CN107389805B - 还原性释放糖蛋白n-糖链及其衍生物分离和分析鉴定的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于糖生物技术领域，具体涉及一种还原性释放糖蛋白N‑糖链及其衍生物制备、分离和分析鉴定的方法。本发明还原性释放糖蛋白N‑糖链的方法为先将糖蛋白溶于浓氨水中进行糖链的水解，然后经NaBH₃CN的还原，得到还原端带有活性氨基(NH₂)的糖胺，该方案通用性强，适用于中性N‑糖链、酸性N‑糖链和含有核心α‑1,3‑岩藻糖糖基化的中性N‑糖链，释放的N‑糖链稳定性高，不会发生降解，可以直接进行初步的分析。此外，本发明提供了对所得到的N‑糖链进行Fmoc标记的方法，还提供了对N‑糖链和Fmoc标记的N‑糖链进行分离和分析鉴定的方法。

Description

还原性释放糖蛋白N-糖链及其衍生物分离和分析鉴定的方法

技术领域

本发明属于糖生物学技术领域，具体涉及一种还原性释放糖蛋白N-糖链及其衍生物分离和分析鉴定的方法。

背景技术

糖基化是蛋白质翻译后修饰中最主要的修饰之一，在蛋白质翻译调控、蛋白质降解等过程中起着非常重要的作用。50％以上的蛋白质以糖蛋白的形式存在，并且越来越多的研究表明，糖基化异常可导致人类疾病。在临床治疗过程中，使用的抗体药物均带有糖基化。

根据蛋白质与糖链连接方式的不同，糖基化可以大致分为四种类型：N-连接糖基化、O-连接糖基化、C-甘露糖糖基化和糖基磷脂酰肌醇(glycophosphatidlyinositol,GPI)锚定连接。O-连接糖基化是指寡糖链与Ser、Thr、羟基赖氨酸或羟脯氨酸的羟基相连，例如在真核生物中，糖蛋白分类是基于糖链与蛋白质的连接类型的，可分为：N-糖链和O-糖链两大类。其中，糖蛋白的O-糖链是通过N-乙酰葡萄糖胺连接在蛋白质丝氨酸或丝氨酸的羟基氧上，也有通过O-甘露醇等其他方式的连接。糖蛋白的N-糖链与蛋白质中的天冬酰胺残基(Asn)的氨基侧链共价相连，在动物细胞中，几乎都是N-乙酰葡萄糖胺与Asn残基以β-苷键构型相连。所有的N-糖链都有一个五糖核心结构，根据链接与三甘露糖残基核心结构上的单糖残基不同，N-糖链可以划分为高甘露糖型、复杂型和杂合型。

目前，大量的研究表明，糖蛋白上的糖链的异常变化和许多疾病有关，因此以研究糖链的结构和功能为主要内容的功能糖组学吸引了生命科学领域广泛的关注，尤其是以糖链作为研究对象来筛选癌症血清标志物的研究，为人类癌症的早期诊断、预后、治疗、反应预测和群体筛查开辟了新的途径。

由于糖蛋白分子量较大，一般需要将糖链从蛋白上释放后才能进行分析，因此，糖链的释放在糖链分析中是一个非常关键的环节，对糖蛋白糖链结构和功能的分析研究有重要意义。蛋白质的N-糖基化修饰时目前研究较为集中的一种糖基化方式。

目前，糖蛋白N-糖链的释放主要采用酶解法，如N-糖苷酶F(PNGase F)与N-糖苷酶A(PNGase A)。PNGase F能够水解糖蛋白或糖肽N-糖链的还原性末端N-乙酰葡糖胺与天冬酰胺残基侧链之间的酰胺键，天冬酰胺变为天门冬氨酸，并得到完整的糖链，PNGase F可以有效释放大多数N-糖链，但无法作用存在于一些植物和昆虫等样品中的核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链，Tretter V.,Altmann F.,Marz L.Peptide-N⁴-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attachedα-1→3to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue[J].EuropeanJournal of Biochemistry,1991,199(3):647-652。PNGase A可以解离核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链，但由于酶活性较低，不能作用于完整的糖蛋白，仅适用于短的糖肽，对唾液酸化糖链的释放效率低，Hanneman A.J.,Rosa J.C.,Ashline D.,et al.Isomer andglycomer complexities of core GlcNAcs in Caenorhabditis elegans[J].Glycobiology,2006,16(9):874-890。可以看出，两种酶解法都有各自的局限性并且价格昂贵难以用于大规模的糖组学分析。

相比之下，化学释放方法成本较低，适用范围广。常见的化学法有肼解法，即糖蛋白在无水肼中于90℃反应4h可以非还原性的释放糖链，此方法虽通用性好，但是无水肼有剧毒，容易爆炸，且反应过程中，N-乙酰氨基中的酰基易脱落。

糖蛋白还可以在1M的氢氧化钠(NaOH)和1M的硼氢化钠(NaBH₄)体系中进行解离，糖蛋白在氢氧化钠碱性介质中能解离出还原性N-糖链，由于脱乙酰化副反应十分严重，并且还原性糖链在强碱性的水性介质中会发生降解，在反应体系中加入硼氢化钠等还原剂，使得解离下来的糖链主要生成还原端醇羟基的糖醇产物，该产物不可进行荧光标记，不利于后续的分离分析。

近年来，Huang等提出糖蛋白在浓氨水和饱和的碳酸钠中释放N-糖链的方法，该方法虽然可使部分N-糖链被非还原性的完整解离，且副产物较少，但是水解后一部分核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链在碱性环境下会发生peeling降解，不利于后续的分析。

本课题组之前发展了N-糖链非还原性释放方法，即糖蛋白在NaOH水溶液中于50℃反应16h，能释放不带有核心α-1,3-岩藻糖的N-糖链，该方法副产物少，得到的N-糖链都是还原性寡糖,可以标记荧光试剂进行后续的LC、CE及LC-MS/MS分析；但是一部分核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链在氢氧化钠水溶液中容易降解，必须采用释放同时标记的策略，释放糖链后立即进行PMP衍生化，利用PMP抑制核心α-1,3-岩藻糖的降解反应，不能直接进行N-糖链的分析。

鉴于此，目前缺乏通用的化学法释放糖蛋白N-糖链的方法。因此，发展通用性强、副产物少、N-糖链释放后稳定性好，便于分析的N-糖链释放新方法，对糖蛋白的N-糖链分析鉴定和大量制备有重要意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在缺乏应用于含有核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链的通用性强的释放N-糖链的化学方法，且现有方法得到的N-糖链不稳定，易分解，不利于后续分析的缺陷，本发明提供了一种还原性释放糖蛋白N-糖链的方法。本发明要解决的技术问题通过以下技术方案实现：

