CN105518452B - 标记糖链样品的调制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明发现：通过用高浓度的有机溶剂稀释标记糖链并担载于二氧化硅类载体上，用高浓度的有机溶剂清洗该载体，用含有水的溶液洗脱吸附于该载体上的标记糖链，由此能够显著地降低标记糖链(特别是O型糖链)的损失，并且能够高效地除去标记糖链以外的物质(试剂、盐类、添加剂、未标记物等)。
Description
技术领域
本发明涉及一种调制经过标记的糖链样品的方法，特别是涉及一种高效地调制经过标记的O型糖链样品的方法。
背景技术
糖链是葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、海藻糖(Fuc)、木糖(Xyl)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、唾液酸等的单糖和这些的衍生物以链状连接而成的分子的总称。
糖链非常富有多样性，是参与生物所具有的各种功能的物质。糖链在生物体内多作为结合于蛋白质或脂质等而成的复合糖质而存在，日渐明确生物体内的糖类与细胞间信号传递、蛋白质的功能和相互作用的调节等息息相关。
作为具有糖链的生物大分子，可以列举有助于细胞的稳定化的植物细胞的细胞壁的蛋白多糖、影响细胞的分化、增殖、粘着、移动等的糖脂质、以及参与细胞间相互作用或细胞识别的糖蛋白等，逐渐明确了这些大分子的糖链相互代行、辅助、扩增、调节或者阻碍功能并且是高度精密地控制生物反应的机构。进一步，只要明确了这样的糖链与细胞的分化增殖、细胞粘着、免疫以及细胞的癌化的关系，就可以使糖链工程学与医学、细胞工程学或者脏器工程学密切关联，从而可以期待谋求新的发展。
为了早期发现疾病确保高的生活质量(QOL)，需要能够预防疾病的发病或诊断其发展的生物标记物。根据糖链生物合成中所涉及的糖基转移酶的基因阻断小鼠的分析，可知在各种组织·器官的功能维持中糖链是必须的(非专利文献1、2)。另外，还已知如果糖基化中发现有异常则会引起各种疾病(非专利文献3)。因为糖链的结构根据细胞的癌化或各种疾病而显著地变化，因此，期待其在作为用于调查疾病的发展的生物标记物上的利用。
糖链还可以列举作为对于生物医药品的了解重要的品质特性之一，对于生物医药品的等效性的担保也可以说有益。因此，也有作为生物医药品的制造过程的设计或工序内管理寻求导入糖链分析法的想法。
由于糖链自身不具有荧光性、紫外线吸收性，因此，在对糖链进行分析时多预先施加标记。在利用HPLC或HPLC-MS对糖链进行分析的情况下，通常实施2-氨基苯甲酰胺衍生化(2AB化)、2-氨基吡啶衍生化(PA化)等的荧光标记(非专利文献4)。另外，在利用MALDI-TOFMS对糖链进行分析的情况下，也通过施以标记来谋求测定灵敏度的提高(非专利文献5、6)。
在对糖链施以标记(标记化)时，为了提高标记效率而使过量的标记试剂对糖链作用的情况较多。如果在样品溶液中存在过量的标记试剂，则由于对HPLC测定或质谱带来障碍，因此，必须预先将其除去。作为试剂的除去方法，使用整体式硅胶的方法作为有用的方法被经常使用。作为现有方法所使用的方法将糖链中被称为N型糖链(天冬酰胺结合型糖链)的糖链群作为对象进行了研究，对于N型糖链的捕捉回收很充分，但对于比N型糖链分子量小的被称为O型糖链(丝氨酸·苏氨酸结合型糖链)的分子，捕捉回收的回收率低，特别难以进行O型糖链的定量分析，从而寻求能够以高的回收率回收O型糖链的方法(非专利文献7～9)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Ioffe E.,Stanley P.,Proc.Natl.Acad.Sci.,91,pp.728-732(1994)
非专利文献2：Metzler M.,Gertz A.,Sarker M.,Schachter H.,Schrader J.W.,Marth J.D.,EMBO J.,13,pp.2056-2065(1994)
