一种苯硼酸材料富集糖肽的方法
技术领域
本发明属于分离与纯化技术领域,具体涉及一种糖肽富集方法。
技术背景
蛋白质的糖基化修饰参与真核细胞许多重要的调节过程,包括受体激活、信号转导以及细胞吞噬等[Ohtsubo and Marth,Cell,2006]。许多疾病的发生与蛋白质糖基化的变异有关,比如恶性肿瘤[Wang,et al.,Glycobiology2006]、风湿性关节炎[Fournier,etal.Biochimica Et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology,2000)慢性阻碍性肺部疾病[Nihlen,et al.,Scandinavian Journal of Clinical &Laboratory Investigation,2001]、以及阿尔茨海默病等[van Rensburg,et al.,Metabolic Brain Disease,2004]。由此,对糖蛋白的结构进行表征非常重要。但是,在糖蛋白中糖基化位点表达的化学计量位点相对比较低;另外酶解液中糖肽数量比较少,导致在质谱检测时糖肽信号强度比较低;因此,在对酶解液进行质谱分析前,需要对糖肽进行富集[Temporini,et al.,Mass Spectrometry Reviews,2008]。
目前,发展了许多富集糖肽的策略包括凝集素亲和色谱法、肼化学法、硼酸亲和色谱法及亲水作用色谱法等。凝集素亲和作用色谱被广泛应用在分离和富集糖蛋白和糖肽中[Dalziel,et al.1999]。但存在糖基化覆盖率低的问题[Kubota,et al.Anal.Chem.2008];肼化学对糖肽的选择性高,但是该方法存在丢失糖链的信息的问题[Zhang,H.;etal.Nat.Biotechnol.2003.];亲水作用色谱对不同的糖链结构有保留,在糖肽富集的行列中表现出很好的效果,糖基化覆盖率高。但是该方法容易受到极性非糖肽的干扰[Wada,Y.;et al.Anal.Chem.2004.]。硼酸亲和色谱法能与顺势二醇形成硼酸酯结构也可以用来富集糖肽[Zhou,W.;et al.Chem.Commun.2008]。该方法通常在碱性缓冲盐体系下进行富集。但非糖肽与硼酸材料之间存在的氢键作用降低了该方法的选择性。降低或消除硼酸材料与非糖肽之间的氢键作用,同时增强糖肽与硼酸材料之间的作用对提高硼酸材料对糖肽的选择性是非常必要的。
发明内容
本发明涉及一种苯硼酸材料富集糖肽的方法。
本方法使用具有苯硼酸修饰的硅球作为富集材料,通过优化有机溶剂的种类和浓度、缓冲盐类型和浓度,富集温度等参数,实现了对糖肽的选择性富集。本方法涉及的色谱模式为亲水作用色谱和亲和作用色谱原理。
本发明的目的在于提供一种具有高选择性、糖基化覆盖率广和操作简单的糖肽富集方法,能对痕量糖肽进行选择性富集。
一种苯硼酸材料富集糖肽富集方法,其特征在于:以苯硼酸修饰的硅球为富集材料,进行固相萃取(SPE),于肽样品中富集分离出糖肽。
富集材料的粒径是2-50m,孔径为
硅球上修饰的苯硼酸层数是单层或多层;所述单层为一分子苯硼酸通过连接基团结合到硅球上的一分子硅羟基上;所述多层为多分子苯硼酸通过聚合首尾相连结合到硅球上的一分子硅羟基上。
所述富集分离的色谱模式为亲水作用色谱和亲和作用色谱原理;以苯硼酸修饰的硅球作为富集材料,使用固相萃取(SPE)技术,
首先使富集材料与肽样品接触,然后冲洗富集材料去除其上的非糖肽,最后将富集材料上的糖肽洗脱下来;
冲洗非糖肽的流动相组成包括水、有机溶剂和缓冲盐混合液,或水和有机溶剂混合液;
洗脱糖肽的洗脱溶剂组成包括水或水和有机溶剂混合液。
具体操作采用柱固相萃取模式或分散固相萃取模式;
在柱固相萃取(SPE)模式下采用富集材料富集糖肽时,将肽样品上到填装有富集材料的SPE柱上,采用冲洗非糖肽的流动相冲洗富集材料去除其上的非糖肽,再采用洗脱溶剂冲洗,富集出糖肽;