一种还原性释放糖蛋白N-糖链的方法，其包括以下步骤：

(1)取糖蛋白样品，溶于浓氨水中，糖蛋白样品在氨水中的浓度为5～20mg/mL；

(2)向反应体系中加入NaBH₃CN固体至反应体系中NaBH₃CN的浓度为1mol/L，得到的混合物在40℃下反应16小时；

(3)反应结束后，减压浓缩反应体系，加水重新溶解后，调节pH至中性，再次浓缩除去溶剂，即得糖蛋白N-糖链粗品。

进一步地，本发明所述的还原性释放糖蛋白N-糖链的方法中，当所述糖蛋白样品的糖链是中性N-糖链时，所述步骤(2)中，在加入NaBH₃CN固体时，还向反应体系中加入NaOH固体至反应体系中NaOH的浓度为0.3mol/L。

进一步地，本发明所述的还原性释放糖蛋白N-糖链的方法中，制备得到糖蛋白N-糖链粗品后，还包括步骤(4)纯化：将步骤(3)得到的N-糖链粗品依次经C18固相萃取柱纯化和石墨碳固相萃取柱纯化，以除去肽杂质和盐得到纯化后的N-糖链样品。

进一步地，本发明所述的还原性释放糖蛋白N-糖链的方法中，在经C18固相萃取柱纯化前，先经过微晶纤维素柱纯化，所述微晶纤维素柱纯化过程为：微晶纤维素柱预先用双蒸水洗柱，然后用正丁醇/甲醇/水溶液(v/v/v)＝4:1:1的混合溶剂平衡；将N-糖链粗品重溶于正丁醇/甲醇/水(v/v/v)＝4:1:1的混合溶剂中，上样，再用相同比例的混合溶剂冲柱，以除去肽杂质，然后用双蒸水将N-糖链洗脱出柱，收集洗脱液，减压浓缩。

进一步地，本发明所述的还原性释放糖蛋白N-糖链的方法中，所述C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用乙腈活化，再双蒸水平衡，然后将待纯化样品用双蒸水溶解后上样，直接用双蒸水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩；

所述石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用乙腈活化，再用双蒸水平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化后的样品上样，上样后先用双蒸水洗脱除盐，然后，用合适浓度的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得纯化后的N-糖链样品。

进一步地，本发明所述的还原性释放糖蛋白N-糖链的方法中，所述石墨碳固相萃取柱纯化过程中，若待纯化N-糖链为酸性N-糖链，则在洗脱液乙腈水溶液中加入适量三氟乙酸，调节pH后，再进行洗脱。

另一方面，本发明还提供了对所得到的N-糖链进行衍生化的方法，其包括以下步骤：

(A)将N-糖链样品溶于双蒸水中，再依次加入与溶剂双蒸水等体积的、浓度为50mg/mL NaHCO₃水溶液、双蒸水和浓度为20mg/mL的Fmoc-Cl的四氢呋喃溶液；

(B)振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后，用乙酸乙酯萃取，以除去过量的Fmoc-Cl试剂，收集萃取后的水相；

(C)过C18固相萃取柱除盐，C18固相萃取柱先用乙腈活化，再用双蒸水平衡，然后将步骤(B)所得到产物上样，上样后先用双蒸水洗脱除盐，然后，用50％的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得Fmoc标记的N-糖链衍生物。

另一方面，本发明还提供了对所得到的Fmoc标记的N-糖链衍生物的分离方法，其包括以下步骤：

(i)Fmoc标记的N-糖链使用一维正相柱HPLC进行分离，色谱条件为：

选用TSK-GEL Amide-80柱，柱温20℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，

流动相A为乙腈，B为100mM的乙酸铵水溶液，C为双蒸水；

样品分离条件：

对于中性N-糖链，样品分离条件：t＝0min，80％A，20％B，t＝120min，60％A，40％B；

对于酸性N-糖链，样品分离条件：t＝0min，80％A，20％B，t＝150min，55％A，45％B；

(ii)分别收集一维正相柱分离得到的每一组分的洗脱剂，并减压浓缩；

(iii)将一维正相柱分离得到的各组分分别用二维反相柱分离，二维反相柱选用SinoChrom C8柱，柱温20℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，

流动相A为乙腈，B为0.05％冰乙酸水溶液，C为双蒸水；

样品分离条件：t＝0min，12％A，88％B；t＝60min，27％A，73％B；

经以上分离过程得到糖蛋白样品中所含的多种N-糖链的Fmoc标记衍生物。

另一方面，本发明还提供了对制备得到的N-糖链的鉴定方法，其包括以下步骤：

(I)全甲基化衍生

向纯化后的N-糖链样品中加入NaOH混悬在DMSO中所形成的悬浊液和碘甲烷，其中，NaOH混悬在DMSO中所形成的悬浊液：碘甲烷(v/v)＝4：1；

反应体系振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后，加入双蒸水猝灭反应，再用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，水洗以除去过量的碱，所得有机相浓缩除溶剂，得全甲基化衍生物；

(II)多级质谱鉴定

质谱鉴定参数为：进样量，2μL进样环控制；

载样流动相为体积比50％的甲醇水溶液，流速为50μL/min；

工作电压为4kV；

鞘气流速为20arb，辅助气体流速为10arb；

毛细管电压为37V，毛细管透镜电压是250V，毛细管温度是300℃；

最大注入时间是1000ms，微扫描是3次；

碰撞气体是氦气；

同位素宽度m/z 3.00；

离子碰撞能量是35％～45％；

激活电荷是0.25；

激活时间是30ms。

另一方面，本发明还提供了对制备得到的Fmoc标记的N-糖链衍生物的鉴定方法，其包括以下步骤：

(I)全甲基化衍生

向Fmoc标记的N-糖链衍生物中，加入NaOH混悬在DMSO中所形成的悬浊液和碘甲烷，其中，NaOH混悬在DMSO中所形成的悬浊液：碘甲烷(v/v)＝4：1；

反应体系振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后，加入双蒸水猝灭反应，再用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，水洗以除去过量的碱，所得有机相浓缩除溶剂，得全甲基化衍生物；

(II)多级质谱鉴定

质谱鉴定参数为：进样量，2μL进样环控制；

载样流动相为体积比50％的甲醇水溶液，流速为50μL/min；

工作电压为4kV；

鞘气流速为20arb，辅助气体流速为10arb；

毛细管电压为37V，毛细管透镜电压是250V，毛细管温度是300℃；

最大注入时间是1000ms，微扫描是3次；

碰撞气体是氦气；

同位素宽度m/z 3.00；

离子碰撞能量是35％～45％；

激活电荷是0.25；

激活时间是30ms。

本发明中所述的“酸性N-糖链”是指带有羧基(-COOH)、硫酸基(-SO₃H)等酸性取代基的N-糖链，例如含有唾液酸的N-糖链。

本发明中所述的“中性N-糖链”是指不含有酸性取代基的N-糖链，例如，核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明还原性释放糖蛋白N-糖链的方法先将糖蛋白溶于浓氨水中进行糖链的碱性条件下水解，然后经NaBH₃CN的还原，得到还原端带有活性氨基的糖胺，该方法通用性强，可适用于中性N-糖链和酸性N-糖链，可避免核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链的peeling降解，并且释放糖链的效率高，副反应少，效果与特异性酶解法相当。