非专利文献3：Powell L.D.,Paneerselvam K.,Vij R.,Diaz S.,Manzi A.,BuistN.,Freeze H.,Varki A.,J.Clin.Invest.,94,pp.1901-1909(1994)
非专利文献4：Shilova N.V.,Bovin N.V.,Russian Journal of BioorganicChemistry,29,pp.309-324(2003)
非专利文献5：Shinohara Y.,Furukawa J.-i.,Niikura K.,Miura Y.,NishimuraS.-I.,Anal.Chem.,76,pp.6989-6997(2004)
非专利文献6：Furukawa J.-i.,Shinohara Y.,Kuramoto H.,Miura Y.,ShimaokaH.,Kurogochi M.,Nakano M.,Nishimura S.-I.,Anal.Chem.,80,pp.1094-1101(2008)
非专利文献7：Klein A,Lebreton A,Lemoine J,Perini JM,Roussel P,Michalski JC.,Clin.Chem.,44,pp.2422-2428(1998)
非专利文献8：Anumula KR.,Anal.Biochem.,373,pp.104-111(2008)
非专利文献9：Prater BD,Anumula KR,Hutchins JT.,Anal.Biochem.,369,pp.202-209(2007)
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明的目的在于提供一种能够在以O型糖链为代表的分子量小的糖链群进行标记反应之后，将其有效地精制、回收的标记糖链样品的调制方法。
解决技术问题的手段
本发明者们为了达成上述目的重复进行专门研究，其结果发现：通过用高浓度的有机溶剂稀释标记糖链并担载于二氧化硅类载体上，用高浓度的有机溶剂清洗该载体，用含有水的溶液洗脱吸附于该载体上的标记糖链，由此能够显著地降低标记糖链(特别是经过标记的O型糖链)的损失，并且能够高效地除去标记糖链以外的物质(试剂、盐类、添加剂、未标记物等)，至此完成本发明。
更详细地说，本发明提供以下发明。
[1]一种方法，其中，所述方法为调制标记糖链样品的方法，
包括：
(工序1)通过使含有标记糖链的样品溶液接触二氧化硅类载体，从而使糖链成分吸附于二氧化硅类载体上的工序；
(工序2)用清洗液清洗二氧化硅类载体的工序；
(工序3)使洗脱液接触二氧化硅类载体，使吸附的糖链成分洗脱的工序，
其中，工序1中的样品溶液为含有超过95体积％的有机溶剂的溶液。
[2]如[1]所述的方法，其中，所述工序1的样品溶液中所含的有机溶剂为乙腈。
[3]如[1]或[2]所述的方法，其中，工序2的清洗液为含有超过95体积％的有机溶剂和小于5体积％的水的溶液。
[4]如[3]所述的方法，其中，所述工序2的清洗液中所含的有机溶剂为乙腈。
[5]如[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，工序3的洗脱液为含有1体积％以上的水的溶液。
[6]如[5]所述的方法，其中，工序3的洗脱液为含有50体积％以上的水的溶液。
[7]如[5]所述的方法，其中，工序3的洗脱液为水。
[8]如[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，所述二氧化硅类载体为整体式硅胶(monolithic silica)。
[9]如[1]～[8]中任一项所述的方法，其中，标记糖链是在糖链的还原末端上结合有含有氨基、酰肼基或氨基氧基的化合物而成的物质。
[10]如[9]所述的方法，其中，标记糖链是在糖链的还原末端上结合有选自下述中的至少1种的含有氨基的化合物而成的物质，
2-氨基吡啶、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基邻氨基苯甲酸、7-氨基-1-萘酚、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶、9-氨基芘-1,4,6-三磺酸、8-萘胺-1,3,6-三磺酸、7-氨基-1,3-萘二磺酸、2-氨基-9(10H)-吖碇酮、5-氨基荧光素、丹酰基乙二胺、7-氨基-4-甲基香豆素、苄胺。
