KR102047906B1 - 당쇄를 조제하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 당쇄를 조제하는 방법은, 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플에 표지 시약을 첨가함으로써, 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻는 표지 공정을 갖는, 당쇄를 조제하는 방법으로서, 표지 공정에 있어서, 표지 시약과 당쇄의 반응 환경 중에 물을 포함하는 것이다.

Description

당쇄를 조제하는 방법
본 발명은 당쇄를 조제하는 방법에 관한 것이다.
당쇄를 조제하는 방법에 관한 것이며, 당쇄의 표지 기술에 대하여 다양한 개발이 이루어져 왔다. 이런 종류의 기술로서는, 특허문헌 1에 기재된 것이 알려져 있다. 동일 문헌에는, 2-아미노벤즈아마이드나 2-아미노피리딘 등의 일반적인 표지 시약을 사용하여, 완전히 건고한 상태의 비즈에 포착되어 있는 당쇄를 표지하는 것이 기재되어 있다(특허문헌 1의 단락 0056~0061).
동일 문헌에는, 표지 시약으로서, 2-아미노벤즈아마이드(2-AB) 및 사이아노 수소화 붕소 나트륨의 종농도(終濃度)가 각각 0.35M, 1M이 되도록 30% 아세트산/DMSO 혼합 용매가 사용된다고 기재되어 있다(특허문헌 1의 단락 0059). 마찬가지로, 비특허문헌 1에는, 2-AB를 이용한 표지 시약의 조성에 대하여 기재되어 있다.
또, 비특허문헌 2는, 2-AB를 이용한 글라이칸 표지 키트의 사용법의 순서가 기재된 안내서이다.
국제 공개공보 제2009/133696호
J.C Bigge, T.P Patel, J.A Bruce, P.N Goulding, S.M Charles, R.B Parekh. "Nonselective and Efficient Fluorescent Labeling of Glycans Using 2-Amino Benzamide and Anthranilic Acid" Analytical Biochemistry 1995 September 20 230(2):229-238. Product Guide for LudgerTagTM 2-AB(2-aminobenzamide) Glycan Labeling Kit containing 2-picoline borane, [online], 2013년 12월 11일 작성일(2016년 9월 26일 갱신일), URL: <http://www.ludger.com/docs/products/lt/lt-kab/ludger-lt-kab-vp24-guide.pdf>
당쇄 표지의 기술 분야에 있어서, 상기 특허문헌 1 등과 같이, 수분이 완전히 증발한 건조 환경하에서 당쇄의 표지를 실시하는 것이, 통상의 프로토콜로서 알려져 있다. 그리고, 2-AB 등의 표지 시약의 혼합 용매로서 물을 첨가하지 않는 것이 일반적으로 이용되고 있다.
그러나, 본 발명자가 검토한 결과, 상기 특허문헌 1에 기재된 당쇄 표지 방법에 있어서는, 표지 효율의 점에서, 추가적인 개선의 여지를 갖는 것이 판명되었다.
본 발명자는 검토한바, 당쇄와 표지 시약의 반응 환경을 적절히 제어함으로써, 표지 효율을 개선할 수 있는 것을 발견했다.
이와 같은 발견에 근거하여 더 예의 연구한바, 통상 알려져 있는(수분이 완전히 증발한 건조 환경하에서 당쇄의 표지를 실시하는) 당쇄 표지 프로토콜과는 달리, 당쇄와 표지 시약의 반응 환경 중에 물을 포함시킴으로써, 당쇄의 표지 효율이 특허문헌 1의 표지 효율과 비교하여 더 개선할 수 있는 것을 발견했다.
상세한 메커니즘은 확실하지 않지만, 물의 높은 극성에 의하여, 2-AB 등의 표지 시약의 혼합 용매 중에 있어서의 분산성이 높아져, 당쇄의 표지 효율이 향상되는 것이라고 생각된다.
그리고, 추가로 검토를 진행시킨 결과, 당쇄량 X에 대한 수분량 Y의 비율을 나타내는 "X/Y"를 지표로 하여, X/Y의 하한값을 적절히 제어함으로써, 당쇄의 표지를 효율적으로 행할 수 있고, X/Y의 상한값을 적절히 제어함으로써, 과잉인 물에 의하여 반응 환경계 중의 표지 시약의 농도가 저하되어, 표지 효율이 저하되는 것을 억제할 수 있는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에 의하면,
당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플에 표지 시약을 첨가함으로써, 상기 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻는 표지 공정을 갖는, 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 표지 공정에 있어서, 상기 표지 시약과 상기 당쇄의 반응 환경 중에 물을 포함하고,
상기 표지 공정에 있어서, 상기 반응 환경 중의 물의 양을 X(μL)로, 상기 당쇄의 양을 Y(μg)로 했을 때, X/Y가 1.2 이상 50 이하인, 당쇄를 조제하는 방법이 제공된다.
또, 본 발명자는, 당쇄와 표지 시약의 반응 환경에 대하여 더 예의 검토한 결과, 반응 환경 중에 저농도로 존재하는 당쇄에 있어서, 상세한 메커니즘은 확실하지 않지만, 미량의 물이어도 표지 효율을 향상시킬 수 있다라고 하는 스몰 스케일에 있어서의 새로운 발견을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에 의하면,
당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플에 표지 시약을 첨가함으로써, 상기 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻는 표지 공정을 갖는, 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 표지 공정에 있어서, 상기 표지 시약과 상기 당쇄의 반응 환경 중에 물을 포함하고,
상기 표지 공정에 있어서, 상기 당쇄의 양이 0μg 초과 1μg 미만인 경우, 상기 반응 환경 중의 물의 양은 0μL 초과 1.0μL 이하인, 당쇄를 조제하는 방법이 제공된다.
본 발명에 의하면, 표지 효율이 우수한 당쇄를 조제하는 방법이 제공된다.
상술한 목적, 및 그 외의 목적, 특징 및 이점은, 이하에 설명하는 적합한 실시형태, 및 그에 부수하는 이하의 도면에 의하여 더 명확해진다.
도 1은 실시예 1~3, 비교예 1에서 얻어진 HPLC 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 2는 실시예 4, 5, 비교예 2에서 얻어진 HPLC 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 3은 실시예 6, 7, 비교예 3에서 얻어진 HPLC 스펙트럼을 나타내는 도이다.
도 4는 실시예 8, 9, 비교예 4에서 얻어진 HPLC 스펙트럼을 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대하여, 도면을 이용하여 설명한다. 또한, 모든 도면에 있어서, 동일한 구성 요소에는 동일한 부호를 붙여, 적절히 설명을 생략한다.
본 실시형태의 당쇄를 조제하는 방법의 개요를 설명한다.
본 실시형태의 당쇄를 조제하는 방법은, 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플에 표지 시약을 첨가함으로써, 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻는 표지 공정을 갖는 것이며, 당해 표지 공정에 있어서, 표지 시약과 당쇄의 반응 환경 중에 물을 포함하는 것이다.
본 실시형태의 당쇄를 조제하는 방법에 의하면, 당쇄와 표지 시약의 반응 환경 중에 물을 포함시킴으로써, 당쇄의 표지 효율을 특허문헌 1의 표지 효율과 비교하여 더 향상시키는 것이 가능하다. 상세한 메커니즘은 확실하지 않지만, 물의 고극성에 의하여, 2-AB 등의 표지 시약의 혼합 용매 중에 있어서의 분산성이 높아져, 당쇄의 표지 효율이 향상되는 것이라고 생각된다.
따라서, 본 실시형태의 당쇄를 조제하는 방법은, 당쇄의 표지 효율이 우수한 당쇄 표지 프로토콜을 실현하는 것이 가능하다.
이하, 본 실시형태의 당쇄를 조제하는 방법의 각 공정에 대하여 상세하게 설명한다.
본 실시형태의 당쇄를 조제하는 방법의 일례로서는, 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플에 표지 시약을 첨가함으로써, 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻는 표지 공정을 가질 수 있다.
(당단백질)
본 실시형태에 있어서, 당쇄는, 당단백질 유래의 당쇄로 할 수 있다.
상기 당단백질은, 적어도 당쇄를 복합 성분으로서 포함하는 단백질이면 된다. 당단백질의 당쇄 부분은, N-결합형이어도 되고, O-결합형이어도 된다. 또, 당쇄 부분은, 천연의 구조를 갖고 있어도 되고, 인공적으로 개변되어 있어도 된다. 또, 당쇄 부분은 중성 당쇄여도 되고, 산성 당쇄여도 된다. 또, 당단백질에 있어서의 당쇄 결합 부위는, 천연물과 동일한 부위여도 되고, 천연물에서는 당쇄가 결합하고 있지 않은 부위여도 된다.
상기 당쇄는, 단당류 또는 다당류를 갖는 것이다. 이들을 단독으로 이용해도 되고 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다.
당단백질의 단백질 부분은, 변성 전의 상태에 있어서, 당쇄 부분을 그 내부에 도입하도록 폴딩하고 있어도 된다. 이와 같은 단백질 부분의 분자량은, 예를 들면 1kDa 이상이어도 되고, 10kDa 이상이어도 된다. 단백질 부분의 분자량 범위 내의 상한은 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 1000kDa여도 된다.
구체적인 당단백질로서는, 예를 들면 항체, 호르몬, 효소 및 이들을 포함하는 복합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 생리 활성 물질을 들 수 있다. 여기에서, 복합체로서는, 항원과 항체의 복합체, 호르몬과 수용체의 복합체, 효소와 기질의 복합체 등을 들 수 있다. 이들 당단백질은, 세포 배양 공학적으로 조제되는 생리 활성 물질로서 이용할 수 있다.
또, 당단백질이 항체를 포함할 수 있다. 이 항체로서는, 예를 들면 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE 등의 면역 글로블린; Fab, F(ab'), F(ab')2, 1본쇄 항체(scFv), 이중 특이성 항체(diabody) 등의 저분자 항체; Fc영역과 다른 기능성 단백질 또는 펩타이드와의 융합에 의하여 구성되는 Fc 융합 단백질 또는 펩타이드 등의 Fc 함유 분자; 방사성 동위 원소 배위성 킬레이트, 폴리에틸렌글라이콜 등의 화학 수식기를 부가한 화학적 수식 항체 등을 들 수 있다. 또, 항체는 모노클로날 항체여도 되고, 폴리클로날 항체여도 된다.
또, 항체는 항체 의약품 후보 또는 항체 의약품이어도 된다. 항체 의약품 후보는 항체 의약품의 개발 도상에 있는 물질이며, 항체 의약품으로서의 활성 및 안전성 등의 평가에 제공되는 물질이다.
<유리 공정>
또, 본 실시형태의 당쇄를 조제하는 방법의 일례로서는, 표지 공정 전에 고상에 고정된 상태의 시료에 당쇄 유리 효소를 작용시킴으로써, 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플을 얻는 유리 공정을 가질 수 있다. 이로써, 당쇄의 절출(切出)을 신속히 행할 수 있다.
(시료)
본 실시형태에 있어서, 고상에 고정된 시료는, 상기 당단백질을 포함할 수 있다.