2、本发明还原性释放糖蛋白N-糖链的方法所释放的N-糖链经过NaBH₃CN还原以还原端带有活性氨基的糖胺形式存在，稳定性高，不会发生降解，可以直接进行初步的分析，克服了现有方法得到的核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链不稳定，易降解，副反应多，N-糖链产物少，不利于后续分析的缺陷。

3、本发明还原性释放糖蛋白N-糖链的方法所释放的N-糖链采用了Fmoc-Cl进行柱前衍生化得到Fmoc标记的N-糖链衍生物，一方面，衍生化之后使糖链带上发色基团、极性降低，可在HPLC色谱柱上进行分离，提高了检测灵敏度，可以保证衍生化后的N-糖链顺利进行HPLC分离、LC-MS鉴定，从而得到糖蛋白中的所含的N-糖链的种类和类型；另一方面，Fmoc基团为可脱除的临时性衍生基团，在鉴定之后可以方便的脱掉，有利于糖链的回收，在后续工作中继续使用。

4、本发明还对还原性释放的N-糖链以及Fmoc标记的N-糖链衍生物进行了多级质谱分析方法进行研究，探索出适合的质谱检测条件，通过本发明的多级质谱分析方法可获得糖苷键的类型、糖链序列和连接方式，此化学释放N-糖链的方法在本领域具有普遍适用性，对于糖组学研究具有重要价值。

附图说明

图1为还原性释放糖蛋白N-糖链及其衍生物分离分析鉴定方法的化学原理图。

图2为还原性化学法释放鸡蛋白蛋白N-糖链的ESI-MS图谱(A)及其Fmoc衍生物的ESI-MS图谱(B)。

图3为PNGase F酶法释放荞麦花粉总蛋白N-糖链的ESI-MS图谱(A)、还原性化学法释放法的N-糖链的ESI-MS图谱(B)及其Fmoc衍生物的ESI-MS图谱(C)。

图4为PNGase F酶法释放胎牛血清总蛋白N-糖链的ESI-MS图谱(A)、还原性化学法释放法的N-糖链的ESI-MS图谱(B)及其Fmoc衍生物的ESI-MS图谱(C)。

图5为Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链的一维HILIC-HPLC图谱。

图6为Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链的的二维C8-HPLC图谱。

图7为Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链的在线HILIC-MS紫外图谱(A)和EIC图谱(B)。

图8为荞麦花粉总蛋白N-糖链(H3N2F1X1)的全甲基化MSⁿ图谱分析。

图9为Fmoc标记的荞麦花粉总蛋白N-糖链(H3N2F1X1)的全甲基化MSⁿ图谱分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下面所描述的实施例，除非其他方面表明所有的温度定为摄氏度，如无特殊说明温度的误差范围为实施例中无特殊说明，反应温度为室温，室温指25℃±5℃，所有的温度误差为±5℃。

鸡蛋白蛋白、氰基硼氢化钠(NaBH₃CN)、氢氧化钠(NaOH)、二甲基亚砜(DMSO)和微晶纤维素均购于Sigma-Aldrich公司；PNGase F购于New England BioLabs公司；十二烷基硫酸钠(SDS)、二硫苏糖醇(DTT)、NP-40均购于Aladdin Industrial Inc公司；胎牛血清(FBS)购于Thermo Scientific公司；荞麦花粉由温室培养获得。

固相萃取小柱Sep-Pak C18(100mg/1mL)购于Waters公司；固相萃取小柱多孔石墨碳柱(150mg/4mL)购于Alltech Associates公司；微晶纤维素小柱是用一次性枪头自制。MD34透析袋(截留分子量为8～14KDa)购买于Union Carbide公司；色谱纯乙腈购于FisherScientific公司，其它试剂均为分析纯。浓氨水直接购买，百分质量浓度为26％～28％。双蒸水是实验室用自动双重纯水蒸馏器进行制备。

本发明中质谱鉴定(ESI-MS)和多级质谱鉴定(MSⁿ)使用电喷雾电离线性离子阱质谱(LTQ XL，Thermo Scientific，USA)进行检测，如无特别说明，检测条件如下：

一级ESI-MS参数设置如下：进样量，2μL进样环控制；载样流动相为甲醇/水(50％/50％，v/v)；流速为50μL/min；工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；数据采集使用LTQ Tune软件。

多级质谱(MSⁿ)检测参数设置为：进样量，2μL进样环控制；载样流动相为体积比50％的甲醇水溶液，流速为50μL/min；工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次；碰撞气体是氦气；同位素宽度m/z 3.00；离子碰撞能量是35％～45％；激活电荷是0.25；激活时间是30ms。数据采集使用LTQ Tune软件，糖链结构的分析软件是Glycoworkbench。

本发明中的一级质谱(MS)检测和多级质谱(MSⁿ)检测，如未做特别说明的均是在正离子模式下检测的。

下面简写词的使用贯穿本发明：

ACN 乙腈

arb arbitrary unit 任意单位，属于压力单位

DMSO 二甲基亚砜

DTT 二硫苏糖醇

EIC 萃取离子流色谱峰

Fmoc-Cl 9-芴甲基氯甲酸酯

Fmoc 9-芴甲基甲酸酯基

FBS 胎牛血清

MeOH 甲醇

MSⁿ 多级质谱

mL 毫升

min 分钟

ms 毫秒

h 小时

NaBH₃CN 氰基硼氢化钠

NaOH 氢氧化钠

NaOAc 乙酸铵

Retention time 保留时间

Relative Abundance 相对丰度

SDS 十二烷基硫酸钠

THF 四氢呋喃

V 伏

M mol/mL

实施例：

本发明中的实施例是关于化学法还原性释放糖蛋白N-糖链、N-糖链的Fmoc衍生物制备、分离、以及N-糖链和Fmoc标记的N-糖链衍生物的鉴定，这些过程所涉及的化学反应原理如图1所示。

还原性释放糖蛋白N-糖链的方法为先将糖蛋白溶于浓氨水中进行糖链的水解，然后经NaBH₃CN的还原，得到还原端带有活性氨基(NH₂)的糖胺，该方案通用性强，不仅适用于不含有核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链，也适用于含有核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链，释放的N-糖链稳定性高，不会发生降解，可以直接进行初步的分析。