[11]如[9]所述的方法，其中，标记糖链是在糖链的还原末端上结合有选自下述中的至少1种的含有酰肼基的化合物而成的物质，
2-氨基苯酰肼、2-肼基苯甲酸、苄基肼、5-二甲基氨基萘-1-磺酰肼(丹酰肼)、2-肼基吡啶、9-芴基甲基肼基甲酸酯(Fmoc-肼)、4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-苯并二茚-3-丙酸酰肼、2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素)乙酰肼、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸酰肼(DCCH)、苯肼、1-萘乙酰肼、苯乙酰肼。
[12]如[9]所述的方法，其中，标记糖链是在糖链的还原末端上结合有选自下述中的至少1种的含有氨基氧基的化合物而成的物质，
N-氨基氧基乙酰基(色氨酰)精氨酸甲酯、O-苄基羟胺、O-苯基羟胺、O-(2,3,4,5,6-五氟苄基)羟胺、O-(4-硝基苄基)羟胺、2-氨基氧基吡啶、2-氨基氧基甲基吡啶、4-[(氨基氧基乙酰基)氨基]苯甲酸甲酯、4-[(氨基氧基乙酰基)氨基]苯甲酸乙酯、4-[(氨基氧基乙酰基)氨基]苯甲酸正丁酯、氨基氧基生物素。
[13]一种标记糖链样品，其中，通过[1]～[12]中任一项所述的方法而制得。
[14]一种糖链的分析方法，其中，利用HPLC、质谱、LC-MS或者毛细管电泳法的分析方法来对通过[1]～[13]中任一项所述的方法制得的标记糖链样品进行分析。
发明的效果
根据本发明的方法，能够飞跃性地提高标记后的O型糖链的回收率，并且能够高效地除去标记的糖链以外的成分。因此，本发明对O型糖链的分析有用。
附图说明
[图1]用乙腈/水(95:5，v/v)将吸附于整体式硅胶上的2AB标记葡萄糖低聚物清洗之后，用纯水洗脱。图1是表示由此得到的2AB标记葡萄糖低聚物的HPLC的峰型的图。
[图2]用100％乙腈将吸附于整体式硅胶上的2AB标记葡萄糖低聚物清洗之后，用纯水洗脱。图2是表示由此得到的2AB标记葡萄糖低聚物的HPLC的峰型的图。
[图3]将2AB标记葡萄糖低聚物溶解于含有各浓度(1％、5％或10％)的DMSO的乙腈溶液、或者含有各浓度(1％、5％或10％)的乙酸的乙腈溶液中，调制6种糖链溶液。将这些糖链溶液注入整体式硅胶中，使该葡萄糖低聚物吸附于整体式硅胶上，用100％乙腈清洗之后，用纯水洗脱。图3是表示由此得到的2AB标记葡萄糖低聚物的HPLC的峰型的图。
具体实施方式
(糖链样品)
本发明中使用的糖链样品可以使用由例如全血、血清、血浆、尿、唾液、细胞、组织、病毒、植物组织等的生物体样品调制的糖链样品。另外，可以使用由经过精制的糖蛋白或未精制的糖蛋白中调制的样品。作为糖链样品，也可以使用另外精制后的纯净的糖链。
作为从生物体样品中所含的糖蛋白中使糖链游离的方法，可以使用例如通过使用了N-糖苷酶或O-糖苷酶的糖苷酶处理、肼分解、碱处理的β脱离等的方法。在进行N型糖链的分析的情况下，优选为使用N-糖苷酶的方法。在糖苷酶处理之前，也可以进行使用了胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶等的蛋白酶处理。在进行O型糖链的分析的情况下，优选为使用肼分解的方法。在肼分解之前，也可以使用胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶等进行蛋白酶处理。
(糖链精制)
在标记糖链之前，优选除去糖链以外的夹杂物(例如，蛋白质、肽、核酸、脂质等)。作为夹杂物的除去方法，例如可以使用凝胶过滤精制、超滤、透析、利用了极性的固相提取、通过离子交换树脂的精制、利用了溶解性的差异的沉淀等。还可以使用通过与糖链选择性地结合的固相载体(例如，Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制造的BIotGlyco BS-45601S，参照非专利文献6)的精制。也可以不除去夹杂物而标记糖链。