或在分散固相萃取模式下采用富集材料顺序富集磷酸肽时,将肽样品直接与富集材料混合,离心,采用冲洗非糖肽的流动相去除富集材料上的非糖肽;离心,采用洗脱溶剂冲洗富集材料上的,富集出糖肽。
分散固相萃取模式下,肽样品与富集材料接触后需要孵化,孵化时间0.5-120分钟;
冲洗非糖肽的流动相组成如下a-f任一之一所示:
a.A相为水,B相为乙腈,体积比A/B:10/90-40/60。
b.A相为水,B相为甲醇,体积比A/B:10/90-40/60。
c.A相为碳酸氢铵水溶液,B相为乙腈,体积比A/B:5/95-40/60。
d.A相为碳酸氢铵水溶液,B相为甲醇,体积比A/B:5/95-40/60。
e.A相为磷酸氢二钾水溶液,B相为乙腈,体积比A/B:5/95-40/60。
f.A相为磷酸氢二钾水溶液,B相为甲醇,体积比A/B:5/95-40/60。
其中碳酸氢铵水溶液,浓度5-200mM,pH 7.9;
磷酸氢二钾水溶液,浓度5-200mM,pH 7。
洗脱糖肽的洗脱溶剂组成如下任一之一所示:
a.A相为水,B相为乙腈,体积比A/B:50/50-99/1。
b.A相为水,B相为甲醇,体积比A/B:50/50-99/1。
c.A相为甲酸水溶液,B相为乙腈,体积比A/B:50/50-99/1。
d.A相为甲酸水溶液,B相为甲醇,体积比A/B:50/50-99/1。
e.A相为乙酸水溶液,B相为乙腈,体积比A/B:50/50-99/1。
f.A相为水溶液,B相为甲醇,体积比A/B:50/50-99/1。
其中甲酸水溶液,含量0.1-10%,pH 1-4;
其中乙酸水溶液,含量0.1-10%,pH 1-4;
肽样品的样品浓度为0.1ng/mL-1mg/mL;
富集温度为15-60℃。
所述肽样品为蛋白酶解液;
所述蛋白为组织、细胞、血清、尿液等生物样品中的蛋白或者是糖蛋白标准品(转铁蛋白、胎球蛋白、辣根过氧化酶、核糖核酸酶B等)中的一种或二种以上混合;
所述酶为胰蛋白酶、内肽酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶中的一种或二种以上混合。
具体的制备步骤如下:
具体操作时采用萃取模式模式,过程如下:
1]将苯硼酸修饰硅胶装入萃取柱中,采用冲洗液平衡柱子,将肽样品旋干,溶解于1-200L含有90-10%乙腈/5-200mM碳酸氢铵缓冲盐到萃取柱上;
2]采用2-50倍苯硼酸修饰硅胶材料柱体积的的90-10%乙腈/5-200碳酸氢铵缓冲盐淋洗溶液冲洗,去除非糖肽;重复此步骤1-10次;
3]采用2-50倍9的0-50%乙腈[pH2-6)洗脱溶液洗脱糖肽。重复此步骤1-10次。
具体操作时采用分散固相萃取模式,过程如下;
1]将糖肽样品旋干,溶解于1-200L含有90-10%乙腈/5-200mM碳酸氢铵缓冲盐后,直接与苯硼酸修饰硅胶材料混合,孵化0.5-120分钟,离心,弃上层溶液,收集沉淀;
2]离心后的苯硼酸修饰硅胶材料与2~50倍材料柱体积的含有90-10%乙腈/5-200mM碳酸氢铵缓冲盐混合孵化,孵化0.5-120分钟,离心,弃上层溶液,收集沉淀;重复此步骤1-10次;
3]离心后的苯硼酸修饰硅胶材料与2~50倍材料柱体积的0-50%乙腈[pH2-6)洗脱溶液洗脱混合,孵化0.5-120分钟,离心,收集上清液,得到糖肽。重复此步骤1-10次。
该方法具有选择性高、吸附量大、操作简便可控等特点,适用于生物样品中糖肽的选择性富集。
本发明具有如下优点:
1.本发明的优点在于苯硼酸修饰硅胶材料富集糖肽时表现出了高选择性、高糖基化覆盖率、通用性广等特点,可以实现糖肽的有效富集;
2.本发明涉及的苯硼酸修饰硅胶材料既可以方便的装填成不同长度,不同内径的柱子,又可以直接添加与离心管,操作简单,易于重复。特别适合微量生物样品中糖肽段的富集;
3.本发明富集得到的糖肽可直接用于电喷雾-质谱分析(ESI-MS)或者基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALD-TOF MS),提高了质谱的检测限和灵敏度。
本发明具有如下优点:
1.高选择性。针对当前糖肽富集遇到的问题,本发明提出使用亲水作用色谱和亲和色谱联用方法富集糖肽。此方法对糖肽的富集选择性高,有效解决了非糖肽因氢键作用与糖肽共流出的问题。
2.通量高。通过固相萃取模式和分散固相萃取模式,可以在同一材料上实现不同操作模式下糖肽的高通量选择性富集,。
3.高重复性。实验操作简单可控,易实现自动化,过程稳定,重复性好。
附图说明
图1多层苯硼酸修饰硅球对标准糖蛋白辣根过氧化酶酶解产物中糖肽富集前后的电喷雾质谱图。(a)经多层苯硼酸修饰硅球富集后的质谱图;(b)未经富集的质谱图。糖肽标示为星号。
图2单层苯硼酸修饰硅球对标准糖蛋白辣根过氧化酶酶解产物中糖肽富集前后的电喷雾质谱图。(a)经单层苯硼酸修饰硅球富集后的质谱图;(b)未经富集的质谱图。糖肽标示为星号。
具体实施方式
现结合实例,对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明,而非对本发明的限定。
单层苯硼酸修饰硅球的制备过程为L型天冬氨酸(4g,30mmol),K2CO3(18g,130mmol),CuSO4·5H2O(0.075g,0.3mmol),2-唑-1-磺酰基叠氮化物(8.5g,40.6mmol)、CH3OH(100mL)和粒径为5μm的球形硅胶(20g)加入到250mL圆底烧瓶中,此混合物在室温下搅拌9h后,离心浓缩干燥,得到α-叠氮L-天冬氨酸。然后,α-叠氮L-天冬氨酸中加入乙酸铜(0.4g,2mmol)和抗坏血酸钠(0.8g,4mmol)水溶液(100mL),室温下搅拌114h。所得产物依次用甲醇,水,质量浓度10%的EDTA水溶液,水,甲醇各洗涤两次,每次100ml,室温下真空干燥12小时即得单层苯硼酸修饰硅球。
多层苯硼酸修饰硅球的制备过程如下:粒径为5μm的球形硅胶(1g)被分散到含有三甲氧基巯丙基硅烷(重量比5%)的无水甲醇中室温下反应24h。所得产物经依次用甲醇和二氧六环洗涤两次后,加入含有偶氮二异丁腈(10mg)的苯硼酸PBA(0.2g)二氧六环溶液(100mL),80℃下反应1h。所得产物经丙酮洗涤两次后,60℃烘干5天。
单层苯硼酸修饰硅球是指一分子苯硼酸通过连接基团结合到硅球上的一分子硅羟基上;
多层苯硼酸修饰硅球为多分子苯硼酸通过聚合首尾相连结合到硅球上的一分子硅羟基上。
实施例1
将1mg苯硼酸修饰硅球装入萃取柱中,采用30L含有体积浓度80%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液平衡柱子;将10L 100g/mL的标准糖蛋白辣根过氧化酶的胰蛋白酶的酶解液旋干,溶解于30L含有体积浓度80%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液后,上样到萃取柱上;
用30L含有体积浓度80%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液冲洗,去处非糖肽;重复冲洗过程2次;
然后,采用20L体积浓度50%乙腈(pH3)水溶液洗脱糖肽,重复此洗脱过程2次;合并富集后的糖肽馏分用质谱进行分析。
由图1可见,多层苯硼酸修饰硅球对标准糖蛋白辣根过氧化酶酶解产物中糖肽富集后的特异性。
实施例2
将1mg苯硼酸修饰硅球用100L含有体积浓度80%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液分散,离心后,弃上层溶液,收集沉淀;将10L 100g/mL的标准糖蛋白辣根过氧化酶的胰蛋白酶的酶解液旋干后,用100L含有体积浓度80%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液溶解,与苯硼酸修饰硅胶材料混合,孵化0.5-120分钟(具体可30分钟),离心,弃上层溶液,收集沉淀;离心后的苯硼酸修饰硅胶材料与100L含有体积浓度80%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液混合孵化,孵化0.5-120分钟,离心,弃上层溶液,收集沉淀;重复此步骤2次;