实施例中还对化学法还原性释放的N-糖链进行Fmoc标记衍生化，对Fmoc标记的N-糖链衍生物进行了2D-HPLC分离，并且对N-糖链和Fmoc标记的N-糖链衍生物进行了MSⁿ鉴定。具体实验过程以下详述。

实施例1：鸡蛋白蛋白N-糖链的还原性化学法释放及纯化

化学法释放：

称取鸡蛋白蛋白10mg，鸡蛋白蛋白中为中性N-糖链，溶于浓氨水(1mL，浓度26％～28％)中；向反应体系中加入NaOH固体至反应体系中NaOH的浓度为0.3mol/L，向反应体系中加入NaBH₃CN固体至反应体系中NaBH₃CN的浓度为1mol/L；得到的反应混合物在40℃下反应16小时，反应结束后，用旋转蒸发仪减压浓缩反应体系，加双蒸水1mL重新溶解后，调节pH至中性(pH在7左右即可)，再次用旋转蒸发仪减压浓缩除去溶剂，即得鸡蛋白蛋白的N-糖链粗品。对于中性N-糖链，在反应体系中增加氢氧化钠，可以增加碱性，提高糖链产率。

鸡蛋白蛋白的N-糖链粗品的纯化方法是将得到的鸡蛋白蛋白N-糖链粗品依次经微晶纤维素柱纯化、C18固相萃取柱纯化和石墨碳固相萃取柱纯化。

微晶纤维素柱纯化方法：

小试(鸡蛋白蛋白10mg)可用微晶纤维素填装一次性枪头制作微晶纤维素小柱，微晶纤维素小柱需要依次用双蒸水前处理(100mL双蒸水洗柱)，然后用正丁醇/甲醇/水溶液(v/v/v)＝4:1:1，混合溶剂10mL平衡；将鸡蛋白蛋白的N-糖链粗品重溶于正丁醇/甲醇/水(v/v/v)＝4:1:1的混合溶剂500μL中，上样，再用相同比例的正丁醇/甲醇/水(v/v/v)＝4:1:1的混合溶剂50mL冲柱，以除去肽杂质，然后用双蒸水5mL将N-糖链洗脱出柱，收集洗脱液，减压浓缩。

在小试中，还原性化学法释放的N-糖链可以省略微晶纤维素小柱纯化步骤，直接用C18固相萃取柱纯化和石墨碳固相萃取柱纯化即可。C18固相萃取柱纯化用于除去样品中的盐，石墨碳固相萃取柱用于除去样品中的肽杂质，根据装柱时填料的用量和样品量，本领域技术人员可根据经验选择是否需要先进行微晶纤维素柱纯化。一般蛋白样品量较大时，为了提高纯化效果，先用微晶纤维素柱纯化，除去肽杂质可提升纯化效果，原因在于，先用微晶纤维素柱除去大部分的肽杂质，可以提高C18固相萃取柱纯化和石墨碳固相萃取柱的负载量。

微晶纤维素柱纯化中试方法与小试基本一致(以对应蛋白样品200mg为例)：

可微晶纤维素填装制作30mL的微晶纤维素柱，微晶纤维素柱需要依次用双蒸水前处理(2L双蒸水洗柱)，然后用正丁醇/甲醇/水溶液(v/v/v)＝4:1:1，混合溶剂150mL平衡；将N-糖链粗品重溶于正丁醇/甲醇/水(v/v/v)＝4:1:1的混合溶剂10mL中，上样，再用相同比例的正丁醇/甲醇/水(v/v/v)＝4:1:1的混合溶剂300mL冲柱，以除去肽杂质，然后用双蒸水50mL将N-糖链洗脱出柱，收集洗脱液，减压浓缩。

C18固相萃取柱纯化方法：

以对应10mg蛋白样品为例，C18固相萃取柱先用乙腈5mL活化，再双蒸水10mL平衡，然后将经微晶纤维素柱纯化后的样品溶于双蒸水1mL中，上样，直接用双蒸水4mL×4进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩即得。

C18固相萃取柱纯化中试方法与小试基本一致，试剂量可适量等比增加。

石墨碳固相萃取柱纯化方法：

以对应10mg蛋白样品为例，石墨碳固相萃取柱先用乙腈5mL活化，再用双蒸水10mL平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化后的样品上样，上样后先用双蒸水20mL洗脱除盐，然后，用3mL 25％乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得纯化后的鸡蛋白蛋白N-糖链样品。

石墨碳固相萃取柱纯化中试方法与小试基本一致，试剂量可适量等比增加。

实施例1所制备得到的鸡蛋白蛋白N-糖链经ESI-MS检测，得图谱如图2A所示。

如图2A所示，鸡蛋白蛋白的质谱图中均为糖胺形式的N-糖链，并且没有检测到副产物，表明本发明所研究发现的还原性化学法释放N-糖链方法，适用于中性N-糖链的释放，没有副反应，反应速度快，成本远低于酶解法。

实施例2：荞麦花粉总蛋白N-糖链的还原性化学法释放及纯化

化学法释放：

称取荞麦花粉总蛋白10mg，荞麦花粉总蛋白中为中性N-糖链，溶于浓氨水(1mL，百分质量浓度26％～28％)中；向反应体系中加入NaOH固体至反应体系中NaOH的浓度为0.3mol/L，向反应体系中加入NaBH₃CN固体至反应体系中NaBH₃CN的浓度为1mol/L。得到的反应混合物在40℃下反应16小时，反应结束后，用旋转蒸发仪减压浓缩反应体系，加双蒸水1mL重新溶解后，调节pH至中性(pH在7左右即可)，再次用旋转蒸发仪减压浓缩除去溶剂，即得荞麦花粉总蛋白的N-糖链粗品。

荞麦花粉总蛋白的N-糖链粗品的纯化方法是将得到的荞麦花粉总蛋白N-糖链粗品依次经微晶纤维素柱纯化、C18固相萃取柱纯化和石墨碳固相萃取柱纯化。

微晶纤维素柱纯化方法：

小试(荞麦花粉总蛋白10mg)用微晶纤维素填装一次性枪头制作微晶纤维素柱，洗脱条件与鸡蛋白蛋白的N-糖链相同。

C18固相萃取柱纯化方法：洗脱条件与实施例1中鸡蛋白蛋白的N-糖链洗脱条件相同。

石墨碳固相萃取柱纯化方法：洗脱条件与实施例1中鸡蛋白蛋白的N-糖链洗脱条件相同，用3mL 10％乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得纯化后的荞麦花粉总蛋白N-糖链样品。

实施例2所制备得到的荞麦花粉总蛋白N-糖链经ESI-MS检测，得图谱如图3B所示。

如图3B所示，荞麦花粉总蛋白的N-糖链，没有检测到脱乙酰基副产物，表明本发明所研究发现的还原性化学法释放N-糖链的方法，适用于含有核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链，没有副反应，反应速度快，成本远低于酶解法。本方法可避免核心α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链的降解，克服了传统化学法中的α-1,3-岩藻糖糖基化N-糖链易降解的缺陷。