(糖链的标记)
可以根据需要使糖链样品干燥之后，加入标记试剂使之反应来标记糖链。标记反应优选为例如使用还原性氨基化反应来用任意的氨基化合物进行标记的反应。作为标记试剂，优选为包含与糖链的还原末端具有反应性的氨基、酰肼基、氨基氧基等的官能团的物质。
作为具有氨基的物质，优选从以下所列举的化合物群中选择，但是不限定于此。
2-氨基吡啶、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基邻氨基苯甲酸、7-氨基-1-萘酚、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶、9-氨基芘-1,4,6-三磺酸、8-萘胺-1,3,6-三磺酸、7-氨基-1,3-萘二磺酸、2-氨基-9(10H)-吖碇酮、5-氨基荧光素、丹酰基乙二胺、7-氨基-4-甲基香豆素、苄胺。
这些化合物中，2-氨基苯甲酰胺(2AB)多用作通过HPLC分析糖链时的标记，从而特别优选。
作为具有酰肼基的物质，优选从以下所列举的化合物群中选择，但是不限定于此。
2-氨基苯酰肼、2-肼基苯甲酸、苄基肼、5-二甲基氨基萘-1-磺酰肼(丹酰肼)、2-肼基吡啶、9-芴基甲基肼基甲酸酯(Fmoc-肼)、4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-苯并二茚-3-丙酸酰肼(4,4-difluoro-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene-3-propionoc acid,hydrazide)、2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素)乙酰肼、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸酰肼(DCCH)、苯肼、1-萘乙酰肼、苯乙酰肼。
作为具有氨基氧基的物质，优选从以下所列举的化合物群中选择，但是不限定于此。
N-氨基氧基乙酰基(色氨酰)精氨酸甲酯、O-苄基羟胺、O-苯基羟胺、O-(2,3,4,5,6-五氟苄基)羟胺、O-(4-硝基苄基)羟胺、2-氨基氧基吡啶、2-氨基氧基甲基吡啶、4-[(氨基氧基乙酰基)氨基]苯甲酸甲酯、4-[(氨基氧基乙酰基)氨基]苯甲酸乙酯、4-[(氨基氧基乙酰基)氨基]苯甲酸正丁酯、氨基氧基生物素。
在本发明中，标记反应的条件没有限定，例如，优选相对于糖链添加10等量以上的标记试剂，在还原剂的存在下进行加热反应。反应体系中的pH优选为酸性至中性的条件，进一步优选为2～9，更加优选为2～8，最优选为2～7。反应温度优选为4～90℃，进一步优选为25～90℃，更加优选为40～90℃。反应时间优选为10分钟～24小时，进一步优选为10分钟～8小时，更加优选为10分钟～3小时。在用含有酰肼基的化合物或含有氨基氧基的化合物进行标记的情况下，可以不一定添加还原剂。
特别是，在氨基化合物为2-氨基苯甲酰胺的情况下，pH为酸性至中性的条件，优选为2～9，进一步优选为2～8，更加优选为2～7。反应温度为4～90℃，优选为30～90℃，更加优选为40～80℃。氨基化合物的浓度为1mM～10M，优选为10mM～10M，更加优选为100mM～1M。还原剂的浓度为1mM～10M，优选为10mM～10M，更加优选为100mM～2M。反应时间为10分钟～24小时，优选为10分钟～8小时，更加优选为1小时～3小时。
另外，作为还原剂，能够使用例如氰基硼氢化钠、甲基胺硼烷、二甲胺硼烷、三甲胺硼烷、甲基吡啶硼烷、吡啶硼烷等，从反应性的方面考虑，优选使用氰基硼氢化钠。
(标记糖链的精制)