离心后的苯硼酸修饰硅球与100L体积浓度50%乙腈(pH3)水溶液洗脱混合,孵化0.5-120分钟(具体可30分钟),离心,收集上清液,得到糖肽;重复此步骤1次。合并富集后的糖肽馏分用质谱进行分析。
由图2可见,单层苯硼酸修饰硅球对标准糖蛋白辣根过氧化酶酶解产物中糖肽富集后的特异性。
实施例3
将1mg苯硼酸修饰硅球装入萃取柱中,采用30L含有体积浓度80%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液平衡柱子,将10L 100g/mL的标准糖蛋白辣根过氧化酶的胰蛋白酶的酶解液旋干,溶解于30L含有体积浓度75%甲醇的50mM碳酸氢铵溶液后,上样到萃取柱上;用30L含有体积浓度75%甲醇的50mM碳酸氢铵溶液冲洗,去处非糖肽;重复2次;
采用20L体积浓度50%乙腈(pH3)洗脱溶液洗脱糖肽。重复此步骤2次,合并富集后的糖肽用质谱进行分析。
实施例4
将1mg苯硼酸修饰硅球用100L含有体积浓度75%甲醇的50mM碳酸氢铵溶液平衡柱子冲洗,离心后,弃上层溶液,收集沉淀;将10L 100g/mL的标准糖蛋白辣根过氧化酶的胰蛋白酶的酶解液旋干后,用100L含有体积浓度75%甲醇的50mM碳酸氢铵溶液溶解,与苯硼酸修饰硅胶材料混合,孵化60分钟,离心,弃上层溶液,收集沉淀;
离心后的苯硼酸修饰硅胶材料与100L含有体积浓度75%甲醇的50mM碳酸氢铵溶液混合孵化,孵化120分钟,离心,弃上层溶液,收集沉淀;重复此步骤2次;
离心后的苯硼酸修饰硅胶材料与100L 50%甲醇(pH3)洗脱溶液洗脱混合,孵化90分钟,离心,收集上清液,得到糖肽。重复此步骤1次。
实施例5-8
分别调整冲洗液为含有体积浓度85%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液、含有体积浓度70%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液、含有体积浓度65%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液和含有体积浓度50%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液,其他条件同实施例1,富集后得到的糖肽进行质谱分析,实验结果表明在萃取模式操作模式下含有体积浓度85%乙腈的50mM碳酸氢铵溶液可以有效地保留和富集糖蛋白标准品酶解液中的糖肽。
实施例9-12
调整10L蛋白酶解液的上样浓度为2ng/mL、20ng/mL、100ng/mL和200ng/mL,其他条件同实施例1,富集后得到的糖肽进行质谱分析,实验结果表明在萃取模式操作模式下20ng/mL上样浓度可以有效地保留和富集的蛋白中的糖肽。
实施例13-16
调整洗脱溶液的乙腈浓度为10%、20%、30%和50%,其他条件同实施例1,进行选择性富集和质谱分析。
实施例17-20
调整洗脱溶液的体积为50μL、100μL、150μL和200μL,其他条件同实施例1,进行选择性富集和质谱分析。
实施例21-24调整洗脱溶液的乙腈浓度为10%、20%、30%和50%其他条件同实施例2,富集后得到的糖肽进行质谱分析,实验结果表明在离心操作模式下1mg的材料可以有效地保留和富集蛋白中的糖肽。
实施例25-28
调整10L蛋白酶解液的上样浓度为2ng/mL、20ng/mL、100ng/mL和200ng/mL,其他条件同实施例2,富集后得到的糖肽进行质谱分析,实验结果表明在离心操作模式下1mg的材料可以有效地保留和富集蛋白中的糖肽。
实施例29-32
调整洗脱溶液的体积为50μL、100μL、150μL和200μL,,其他条件同实施例2,进行选择性富集和质谱分析。
实施例33-36
调整洗脱溶液的乙腈浓度为10%、20%、30%和50%,其他条件同实施例2,进行选择性富集和质谱分析。