实施例3：胎牛血清总蛋白N-糖链的还原性化学法释放及纯化

化学法释放：

称取胎牛血清总蛋白10mg，胎牛血清总蛋白的糖链为酸性N-糖链，溶于浓氨水(1mL，浓度26％～28％)中；向反应体系中加入NaBH₃CN固体至反应体系中NaBH₃CN的浓度为1mol/L。得到的反应混合物在40℃下反应16小时，反应结束后，用旋转蒸发仪减压浓缩反应体系，加双蒸水1mL重新溶解后，调节pH至中性(pH在7左右即可)，再次用旋转蒸发仪减压浓缩除去溶剂，即得胎牛血清总蛋白的N-糖链粗品。

对于酸性N-糖链，不加入氢氧化钠调节碱性，防止N-糖链中的唾液酸脱乙酰基降解。

胎牛血清总蛋白的N-糖链粗品的纯化方法是将得到的胎牛血清总蛋白N-糖链粗品依次经微晶纤维素柱纯化、C18固相萃取柱纯化和石墨碳固相萃取柱纯化。

微晶纤维素柱纯化方法：

小试(胎牛血清总蛋白10mg)用微晶纤维素填装一次性枪头制作微晶纤维素柱，洗脱条件与鸡蛋白蛋白的N-糖链相同。

C18固相萃取柱纯化方法：洗脱条件与实施例1中鸡蛋白蛋白的N-糖链洗脱条件相同。

石墨碳固相萃取柱纯化方法：

石墨碳固相萃取柱先用乙腈5mL活化，再用双蒸水10mL平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化后的样品上样，上样后先用双蒸水20mL洗脱除盐，然后，依次用5％乙腈水溶液3mL、10％乙腈水溶液3mL，20％乙腈水溶液3mL和25％乙腈水溶液3mL(含有0.05％三氟乙酸)洗脱，收集20％乙腈水溶液和25％乙腈水溶液洗脱剂流分，减压浓缩得纯化后的胎牛血清总蛋白N-糖链样品。

实施例3所制备得到的胎牛血清总蛋白N-糖链经ESI-MS检测，负离子模式下检测的，检测的质谱峰均为双电荷，得图谱如图4B所示。

如图4B所示，胎牛血清总蛋白的N-糖链，没有检测到脱乙酰基、脱唾液酸等副产物，表明本发明所研究发现的还原性化学法释放N-糖链方法，适用于酸性N-糖链，没有副反应，释放N-糖链效果与特异性酶解相当；反应速度快，成本远低于酶解法。

实施例4：鸡蛋白蛋白N-糖链的Fmoc衍生化

将实施例1制备的鸡蛋白蛋白的N-糖链样品溶于双蒸水200μL中，再依次加入浓度为50mg/mL NaHCO₃水溶液200μL、双蒸水200μL和浓度为20mg/mL的Fmoc-Cl的四氢呋喃溶液200μL；反应体系在室温下振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后，用乙酸乙酯萃取3次，每次用500μL乙酸乙酯，以除去过量的Fmoc-Cl试剂，收集萃取后的水相；水相经旋转蒸发仪减压浓缩得到Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链粗品。小试中，收集的水相也可以直接上样用C18固相萃取柱除盐。

将所得粗品经C18固相萃取柱除盐，C18固相萃取柱先用乙腈5mL活化，再用双蒸水10mL平衡，然后将粗品上样，上样后先用双蒸水6mL洗脱除盐，然后，用50％的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得纯化后的Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链衍生物。

实施例4所制备得到的Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链衍生物经ESI-MS检测，得图谱如图2B所示。

如图2B为Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链衍生物ESI-MS图谱，对比图2A和2B发现相应分子碎片的分子量均增加222，证明Fmoc衍生化产物生成。

实施例5：荞麦花粉总蛋白N-糖链的Fmoc衍生化

将实施例2制备的荞麦花粉总蛋白的N-糖链样品溶于双蒸水200μL中，再依次加入浓度为50mg/mL NaHCO₃水溶液200μL、双蒸水200μL和浓度为20mg/mL的Fmoc-Cl的四氢呋喃溶液200μL；反应体系在室温下振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后，用乙酸乙酯萃取3次，每次用500μL乙酸乙酯，以除去过量的Fmoc-Cl试剂，收集萃取后的水相；水相经旋转蒸发仪减压浓缩得到Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链粗品。小试中，收集的水相也可以直接上样用C18固相萃取柱除盐。

将所得粗品经C18固相萃取柱除盐，C18固相萃取柱先用乙腈5mL活化，再用双蒸水10mL平衡，然后将粗品上样，上样后先用双蒸水6mL洗脱除盐，然后，用50％的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得纯化后的Fmoc标记的荞麦花粉总蛋白N-糖链衍生物。

实施例5所制备得到的Fmoc标记的荞麦花粉总蛋白N-糖链衍生物经ESI-MS检测，得图谱如图3C所示。

图3C为Fmoc标记的荞麦花粉总蛋白N-糖链衍生物ESI-MS图谱，对比图3B和3C发现相应分子碎片的分子量均增加222，证明Fmoc衍生化产物生成。

实施例6：胎牛血清总蛋白N-糖链的Fmoc衍生化

将实施例3制备的胎牛血清总蛋白的N-糖链样品溶于双蒸水(200μL)中，再依次加入浓度为50mg/mL NaHCO₃水溶液200μL、双蒸水200μL和浓度为20mg/mL的Fmoc-Cl的四氢呋喃溶液200μL；反应体系在室温下振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后，用乙酸乙酯萃取3次，每次用500μL乙酸乙酯，以除去过量的Fmoc-Cl试剂，收集萃取后的水相；水相经旋转蒸发仪减压浓缩得到Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链粗品。小试中，收集的水相也可以直接上样用C18固相萃取柱除盐。

将所得粗品经C18固相萃取柱除盐，C18固相萃取柱先用乙腈5mL活化，再用双蒸水10mL平衡，然后将粗品上样，上样后先用双蒸水6mL洗脱除盐，然后，用50％的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得纯化后的Fmoc标记的胎牛血清总蛋白N-糖链衍生物。

实施例6所制备得到的Fmoc标记的胎牛血清总蛋白N-糖链衍生物经ESI-MS，负离子模式下检测，检测的质谱峰均为双电荷，得图谱如图4C所示。

图4C为Fmoc标记的胎牛血清总蛋白N-糖链衍生物ESI-MS图谱，对比图4B和4C发现相应分子碎片的分子量均增加222，证明Fmoc衍生化产物生成。

实施例7：荞麦花粉总蛋白N-糖链的PNGase F酶解释放(对照试验)