상기 고상에 고정된 시료는, 예를 들면 당단백질을 포함하는 시료를 고상에 접촉시켜 포착함으로써 얻을 수 있다. 고상에 접촉시켜야 하는 당단백질을 포함하는 시료는, 당쇄 조제를 신속히 행하는 관점에서, 당단백질의 정제(당단백질을 그 협잡물로부터 분리하는 것)가 행해져 있지 않은 것이어도 된다. 예를 들면, 혈액(예를 들면, 혈청, 혈장), 림프액, 복강 침출액, 조직간액, 뇌척수액, 복수(腹水) 등의 체액; B 세포, 하이브리도머, CHO 세포 등의 항체 산생 세포의 배양 상청; 항체 산생 세포를 이식한 동물의 복수 등을 들 수 있다. 시료는 배양 상청 등의 세포 배양 공학적인 당단백질의 조제물과 같이, 단백질 부분이 균일하고, 또한 당쇄 부분이 비균일한 당단백질의 베리에이션 혼합물이어도 된다.
고상에 고정된 단백질을 포함하는 시료는, 상기 외에 당단백질의 고상 합성에 의하여 얻어지는 생성물이어도 된다.
고상에 접촉시켜야 하는 당단백질을 포함하는 시료에 있어서의 당단백질의 농도는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 0.1μg/mL~50mg/mL여도 된다. 상기 하한값 이상인 것은, 검출의 점에서 바람직하고, 상기 상한값 이하인 것은, 정량성의 점에서 바람직하다.
고상에 접촉시켜야 하는 당단백질은, 용기 1개당 0.001μg~100mg여도 되고, 0.001μg~5mg여도 된다. 당단백질의 양이 상기 하한값 이상인 것은 검출의 점에서 바람직하다. 본 실시형태의 방법은 공정 수가 적고 시료의 로스가 매우 적기 때문에, 당단백질이 작은 스케일(특히 0.001~500μg)인 경우에 특히 유용하다. 당단백질의 양이 상기 상한값 이하인 것은, 정량성의 점에서 바람직하다.
고상에 고정된 당단백질을 포함하는 시료는, 고상에 고정된 당단백질이 액체 성분 중에 분산된 상태로 준비되어도 되고, 액체 성분이 분리된 상태로 준비되어도 된다.
또, 고상에 고정된 당단백질을 포함하는 시료는, 상기의 당단백질을 포함하는 시료를 고상에 접촉시켜 당단백질의 포착이 완료된 시점, 또는 고상 합성이 완료된 시점에서 협잡물을 포함할 수 있다. 협잡물로서는, 고상에 고정해야 하는 당단백질을 포함하는 시료에 포함되어 있던 성분, 당단백질의 고상 합성에 이용한 시약 등을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는, 염, 저분자 화합물, 단백질(당해 고상에 대한 결합성을 갖지 않는 단백질)과 그 외의 생체 분자를 들 수 있다.
따라서, 고상에 고정된 당단백질을 포함하는 시료는, 당단백질의 포착이 완료된 후, 또는 고상 합성이 완료된 후에, 세정 처리가 행해진 것이어도 된다. 이로써, 당단백질을 고상에 고정한 채로, 협잡물을 제거할 수 있다. 세정은, 고상에 세정액을 통액(通液)시킴으로써 행할 수 있다. 통액의 방법으로서는, 자연 낙하, 흡인, 가압, 원심 등의 방법을 들 수 있다.
세정액으로서는, 당단백질의 단백질 부분과 고상 표면의 링커의 결합을 절단하지 않는 액성 및 조성인 것이 당업자에 의하여 적절히 선택된다. 구체적으로는, 완충액 그 외의 수용액 또는 물이어도 된다. 수용액을 이용하는 경우, pH가 5~10인 것이 바람직하다. 수용액의 pH가 이 범위 내이면, 이후의 공정에서 이용하는 당쇄 유리 효소의 활성을 유지하기 쉽다. 또, 당단백질이 비공유 결합에 의하여 고상에 고정되어 있는 경우에는, 당단백질의 유리를 방지하기 쉽다. 완충액을 이용하는 경우, 완충제로서는, 탄산 암모늄, 탄산 수소 암모늄, 염화 암모늄, 시트르산 수소 이암모늄, 카밤산 암모늄 등의 암모늄염; 트리스하이드록시메틸암모늄 등의 트리스 완충제; 인산염 등을 들 수 있다.
(고상)
본 실시형태에 있어서, 상기 시료 중의 당단백질이 고상에 고정될 수 있는 고정의 양태로서는, 특이적 결합에 의한 비공유 결합(수소 결합 및 이온 결합)과, 공유 결합이 포함되고, 예를 들면 영동 젤에 적용 또는 블로팅 멤브레인으로 전사됨으로써 단순히 유지되는 것에 불과한 양태는 포함되지 않는다. 비공유 결합에 의한 고정인 경우, 결합 속도 상수 ka(단위 M-1s-1)가, 예를 들면 103 이상, 예를 들면 104 이상, 예를 들면 103~105, 예를 들면 104~105의 친화성을 갖는 것이 바람직하다.
당단백질을 고정하고 있는 고상은, 당단백질의 단백질 부분과 비공유 결합적 또는 공유 결합적으로 연결하고 있는 링커를 표면에 갖는 담체이면 특별히 한정되지 않는다.
담체가 그 표면에 갖는 링커로서는, 예를 들면 당단백질의 단백질 부분을 포착 가능한 리간드를 들 수 있다. 리간드로서는, 당단백질의 단백질 부분에 친화성이 있는 분자(이하, 간단히 당단백질에 친화성이 있는 분자라고 하는 경우가 있음), 이온 교환기 또는 소수성기가 표면에 화학적으로 수식된 담체를 들 수 있다.
당단백질에 친화성이 있는 분자는 특별히 한정되지 않고, 포착해야 하는 당단백질에 따라 당업자가 용이하게 결정할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드성 또는 단백질성 리간드, 앱타머(당단백질에 특이적으로 결합 가능한 합성 DNA, 합성 RNA 또는 펩타이드), 화학 합성성 리간드(싸이아졸 유도체 등)를 들 수 있다.
예를 들면, 당단백질이 항체인 경우, 당단백질에 친화성이 있는 분자는, 항체 또는 항체의 정상 영역인 Fc 함유 분자에 특이적으로 결합하는 것이어도 된다. 보다 구체적으로는, 펩타이드성 또는 단백질성 리간드로서, 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 프로테인 H, 프로테인 D, 프로테인 Arp 등의 미생물 유래 리간드; 그 리간드들의 재조합 발현에 의하여 얻어지는 기능적 개변체(유연(類緣) 물질); 항체의 Fc 리셉터 등의 재조합 단백질 등을 들 수 있다. 이로써, 당쇄 해석의 중요성이 특히 높은 항체에 대하여, 스루풋성이 높은 당쇄 시료 조제 및 해석이 가능해진다.
이온 교환기는, 이온 교환 기능에 의하여 당단백질을 포착 가능하고, 또한 카운터 이온에 의하여 이온 강도 의존적으로 당단백질을 탈리 가능한 관능기이면 특별히 한정되지 않는다. 바람직하게는, 카복실기(보다 구체적으로는, 카복시메틸기 등), 설폰산기(보다 구체적으로는, 설포에틸기, 설포프로필기 등) 등의 양이온 교환기를 들 수 있으며, 4급 아미노기 등의 음이온 교환기여도 된다.
소수성기로서는, 예를 들면 탄소수 2~8의 알킬기 또는 아릴기를 들 수 있다. 보다 구체적으로는, 뷰틸기, 페닐기, 옥틸기 등을 들 수 있으며, 이들 기는 1종을 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다.
담체가 그 표면에 갖는 링커로서는, 상기 외에, 당단백질의 단백질 부분의 구성 요소인 C 말단 아미노산 잔기의 C 말단과 공유 결합한 연결기여도 된다. 이와 같은 연결기로서는, 펩타이드 고상 합성에서 이용되는 고상 표면 수식 시약인 아미노기 함유 화합물로부터 유도되는 연결기를 들 수 있다.
담체는 물에 불용인 기재로서, 상기의 링커를 고정화할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 유기 담체, 무기 담체 및 그들의 복합 담체를 들 수 있다. 유기 담체로서는, 가교 폴리바이닐알코올, 가교 폴리아크릴레이트, 가교 폴리아크릴아마이드, 가교 폴리스타이렌 등의 합성 고분자; 가교 세파로스, 결정성 셀룰로스, 가교 셀룰로스, 가교 아밀로스, 가교 아가로스, 가교 덱스트란 등의 다당류로 이루어지는 담체를 들 수 있다. 이들은 1종을 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다. 무기 담체로서는, 유리 비즈, 실리카젤, 모노리스 실리카 등을 들 수 있다.
유기 담체가 물을 포함하기 쉬운 성질인 것에 반하여, 무기 담체는 물을 포함하기 어렵다. 본 실시형태의 방법에서는, 고상 상에서 다양한 반응을 행하기 때문에, 물을 포함하기 어려운 무기 담체를 이용하는 것이 바람직하다. 이로써, 효소 및/또는 시약의 효과를 희석시키지 않기 때문에 바람직하다. 효소 및/또는 시약의 효과의 희석 방지는, 분석에 있어서의 불필요한 시그널의 검출의 방지에 기여한다. 따라서, 담체는 무기 담체인 것이 바람직하다. 또, 담체가 무기 담체이면, 예를 들면 당쇄 유리 효소에 의하여 담체의 일부가 유리하지 않고, 당 유래의 수지를 사용한 경우에 처음부터 수지에 잔존하는 당의 용출이 일어나지 않는다. 이로 인하여, 유리된 당쇄의 분석에 있어서, 불필요한 시그널의 출현을 억제하기 쉽다.
담체의 형상으로서는 특별히 한정되지 않고, 입자상이어도 되고, 비입자상이어도 된다. 입자상의 담체(비즈)의 경우, 다공질 담체여도 된다. 입자상의 담체의 경우, 평균 입자경은 예를 들면 1~100μm여도 된다. 평균 입자경이 상기 하한값 이상인 것은, 통액성의 점에서 바람직하고, 상기 상한값 이하인 것은, 이론 단수의 저하를 막는 점에서 바람직하다.
비입자상의 담체로서는, 모노리스 타입의 실리카젤 및 막체 등을 들 수 있다. 모노리스 타입의 실리카젤은, 마이크로미터 사이즈의 3차원 그물코상 세공(細孔)(매크로 구멍)과, 나노미터 사이즈의 세공(메소 구멍)을 갖는, 실리카젤의 벌크체이다. 매크로 구멍의 직경은 예를 들면 1~100μm여도 되고, 1~50μm여도 되며, 1~30μm여도 되고, 1~20μm여도 된다. 매크로 구멍이 상기 하한값 이상인 것은 통액성의 점에서 바람직하고, 상기 상한값 이하인 것은, 이론 단수의 저하를 막는 점에서 바람직하다. 메소 구멍의 직경은 예를 들면 1~100nm여도 되고, 1~50nm여도 된다. 이로써 당을 효율적으로 포착할 수 있다.
담체의 사용 체적(입자상 담체에 있어서는, 담체 자체의 체적에, 충전 시의 공극의 체적도 포함하고, 비입자상 담체에 있어서는, 담체 자체의 체적에, 메소 구멍 및 매크로 구멍의 체적도 포함함)은, 예를 들면 0.001~0.1cm3여도 되고, 예를 들면 0.001~0.01cm3여도 된다. 상기 하한값 이상인 것은, 이론 단수의 저하를 막는 점에서 바람직하고, 상기 상한값 이하인 것은, 통액성의 점에서 바람직하다. 또, 상기의 체적이면, 용출 후의 분리액을, HPLC 분석에 적합한 농도로 얻는 것도 용이해진다.
본 실시형태에 있어서, 상기 고상이, 예를 들면 칼럼 구조 또는 카트리지 구조를 가질 수 있다. 이와 같은 고상은, 상기 비입자상의 담체이고 소정의 필터 형상을 갖도록 구성되어 있으며, 용기의 일부와 일체화하도록 구성되어 있어도 되고, 또 개별의 부재로서 착탈 가능하게 용기 내에 고정되어 있어도 된다.
상기 고상은, 칼럼, 멀티 웰 플레이트의 각 웰, 필터 플레이트의 각 웰, 마이크로 튜브 등의 용기 안에 충전된 상태로 사용되어도 된다.
본 실시형태에 있어서의 상기 유리 공정은, 용기 중에서 실시되어도 된다. 즉, 고상에 고정된 당단백질을 포함하는 시료는, 용기 내에 준비되어도 된다. 고상에 고정된 당단백질은, 당해 용기 내에서 조제되는 것이 효율적으로 바람직하다.
(용기)
상기 용기는, 액체 및 고상의 유지와 고상을 유지한 상태에서의 액체의 분리(통액)가 가능한 용기이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 칼럼, 멀티 웰 플레이트의 각 웰, 필터 플레이트의 각 웰, 마이크로 튜브 등을 들 수 있다. 또, 이 용기는 튜브 형상을 갖고 있어도 되고, 구체적으로는, 일단이 개구되어 있고 타단이 폐구된 튜브 형상을 갖고 있어도 된다. 개방된 상태의 용기는, 일단 측의 개구가 폐쇄되어 있지 않고, 그 용기의 내부 공간과 외부 공간이 연통한 상태에 있다.
(당쇄 유리 효소)
본 실시형태에 있어서, 상기 당쇄 유리 효소로서는, 예를 들면 펩타이드 N-글리카나제(PNGase F, PNGase A) 또는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제(Endo-H, Endo-F, Endo-A, Endo-M) 등을 들 수 있다.
당쇄 유리 효소는, 물 또는 완충액 중에 분산된 상태로 준비되어도 된다. 완충액을 이용하는 경우, 완충제로서는, 탄산 암모늄, 탄산 수소 암모늄, 염화 암모늄, 시트르산 수소 이암모늄, 카밤산 암모늄 등을 들 수 있다. 완충액은, pH가 5~10인 것이 바람직하다. 완충액의 pH가 이 범위 내이면, 당쇄 유리 효소의 활성을 유지하기 쉽다. 물 또는 완충액은, 당쇄 유리 효소와 함께, 금속염 등의 염류 등의 단백질의 안정화제 등의 성분을 함유하고 있어도 된다.
상기 유리 공정은, 탈당쇄 촉진제의 존재하에서 행해져도 된다. 이로써, 당단백질로부터 유리한 당쇄를 포함하는, 당쇄 함유 샘플의 회수율을 향상시킬 수 있다.
(탈당쇄 촉진제)
상기 탈당쇄 촉진제는, 산유래형 음이온성 계면활성제를 함유하는 것이 바람직하다. 산유래형 음이온성 계면활성제에 의하여, 당단백질의 단백질 부분이 변성되어 3차 구조가 변화되고, 당쇄 유리 효소가 분해 표적 부위에 작용하기 쉬워진다. 이로써, 당부분이 용이하게 분해되어 유리한다.
산유래형 음이온성 계면활성제는, 유기산으로부터 유도되는 음이온성 계면활성제이다. 예를 들면, 카복실산형 음이온성 계면활성제, 설폰산형 음이온성 계면활성제, 황산 에스터형 음이온성 계면활성제, 인산 에스터형 음이온성 계면활성제 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 카복실산형 음이온성 계면활성제가 바람직하다. 산유래형 음이온성 계면활성제가 카복실산형 음이온성 계면활성제이면, 당단백질의 단백질 부분을 변성시키지만, 당쇄 유리 효소를 변성시키기 어려운 경향이 있다고 생각된다.
상기 카복실산형 음이온성 계면활성제로서는, R1-COOX(여기에서, R1은 유기기를 나타내고, X는 수소 원자 또는 양이온을 나타냄)로 나타나는 카복실산 및 카복실산염과, R1CON(R2)-R3-COOX(여기에서, R1은 유기기를 나타내고, -N(R2)-R3-COO-는 아미노산 잔기를 나타내며, X는 수소 원자 또는 양이온을 나타냄)로 나타나는 아미노산 및 그 염(N-아실아미노산계 계면활성제) 등을 들 수 있다. 그 중에서도, R1CON(R2)-R3-COOX(여기에서, R1은 유기기를 나타내고, -N(R2)-R3-COO-는 아미노산 잔기를 나타내며, X는 수소 원자 또는 양이온을 나타냄)로 나타나는 아미노산 및 그 염(N-아실아미노산계 계면활성제)이 바람직하다.
양이온 X로서는, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속 이온, 트라이에탄올아민 이온, 암모늄 이온 등을 들 수 있다. 또한, 이하의 모든 산유래형 음이온성 계면활성제의 예시에 있어서, "염"은 적어도 나트륨염, 칼륨염, 트라이에탄올아민염, 암모늄염을 예시하는 것으로 한다.
상기 R1-COOX로 나타나는 카복실산염에 있어서, 유기기 R1은, 적어도 탄소를 갖는 기이며, 고급 알킬기, 고급 불포화 탄화 수소기, 옥시알킬렌기가 개재된 탄화 수소기, 불소 치환된 고급 알킬기를 들 수 있다.
고급 알킬기 및 고급 불포화 탄화 수소기의 탄소수는 6~18이어도 된다. 이와 같은 고급 알킬기 또는 고급 불포화 탄화 수소기를 갖는 카복실산형 음이온성 계면활성제의 구체예로서는, 옥탄산염, 데칸산염, 라우르산염, 미리스트산염, 팔미트산염, 스테아르산염, 올레산염, 리놀레산염 등을 들 수 있다. 또, 상기의 고급 알킬기 및 고급 불포화 탄화 수소기는 치환되어 있어도 되고, 치환기는 탄소수가 예를 들면 1~30인 알킬기 또는 알콕시카보닐기여도 된다.
옥시알킬렌기가 개재된 탄화 수소기에 있어서는, 1 이상의 옥시알킬렌기가 주쇄에 포함되어 있어도 된다. 옥시알킬렌기는, 옥시에틸렌기, 옥시-n-프로필렌기, 옥시아이소프로필렌기 등을 들 수 있다. 옥시알킬렌기가 개재되어 있는 탄화 수소기로서는, 예를 들면 R4-(CH2CH2O)n-R5-로 나타나는 기를 들 수 있다.
여기에서, R4는 고급 알킬기, 고급 불포화 탄화 수소기, 또는 치환 혹은 무치환의 아릴기여도 된다. 고급 알킬기 및 고급 불포화 탄화 수소기의 탄소수는 6~18이어도 된다. 아릴기로서는, 페닐기, 나프틸기 등을 들 수 있다. 치환 아릴기의 경우, 치환기는 직쇄 또는 분기의 알킬기여도 되고, 당해 직쇄 또는 분기의 알킬기의 탄소수는 1~30이어도 된다. 특히 페닐기의 경우, 당해 치환기는 설폰일기에 대하여 파라위로 치환되어 있어도 된다. 또, n은 1~10이어도 된다. 또, R5는 시그마 결합, 또는 에틸렌기, 메틸렌기, n-프로필렌기 등의 알킬렌기여도 된다. 이와 같은 카복실산염의 구체예로서는, 라우레스카복실산염(예를 들면, 라우레스-4-카복실산염, 라우레스-6-카복실산염)트라이데세스카복실산염(예를 들면, 트라이데세스-4-카복실산염, 트라이데세스-6-카복실산염) 등을 들 수 있다.
불소 치환된 고급 알킬기에 있어서는, 1 이상의 수소 원자가 불소 원자로 치환되어 있다. 불소 치환된 고급 알킬기는, 모든 수소 원자가 불소로 치환된 퍼플루오로알킬기여도 된다. 또 탄소수는, 6~18이어도 된다. 이와 같은 퍼플루오로알킬카복실산 및 퍼플루오로알킬카복실산염의 구체예로서는, 퍼플루오로옥탄산, 퍼플루오로노난산, 퍼플루오로옥탄산염, 퍼플루오로노난산염 등을 들 수 있다.
상기 카복실산형 음이온성 계면활성제-아미노산 및 그 염에 있어서, R1CON(R2)-R3-COOX로 나타나는 아미노산 또는 그 염에 있어서, 유기기 R1 및 양이온 X는, 상기의 카복실산 또는 카복실산염에 있어서의 유기기 R1 및 양이온 X와 동일하다.
또, R2는 수소 원자 또는 알킬기(예를 들면, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 아이소프로필기 등)이다. R3은 치환 또는 무치환의 에틸렌기, 메틸렌기, n-프로필렌기 등이어도 되고, N 말단 측의 질소 원자와 함께 환을 형성하고 있어도 된다. 따라서, -N(R2)-R3-COO-로 나타나는 아미노산 잔기는, α-아미노산 잔기, β-아미노산 잔기, γ-아미노산 잔기 등이어도 되고, 천연 아미노산 유래의 잔기여도 되며, 비천연 아미노산 유래의 잔기여도 된다. 예를 들면, 사르코신 잔기, 글루탐산 잔기, 글라이신 잔기, 아스파라진산 잔기, 프롤린 잔기, β-알라닌 잔기 등의 아미노산 유래의 잔기를 들 수 있다.
R2가 수소 원자인 경우의 당해 아미노산 또는 그 염(즉 N-아실아미노산계 계면활성제)의 구체예로서는, N-라우로일아스파라진산염, N-라우로일글루탐산, N-라우로일글루탐산염, N-미리스토일글루탐산염, N-코코일알라닌염, N-코코일글라이신염, N-코코일글루탐산염, N-팔미토일글루탐산염, N-팔미토일프롤린, N-팔미토일프롤린염, N-운데실레노일글라이신, N-운데실레노일글라이신염, N-스테아로일글루타민염 등을 들 수 있다. 산유래형 음이온성 계면활성제가 N-아실아미노산계 계면활성제이면, 당단백질의 단백질 부분을 보다 변성시키기 쉽고, 당쇄 유리 효소를 변성시키기 어려운 경향이 있다.