由于通过上述的方法调制的含有标记糖链的样品溶液(标记糖链溶液)中包含试剂、盐类、添加剂、未标记物，因此，难以直接提供给分析。因此，在分析前需要预先除去这些物质。作为除去方法，优选使用包括：通过使含有标记糖链的样品溶液与具有硅烷醇基的二氧化硅类载体接触，从而使糖链成分吸附于二氧化硅类载体上的工序(工序1)；用清洗液清洗二氧化硅类载体的工序(工序2)；使洗脱液接触二氧化硅类载体，使吸附后的糖链成分洗脱的工序(工序3)的方法。通过二氧化硅类载体具有硅烷醇基，从而可以有效地进行标记糖链的捕捉，其结果，能够调制除去了标记糖链以外的物质(糖链以外的夹杂物、试剂、盐类、添加剂、未标记物等)的标记糖链试剂。
作为本发明所涉及的二氧化硅类载体，只要是含有二氧化硅的载体即可，可以仅由二氧化硅构成，也可以是二氧化硅-有机物混合物型。另外，其形状也没有特别地限制，可以是颗粒状、板状、纤维状、多孔状等的任一种。在本发明中，其中，特别优选使用整体式硅胶(Monolithic silica)。整体式硅胶是形成具有三维网状结构的过滤器状的多孔质连续体的二氧化硅，与现有的颗粒状二氧化硅相比较，具有通液性更良好、不需要玻璃料(珠子拦截用的部件)、死体积少等的优点(日本特开平6-265534号公报)。整体式硅胶优选固定于柱状的容器或多孔板上。
对于整体式硅胶的孔径，如果过小，则通液性降低；如果过大，则理论塔板数降低，由此糖链的回收量降低。因此，整体式硅胶的孔径，例如相互连续的微孔(通孔)直径优选为1～100μm，进一步优选为1～50μm，更加优选为1～30μm，最优选为1～20μm。对于整体式硅胶的性状，优选为正相模式或HILIC(Hydrophilic interaction chromatography(亲水作用色谱))模式。
作为整体式硅胶的使用形态，优选在固定有整体式硅胶的柱或多孔板中注入含有标记糖链的样品溶液，通过自然滴落、抽吸、加压、离心等的方法使样品溶液通过整体式硅胶部之后，用清洗液清洗，添加洗脱液使糖链成分洗脱。
适用于二氧化硅类载体(优选为整体式硅胶)的样品溶液优选为含有超过95体积％的有机溶剂的溶液，进一步优选为含有96体积％以上的有机溶剂的溶液，更加优选为含有98体积％以上的有机溶剂的溶液，特别优选为含有99体积％以上的有机溶剂的溶液。作为上述有机溶剂，可以使用乙腈、己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃等，最优选为乙腈。
优选在施用了糖链样品之后，用清洗液清洗二氧化硅类载体(优选为整体式硅胶)。清洗液优选为含有超过95体积％的有机溶剂和小于5体积％的水的溶液，进一步优选为含有96体积％以上的有机溶剂和4体积％以下的水的溶液，更加优选为含有98体积％以上的有机溶剂和2体积％以下的水的溶液，特别优选为含有99体积％以上的有机溶剂和1体积％以下的水的溶液，最优选为100％的有机溶剂。作为上述有机溶剂，可以使用乙腈、己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃等，最优选为乙腈。
优选清洗操作之后，在二氧化硅类载体(优选为整体式硅胶)中添加洗脱液，将吸附的标记糖链洗脱。洗脱液优选含有10体积％以上的水，进一步优选含有50体积％以上的水，最优选为水。水以外的成分例如优选为选自乙腈、以及以甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇为代表的醇中的有机溶剂。回收的糖链溶液(标记糖链样品)根据需要可以浓缩、干燥或稀释提供给各种测定。
(使用了MALDI-TOF MS的糖链分析)
得到的标记糖链可以利用以MALDI-TOF MS为代表的质谱法进行分析。
(使用了HPLC和LC-MS的糖链分析)
得到的标记糖链可以使用HPLC或LC-MS进行分析。特别是在糖链被2AB化的情况下，特别优选通过HPLC或LC-MS的分析。
(其它的糖链分析)
得到的标记糖链可以提供给毛细管电泳等各种分析。
实施例
在以下的实施例中具体地说明本发明，但是本发明不限定于这些实施例。
A.标记后的糖链样品的调制