参照现有技术中酶解法过程：称取荞麦花粉总蛋白5mg，溶于双蒸水450μL中，加入蛋白质变性液50μL(蛋白质变性液配制方法：SDS50mg和DTT62mg溶于双蒸水1mL中)，在100℃加热变性10分钟。糖蛋白的变性，即破坏分子中的次级结构，不涉及肽键和二硫键的断裂，一级结构仍保持完整。

待样品冷却到室温时，加入酶解缓冲液50μL(磷酸钠1.9g溶于双蒸水10mL中，用磷酸调pH到7.5)、NP-40 50μL(10％水溶液，v/v)和PNGase F酶1μL，37℃反应24小时。待反应结束，100℃灭活5分钟，样品用氮气吹干仪吹干。将样品重溶于1mL双蒸水中，分别过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化后得到荞麦花粉总蛋白N-糖链。

实施例7所制备得到的PNGase F酶法释放的荞麦花粉总蛋白的N-糖链经ESI-MS检测，得图谱如图3A所示。

对比图3A和3B可以确定，对于含有核心α-1,3-岩藻糖糖基化的N-糖链，本发明的化学法反应速度更快，成本更低；由图3A和3B还可知荞麦花粉总蛋白N-糖链中带有核心岩藻糖的N-糖链均为α-1,3连接，并且化学法释放N-糖链没有降解作用。

实施例8：胎牛血清总蛋白糖蛋N-糖链的PNGase F酶解释放(对照试验)

参照现有技术中酶解法过程：称取胎牛血清总蛋白5mg，溶于双蒸水450μL中，加入蛋白质变性液50μL(蛋白质变性液配制方法：SDS50mg和DTT62mg溶于双蒸水1mL中)，在100℃加热变性10分钟。待样品冷却到室温时，加入酶解缓冲液50μL(磷酸钠1.9g溶于双蒸水10mL中，用磷酸调pH到7.5)、NP-40 50μL(10％水溶液，v/v，)和PNGase F酶1μL，37℃反应24小时。待反应结束，100℃灭活5分钟，样品用氮气吹干仪吹干。将样品重溶于1mL双蒸水中，分别过C18固相萃取柱和石墨碳固相萃取柱纯化后得到胎牛血清总蛋白N-糖链。

实施例8所制备得到的PNGase F酶法释放的胎牛血清总蛋白的N-糖链经ESI-MS检测，负离子模式下检测，检测的质谱峰均为双电荷，得图谱如图4A所示。

对比图4A和4B，可以确定，对于酸性N-糖链而言，还原性化学法释放N-糖链的反应效果与特异性酶解法效果相当；并且反应过程中没有发现脱乙酰基和脱唾液酸的副产物，反应收率高；反应速度更快，成本更低。

实施例9：Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链衍生物的分离

实施例4所制备得到的Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链的分离方法，包括以下步骤：

首先，使用一维正相柱HPLC(HILIC)进行分离，色谱条件为：

选用TSK-GEL Amide-80柱，柱温20℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min；

流动相A为乙腈，B为100mM乙酸铵溶液，C为双蒸水；对于中性N-糖链，鸡蛋白蛋白N-糖链为中性N-糖链，样品分离条件：t＝0min，80％A，20％B，t＝120min，60％A，40％B；(对于酸性N-糖链，如胎牛血清总蛋白的N-糖链为酸性N-糖链，样品分离条件：t＝0min，80％A，20％B，t＝150min，55％A，45％B)；洗柱条件：t＝0min，50％A，50％C，t＝30min，25％A，75％C，t＝45min，25％A，75％C。

分别收集一维正相柱分离得到的每一组分的洗脱剂，并减压浓缩。Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链衍生物的一维HILIC-HPLC图谱如图5所示，从样品中主要收集到17个峰(已用竖线隔开)，按照保留时间分别编号1～17。将一维正相柱分离得到的各组分(NP01～NP17)分别用二维反相柱(C8-HPLC)分离。NP表示正相柱，RP表示反相柱。

二维反相柱选用SinoChrom C8柱，柱温20℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min；流动相A为乙腈，B为0.05％冰乙酸溶液，C为双蒸水；样品分离条件：t＝0min，12％A，88％B；t＝60min，27％A，73％B；洗柱条件：t＝0min，25％A，75％C；t＝30min，100％A；t＝45min，100％A。

以上分离过程得到Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链衍生物中所含的多种N-糖链的Fmoc标记衍生物纯品，结果如图6所示。总共收集到主要的21种N-糖链，根据各组分在一维正向柱中的编号，对这21种N-糖链进行编号，例如，在二维反相柱中第二个峰(RP02-47.64)和第三个峰(RP02-48.88)是将一维正相柱中的第二个组分(NP-02)经二维反相柱分离后得到的，代表两个不同的N-糖链，其保留时间不一样。对二维反相柱分离出的每个N-糖链进行ESI-MS检测分析。

通过两次HPLC分析液相和ESI-MS质谱的数据，可归纳总结出Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链衍生物分离后的数据，具体结果如表1所示，其中N-糖链衍生物的编号和图6中所标的出峰序号一一对应。

表1：两次HPLC收集到的Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链衍生物的出峰时间、分子量和糖链结构的汇总表

上表中：●表示己糖；■表示N-乙酰葡萄糖胺；○表示半乳糖。

此外，还对本实施例4制备得到的Fmoc标记的鸡蛋白蛋白N-糖链衍生物进行在线一维正相柱与ESI-MS联用检测。

其中，一维正相柱色谱条件为：选用TSK-GEL Amide-80柱，柱温20℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min；流动相A为乙腈，B为100mM乙酸铵溶液，C为双蒸水；样品分离条件：t＝0min，80％A，20％B，t＝120min，60％A，40％B。EIC图谱是根据糖链分子量提取出来的图谱，其中纵轴为质谱的信号强度，每输入一个分子量就会有相应的质谱信号出现，而其它的信号就会被排除在外。提取得到萃取离子流色谱(EIC)，具体结果如图7所示。

基于LC-MS分析，相同分子量的糖链同分异构体在液相分离时的出峰时间不一样，根据图7发现，鸡蛋白蛋白的N-糖链中H3N3、H4N3、H3N4、H3N5和H4N6均有两个同分异构体，H4N4、H5N4和H3N6均有三个同分异构体。

本发明还原性释放糖蛋白N-糖链的方法所释放的N-糖链用Fmoc-Cl进行衍生化得到Fmoc标记的N-糖链衍生物，一方面，衍生化之后使糖链带上发色基团、极性降低，可在HPLC色谱柱上进行分离，还提高了检测灵敏度，可以保证衍生化后的N-糖链顺利进行HPLC分离、LC-MS鉴定；另一方面，Fmoc基团为可脱除的临时性衍生基团，经两次HPLC分离后的N-糖链衍生物在经过鉴定之后可以方便的脱掉Fmoc基团，有利于糖链的回收，在后续工作中继续使用。

实施例10：荞麦花粉总蛋白N-糖链的全甲基化及多级质谱分析

全甲基化衍生：

向实施例2所制备得到的荞麦花粉总蛋白N-糖链中加入DMSO/NaOH的悬浊液300μL(90mg NaOH固定加入1mL的DMSO中配置而成)和碘甲烷75μL，其中DMSO/NaOH的悬浊液：碘甲烷(v/v)＝4：1；反应体系在室温下振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后加入双蒸水500μL猝灭反应，再用二氯甲烷萃取3次，每次500μL二氯甲烷，合并二氯甲烷层，水洗以除去过量的碱，所得有机相3次，每次500μL，合并有机相，浓缩除溶剂得全甲基化衍生物。

多级质谱鉴定：

全甲基化衍生物样品经氮吹干燥后，溶于50％甲醇水溶液50～100μL中用于ESI-MS和MSⁿ分析以确定糖链序列。

使用电喷雾电离线性离子阱质谱(LTQ XL，Thermo Scientific，USA)进行检测。ESI-MS参数设置如下：进样量，2μL进样环控制；载样流动相为甲醇/水(50％/50％,v/v)；流速为50μL/min；工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次。全甲基化N-糖链的多级数据采用碰撞诱导解离的方式裂解碎片，MSⁿ条件：碰撞气体是氦气；同位素宽度m/z 3.00；离子碰撞能量是35％～45％；激活电荷是0.25；激活时间是30ms。数据采集使用LTQ Tune软件，糖链结构的分析软件是Glycoworkbench。

得到全甲基化荞麦花粉总蛋白N-糖链H3N2F1X1的MSⁿ图谱，如图8所示。

发现花粉糖链H3N2F1X1的裂解产物是带有电荷中心的还原端碎片，而非还原端碎片未被检测到，适合糖链序列的测定。

通过MSⁿ产生的一系列碎片离子峰并结合Glycoworkbench软件，对糖链结构进行分析。如图8A所示，为全甲基化的糖胺H3N2F1X1(m/z 1526)的MS²图谱，如图8B所示是在m/z1526的MS²图谱中选取峰m/z 1467进行MS³分析。由图8A中的m/z 1350(Y_3γ)、m/z 1307(Y_3α)、m/z 1000(^3,5X₂Y_3β)和m/z 608(^1,3X₁Y₂)以及图8B中的m/z 1248(^3,5X_3γY_3α)、m/z 1032(^3,5X_3γY_3αY_3β)、m/z 739(Y₂)和m/z 493(Y₁)可以分析出糖链的断裂方式是从非还原端开始，电荷中心在还原端。

实施例11：Fmoc标记的荞麦花粉总蛋白N-糖链衍生物的全甲基化及多级质谱分析

全甲基化衍生：

向实施例5所制备得到的Fmoc标记的荞麦花粉总蛋白N-糖链衍生物中加入DMSO/NaOH的悬浊液300μL(90mg NaOH加入1mL的DMSO中配置而成的悬浊液)和碘甲烷75μL，其中DMSO/NaOH的悬浊液：碘甲烷(v/v)＝4：1；反应体系在室温下，振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后加入双蒸水500μL猝灭反应，再用二氯甲烷萃取3次，每次500μL二氯甲烷，合并二氯甲烷层，水洗以除去过量的碱，所得有机相3次，每次500μL，合并有机相，浓缩除溶剂得全甲基化衍生物。

多级质谱鉴定：

全甲基化衍生物样品氮吹干燥后溶于50％甲醇溶液50～100μL中用于ESI-MS和MSⁿ分析以确定糖链详细结构，用于糖链连接方式的测定，包括分支和连接方式。

使用电喷雾电离线性离子阱质谱(LTQ XL，Thermo Scientific，USA)进行检测。ESI-MS参数设置如下：进样量，2μL进样环控制；载样流动相为甲醇/水(50％/50％,v/v)；流速为50μL/min；工作电压为4kV；鞘气流速为20arb；辅助气体流速为10arb；毛细管电压为37V；毛细管透镜电压是250V；毛细管温度是300℃；扫描类型为一级全扫描；最大注入时间是1000ms；微扫描是3次。采用碰撞诱导解离的方式裂解碎片，碰撞气体是氦气；同位素宽度m/z 3.00；离子碰撞能量是35％～45％；激活电荷是0.25；激活时间是30ms。数据采集使用LTQ Tune软件，糖链结构的分析软件是Glycoworkbench。

得到全甲基化Fmoc标记的荞麦花粉总蛋白N-糖链衍生物H3N2F1X1的MSⁿ图谱，如图9所示，发现荞麦花粉总蛋白的N-糖链H3N2F1X1的核心岩藻糖是α-1,3糖苷键连接，木糖是β-1,2糖苷键连接。

如图9A所示，为全甲基化Fmoc标记的糖链H3N2F1X1(m/z 1578)的MS²图谱，从图中可知此糖链带有的核心岩藻糖是α-1,3糖苷键连接，并且N-糖链五糖核心的连接已知，两个甘露糖的分支上面是α-1,6糖苷键连接，下面是α-1,3糖苷键连接，由此推断木糖的连接位置是2位或4位。如图9B所示，是在m/z 1578的MS²图谱中选取断裂岩藻糖的峰m/z 1372进行MS³分析，通过穿环裂解碎片离子判断糖链的连接方式，其中m/z 843(Z_1δ ^2,4X₂Z_3α)是糖环穿环裂解的碎片峰，可以得出木糖是2位连接。如图9C所示，是在m/z 1578的MS²图谱中选取断裂岩藻糖和GlcNAc的峰m/z 1054进行MS³分析，其中穿环裂解碎片峰m/z 543(B₃ ^2,4X₂Y_3α)和m/z 484(B₃ ^0,2X₂)可以进一步推断木糖是β-1,2糖苷键连接。

对比实施例10和实施例11可知，相比N-糖链MSⁿ结果而言，Fmoc标记的N-糖链的MSⁿ既可以检测到还原端碎片，也可以检测到非还原端碎片，所得信息更加丰富，更适合于N-糖链连接方式的测定。

本发明对还原性释放的N-糖链以及Fmoc标记的N-糖链衍生物进行了多级质谱分析方法进行研究，探索出适合的质谱检测条件，通过本发明的多级质谱分析方法可获得糖蛋白中N-糖链的糖苷键的类型、糖链序列和连接方式，对于糖组学研究具有重要价值。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种还原性释放糖蛋白N-糖链的方法，其包括以下步骤：