R2가 알킬기인 경우의 당해 아미노산 또는 그 염(즉 N-아실-N-알킬아미노산계 계면활성제)의 구체예로서는, N-코코일-N-메틸알라닌, N-코코일-N-메틸알라닌염, N-미리스토일-N-메틸-β-알라닌, N-미리스토일-N-메틸-β-알라닌염, N-미리스토일사르코신염, N-라우로일-N-메틸알라닌, N-라우로일-N-메틸알라닌염, N-라우로일-N-에틸글라이신, N-라우로일-N-아이소프로필글라이신염, N-라우로일-N-메틸-β-알라닌, N-라우로일-N-메틸-β-알라닌염, N-라우로일-N-에틸-β-알라닌, N-라우로일-N-에틸-β-알라닌염, N-라우로일사르코신, N-라우로일사르코신염, N-코코일사르코신, N-코코일사르코신염, N-올레오일-N-메틸-β-알라닌, N-올레오일-N-메틸-β-알라닌염, N-올레오일사르코신, N-올레오일사르코신염, N-리놀레일-N-메틸-β-알라닌, N-팔미토일-N-메틸-β-알라닌, N-팔미토일사르코신염 등을 들 수 있다. 산유래형 음이온성 계면활성제가 N-아실-N-알킬아미노산계 계면활성제이면, 당단백질의 단백질 부분을 더 변성시키기 쉽고, 당쇄 유리 효소를 변성시키기 어려운 경향이 있다.
상기 설폰산형 음이온성 계면활성제는, R1-SO3X(여기에서, R1은 유기기를 나타내고, X는 수소 원자 또는 양이온을 나타냄)로 나타나는 설폰산 또는 설폰산염이다. 유기기 R1은, 적어도 탄소를 갖는 기이며, 고급 알킬기, 고급 불포화 탄화 수소기, 옥시알킬렌기가 개재된 탄화 수소기, 불소 치환된 고급 알킬기, 치환 또는 무치환의 아릴기, 2가의 연결기(예를 들면, -O-, -CO-, -CONH-, -NH- 등)가 개재된 고급 알킬기 또는 고급 불포화 탄화 수소기 등을 들 수 있다.
유기기 R1 중, 고급 알킬기, 고급 불포화 탄화 수소기, 옥시알킬렌기가 개재된 탄화 수소기, 불소 치환된 고급 알킬기, 및 양이온 X에 대해서는, 상기의 카복실산 또는 카복실산염에 있어서의 유기기 R1 및 양이온 X와 동일하다.
구체적으로는, 1-헥세인설폰산염, 1-옥테인설폰산염, 1-데케인설폰산염, 1-도데케인설폰산염; 퍼플루오로뷰테인설폰산, 퍼플루오로뷰테인설폰산염, 퍼플루오로옥테인설폰산, 퍼플루오로옥테인설폰산염; 테트라데센설폰산염; 알파설포 지방산 메틸에스터염(CH3(CH2)nCH(SO3X)COOCH3) 등(n은, 1~30의 정수)을 들 수 있다.
유기기 R1이 치환 또는 무치환의 아릴기인 경우, 아릴기로서는, 페닐기, 나프틸기 등을 들 수 있다. 치환 아릴기의 경우, 치환기는 직쇄 또는 분기의 알킬기여도 되고, 당해 직쇄 또는 분기의 알킬기의 탄소수는 1~30이어도 된다. 특히 페닐기의 경우, 당해 치환기는 설폰일기에 대하여 파라위로 치환되어 있어도 된다. 이와 같은 방향족계 설폰산염으로서는, 톨루엔설폰산염, 큐멘설폰산염, 옥틸벤젠설폰산염, 도데실벤젠설폰산염, 나프탈렌설폰산염, 나프탈렌다이설폰산염, 나프탈렌트라이설폰산염, 뷰틸나프탈렌설폰산염 등을 들 수 있다.
유기기 R1이, 2가의 연결기(예를 들면, -O-, -CO-, -CONH-, -NH- 등)가 개재된 고급 알킬기 또는 고급 불포화 탄화 수소기인 경우의 설폰산형 계면활성제로서는, 당해 고급 알킬기 또는 고급 불포화 탄화 수소기로 O-치환된 이세싸이온산염, 당해 고급 알킬기 또는 고급 불포화 탄화 수소기로 N-치환된 타우린염 등을 들 수 있다. 당해 고급 알킬기 또는 고급 불포화 탄화 수소기의 탄소수는, 6~18이어도 된다. 이와 같은 설폰산형 계면활성제의 구체예로서는, 코코일이세싸이온산염, 코코일타우린염, 코코일-N-메틸타우린, N-올레오일-N-메틸타우린염, N-스테아로일-N-메틸타우린염, N-라우로일-N-메틸타우린염 등을 들 수 있다.
상기 황산 에스터형 음이온성 계면활성제는, R1-OSO3X(여기에서, R1은 유기기를 나타내고, X는 양이온을 나타냄)로 나타나는 황산 에스터염이다. 유기기 R1은, 적어도 탄소를 갖는 기이며, 고급 알킬기, 고급 불포화 탄화 수소기, 옥시알킬렌기가 개재된 탄화 수소기, 불소 치환된 고급 알킬기이며, 각각 상술한 카본형 계면활성제에 있어서의 R1과 동일하다. 양이온 X로서는, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속 이온, 트라이에탄올아민 이온, 암모늄 이온 등을 들 수 있다.
황산 에스터염의 구체예로서는, 라우릴 황산염, 미리스틸 황산염, 라우레스 황산염(C12H25(CH2CH2O)nOSO3X, 여기에서, n은 1~30의 정수), 폴리옥시에틸렌알킬페놀설폰산 나트륨(C8H17C6H4O[CH2CH2O]3SO3X) 등을 들 수 있다.
상기 인산 에스터형 음이온성 계면활성제는, R1-OSO3X(여기에서, R1은 유기기를 나타내고, X는 수소 원자 또는 양이온을 나타냄)로 나타나는 인산 에스터 또는 인산 에스터염이다. 유기기 R1은, 적어도 탄소를 갖는 기이며, 고급 알킬기, 고급 불포화 탄화 수소기, 옥시알킬렌기가 개재된 탄화 수소기, 불소 치환된 고급 알킬기이고, 각각 상술한 카본형 계면활성제에 있어서의 R1과 동일하다. 양이온 X로서는, 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속 이온, 트라이에탄올아민 이온, 암모늄 이온 등을 들 수 있다.
인산 에스터 또는 인산 에스터염의 구체예로서는, 라우릴 인산, 라우릴 인산염 등을 들 수 있다.
상기 탈당쇄 촉진제는, 물 또는 완충액 중에 산유래형 음이온성 계면활성제가 용해 또는 분산된 상태로 준비되어도 된다. 완충액을 이용하는 경우, 완충제로서는, 탄산 암모늄, 탄산 수소 암모늄, 염화 암모늄, 시트르산 수소 이암모늄, 카밤산 암모늄 등의 암모늄염; 트리스하이드록시메틸암모늄 등의 트리스 완충제; 인산염 등을 들 수 있다. 완충액은, pH가 5~10인 것이 바람직하다. 완충액의 pH가 이 범위 내이면, 당쇄 유리 효소의 활성을 유지하기 쉽다. 탈당쇄 촉진제에 있어서, 물 또는 완충액 중에 포함되는 산유래형 음이온성 계면활성제 이외의 성분으로서는, 계면활성제 이외의 금속염 등의 염류를 들 수 있다.
본 실시형태에 있어서의 유리 공정에서는, 당쇄 유리 효소의 지적(至適) 조건(온도 및 pH)이 충족된, 당단백질과 당쇄 유리 효소를 포함하는 유리 반응액이 조제되면 된다.
탈당쇄 촉진제를 이용하는 경우는, 당쇄 유리 효소의 지적 조건(온도 및 pH)이 충족된, 당단백질과 산유래형 음이온성 계면활성제와 당쇄 유리 효소를 포함하는 유리 반응액이 조제되면 된다. 따라서, 탈당쇄 촉진제를 이용하는 경우에는, 고정된 당단백질을 포함하는 시료(이하, 간단히 당단백질을 포함하는 시료라고 하는 경우가 있음), 탈당쇄 촉진제, 및 당쇄 유리 효소는 어떠한 조작 순서로 혼합되어도 된다.
예를 들면, 당단백질을 포함하는 시료와, 탈당쇄 촉진제와, 당쇄 유리 효소를 동일한 타이밍에 서로 혼합하여 유리 반응액을 조제해도 된다. 또, 먼저 탈당쇄 촉진제를 첨가하고, 그 후에 당쇄 유리 효소를 첨가함으로써 유리 반응액을 조제해도 된다. 또한, 고상에 고정된 당단백질이 후술하는 전처리를 거쳐 얻어진 것인 경우이고, 또한 탈당쇄 촉진제와 전처리에 이용되는 계면활성제가 동일 물질인 경우에는, 전처리 시에, 탈당쇄 촉진제에 상당하는 분량의 계면활성제를, 전처리제에 상당하는 분량의 계면활성제에 추가하여 먼저 첨가해 두고, 이어지는 유리 공정에서(이미 탈당쇄 촉진제가 존재하고 있는 상태이기 때문에) 당쇄 유리 효소만을 첨가해도 된다.
구체적으로는, 모든 성분을 혼합시킨 유리 반응액을 조제하고, 그 후, 지적 온도로 설정하여, 당단백질로부터 당쇄를 유리시키는 반응을 행할 수 있다. 이 경우, 반응 시간은 예를 들면 5초~24시간이어도 된다.
탈당쇄 촉진제를 이용하는 경우에는, 당단백질을 포함하는 시료와, 산유래형 음이온성 계면활성제를 먼저 혼합하여 당단백질의 단백질 부분을 변성시킨 후에, 당쇄 유리 효소와 혼합해도 된다. 이 경우, 변성 시간은 예를 들면 5초~24시간이어도 되고, 당쇄 유리 시간은 예를 들면 5초~24시간이어도 된다.
유리 반응액에 있어서, 당단백질의 농도는, 예를 들면 0.1μg/mL~100mg/mL여도 되고, 예를 들면 1μg/mL~10mg/mL여도 된다. 유리 반응액 중의 당단백질의 농도가 상기 하한값 이상인 것은, 검출성의 점에서 바람직하고, 상기 상한값 이하인 것은, 정량성의 점에서 바람직하다.
탈당쇄 촉진제를 이용하는 경우, 유리 반응액에 있어서, 산유래형 음이온성 계면활성제의 농도는, 예를 들면 0.01~30질량%여도 되고, 예를 들면 0.2~1.0질량%여도 되며, 예를 들면 0.2~0.3질량%여도 되고, 예를 들면 0.22~0.27질량%여도 된다. 혹은, 산유래형 음이온성 계면활성제는, 당단백질 1μg에 대하여 0.001μg~100mg 이하가 되도록 이용해도 된다.
산유래형 음이온성 계면활성제의 사용량을 상기의 범위로 설정함으로써, 당쇄 유리 효소의 활성 유지의 점 및 유리 당쇄의 회수량의 점에서 양호해지고, 또한 회수량의 안정성의 점에서도 양호해진다. 또, 예를 들면 유리 당쇄의 정제를 고상 담체에 의하여 행하는 경우에, 건조 시간이 길어지는 것을 방지하는 점에서도 바람직하다.
유리 반응액에 있어서, 당쇄 유리 효소의 농도는, 예를 들면 0.001μU/mL~1000mU/mL여도 되고, 예를 들면 0.01μU/mL~100mU/mL여도 된다. 혹은, 당쇄 유리 효소를 당단백질 1μg에 대하여 0.001μU~1000mU가 되도록 이용해도 된다. 당쇄 유리 효소의 사용량을 상기의 범위로 설정함으로써, 효율적인 당쇄 유리가 가능해진다.
반응 pH는, 당쇄 유리 효소의 지적 pH에 맞추면 되지만, 예를 들면 5~10이어도 된다. 반응 온도도, 당쇄 유리 효소의 지적 온도에 맞추면 되지만, 예를 들면 4~90℃여도 된다.
상기 유리 공정에 있어서, 반응 시간은, 당단백질의 스케일 등에 따라서도 다르지만, 예를 들면 5초~24시간이어도 된다. 바람직하게는, 유리 공정의 반응계를 개방계(예를 들면, 용기를 개방한 상태)로 하여 용매가 증발하도록 가열해도 된다. 또, 폐쇄(캡)한 상태에서 용기를 가열한 후, 개방한 상태의 용기 중의 용매에 대하여, 공지 방법으로 건조하여 제거해도 된다. 가열 온도로서는, 예를 들면 40℃ 이상, 예를 들면 45℃ 이상이어도 된다. 이로써, 유리 공정의 진행 중에 용매가 증발하여 반응액의 농도가 서서히 상승하기 때문에, 본 실시형태의 방법으로 제공된 당단백질의 스케일에 관계없이, 당쇄 유리가 효율적으로 진행되는 농도로 제공하는 것이 용이하다. 또한, 유리 반응과 함께 용매 제거가 함께 행해지기 때문에, 유리 공정과 별도로 용매 제거 공정을 행하기 위한 시간이 단축되거나 또는 불필요해져, 더 신속한 당쇄 조제가 가능해진다. 가열 온도의 범위 내의 상한으로서는, 당쇄 유리 효소의 변성을 막는 관점에서, 예를 들면 80℃여도 된다.
이상에 의하여, 상기 유리 공정에 의하여, 시료 중의 당단백질로부터 분리된 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플이 얻어진다.
<전처리 공정>
본 실시형태의 당쇄를 조제하는 방법의 일례로서는, 상기 유리 공정 전에, 시료에 대하여, 계면활성제 또는, 염화 구아니딘·구아니딘싸이오사이아네이트·구아니딘염산염 등의 구아니딘염·요소 등의 카오트로픽 시약을 포함하는, 전처리제를 접촉시키는 전처리 공정을 더 가져도 된다.
이로써, 단백질 부분의 분해 처리를 행하지 않고, 당단백질로부터의 당쇄의 유리가 용이해진다. 그 결과, 당쇄 유리 처리에 필요한 시간을 큰 폭으로 단축할 수 있다.
전처리 공정에서는, 고상에 고정된 당단백질을 포함하는 시료에 계면활성제를 포함하는 전처리제를 접촉시켜도 된다. 전처리 공정은, 당단백질을 포함하는 시료를 고상에 접촉시켜 당단백질의 포착이 완료된 후, 또는 고상 합성이 완료된 후 혹은 추가로 세정 처리가 행해진 후로서, 당쇄 유리 효소에 접촉되기 전에 행해져도 된다. 전처리 공정을 실시함으로써, 유리 공정에 있어서 당단백질에 당쇄 유리 효소가 작용하기 쉬워진다.
전처리제에 포함되는 계면활성제는, 음이온 계면활성제, 양이온 계면활성제, 양성 계면활성제, 및 비이온 계면활성제 중 어느 것이어도 된다.
음이온 계면활성제로서는 특별히 한정되지 않고, 비누 등의 지방산의 염, 알킬벤젠설폰산염, 고급 알코올 황산 에스터염, 폴리옥시에틸렌알킬에터 황산염, α-설포 지방산 에스터, α-올레핀설폰산염, 모노알킬 인산 에스터염, 알킬설폰산염 등을 들 수 있지만, 이후의 당쇄 유리 공정에서 이용되는 탈당쇄 촉진제로서 이용할 수 있는 음이온성 계면활성제(본 명세서에서는, 탈당쇄 촉진제로서도 이용할 수 있는 음이온성 계면활성제를, 특히 산유래형 음이온성 계면활성제라고 함)인 것이 바람직하다. 산유래형 음이온성 계면활성제를 전처리 공정에서 이용하는 경우, 당쇄 유리 공정에서 이용되는 탈당쇄 촉진제로서 예를 든 계면활성제와 동일한 계면활성제여도 되고, 다른 계면활성제여도 된다.
양이온 계면활성제로서는 특별히 한정되지 않고, 알킬트라이메틸암모늄염, 다이알킬다이메틸암모늄염, 알킬다이메틸벤질암모늄염, 아민염계 등을 들 수 있다. 양성 계면활성제로서는 특별히 한정되지 않고, 알킬아미노 지방산염, 알킬베타인, 알킬아민옥사이드 등을 들 수 있다. 비이온 계면활성제로서는 특별히 한정되지 않고, 폴리옥시에틸렌알킬에터, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에터, 알킬글루코사이드, 폴리옥시에틸렌 지방산 에스터, 자당 지방산 에스터, 소비탄 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌소비탄 지방산 에스터, 지방산 알칸올아마이드, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 블록 코폴리머 등을 들 수 있다.
전처리제는, 계면활성제가, 물 또는 완충액 중에 용해된 상태로 이용되어도 된다. 완충액을 이용하는 경우, 완충제로서는, 탄산 암모늄, 탄산 수소 암모늄, 염화 암모늄, 시트르산 수소 이암모늄, 카밤산 암모늄 등의 암모늄염; 트리스하이드록시메틸암모늄 등의 트리스 완충제; 인산염 등을 들 수 있다. 완충액은, pH가 5~10인 것이 바람직하다. 완충액의 pH가 이 범위 내이면, 이후의 공정에서 이용하는 당쇄 유리 효소의 활성을 유지하기 쉽다. 당단백질을 포함하는 시료에 있어서, 물 또는 완충액 중에 포함되는 당단백질 이외의 성분으로서는, 금속염 등의 염류 등의 단백질의 안정화제 등을 들 수 있다.
전처리제 중의 계면활성제의 농도는, 예를 들면 0.01~30질량%여도 되고, 예를 들면 0.2~1.0질량%여도 되며, 예를 들면 0.2~0.3질량%여도 되고, 예를 들면 0.22~0.27질량%여도 된다. 당해 농도가 상기 하한값 이상인 것, 및 상기 상한값 이하인 것에 의하여, 이후의 당쇄 유리 공정에 있어서 유리시킨 당쇄를, 양호한 회수율로 얻을 수 있다.
전처리제는, 고상에 접촉시킨 후에는, 고상에 고정된 당단백질로부터 분리될 수 있다. 분리는 소정의 사용량 전부를 용기 내에 넣은 후에 한 번에 행해도 되고, 소정의 사용량의 일부를 몇 회로 나누어 넣고, 그때마다 행해도 된다. 전처리제의 분리는, 감압 또는 원심 분리 등에 의하여 행할 수 있다.
전처리 공정을 끝낸 고상에 고정된 당단백질은, 신속 조제의 관점에서, 세정되지 않고 유리 공정에 제공해도 되지만, 전처리 공정 후, 유리 공정 전에 세정 조작을 행해도 된다. 세정 조작은 각 조작 사이에 적절히 실시해도 된다.
<표지 공정>
본 실시형태의 당쇄를 조제하는 방법의 일례로서는, 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플에 표지 시약을 첨가함으로써, 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻는 표지 공정을 갖는 것이며, 당해 표지 공정에 있어서, 표지 시약과 당쇄의 반응을 용기 내에서 행할 수 있다. 또, 표지 공정은, 유리 공정을 행한 용기와 동일한 용기를 이용하여 실시해도 된다.
이와 같은 표지 공정에서는, 유리 공정에서 얻어진 용기 중의 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플에, 표지 화합물을 포함하는 표지 시약(표지 반응액)을 첨가하여, 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻을 수 있다.
(표지 화합물)
상기 표지 화합물은, 당쇄에 대한 반응성기와, 당쇄에 수식해야 하는 수식기를 갖는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 당쇄에 대한 반응성기로서는, 옥실아미노기, 하이드라자이드기, 아미노기 등을 들 수 있다. 수식기는, 당쇄의 분석 수법에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있다.
예를 들면, 표지 화합물이, 당쇄에 대한 반응성기로서 옥실아미노기 또는 하이드라자이드기를 갖는 경우, 당쇄에 수식해야 하는 수식기로서는, 예를 들면 아르지닌 잔기, 트립토판 잔기, 페닐알라닌 잔기, 타이로신 잔기, 시스테인 잔기, 라이신 잔기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기를 선택할 수 있다.
표지 화합물이 아르지닌 잔기를 포함하는 경우, 수식된 당쇄의 말디토프 질량 분석(MALDITOF-MS) 측정 시에 이온화가 촉진되어, 검출 감도가 향상되는 점에서 바람직하다. 표지 화합물이 트립토판 잔기를 포함하는 경우, 당해 잔기는 형광성이고 또한 소수성인 점에서, 수식된 당쇄의 역상(逆相) HPLC 검출 시에, 분리성이 향상 및 형광 검출 감도가 향상되는 점에서 바람직하다. 표지 화합물이 페닐알라닌 잔기 및/또는 타이로신 잔기를 포함하는 경우, 수식된 당쇄의 UV 흡수에 의한 검출에 적합한 점에서 바람직하다. 표지 화합물이 시스테인 잔기를 포함하는 경우, 당해 잔기의 -SH기를 표적으로 하여 ICAT 시약(미국 에이비아이(ABI)사) 등의 라벨화 시약에 의한 라벨화가 가능하다. 표지 화합물이 라이신 잔기를 포함하는 경우, 당해 잔기의 아미노기를 표적으로 하여 iTRAQ 시약(미국 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems)사), ExacTag 시약(미국 퍼킨(Perkin)사) 등의 라벨화 시약에 의한 라벨화가 가능하다. 표지 화합물이 트립토판 잔기를 포함하는 경우, 당해 잔기의 인돌기를 표적으로 하여 NBS 시약(일본, 시마즈 세이사쿠쇼)에 의한 라벨화가 가능하다.
또, 예를 들면 표지 화합물이 당쇄에 대한 반응성기로서 아미노기를 갖는 경우, 표지 화합물로서 자외선 흡수 특성 또는 형광 특성을 갖는 아미노기를 갖는 화합물을 이용할 수 있다. 이 아미노기를 갖는 화합물에 있어서, 당쇄에 수식해야 하는 수식기로서는, 방향족기를 들 수 있다. 아미노기 및 방향족기를 갖는 표지 화합물의 사용에서는, 환원 아미노화에 의한 수식이 행해진다. 방향족기는, 자외 가시 흡수 특성 또는 형광 특성을 갖기 때문에, UV 검출 또는 형광 검출에서의 검출 감도가 향상되는 점에서 바람직하다.
이와 같은 방향족기를 부여하는 표지 화합물로서는, 구체적으로는, 8-아미노피렌-1,3,6-트라이설포네이트, 8-아미노나프탈렌-1,3,6-트라이설포네이트, 7-아미노-1,3-나프탈렌다이설폰산, 2-아미노9(10H)-아크리돈, 5-아미노플루오레세인, 댄실에틸렌다이아민, 2-아미노피리딘, 7-아미노-4-메틸쿠마린, 2-아미노벤즈아마이드, 2-아미노벤조산, 3-아미노벤조산, 7-아미노-1-나프톨, 3-(아세틸아미노)-6-아미노아크리딘, 2-아미노-6-사이아노에틸피리딘, 에틸 p-아미노벤조에이트, p-아미노벤조나이트릴 및 7-아미노나프탈렌-1,3-다이설폰산을 들 수 있다.
그 중에서도, 아미노기를 갖는 화합물로서는, 2-아미노벤즈아마이드를 포함할 수 있다. 2-아미노벤즈아마이드는, 반응 스케일이 큰 경우여도 협잡물(예를 들면, 염, 단백질 그 외의 생체 분자)의 영향을 비교적 받기 어려운 점에서 바람직한 경우가 있다. 한편, 본 실시형태의 방법은, 반응 스케일이 작은 경우에 특히 유용하다. 반응 스케일이 작을수록 협잡물의 영향을 받기 어려워지기 때문에, 보다 다종다양한 표지 시약(표지 반응액)으로 적용할 수 있다. 또한, 표지 화합물로서의 기능이 유지되는 한에서, 상술한 화합물의 유도체도 또한 바람직하게 이용된다.
표지 화합물은, 물, 완충액 및/또는 유기 용매에 용해시켜 사용될 수 있다. 완충액으로서는, 상술한 유리 공정에서 이용되는 것과 동일한 완충제의 수용액을 들 수 있다.
(표지 시약)
본 실시형태의 표지 시약은, 자외선 흡수 특성 또는 형광 특성을 갖는 아미노기를 갖는 화합물 등의 표지 화합물, 환원제 및 유기 용매를 포함할 수 있다.
상기 유기 용매는, 비프로톤성 극성 유기 용매, 프로톤성 극성 유기 용매 및 비프로톤성 비극성 유기 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다.
구체적으로는, 유기 용매로서는, 예를 들면 다이메틸설폭사이드(DMSO), 다이메틸폼아마이드(DMF), N-메틸피롤리돈(NMP) 등의 비프로톤성 극성 유기 용매, 유기산(폼산, 아세트산, 프로피온산, 뷰티르산 등) 및 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올 등) 등의 프로톤성 극성 유기 용매와, 헥세인 등의 비프로톤성 비극성 유기 용매를 들 수 있다. 이들 용매는, 1종을 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다.
표지 공정에 필요한 시간의 단축 효과를 보다 바람직하게 얻는 관점에서, 유기 용매로서 폼산, 아세트산, 프로피온산, 뷰티르산 등의 유기산을 이용할 수 있다. 그 중에서도, 조작 용이성의 관점에서, 유기산으로서 아세트산을 이용할 수 있다.
프로톤성 극성 유기 용매의 비점이 비교적 낮은 경우(예를 들면 비점이 140℃ 미만인 경우), 프로톤성 용매에 더하여, 당해 프로톤성 용매보다 비점이 높은 용매를 병용해도 된다. 이로써, 표지 공정에 있어서의 상기의 비교적 비점이 낮은 프로톤성 극성 유기 용매의 휘발 속도를 지연시킬 수 있다. 그 결과, 표지 공정 중에, 미반응물의 원하지 않는 석출을 억제할 수 있다. 이로써, 양호한 수량(收量)으로 표지 당쇄를 얻을 수 있다. 이와 같은 비점이 높은 용매(이하, 고비등점 용매라고 기재함)를 병용하는 양태는, 당쇄의 스케일이 작은 경우, 용매의 양이 적은 경우, 및/또는 반응 시간이 길어지는 경우에 선택할 수 있다.
상술한 고비등점 용매로서는, 예를 들면 비점 140~200℃의 비프로톤성 극성 유기 용매여도 된다. 구체적인 고비등점 용매로서는, 다이메틸설폭사이드, 다이메틸폼아마이드, N-메틸피롤리돈 등의 비프로톤성 극성 유기 용매를 들 수 있다.
고비등점 용매로서 비프로톤성 극성 유기 용매를 병용하는 경우, 그 양은, 표지 화합물인 2-아미노벤즈아마이드나 환원제의 용해성·반응성을 향상시킨다는 관점에서, 프로톤성 극성 유기 용매보다 체적%가 낮은 것이 바람직하고, 프로톤성 극성 유기 용매의 4체적% 이상 100체적% 미만이어도 되며, 4~70체적%여도 된다.
환원 아미노화에 의한 수식에 있어서는, 당쇄의 환원 말단에 형성되는 알데하이드기와 표지 화합물의 아미노기를 반응시켜, 형성된 시프 염기를 환원제에 의하여 환원하는 것으로 당쇄의 환원 말단에 수식기가 도입됨으로써, 효율적인 표지가 가능해진다.
상기 환원제로서는, 예를 들면 사이아노 수소화 붕소 나트륨, 수소화 트라이아세톡시 붕소 나트륨, 메틸아민보레인, 다이메틸아민보레인, 트라이메틸아민보레인, 피콜린보레인 및 피리딘보레인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있다. 독성이 낮은 피콜린보레인을 이용함으로써, 안전성이 높은 표지가 가능해진다.
안전성 및 반응성의 양쪽 모두의 관점에서, 피콜린보레인(2-피콜린-보레인)을 이용하는 것이 바람직하다. 동일한 관점에서, 피콜린보레인을 환원제로서 이용하는 경우, 표지 화합물로서는 예를 들면 2-아미노벤즈아마이드를 이용하는 것이 바람직하다. 또, 환원제로서 피콜린보레인을 이용한 경우는, 용매로서 프로톤성 극성 유기 용매를 포함하는 것이 바람직하다. 이로써, 피콜린보레인을 고농도로 용해할 수 있기 때문에, 표지 공정에 필요한 시간이 단축된다. 용매로서 아세트산 등의 프로톤성 극성 유기 용매와 다이메틸설폭사이드 등의 비프로톤성 극성 유기 용매의 혼합 용매를 이용해도 된다.
본 실시형태에 있어서의 표지 공정에서는, 표지 시약과 당쇄 함유 샘플 중에 함유되는 당쇄의 반응 환경 중에 물을 포함하는 것이다. 구체적으로는, 상기 표지 공정은, 용기 내의 반응 환경 중에 물이 포함된 상태에서, 표지 시약과 당쇄를 반응시킬 수 있다. 이로써, 상술한 바와 같이 표지 효율을 높일 수 있다.
상기 표지 공정에 있어서, 표지 시약과 당쇄의 반응 환경은, 고상 중에 존재해도 되지만, 이에 한정되지 않고, 고상 중이 아닌 용기 내의 바닥부 표면 상의 액상 중에 존재해도 된다. 이 반응 환경계는, 예를 들면 표지 화합물, 환원제와 유기 용매를 포함하는 표지 시약, 당쇄를 포함하는 당쇄 함유 샘플, 및 물 등으로 구성할 수 있다. 상기 액상은, 이들 반응 환경계 중의 용매 등으로 구성되어 있어도 된다.
또, 표지 공정에 있어서, 반응 환경 중의 물의 양을 X(μL)로, 당쇄의 양을 Y(μg)로 했을 때, 당쇄량에 대한 수분량의 비율을 나타내는 X/Y의 하한값은, 예를 들면 1.2 이상이며, 바람직하게는 1.3 이상이고, 보다 바람직하게는 2 이상이다. 이와 같이 당쇄에 대한 수분 비율을 나타내는 X/Y를 상기 하한값 이상으로 함으로써, 당쇄의 표지를 효율적으로 행할 수 있다. 또, 반응 환경 중에 고농도(예를 들면 1μg 초과)로 존재하는 당쇄에 대한 표지에 대해서도, 안정적으로 행할 수 있다. 상기 X/Y의 상한값은, 예를 들면 50 이하가 바람직하고, 30 이하가 보다 바람직하다. 상기 X/Y를 상기 상한값 이하로 하면, 과잉인 물이 존재하는 것에 의하여, 반응 환경계 중의 표지 화합물의 농도가 저하됨으로써, 표지 효율이 저하되는 것을 억제할 수 있다.
상기 표지 공정에 있어서, 반응 환경 중에 소정 농도 이상의 고농도로 존재하는 당쇄에 대한 표지에 대해서도 안정적으로 행하는 관점에서, 당쇄량보다 수분량이 많아지도록 당쇄와 표지 시약의 반응 환경을 적절히 제어함으로써, 표지 효율 및 표지성을 향상시킬 수 있다. 상기 X/Y의 하한값은, 당쇄량보다 수분량이 많아지는 것을 나타낸다.
한편, 과잉인 물에 의하여, 반응 환경계 중의 표지 화합물의 농도가 과도하게 저하되지 않도록 당쇄와 표지 시약의 반응 환경을 적절히 제어함으로써, 표지의 효율이 저하되는 것을 억제할 수 있다. 상기 X/Y의 상한값은, 표지 화합물의 농도가 과도하게 저하되지 않는 수분량을 나타낸다.
또, 본 실시형태의 표지 공정에 있어서, 스몰 스케일에서는, 미량의 물이 존재하는 경우이더라도, 당쇄를 표지할 수 있다. 즉, 표지 공정에 있어서, 반응 환경 중의 당쇄의 양이 0μg 초과 1μg 미만인 경우, 반응 환경 중의 물의 양은, 예를 들면 0μL 초과 1.0μL 이하이며, 바람직하게는 0.5μL 이하이고, 보다 바람직하게는 0.3μL 이하이다. 이와 같이, 반응 환경 중에 저농도로 존재하는 당쇄에 대해서는, 미량의 물이어도 표지 효율을 향상시킬 수 있다.
상기 스몰 스케일에서의 표지 공정에 있어서, 저농도로 존재하는 당쇄의 조건을, 0μg 초과 1μg 미만으로 하는 당쇄량으로 나타내고, 미량의 물의 조건을, 0μL 초과 1.0μL 이하로 하는 물의 양으로 나타낸다. 이때, 당쇄량은, 0μg 초과 1μg 미만이어도 되고, 0μg 초과 0.9μg 이하여도 되며, 0μg 초과 0.8μg 이하여도 된다.
여기에서, 비특허문헌 2(2-AB를 이용한 글라이칸 표지 키트의 안내서)에는, 건조시킨 샘플을 10μl의 물로 재용해시키는 것이 기재되어 있지만, 중량 기준의 당쇄량과 체적 기준의 수량의 기술적 관계에 대해서는 기재되어 있지 않다. 또, 어떤 종류의 글루칸을 갖는 샘플을 사용할지, 어느 정도의 중량의 샘플을 사용할지에 대해서는, 당해 키트의 사용자가 임의로 결정할 사항이기 때문에, 당해 키트의 안내서인 비특허문헌 2에는, 이들에 대한 조건에 대하여 특별히 기재되어 있지 않다.
