

12.根据权利要求10或11所述的试剂盒，其中，还包含：酮、醛或酸酐；以及对糖链具有亲和性的固相。

13.根据权利要求10或11所述的试剂盒，其中，还包含用于实施权利要求1至7中任一项所述的方法的说明书。

14.一种试剂盒，其是用于通过权利要求1至7中任一项所述的方法从糖蛋白游离出糖链的试剂盒，其中，所述试剂盒包含用于与所述(a)羟胺类并用的所述(b)碱性试剂和(c)胺类。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，还包含：酮、醛或酸酐；以及对糖链具有亲和性的固相。

16.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其中，还包含用于实施权利要求1至7中任一项所述的方法的说明书。

17.一种从糖蛋白游离出糖链的装置，其是用于权利要求1至7中任一项所述的方法的装置，其中，

具备：保持收容包含糖蛋白的试样的容器的保持部、以及将试剂导入所述容器的试剂导入部，

所述试剂导入部包括将包含(a)羟胺类和(b)碱性试剂的反应液导入所述容器的反应液导入部。

18.根据权利要求17所述的装置，其中，

所述试剂导入部还包括：向所述容器导入酮的酮导入部、导入醛的醛导入部或导入酸酐的酸酐导入部。

19.根据权利要求17或18所述的装置，其中，还具备：

固相保持部，保持包含对糖链具有亲和性的固相的容器。