(1)取糖蛋白样品，溶于浓氨水中，糖蛋白样品在氨水中的浓度为5～20mg/mL；

(2)向反应体系中加入NaBH₃CN固体至反应体系中NaBH₃CN的浓度为1mol/L，得到的混合物在40℃下反应16小时；

(3)反应结束后，减压浓缩反应体系，加水重新溶解后，调节pH至中性，再次浓缩除去溶剂，即得糖蛋白N-糖链粗品，也就是得到还原端带有活性氨基的糖链。

2.根据权利要求1所述的还原性释放糖蛋白N-糖链的方法，其特征在于，当所述糖蛋白样品中的糖链是中性N-糖链时，所述步骤(2)中，在加入NaBH₃CN固体时，还向反应体系中加入NaOH固体至反应体系中NaOH的浓度为0.3mol/L。

3.根据权利要求1或2所述的还原性释放糖蛋白N-糖链的方法，其特征在于，制备得到糖蛋白N-糖链粗品后，还包括步骤(4)纯化：将步骤(3)得到的N-糖链粗品依次经C18固相萃取柱纯化和石墨碳固相萃取柱纯化，以除去肽杂质和盐得到纯化后的N-糖链样品。

4.根据权利要求3的所述的还原性释放糖蛋白N-糖链的方法，其特征在于，在经C18固相萃取柱纯化前，先经过微晶纤维素柱纯化，所述微晶纤维素柱纯化过程为：微晶纤维素柱预先用双蒸水洗柱，然后用正丁醇/甲醇/水溶液(v/v/v)＝4:1:1的混合溶剂平衡；将N-糖链粗品重溶于正丁醇/甲醇/水(v/v/v)＝4:1:1的混合溶剂中，上样，再用相同比例的混合溶剂冲柱，以除去肽杂质，然后用双蒸水将N-糖链洗脱出柱，收集洗脱液，减压浓缩。

5.根据权利要求3的所述的还原性释放糖蛋白N-糖链的方法，其特征在于，所述C18固相萃取柱纯化过程为：C18固相萃取柱先用乙腈活化，再双蒸水平衡，然后将待纯化样品用双蒸水溶解后上样，直接用双蒸水洗脱，收集洗脱液，减压浓缩；

所述石墨碳固相萃取柱纯化过程为：石墨碳固相萃取柱先用乙腈活化，再用双蒸水平衡，然后将经C18固相萃取柱纯化后的样品上样，上样后先用双蒸水洗脱除盐，然后，用合适浓度的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得纯化后的N-糖链样品。

6.根据权利要求5的所述的还原性释放糖蛋白N-糖链的方法，其特征在于，所述石墨碳固相萃取柱纯化过程中，若待纯化N-糖链是酸性N-糖链，则在洗脱液乙腈水溶液中加入适量三氟乙酸，调节pH后，再进行洗脱。

7.一种权利要求1～6任一项的方法制备得到的N-糖链的衍生化方法，其包括以下步骤：

(A)将N-糖链样品溶于双蒸水中，再依次加入与溶剂双蒸水等体积的、浓度为50mg/mLNaHCO₃水溶液、双蒸水和浓度为20mg/mL的Fmoc-Cl的四氢呋喃溶液；

(B)振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后，用乙酸乙酯萃取，以除去过量的Fmoc-Cl试剂，收集萃取后的水相；

(C)过C18固相萃取柱除盐，C18固相萃取柱先用乙腈活化，再用双蒸水平衡，然后将步骤(B)所得产物上样，上样后先用双蒸水洗脱除盐，然后，用50％的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩得Fmoc标记的N-糖链衍生物。

8.权利要求7的衍生化方法制备得到的Fmoc标记的N-糖链衍生物的分离方法，其包括以下步骤：

(i)Fmoc标记的N-糖链使用一维正相柱HPLC进行分离，色谱条件为：

选用TSK-GEL Amide-80柱，柱温20℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min；

流动相A为乙腈，B为100mM的乙酸铵水溶液，C为双蒸水；

样品分离条件：

对于中性N-糖链，样品分离条件：t＝0min，80％A，20％B，t＝120min，60％A，40％B；

对于酸性N-糖链，样品分离条件：t＝0min，80％A，20％B，t＝150min，55％A，45％B；

(ii)分别收集一维正相柱分离得到的每一组分的洗脱剂，并减压浓缩；

(iii)将一维正相柱分离得到的各组分分别用二维反相柱分离，二维反相柱选用SinoChrom C8柱，柱温20℃，检测波长为254nm，流速为1.0mL/min，

流动相A为乙腈，B为0.05％冰乙酸水溶液，C为双蒸水；

样品分离条件：t＝0min，12％A，88％B；t＝60min，27％A，73％B；

经以上分离过程得到糖蛋白样品中所含的多种N-糖链的Fmoc标记衍生物。

9.权利要求1～6任一项制备得到的N-糖链的鉴定方法，其包括以下步骤：

(I)全甲基化衍生

向纯化后的N-糖链样品中，加入NaOH混悬在DMSO中所形成的悬浊液和碘甲烷，其中，NaOH混悬在DMSO中所形成的悬浊液：碘甲烷(v/v)＝4：1；

反应体系振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后，加入双蒸水猝灭反应，再用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，水洗以除去过量的碱，所得有机相浓缩除溶剂，得全甲基化衍生物；

(II)多级质谱鉴定

质谱鉴定参数为：进样量，2μL进样环控制；

载样流动相为体积比50％的甲醇水溶液，流速为50μL/min；

工作电压为4kV；

鞘气流速为20arb，辅助气体流速为10arb；

毛细管电压为37V，毛细管透镜电压是250V，毛细管温度是300℃；

最大注入时间是1000ms，微扫描是3次；

碰撞气体是氦气；

同位素宽度m/z 3.00；

离子碰撞能量是35％～45％；

激活电荷是0.25；

激活时间是30ms。

10.权利要求7的衍生化方法制备得到的Fmoc标记的N-糖链衍生物的鉴定方法，其包括以下步骤：

(I)全甲基化衍生

向Fmoc标记的N-糖链样品中，加入NaOH混悬在DMSO中所形成的悬浊液和碘甲烷，其中，NaOH混悬在DMSO中所形成的悬浊液：碘甲烷(v/v)＝4：1；

反应体系振荡或搅拌反应30分钟，反应结束后，加入双蒸水猝灭反应，再用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷层，水洗以除去过量的碱，所得有机相浓缩除溶剂，得全甲基化衍生物；

(II)多级质谱鉴定

质谱鉴定参数为：进样量，2μL进样环控制；

载样流动相为体积比50％的甲醇水溶液，流速为50μL/min；

工作电压为4kV；

鞘气流速为20arb，辅助气体流速为10arb；

毛细管电压为37V，毛细管透镜电压是250V，毛细管温度是300℃；

最大注入时间是1000ms，微扫描是3次；

碰撞气体是氦气；

同位素宽度m/z 3.00；

离子碰撞能量是35％～45％；

激活电荷是0.25；

激活时间是30ms。

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