在5mg含有酰肼基的聚合物珠(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制造，BS-45601S)中添加结合有1个以上的葡萄糖的混合物即葡萄糖低聚物，加入了含有2％乙酸的乙腈180μL之后，在80℃使之反应1小时，并使之干固。用2M盐酸胍溶液、水、甲醇、1％三乙基胺溶液清洗聚合物珠之后，添加10％乙酸酐/甲醇溶液，在室温下使之反应30分钟，将酰肼基封端。封端之后，用甲醇和水清洗聚合物珠。在珠子中加入纯水20μL和含有2％乙酸的乙腈180μL，在80℃下使之加热·干固1小时，由此使糖链从珠子中游离。将游离后的糖链溶解于50μL的2-氨基苯甲酰胺(2AB)溶液(以成为350mM的2-氨基苯甲酰胺、1M的氰基硼氢化钠的方式溶解于30％(v/v)乙酸/DMSO混合溶剂中而成的溶液)，在上述的珠子中添加50μL该溶液，在80℃下使之反应2小时，由此将糖链进行2AB标记。回收上清液，得到2AB标记糖链(2AB标记葡萄糖低聚物)溶液(含有未反应的2AB)。
B.标记化糖链的精制
为了降低含有标记糖链的溶液中的标记糖链以外的物质即试剂、盐类、添加剂、未标记物，通过以下的方法进行固相提取。
(实施例1)
使用整体式硅胶从2AB标记糖链溶液中除去试剂、盐类、添加剂、未标记物。作为整体式硅胶，使用了GL Sciences,Inc.制造的“MonoFas离心柱”。该柱是将通孔直径为15μm的圆盘状整体式硅胶过滤器固定于容量约1mL的管子的底部而成的，成为将样品溶液注入管内，进行离心，由此使样品溶液通过整体式硅胶的微孔内的结构。
用乙腈(ACN)稀释2AB标记糖链溶液(溶液中的乙腈浓度：99体积％)，注入到整体式硅胶离心柱中，利用台式离心机进行离心，使之通过，使标记糖链吸附。比较柱的清洗条件。将用乙腈/水(95:5，v/v)清洗柱子之后加入50μL纯水使吸附成分洗脱并回收再进行HPLC的情况(第1条件，图1)与用100％的乙腈清洗柱子之后加入50μL纯水使吸附成分洗脱并回收再进行HPLC的情况(第2条件，图2)比较。
作为相当于N型糖链的糖残基数的模型，着眼于结合有7个葡萄糖的Glc7；作为相当于O型糖链的糖残基数的模型，着眼于结合有1个葡萄糖的Glc1。由于第1条件在N型糖链的回收方面没有问题，因此，将各条件下的Glc1的峰面积相对于Glc7的峰面积的比与将精制后的葡萄糖低聚物直接提供给HPLC的情况下的Glc1的峰面积相对于Glc7的峰面积的比(＝7.0)比较，求得O型糖链的回收率。以第1条件进行的情况下(图1)的Glc1的峰面积相对于Glc7的峰面积的比为4.76，以第2条件进行的情况下(图2)的Glc1的峰面积相对于Glc7的峰面积的比为6.49，O型糖链的回收率用第1清洗方法中回收率比较低，为约70％，第2条件时高达约90％以上，可知，通过第2清洗条件O型糖链的回收率会飞跃性地提高。将HPLC的条件示于表1中。
[表1]
(实施例2)
现有方法中，2AB标记糖链溶液中含有约5％的DMSO和乙酸。调查O型糖链的回收中这些成分的影响。调制将2AB标记葡萄糖低聚物分别溶解于1％DMSO/99％乙腈(体积％，以下相同)、5％DMSO/95％乙腈、10％DMSO/90％乙腈、1％乙酸/99％乙腈、5％乙酸/95％乙腈、10％乙酸/90％乙腈而成的6种溶液，注入到整体式硅胶中之后，用100％乙腈清洗。在6根整体式硅胶柱中加入50μL纯水，使吸附成分洗脱，并进行回收，比较分别进行了HPLC的情况(图3)。
用与在实施例1已经示出的方法相同的方法，将各条件下的Glc1的峰面积相对于Glc7的峰面积的比与将精制后的葡萄糖低聚物直接提供给HPLC的情况下的Glc1的峰面积相对于Glc7的峰面积的比(＝4.03)比较，求得O型糖链的回收率。结果溶解于1％DMSO/99％乙腈、5％DMSO/95％乙腈、10％DMSO/90％乙腈、1％乙酸/99％乙腈、5％乙酸/95％乙腈、10％乙酸/90％乙腈的各条件下的Glc1的峰面积相对于Glc7的峰面积的比分别为3.91、2.58、1.48、3.57、2.16、1.47，O型糖链的回收率分别为97％、64％、37％、89％、54％、36％。现有的条件附近时只能期望50～65％左右的回收率，但是如果溶解于含有1％以下的DMSO的溶液(即，含有99％以上的乙腈的溶液)或含有1％以下的乙酸的溶液(即，含有99％以上的乙腈的溶液)中，则令人惊讶地发现，O型糖链的回收率为约90％以上，O型糖链的回收率飞跃性地提高了。