본 실시형태의 표지 공정에 있어서, 반응 환경 중의 물은, 표지 공정 전에 당쇄 함유 샘플 중의 물을 함유하는 용매를 완전히 제거한 후에, 물을 후첨가하는 것, 표지 공정 전에 용매의 일부를 제거함으로써, 물을 잔존시키는 것, 또는 표지 화합물이나 환원제 등의 표지 시약을 첨가할 때에, 이 표지 시약에 포함되는 물 등에 의하여 적절히 조정할 수 있다.
즉, 본 실시형태의 방법은, 표지 공정에 있어서, 반응 환경 중에 물을 첨가하는 공정을 실시할 수 있다. 이때, 물을 첨가하는 공정 전에, 당쇄 함유 샘플 중의 물 함유 용매를 완전히 건조시켜 물을 제거해도 되고, 용매를 반건조시켜, 그 적어도 일부를 제거해도 된다. 구체적으로는, 용기를 개방한 상태에서, 가열, 흡인, 원심 등의 방법에 의하여 용매를 건조시킬 수 있다. 이로써, 표지 공정의 반응 환경 중에 물을 포함시킬 수 있다.
또, 본 실시형태의 방법은, 표지 공정 전에, 당쇄 함유 샘플 중의 물 함유 용매 중 적어도 일부를 제거하는 공정을 가질 수 있다. 이때, 표지 공정 전에, 물 함유 용매를 완전히 제거하지 않고, 표지 공정에 그 일부를 잔존시킬 수 있다. 이로써, 표지 공정의 반응 환경 중에 물을 포함시킬 수 있다.
또, 본 실시형태의 방법의 일례로서는, 예를 들면 표지 공정에 있어서, 용기를 개방 또는 밀폐한 상태에서, 당쇄 함유 샘플에 표지 시약을 첨가해도 된다. 이때, 당쇄 함유 샘플이나 표지 시약을 용기 밖의 외부 환경에 노출시켜도 된다.
표지 공정에 있어서의 반응 온도는, 예를 들면 4℃~80℃여도 되고, 예를 들면 25℃~70℃여도 된다. 반응 온도가 상기 하한값 이상인 것은 반응 시간이 짧아지는 점에서 바람직하고, 상기 상한값 이하인 것은 고온에 의한 당쇄의 부분 분해가 억제되는 점에서 바람직하다.
또, 표지 공정에 있어서의 반응 시간은, 예를 들면 5분~600분이어도 되고, 예를 들면 30분~300분이어도 된다. 반응 시간이 상기 하한값 이상인 것은 정량적인 표지의 점에서 바람직하고, 상기 상한값 이하인 것은 당쇄의 부분 분해가 억제되는 점에서 바람직하다.
이와 같은 가열 처리는, 개방계 상태 또는 폐쇄계 상태 중 어느 용기를 이용하여 실시해도 된다.
이상의 표지 공정에 의하여, 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻을 수 있다.
<분리 공정>
상기 표지 공정에서 얻어진 표지 생성물이 고상 중에 존재하는 경우, 표지 공정 후에, 고액 분리에 의하여, 표지된 당쇄를 포함하는 분리액을 얻는 분리 공정을 더 가질 수 있다. 즉, 고액 분리에 의하여, 당쇄의 표지체를 용출함으로써, 고상으로부터, 당쇄의 표지체를 용이하게 분리할 수 있다. 예를 들면, 표지 생성물에 용리액을 통액함으로써, 당쇄의 표지체를 용출할 수 있다. 이 경우에 이용하는 용리액은, 물, 수용액, 콜로이드 용액 등의 수계 용액이어도 된다. 용리액으로서, 고상과 단백질 부분의 결합에 대한 절단능을 갖는 성질을 구비하는 것을 선택해도 되고(표지 당쇄의 분석을 예를 들면 크로마토그래피에 의하여 행하는 경우 등), 그와 같은 성질을 구비하지 않는 것을 선택해도 된다(표지 당쇄의 분석을 예를 들면 질량 분석에 의하여 행하는 경우 등). 이로써, 당쇄의 표지체를 포함하는 분리액이 얻어진다.
또, 상기 분리 공정은, 유리 공정 후, 표지 공정 전에 실시해도 된다. 이로써, 고액 분리에 의하여, 당쇄를 포함하는 당쇄 함유 샘플을 용기 내의 바닥부에 용출시킬 수 있다.
<정제 공정>
본 실시형태의 방법은, 정제 공정을 가질 수 있다. 당쇄의 분석 수법에 따라서는, 분리액으로부터 불필요물을 제거함으로써 표지 당쇄를 정제해도 된다. 불필요물의 제거는, 분리액을 정제용 고상에 통액하여 당쇄의 표지체를 포착하고, 포착된 당쇄의 표지체를 재용출함으로써 행해져도 된다. 또한 정제 공정은, 분리 공정 후에 한정되지 않고, 전처리 공정, 유리 공정, 분리 공정, 표지 공정 등의 각 공정의 사이에 실시해도 된다.
분리액 중에는, 당쇄의 표지체와 함께, 표지 공정에서 이용한 잉여의 표지 화합물, 및 유리 공정에서 탈당쇄 촉진제를 이용한 경우에는, 산유래형 음이온성 계면활성제 등의 불필요물이 존재하고 있다. 용리액으로서, 고상과 단백질 부분의 결합에 대한 절단능을 갖는 것을 선택한 경우는, 분리액 중에 단백질도 혼입된다. 이와 같은 경우, 상기의 정제 공정을 실시할 수 있다. 또한, 용리액으로서, 고상과 단백질 부분의 결합에 대한 절단능을 갖지 않는 것을 선택한 경우는, 분리액 중에 단백질은 실질적으로 포함되지 않는다.
또, 상기의 정제 외에, 세정, 원심 등의 공지의 처리에 대해서는, 전처리 공정, 유리 공정, 분리 공정, 표지 공정 등의 각 공정의 사이, 전후에 있어서, 적절히 실시할 수 있다.
<분석 공정>
본 실시형태의 방법에 의하여 조제된 당쇄의 표지체는, 질량 분석법(예를 들면, 말디토프 질량 분석), 크로마토그래피(예를 들면, 고속 액체 크로마토그래피나 HPAE-PAD 크로마토그래피), 전기영동(예를 들면, 캐필러리 전기영동) 등의 공지의 방법에 의하여, 정성적 및/또는 정량적으로 분석할 수 있다. 당쇄의 분석에 있어서는, 각종 데이터베이스(예를 들면, 글리코모드(GlycoMod), 글리코스위트(Glycosuite), 심글리칸(SimGlycan)(등록 상표) 등)를 이용할 수 있다.
이와 같은 당단백질의 당쇄 분석에 의하여, 예를 들면 항체 의약품의 연구 개발, 제조 및 품질 보증 등의 시에 행해지는 항체 의약품의 당쇄 수식 분석; 당쇄 바이오마커의 검색 연구 등의 시에 행해지는 혈청 등의 검체 중의 당단백질의 분석; 줄기세포의 당쇄 분석; 전기영동 젤 밴드 중의 당쇄 분석; 식물 조직의 당쇄 분석 등을 신속히 행하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명은 상술한 실시형태에 한정되는 것이 아니며, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 범위에서의 변형, 개량 등은 본 발명에 포함되는 것이다.
이하, 참고 형태의 예를 부기한다.
1. 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플에 표지 시약을 첨가함으로써, 상기 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻는 표지 공정을 갖는, 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 표지 공정에 있어서, 상기 표지 시약과 상기 당쇄의 반응 환경 중에 물을 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
2. 1.에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 표지 공정에 있어서, 상기 반응 환경 중의 물의 양을 X(μL)로, 상기 당쇄의 양을 Y(μg)로 했을 때, X/Y가 1.2 이상인, 당쇄를 조제하는 방법.
3. 1.에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 표지 공정에 있어서, 상기 당쇄의 양이 0μg 초과 1μg 미만인 경우, 상기 반응 환경 중의 물의 양은 0μL 초과 1.0μL 이하인, 당쇄를 조제하는 방법.
4. 1. 내지 3. 중 어느 하나에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 표지 공정에 있어서, 상기 표지 시약과 상기 당쇄의 반응이 용기 내에서 행해지는, 당쇄를 조제하는 방법.
5. 4.에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 용기가 튜브 형상을 갖는, 당쇄를 조제하는 방법.
6. 1. 내지 5. 중 어느 하나에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 표지 공정 전에, 상기 당쇄 함유 샘플에 포함되는 용매 중 적어도 일부를 제거하는 공정을 더 갖는, 당쇄를 조제하는 방법.
7. 6.에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 표지 공정에 있어서, 상기 반응 환경 중에 물을 첨가하는 공정을 실시하는, 당쇄를 조제하는 방법.
8. 1. 내지 7. 중 어느 하나에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 표지 공정 전에, 고상에 고정된 상태의 시료에 당쇄 유리 효소를 작용시킴으로써, 상기 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플을 얻는 유리 공정을 더 갖는, 당쇄를 조제하는 방법.
9. 8.에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 당쇄 유리 효소가 펩타이드 N-글리카나제 또는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
10. 8. 또는 9.에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 고상이 칼럼 또는 카트리지 구조를 갖는, 당쇄를 조제하는 방법.
11. 8. 내지 10. 중 어느 하나에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 유리 공정 후에, 고액 분리에 의하여 상기 당쇄를 포함하는 분리액을 얻는 분리 공정을 더 갖는, 당쇄를 조제하는 방법.
12. 1. 내지 11. 중 어느 하나에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 표지 시약이 자외선 흡수 특성 또는 형광 특성을 갖는 아미노기를 갖는 화합물, 환원제 및 유기 용매를 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
13. 12.에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 아미노기를 갖는 화합물이 2-아미노벤즈아마이드를 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
14. 12. 또는 13.에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 환원제가 사이아노 수소화 붕소 나트륨, 수소화 트라이아세톡시 붕소 나트륨, 메틸아민보레인, 다이메틸아민보레인, 트라이메틸아민보레인, 피콜린보레인, 및 피리딘보레인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
15. 12. 내지 14. 중 어느 하나에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 유기 용매가 비프로톤성 극성 유기 용매, 프로톤성 극성 유기 용매 및 비프로톤성 비극성 유기 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
16. 1. 내지 15. 중 어느 하나에 기재된 당쇄를 조제하는 방법으로서,
상기 당쇄가 당단백질 유래인, 당쇄를 조제하는 방법.
실시예
이하, 본 발명에 대하여 실시예를 참조하여 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예의 기재에 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1]
당쇄 함유 샘플로서, 원심 에바포레이터로 건조시킨 0.3μg의 말토헵타오스(당쇄: 단일의 올리고당)에, 표지 시약으로서, 20μL의 2AB 용액(40mg의 2-피콜린보레인, 80mg의 2-아미노벤즈아마이드, 120μL의 아세트산, 40μL의 다이메틸설폭사이드(DMSO)를 혼합한 용액), 및 1μL의 순수를 첨가하고, 50℃에서 40분 반응시켰다. 얻어진 조(粗)2AB 표지 당쇄를 포함하는 분리액에 아세토나이트릴을 첨가하여 모노리스 실리카 스핀 칼럼에 적용하고, 세정한 후, 50μL의 순수로 용출하여, 정제 2AB 표지 당쇄를 포함하는 분리액을 얻었다. 계속해서, 얻어진 정제 2AB 표지 당쇄를 포함하는 분리액 1μL에 대하여, 하기 표 1에 나타내는 조건으로 HPLC 측정을 행했다.
[표 1]
Figure 112018096462303-pct00001
표 1의 A액 및 B액은, 각각 이동상을 구성하는 액체이며, 이들 A액과 B액을 혼합하여 이동상의 극성을 조정했다. 또, 표 1에 있어서, "B: a%(T1분)→B: b%(T2분)"이라는 기재는, B 용액의 농도를, (T2-T1)분간으로, a%에서 b%까지 변화시킨 것을 의미한다. 단, T1, T2, a, b는 각각 실수를 나타낸다. 또, 표 1에 있어서 %는 체적%를 나타낸다.
얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 1(a)에 나타낸다. 도 1(a)에 나타내는 바와 같이, 2AB 표지 당쇄의 피크가 검출된 것이 확인되었다. 2AB 표지 당쇄의 피크 면적값을 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure 112018096462303-pct00002
[실시예 2]
순수의 양을 4μL로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 1(b)에 나타낸다.
[실시예 3]
순수의 양을 8μL로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 1(c)에 나타낸다.
[비교예 1]
순수를 첨가하지 않았던 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 1(d)에 나타낸다.
[실시예 4]
말토헵타오스의 양을 1μg으로 변경하고, 순수의 양을 4μL로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 2(a)에 나타낸다.
[실시예 5]
순수의 양을 8μL로 변경한 것 이외에는, 실시예 4와 동일하게 했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 2(b)에 나타낸다.
[비교예 2]
순수를 첨가하지 않았던 것 이외에는, 실시예 4와 동일하게 했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 2(c)에 나타낸다.
[실시예 6]
말토헵타오스의 양을 3μg으로 변경하고, 순수의 양을 4μL로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 3(a)에 나타낸다.
[실시예 7]
순수의 양을 8μL로 변경한 것 이외에는, 실시예 6과 동일하게 했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 3(b)에 나타낸다.
[비교예 3]
순수를 첨가하지 않았던 것 이외에는, 실시예 6과 동일하게 했다. 결과를 표 2에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 3(c)에 나타낸다.
[실시예 8]
말토헵타오스를, 원심 에바포레이터로 건조시킨 글루코스 올리고머(당쇄: 올리고머의 길이가 다른 복수의 올리고당의 혼합물)로 변경한 것 이외에는, 실시예 4와 동일하게 했다. 결과를 표 3에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 4(a)에 나타낸다.
[실시예 9]
순수의 양을 8μL로 변경한 것 이외에는, 실시예 8과 동일하게 했다. 결과를 표 3에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 4(b)에 나타낸다.
[비교예 4]
순수를 첨가하지 않았던 것 이외에는, 실시예 8과 동일하게 했다. 결과를 표 3에 나타낸다. 또, 얻어진 HPLC 스펙트럼을 도 4(c)에 나타낸다.
[표 3]
Figure 112018096462303-pct00003
[실험예 1]
말토헵타오스의 양을 1μg으로 변경하고, 순수의 양을 1μL로 변경한 것 이외에는, 실시예 1과 동일하게 했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
[실험예 2]
순수의 양을 50μL로 변경한 것 이외에는, 실험예 1과 동일하게 했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
[실험예 3]
순수의 양을 100μL로 변경한 것 이외에는, 실험예 1과 동일하게 했다. 결과를 표 4에 나타낸다.
또한, 실험예 1은 비교예 5, 실험예 2는 실시예 10, 실험예 3은 비교예 6에 상당한다.
[표 4]
Figure 112018096462303-pct00004
(표지 효율의 평가)
얻어진 각 실시예 및 각 실험예의 HPLC 스펙트럼으로부터 피크 면적값 S1, 및 각 비교예의 HPLC 스펙트럼으로부터 피크 면적값 S0을 산출했다. HPLC 스펙트럼 중에 복수의 피크가 존재하는 경우, 각각 피크에 있어서의 피크 면적의 합(합곗값)을 피크 면적값으로 했다.
또, 실시예 1~3은 비교예 1을 기준으로 하고, 실시예 4~5 및 실험예 1~3은 비교예 2를 기준으로 하며, 실시예 6~7은 비교예 3을 기준으로 하고, 실시예 8~9는 비교예 4를 기준으로 했을 때(당쇄량 및 수량이 실시예와 동일한 조건이며, 또한 당쇄와 표지 시약의 반응 환경에 물을 함유하지 않는 비교예를 기준으로 했을 때), 기준이 되는 비교예의 피크 면적값 S0에 대한, 각 실시예 또는 각 실험예의 피크 면적값 S1의 비를 피크 면적비(S1/S0)로 했다.
각 실시예 및 각 실험예에 있어서의 HPLC 스펙트럼 중의 피크 면적비에 대하여, 하기의 평가 기준에 비추어 평가했다. 평가 결과를 표 2, 3, 4에 나타낸다. 표 2, 3, 4 중, "-"은, 기준이 되는 비교예를 나타낸다. 기준이 되는 비교예의 피크 면적비(S0/S0)를 1로 했다.
◎: 피크 면적비가 1.5 이상임
○: 피크 면적비가 1.0 이상, 1.5 미만임
×: 피크 면적비가 1.0 미만임
(표지성의 평가)
비교예 1의 당쇄량당의 피크 면적값(비교예 1의 S0/Y)을 기준으로 했을 때, 각 실시예, 각 비교예 및 각 실험예에 대하여, 기준이 되는 비교예 1의 S0/Y에 대한, 당쇄량 Y(μg)당의 HPLC 스펙트럼 중의 피크 면적값(S0/Y 또는 S1/Y)의 비(당쇄량당의 피크 면적값비)를 산출했다.
각 실시예, 각 비교예 및 각 실험예에 있어서의 당쇄량당의 피크 면적값비에 대하여, 하기의 평가 기준에 비추어 평가했다. 평가 결과를 표 2, 4에 나타낸다. 표 2, 4 중, "-"은, 기준이 되는 비교예 1을 나타낸다. 기준이 되는 비교예 1의 당쇄량당의 피크 면적값(비교예 1의 S0/Y)을 1(기준값)로 했다.
○: 당쇄량당의 피크 면적값비가 기준값 1보다 큼
×: 당쇄량당의 피크 면적값비가 기준값 1 이하임
실시예 1~7의 표지 방법은, 기준이 되는 각 비교예에 대하여, 표지 효율이나 표지성이 향상되어 있는 것을 알 수 있었다. 실시예 8 및 9의 표지 방법은, 기준이 되는 비교예 4에 대하여 표지 효율이 향상되어 있는 것을 알 수 있었다.
또한, 실험예 1(비교예 5)의 당쇄 표지 방법에 있어서, 표지 효율 및 표지성은, 기준이 되는 비교예 2에 대하여 저하되는 결과가 얻어졌다. 실험예 2(실시예 10)의 당쇄 표지 방법에 있어서, 표지 효율 및 표지성은, 기준이 되는 비교예 2에 대하여 향상되는 결과가 얻어졌다. 실험예 3(비교예 6)의 당쇄 표지 방법에 있어서, 기준이 되는 비교예 2에 대하여, 표지 효율이 약간 향상되지만, 표지성은 저하되는 결과가 얻어졌다.
이상, 실시형태 및 실시예에 근거하여 본 발명을 구체적으로 설명했지만, 이들은 본 발명의 예시이며, 상기 이외의 다양한 구성을 채용할 수도 있다.
이 출원은, 2017년 4월 4일에 일본에서 출원된 특원 2017-074655호를 기초로 하는 우선권을 주장하며, 그 개시의 전부를 여기에 원용한다.

Claims (15)

  1. 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플에 표지 시약을 첨가함으로써, 상기 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻는 표지 공정을 갖는, 당쇄를 조제하는 방법으로서,
    상기 표지 공정에 있어서, 상기 표지 시약과 상기 당쇄의 반응 환경 중에 물을 포함하고,
    상기 표지 공정에 있어서, 상기 반응 환경 중의 물의 양을 X(μL)로, 상기 당쇄의 양을 Y(μg)로 했을 때, X/Y가 1.2 이상 50 이하이고,
    상기 표지 공정에 있어서, 상기 표지 시약과 상기 당쇄의 반응이 용기 내에서 행해지는, 당쇄를 조제하는 방법.
  2. 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플에 표지 시약을 첨가함으로써, 상기 당쇄의 표지체를 포함하는 표지 생성물을 얻는 표지 공정을 갖는, 당쇄를 조제하는 방법으로서,
    상기 표지 공정에 있어서, 상기 표지 시약과 상기 당쇄의 반응 환경 중에 물을 포함하고,
    상기 표지 공정에 있어서, 상기 당쇄의 양이 0μg 초과 1μg 미만인 경우, 상기 반응 환경 중의 물의 양은 0μL 초과 1.0μL 이하이고,
    상기 표지 공정에 있어서, 상기 표지 시약과 상기 당쇄의 반응이 용기 내에서 행해지는, 당쇄를 조제하는 방법.
  3. 삭제
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 용기가 튜브 형상을 갖는, 당쇄를 조제하는 방법.
  5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 표지 공정 전에, 상기 당쇄 함유 샘플에 포함되는 용매 중 적어도 일부를 제거하는 공정을 더 갖는, 당쇄를 조제하는 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 표지 공정에 있어서, 상기 반응 환경 중에 물을 첨가하는 공정을 실시하는, 당쇄를 조제하는 방법.
  7. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 표지 공정 전에, 고상에 고정된 상태의 시료에 당쇄 유리 효소를 작용시킴으로써, 상기 당쇄를 함유하는 당쇄 함유 샘플을 얻는 유리 공정을 더 갖는, 당쇄를 조제하는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    상기 당쇄 유리 효소가 펩타이드 N-글리카나제 또는 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다제를 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
  9. 청구항 7에 있어서,
    상기 고상이 칼럼 또는 카트리지 구조를 갖는, 당쇄를 조제하는 방법.
  10. 청구항 7에 있어서,
    상기 유리 공정 후에, 고액 분리에 의하여 상기 당쇄를 포함하는 분리액을 얻는 분리 공정을 더 갖는, 당쇄를 조제하는 방법.
  11. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 표지 시약이 자외선 흡수 특성 또는 형광 특성을 갖는 아미노기를 갖는 화합물, 환원제 및 유기 용매를 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 아미노기를 갖는 화합물이 2-아미노벤즈아마이드를 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
  13. 청구항 11에 있어서,
    상기 환원제가 사이아노 수소화 붕소 나트륨, 수소화 트라이아세톡시 붕소 나트륨, 메틸아민보레인, 다이메틸아민보레인, 트라이메틸아민보레인, 피콜린보레인, 및 피리딘보레인으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
  14. 청구항 11에 있어서,
    상기 유기 용매가 비프로톤성 극성 유기 용매, 프로톤성 극성 유기 용매 및 비프로톤성 비극성 유기 용매로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는, 당쇄를 조제하는 방법.
  15. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 당쇄가 당단백질 유래인, 당쇄를 조제하는 방법.
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