产业上利用的可能性
根据本发明，对以O型糖链为代表的分子量小的糖链群进行标记反应之后，能够降低标记糖链的损失，并且能够高效地除去标记糖链以外的物质即试剂、盐类、添加剂、未标记物，不仅能够对N型糖链进行定量分析，还能够对O型糖链进行定量分析。由于启示了在O型糖链上存在许多肿瘤标记物的表位(epitope)，因此，本发明例如在癌症等疾病的诊断或以唾液糖链为靶的新的生物标记物的开发中有用。因此，本发明在例如医疗领域中能够有较大贡献。
Claims (12)
1.一种调制标记糖链样品的方法，其中，
包括：
工序1：通过使含有标记糖链的样品溶液接触二氧化硅类载体，从而使糖链成分吸附于二氧化硅类载体上的工序；
工序2：用清洗液清洗二氧化硅类载体的工序；
工序3：使洗脱液接触二氧化硅类载体，使吸附的糖链成分洗脱的工序，
工序1中的样品溶液为含有99体积％以上的乙腈的溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其中，
工序2中的清洗液为含有超过95体积％的乙腈和小于5体积％的水的溶液。
3.如权利要求2所述的方法，其中，
工序2中的清洗液为100体积％的乙腈。
4.如权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，
工序3中的洗脱液为含有1体积％以上的水的溶液。
5.如权利要求4所述的方法，其中，
工序3中的洗脱液为含有50体积％以上的水的溶液。
6.如权利要求4所述的方法，其中，
工序3中的洗脱液为水。
7.如权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
所述二氧化硅类载体为整体式硅胶。
8.如权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
标记糖链是在糖链的还原末端结合有含有氨基、酰肼基或氨基氧基的化合物而成的物质。
9.如权利要求8所述的方法，其中，
标记糖链是在糖链的还原末端上结合有选自下述中的至少1种的含有氨基的化合物而成的物质，
2-氨基吡啶、2-氨基苯甲酰胺、2-氨基邻氨基苯甲酸、7-氨基-1-萘酚、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶、9-氨基芘-1,4,6-三磺酸、8-萘胺-1,3,6-三磺酸、7-氨基-1,3-萘二磺酸、2-氨基-9(10H)-吖碇酮、5-氨基荧光素、丹酰基乙二胺、7-氨基-4-甲基香豆素、苄胺。
10.如权利要求8所述的方法，其中，
标记糖链是在糖链的还原末端上结合有选自下述中的至少1种的含有酰肼基的化合物而成的物质，
2-氨基苯酰肼、2-肼基苯甲酸、苄基肼、5-二甲基氨基萘-1-磺酰肼(丹酰肼)、2-肼基吡啶、9-芴基甲基肼基甲酸酯(Fmoc-肼)、4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-苯并二茚-3-丙酸酰肼、2-(6,8-二氟-7-羟基-4-甲基香豆素)乙酰肼、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸酰肼(DCCH)、苯肼、1-萘乙酰肼、苯乙酰肼。
11.如权利要求8所述的方法，其中，
标记糖链是在糖链的还原末端上结合有选自下述中的至少1种的含有氨基氧基的化合物而成的物质，
N-氨基氧基乙酰基(色氨酰)精氨酸甲酯、O-苄基羟胺、O-苯基羟胺、O-(2,3,4,5,6-五氟苄基)羟胺、O-(4-硝基苄基)羟胺、2-氨基氧基吡啶、2-氨基氧基甲基吡啶、4-[(氨基氧基乙酰基)氨基]苯甲酸甲酯、4-[(氨基氧基乙酰基)氨基]苯甲酸乙酯、4-[(氨基氧基乙酰基)氨基]苯甲酸正丁酯、氨基氧基生物素。
12.一种糖链的分析方法，其中，
包括：
工序a：实施权利要求1～11中任一项所述的方法的工序；以及
工序b：利用HPLC、质谱、LC-MS或者毛细管电泳法的分析方法来对通过工序a调制的标记糖链样品进行分析的工序。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |